Maria Yakovleva et al.
Diana María Sáez Chica
Irene Varón Sánchez
➢ Introducción
➢ Antecedentes
➢ Biosensor
• Diseño
• Receptor molecular
• Reacciones involucradas
• Transductores
➢ Ensayos y resultados
• Pretratamiento
• Optimización
• Ensayo de interferencias y estabilidad
➢ Conclusiones
➢ Opinión personal
➢ Bibliografía
• Incremento de regulación y
legislación de autenticidad en
productos lácteos
• Mastitis
• Control de procesos de
fermentación en la industria
del queso
• Intolerancia a la lactosa
• Detección amperimétrica del
H2O2 producido por la acción de
1ª Β-galactosidasa, glucosa oxidasa
Generación y galactosa oxidasa (1999)
• µFIAS (2002)
2ª
• Biosensor a estudio (2012)
Generación
• Transferencia electrónica
3ª directa desde la celobiosa
Generación deshidrogenasa hasta un
electrodo de carbono (2010)
Diseño del biosensor
(1) Entrada del buffer
(2) Bomba peristáltica
(3) Válvula de inyección
(4) Termistor
(5) Intercambiador de
calor
(6) Bloque de aluminio
(7) Aislamiento de
poliuretano
(8) Reactor enzimático
(9) Interfaz electrónica
(10) Potenciostato
(11) Electrodo de trabajo
(12) Contraelectrodo
(13) Electrodo de
referencia
(14) Jeringa
(15) Salida
(16) Registrador
Receptor molecular
• Celobiosa deshidrogenasa
(CDH)
– Dominio deshigrogenasa
(DHCDH) y dominio citocromo
(CYTCDH)
– Phanerochaete chrysosporium
– Expresada de forma
heteróloga en Pichia pastoris
– Especificidad por lactosa y
celodextrina
• Inmovilización
I. Activación de cuentas CPG-aminopropil silanizado con
glutaraldehido
II. Inmovilización de la enzima CDH sobre las cuentas
III. Introducción en el reactor
Reacciones involucradas
+ ∆H
Lactosa Lactosobionolactona
Transductores
• Calor liberado en • La especie
Amperimétrico
Termométrico
las reacciones de electroactiva al
oxidación es oxidarse genera
registrado en las en el electrodo de
resistencias trabajo un paso de
térmicas corriente, la cual
distribuidas por el es registrada y es
sistema. proporcional a la
concentración de
la especie.
Transductor Termométrico
• Oxidación enzimática de la lactosa
• Oxidación de H2BQ en el electrodo de trabajo
• El calor producido tras las reacciones es
detectado gracias a las resistencias térmicas
que se encuentran en varios puntos del
sistema
Transductor Amperimétrico
• Especie electroactiva H2BQ
• Potencial externo fijo de 0,4V
• Oxidación de H2BQ con cesión de electrones
al electrodo de trabajo
• Paso de corriente registrada
• La corriente generada es proporcional a la
cantidad de H2BQ que llega al electrodo
polarizado
Pretratamiento de las muestras
Evitar efecto
Objetivo matriz
• Muestras de leche con 0,1% y 3% de grasa
• Pretratamiento: centrifugación (5min, 13000rpm)
+ distintas diluciones
✓ No se encuentran ✓ No se requiere
diferencias ningún
significativas en las pretratamiento salvo
distintas respuestas una dilución de 150
o 300 veces
Pretratamiento de las muestras (I)
• Ensayo de fiabilidad: Método add-found
– Inyección 0,5 mM de lactosa en leche libre de la misma
y pretratada
• Buena correlación de lactosa añadida y detectada
Optimización biosensor
a) Eficiencia de inmovilización
b) Efecto del pH
c) Efecto tasa de flujo
d) Efecto volumen muestra
e) Efecto de la regulación de la temperatura
f) Propiedades analíticas
a) Eficiencia de inmovilización
• Dependencia de la estabilidad
operacional, sensibilidad y rango
lineal
• Estudio cantidad de enzima
inmovilizada
– Unión covalente enzima (CDH) a
soporte solido de CPG - 20 y 50
U por 150 mg de CPG
– Curvas de calibrado para cada
reactor y comparación de
propiedades analíticas
oxidación de alta [Lactosa] →
50 U determinación en amplio rango
de [ ] y alta sensibilidad
b) Efecto de pH
determinar
condiciones óptimas y
Objetivo la respuesta a varios
pHs
• Prueba de actividad catalítica
- rango de pH de 3,5 a 6
• [Lactosa] = 2mM
✓ CDH posee distintos perfiles
de pH para ambas respuestas:
– Medidas termométricas → el
pH no afecta a la respuesta
– Medidas amperométricas →
la respuesta es máxima a un
pH de 5.0 pH óptimo 5.0
c) Efecto tasa de flujo de buffer
• Incremento tasa de flujo de 0,5 a 1,04 mL/min → aumento
respuestas termométricas y amperométricas → picos más
nítidos y reducción de tiempo de ensayo
Flujo 1.0 mL·min-1
✓Estabilidad operacional y eficiente transferencia de masas
✓Tiempo de medida: 2 minutos
d) Efecto volumen de muestra
• Bucle de 50 mL→ Sensibilidad más alta
• Bucle de 30 mL → Rango linear más amplio
Bucle óptimo 50 mL
e) Efecto regulación de Tª
• Actividad catalítica depende de la Tª → regulación reactor a 25,
30 y 37 ºC
• Temperaturas más altas (30 y 37ºC) → sensibilidades altas
respecto a las de 25ºC
• Temperatura de 30ºC → mayor reproducibilidad que a 37ºC
Tª óptima 30ºC
f) Propiedades analíticas
• [BQ] (mediador) en buffer: 2 y 5 mM
• A > [BQ] aumento ruido de fondo y < sensibilidad
[BQ] óptima 2mM
f) Propiedades analíticas
• Estudio rango de [lactosa] de
0,05mM a 50mM → Ambas
respuestas al sustrato fueron
reproducibles y mostraron
precisión de intraensayo (RSD%)
de < 4 % (termométrica) y 3%
(amperométrica)
• Ambas medidas se caracterizan por alta precisión y
reproducibilidad
• Correlación lineal entre [lactosa] y ambas respuestas de 0,05 a
30mM para 50 mL → LOD = 0,05 mM de lactosa
Ensayo de Interferencias
• No mostró respuesta para concentraciones de
glucosa, galactosa y sacarosa (adición de 50mM)
• Sensibilidad a celodextrinas → no presentes en
leche
Ensayo de estabilidad
• Enzima unida a superficie del electrodo
Biosensores 3ª
• Desanclaje o desnaturalización de enzima
generación y menor tiempo de vida del electrodo
• Enzima unida a CPG en reactor
• El electrodo queda libre evitando
problemas de estabilidad y de
Biosensor dual almacenamiento
• Mayor durabilidad (1-2 años, de forma
estimada)
• Inyección de 2 mM lactosa durante 8 horas (más de 80
inyecciones)
✓ Ningún descenso de la señal de respuesta → estabilidad
operacional adecuada
• Optimización parámetros operacionales más importantes →
LOD de 0,05 mM para la lactosa → medida de lactosa en
productos lácteos tras su dilución adecuada
• Análisis SIMPLE y RÁPIDO
• NO INTERFERENCIAS en respuestas → altamente selectivo
• Alta repetibilidad, reproducibilidad y estabilidad de
almacenamiento
• Discordancias en los resultados termométricos y
amperométricos advierten de influencias adversas → aumento
fiabilidad del sistema
• Aplicaciones adicionales
1) Estudios sobre mecanismos de enzimas
2) Biosensores con otro tipo de enzimas
• Ventaja: fiable por uso de método dual de
detección y sensible por bajo LOD
• Desventajas:
1) No es aplicable a productos lácteos que
pueden contener celodextrinas
2) Ausencia de reactor de referencia sin enzima
para registrar cambios térmicos
• Comprensión reducida del diseño del
biosensor por falta de información,
explicaciones escuetas y suplementos poco
aclarativos en el articulo.
• A novel combined thermometric and amperometric biosensor for lactose
determination based on immobilised cellobiose dehydrogenase, Maria
Yakovlevaa, Orsolya Buzasa, Hirotoshi Matsumuraa, Masahiro Samejimab,
Kiyohiko Igarashib, Per-Olof Larssonc, Lo Gortona, Bengt Danielsson.
• Appendix A. Supplementary data, The instrumentation of the combined
biosensor.
• Production and Characterization of Recombinant Phanerochaete
chrysosporium Cellobiose Dehydrogenase in the Methylotrophic Yeast
Pichia pastoris. Makoto Yoshida et al. (2001)
• Principles and applications of thermal biosensors. Ramanathan K., et al.
(2001)
• A simple and sensitive method for lactose detection based on direct
electron transfer between immobilised cellobiose dehydrogenase and
screen-printed carbon electrodes. Gulnara Safina et al. (2010)
• Lactose biosensor based on Langmuir–Blodgett films of poly(3-hexyl
thiophene). Sharma et al. (2004)
