UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN
FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS
ESCUELA DE INGENIERÍA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
PRACTICA 5
SEPARACIÓN DE
AMINOÁCIDOS POR
CROMATOGRAFÍA DE PAPEL
ALUMANA: DIANA CAROLINA CINTICALA QUISPE
CODIGO:2016-11007
CURSO: LABORATORIO DE BIOQUIMICA
DOCENTE: Mgr. CASTELLANOS CABRERA, ROBERTO
HORARIO: 5:00 A 7:00 PM
TACNA – PERU
2018
UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN
FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS
ESCUELA DE INGENIERÍA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
PRACTICA 5
SEPARACIÓN DE AMINOÁCIDOS
POR CROMATOGRAFÍA DE
PAPEL
I. OBJETIVO
Conocer la técnica de cromatografía en capa fina, (ccf), sus características y
los factores que en ella intervienen.
Al finalizar de está practica el alumno deberá conocer el método
cromatografía por el cual se pueden separar de una mezcla los compuestos
químicamente semejantes para su identificación, en relación con los conceptos
de cromatografía
II. FUNDAMENTO TEORICO
La cromatografía se define como la separación de una mezcla de dos o más
compuestos por distribución entre dos fases inmiscibles: una fase móvil, llamada
también activa, que transporta las sustancias que se separan y que progresa en
relación con la otra, denominada fase estacionaria. La fase móvil puede ser un
líquido o un gas y la estacionaria puede ser un sólido o un líquido.
Todas las técnicas cromatografías dependen de la distribución de los componentes
de la mezcla entre esas dos fases. Según lo anterior, son posibles varios tipos de
cromatografía, dependiendo de la naturaleza de las dos fases involucradas: pueden
ser sólido-liquido (capa fina, papel o columna), o bien liquido-liquido o gases
liquido (fase vapor).
Todos los sólidos finamente pulverizados tienen el poder de adsorber en mayor o
menor grado otras sustancias sobre su superficie; y, similarmente, todas las
sustancias pueden ser adsorbidas, unas con más facilidad que otras. Este
fenómeno de adsorción selectiva es el principio fundamental de la cromatografía.
CONCEPTO DE Rf
Rf es el registro, es una relación de distancias, y se define como:
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(a) distancia que recorre la muestra desde el punto de aplicación
Rf =
(b) distancia que recorre el disolvente hasta el frente del eluyente.
Punto de aplicación
El valor de Rf depende de las condiciones en las cuales se corre la muestra (tipo
de
adsorbente, eluyente, así como las condiciones de la placa, temperatura, vapor de
saturación, etc"). Tiene una reproducibilidad de t 20%, por lo que es mejor correr
duplicados de la misma Placa.
CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA
En este caso se utiliza una placa recubierta con fase estacionaria manteniendo un
pequeño espesor constante a lo largo de la placa. El eluyente ascenderá, por
capilaridad, por la placa y arrastrará los componentes a lo largo de ésta
produciendo
"manchas" de los componentes.
En la cromatografía en capa fina (ccf), el grado de elución de las sustancias
depende tanto de su propia polaridad como de la polaridad del eluyente utilizado'
El adsorbente se coloca en forma de una capa delgada adherida sobre un soporte
rígido, qué pueden ser placas de vidrio, aluminio o poliéster. Los tamaños de la
placa para ccf convencional son: 20 x 20; 10 x20 y 5x2 cm.
Hay adsorbentes que contienen un indicador de fluorescencia para facilitar la
identificación de muestras. Si no se usa indicador y los componentes no son
coloridos, se requerirán otras técnicas de revelado.
Eluyentes más comunes para cromatografía en capa fina
éter de petróleo n-hexano
cloruro de metileno acetato de etilo
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ciclohexano t-butil-éter
acetona metanol
' tolueno cloroformo
iso-propanol ácido acético
dietil-éter
etanol
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Reveladores más comunes para cromatografía en capa fina
Las manchas de color son, por supuesto, inmediatamente visibles; las incoloras
pueden revelarse mediante:
a) Luz UV: si la sustancia absorbe luz ultravioleta, se puede usar una fase
estacionaria impregnada con un indicador fluorescente (F254 ó F366), el número
que aparece como subíndice nos indica Ia longitud de onda de excitación del
indicador utilizado"
b) La introducción de la placa en vapores de yodo
c) El rocío con una solución de agualH2SO4 1 :1 (dentro de un compartimiento
especialmente protegido y bajo una campana de extracción de gases). Después
calentar intensamente, por ejemplo, con un mechero. hasta carbonizar los
compuestos.
Adsorbentes más comunes para cromatografía en capa fina.
a) Gel de sílice (se utiliza en el 80% de las separaciones)
b) Oxido de Aluminio ó Alúmina (ácida, neutra ó básica)
c) Celulosa (Nativa o micro-cristalina)
d) Poliamidas
Para la selección del adsorbente deber tomar las s¡guientes consideraciones:
a) Polaridad
b) Tamaño de partícula
c) Diámetro
d) Area Superficial
e) Homogeneidad
f) Pureza
Factores que influyen en una separación por cromatografía de capa fina.
a) Temperatura: a menor temperatura las sustancias se adsorben más en la
fase
estacionaria.
b) La cromatografía debe llevarse a cabo en un área sin corrientes de aire.
c) Limpieza de las placas. Muchas placas están contaminadas con grasa o
agentes plastificantes o adhesivos. Para el trabajo a pequeña escala, éstas
deben limpiarse corriendo primero una mezcla de cloroformo y metanol y
después dejar secar completamente antes de aplicar la muestra.
d) Pureza de los disolventes.
III. MATERIALES
1. Materiales de vidrio
Frasco
Placa Petri
2. Reactivos y/o elementos
Acido aspártico, 1 milimol (133 mgr %)
Leucina, 1 milimol (131 mgr %)
Butanol, ácido acético, agua (4:1:1)
Ninhidrina al 0.05 %
3. Otros materiales
Pipeta
Regla
Lápiz
Papel filtro
Cinta
IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
1. A un extremo de papel filtro en tira haga una pequeña marca con lápiz a un cm
de distancia.
2. Ponga una gota en la marca antes señalada, de los aminoácidos ácido número
un (Ác. Aspartico).
3. Repetir la misma operación con el patrón de aminoácidos número dos
(Leucina).
4. En otro papel repetir lo mismo, pero primeramente se colocar el aminoácido
uno y sobre este aplicar el aminoácido dos.
5. En tres tubos de ensaye 0.75 mL de la mezcla butanol, ácido acético, agua en
cada uno, introduciendo las tiras de papel independientemente una en cada
tubo.
6. Tapar los tubos de ensaye con papel aluminio.
7. Dejar avanzar el frente del solvente aproximadamente hasta 2 cm. antes de
llegar al borde superior. Sacarlos y señalar con un lápiz el lugar donde llegó el
solvente.
8. Una vez seco el papel rocíe con una solución de ninhidrina al 0.05 %.
Dejándolo secar nuevamente.
DEBIDO A QUE NOSE TERMINO DE REALIZR EL EXPERIMETO SE
TOMO DATOS APROXIMADOS.
Rf = Distancia recorrida por aminoácidos / distancia recorrido por el frente
del solvente.
Comparar los resultados obtenidos con los estándares correspondientes. Cuadro
que indica los valores de Rf de los aminoácidos presentes en el estándar,
utilizando como solvente una mezcla de butanol: ácido acético, agua (4:1:1), a una
temperatura de 25 ºC.
Aminoácidos del estándar # 1 Rf aproximado
Acido aspártico 0.17
Prolina 0.29
Leucina 0.59
V. RESULTADOS
Aminoácidos Recorrido de Recorrido RF
aminoácidos de solvente
Ácido áspártico 6.4 cm 7.1 cm 0.901
Leucina 4.7 cm 5.7 cm 0.824
Mezcla D y L 5 cm 8 cm 0.625
VI. CUESTIONARIO
¿Qué es la cromatografía?
Es un método físico o de separación para la caracterización de mezclas
complejas. Existe cromatografía de papel y de columna. Entre la cromatografía
de papel se encuentra la de papel y capa fina. Entre la cromatografía de columna
está la de filtración, intercambio iónico, hidrofóbica y afinidad.
¿Mencionar que tipo de cromatografía se usó en esta práctica?
Cromatografía de papel.
VII. CONCLUSIONES
Las pruebas para identificar aminoácidos, como la cromatografía, se basan en
características propias de cada aminoácido, como es su punto isoeléctrico y su
RF. Mediante un buen uso de la técnica de cromatografía, se puede separar una
mezcla compleja de aminoácidos. El problema en este experimento fue que se
llevó a cabo un mal manejo de las muestras, debido a la inexperiencia y falta
de cuidado. Teniendo en cuenta los datos teóricos se nota que la Leucina tiene
una mayor afinidad por la fase móvil que el ácido aspártico, quien siempre
debe tener un menor RF.
Éste tipo de cromatografía nos permite identificar aminoácidos y que se
genera una reacción como consecuencia de la interacción entre la ninhidrina y
los distintos aminoácidos por la presencia del grupo amino, por lo tanto,
presenta un color característico como es el morado o magenta.
La ninhidrina, es el reactivo adecuado y necesario para aplicar en
cromatografía de aminoácidos, puesto que reacciona con los principales
compuestos (aminoàcidos), permitiendo el reconocimiento de los mismos por
la coloración denominada púrpura de Ruhemann.
Entre los aminoàcidos, la prolina es la excepción en cuanto a la coloración
morado o magenta, más bien, este aminoácido presenta un tono amarillo,
debido que, al reaccionar con la ninhidrina, la prolina no produce amonio en el
momento de esta reacciòn.
VIII. BIBLIOGRAFÍA
http://organica1.org/1311/1311_6.pdf
https://www.uam.es/docencia/jppid/documentos/practicas/actuales/guion-
p6.pdf
https://es.scribd.com/document/267365151/Practica-8-Separacion-de-
Aminoacidos-Por-Cromatografia-Enpapel-Francisco-Correa-C
http://es.wikipedia.org/wiki/Cromatograf%C3%ADa
