INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

INGENIERÍA BIOQUÍMICA

LABORATORIO DE MÉTODOS DE ANÁLISIS QUÍMICOS

“DETERMINACIÓN DE CAFEÍNA EN REFRESCOS DE COLA POR

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA EFICIENCIA (HPLC)”

ALUMNA: ADRIANA BAÑUELOS RAMOS

PROFESOR: VICTOR MANUEL MACÍAS MARTÍNEZ

4IV1

SECCIÓN 1
FUNDAMENTOS.

La cromatografía es un método físico de separación basado en la distribución de los

componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra
móvil. En la cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido que fluye a través de una
columna que contiene a la fase fija.

La cromatografía líquida de alta eficiencia se encuadra dentro de la cromatografía de

elución. En ésta, un líquido (fase móvil) circula en íntimo contacto con un sólido y otro
líquido inmiscible (fas estacionaria); al introducir una mezcla de substancias (analitos) en
la corriente de fase móvil, cada analito avanzará a lo largo del sistema con una velocidad
diferente que dependerá de su afinidad por cada una de las fases. Esto supone que
después de terminado el recorrido de la muestra por la columna, cada una de las
substancias introducidas en el sistema eluirá con un tiempo diferente, es decir, estarán
separadas.

OBJETIVO.

 Conocer el funcionamiento y fundamento del equipo de HPLC, de la cual se llevará

la identificación de la cafeína presente en bebidas gaseosas de cola comerciales
por medio de la comparación de sus tiempos de retención (tR) con el tR de un
estándar de cafeína; utilizando cromatografía en fase reversa y detección por U.V.

RESULTADOS.

TABLA 1. Condiciones cromatográficas.

Fase estacionaria C18 (no polar)

Columna Longitud: 150 mm
Diámetro interno: 4.6 mm
Tamaño de partícula: 5 µm
Fase móvil Disolventes grado HPLC desgasificados y filtrados: Agua-
metanol (v/v) (35:65) (polar), filtrada y desgasificada
Velocidad de flujo 1.0 mL/min
Volumen de inyección 20 µL
%DER <1.5%
Detector UV-Vis (273 nm)
 TABLA 2. Tiempos de retención y áreas bajo la curva en muestras y estándar.

Compuesto TR Área bajo Promedio Cafeína Resultados experimentales.

(min) la curva del área
(mg/ mL) Concentración Concentración
de cafeína en de cafeína por
100mL envase
Estándar 1.73 420,878 X= 420, 878
1.73 - S= - 0.0103 - -
C.V.= -
Pepsi kick 1.73 957,981 X= 956,676
S= 1344 23.41 104.46
1.73 956,753 0.02341
mg/100mL mg/600mL
1.73 955,295 C.V.= 0.14%
Energy 1.72 2,275,728 X= 2,374,069
S= 86314.84 205.9
1.72 2,409,207 0.058 58mg/100mL
mg/355mL
1.72 2,437,274 C.V.= 3.63%
Coca-cola 1.73 427,878 X= 427,868
S=14.1421 10.47 62.87
1.73 427,858 0.01047
C.V= 0.0033% mg/100mL mg/600mL

Coca café 1.73 1,377,288 X= 1,404,186

34.3 80.60
1.65 1,432,373 S=27565.11 0.0343
mg/100mL mg/235mL
1.73 1,402,897 C.V= 1.96%

CÁLCULOS

 Para el estándar de cafeína:

10.3 mg de cafeína se disolvieron en 100 mL de agua destilada.

10.3 𝑚𝑔
=0.0103 mg cafeína/ mililitros.
100 𝑚𝐿

Al tomar una alícuota de 1 mL de la solución anterior y se disolvió en 10 mL de agua

destilada.

0.10 𝑚𝑔
=0.010 mg cafeína / mililitros.
10 𝑚𝐿
  Para las muestras

Si en el promedio de área bajo la curva del estándar de cafeína (420, 878) hay 0.010 mg/
mL

Los mg/mL en Pepsi Kick son:

(956,676)(0.0103) 𝒎𝒈
= 𝟎. 𝟎𝟐𝟑𝟒𝟏
420, 878 𝒎𝑳

Por lo que en 100 mL hay:

𝒎𝒈 𝒄𝒂𝒇𝒆í𝒏𝒂
(0.02341mg/mL) (10mL) (100mL)= 23.41 𝒎𝑳

Y en 600 mL :
(23.41)(600 𝑚𝐿) 𝒎𝒈
= 𝟏𝟒𝟎. 𝟒𝟔
100 𝑚𝐿 𝒎𝒍

Los mg/mL en Energy son:

(2,374,069)(0.0103) 𝒎𝒈
= 𝟎. 𝟎𝟓𝟖
420, 878 𝒎𝑳

Por lo que en 100 mL hay:

𝒎𝒈 𝒄𝒂𝒇𝒆í𝒏𝒂
(0.058mg/mL) (10mL) (100mL)= 58
𝒎𝑳

Y en 355 mL :
(58)(355 𝑚𝐿) 𝒎𝒈
= 𝟐𝟎𝟓. 𝟗
100 𝑚𝐿 𝒎𝒍
Los mg/mL en Coca-cola son:

(427,868)(0.0103) 𝒎𝒈
= 𝟎. 𝟎𝟏𝟎𝟒𝟕
420, 878 𝒎𝑳

Por lo que en 100 mL hay:

𝒎𝒈 𝒄𝒂𝒇𝒆í𝒏𝒂
(0.01047mg/mL) (10mL) (100mL)= 10.47 𝒎𝑳

Y en 600 mL :
(10.47)(600 𝑚𝐿) 𝒎𝒈
= 𝟔𝟐. 𝟖𝟐
100 𝑚𝐿 𝒎𝒍

Los mg/mL en Coca-café son:

(1,404,186)(0.0103) 𝒎𝒈
= 𝟎. 𝟎𝟑𝟒𝟑
420, 878 𝒎𝑳

Por lo que en 100 mL hay:

𝒎𝒈 𝒄𝒂𝒇𝒆í𝒏𝒂
(0.0343 mg/mL) (10mL) (100mL)= 34.3 𝒎𝑳

Y en 235 mL :
(34.3)(235 𝑚𝐿) 𝒎𝒈
= 𝟖𝟎. 𝟔𝟎
100 𝑚𝐿 𝒎𝒍

Partes del HPLC.

COMPARACIÓN DE CROMATOGRAMAS CON LOS RESULTADOS
OBTENIDOS DE LA SECCIÓN 1 Y 4.

Imagen 1. Cromatográma de la sustancia de referencia de la sección 1.

Imagen 2. Cromatograma de la sustancia de referencia de la sección 4.

Imagen 3. Cromatográma de Pepsi Kick de la sección 1.

Imagen 4. Cromatograma de Pepsi Kick de la sección 4.

Imagen 5. Cromatograma de coca Energy de la sección 1.

Imagen 6. Cromatograma de coca Energy de la sección 4.

Imagen 7. Cromatograma de Coca-cola de la sección 1.

Imagen 8. Cromatograma de coca-café de la sección 1.

 Imagen 9. Cromatograma de coca-café de la sección 4.

Imagen 10. Sobre posición de las muestras de la sección 1.

 Imagen 11. Cromatogramas por separados de la sección 1.

DISCUSIÓN Y ANÁLISIS DE RESULTADOS.

Para la determinación de cafeína en bebidas gaseosas de cola, empleamos una

cromatografía de alta resolución (HPLC) pero utilizando la modalidad de fase reversa,
donde la fase móvil es una mezcla de agua-metanol (35:65) que es una fase polar, y una
fase estacionaria que emplea partículas de silica gel recubiertas con cadenas
hidrocarbonadas C18 que le confieren la propiedad de ser una fase estacionaria no polar,
de modo que aquellos compuestos que sean no polares serán mayormente retenidos,
mientras que los polares serán eluídos rápidamente.

Es importante recalcar los componentes y el funcionamiento del equipo para HPLC

utilizado, donde el primer componente de este equipo son los reservorios para fase móvil,
que son frascos de vidrio con paredes homogéneas que nos permitan observar el interior
de éstos, en los cuales colocamos la fase móvil agua-metanol que cabe mencionar que
esta debe ser filtrada y desgasificada previamente con el objetivo de eliminar cualquier
tipo de partículas que pudieran estar presentes y que puedan ser interferencia en la
determinación. Por medio de una bomba binaria reciprocante, es decir que realiza el
bombeo mediante pistones, la fase móvil es impulsada a través de todo el sistema
cromatográfico en la proporción que se haya elegido (en nuestro caso 35:65) llegando a
los inyectores, los cuales nos permiten introducir la muestra al sistema, dicho inyector
cuenta con un loop que retiene una cantidad constante de muestra (20 µL)
independientemente del volumen que sea inyectado, sin embargo es necesario inyectar el
triple del volumen retenido. Seguido de lo anterior, la muestra pasa a la columna C18
(que es una columna con baja polaridad) que tiene una longitud de 150 mm, la longitud de
la columna dependerá de lo que se busca separar, ya que a mayor longitud será mayor el
paso de fase móvil y por tanto se aumentará la capacidad para realizar la separación,
pero también es importante considerar el tamaño de partícula, pues al disminuir el tamaño
se aumenta la superficie de contacto y así mismo la eficiencia de separación. Finalmente,
la muestra es detectada por un detector de UV-Vis a una longitud de onda de 273 nm, ya
que es a 273 nm donde se observa el máximo de absorción de la cafeína; también
añadiendo que la estructura de la molécula de la cafeína presenta anillos aromáticos lo
cual debe ser leía en esa región del espectro.

Una vez que ya fue inyectada la muestra se comienza la lectura en el registrador y se

requiere de una línea base estable por al menos 15 minutos, sin embargo en un inicio no
fue el tiempo estimado o más bien esperado debido a fallas técnicas del sistema fue
necesario emplear otro más eficiente y por lo tanto los resultados se vieron notablemente
afectados comparados con los otros datos de las otras secciones.

Se utilizó un estándar de cafeína con el objetivo de realizar una comparación del tiempo
de retención del estándar (que se define como el tiempo que transcurre desde la
inyección de la muestra (tiempo 0) hasta la aparición del máximo de un pico) con las
diferentes muestras que fueron analizadas por el equipo de HPLC, donde se inyecto por
triplicado dicho estándar y se obtuvo un tiempo de retención de 1.73 minutos, al igual que
las muestras de los refrescos Coca cola, coca café y Pepsi kick, ya que su máximo de
unidades de absorción fue a los tiempos de retención entre 1.73 minutos, lo cual hace
referencia que dichos bebidas contienen el mismo analito, la cafeína, pues los tiempos de
retención son los mismos, mientras que para la muestra de coca Energy presentó una
ligera variación de tiempo de un segundo menos (1.72 minutos), no obstante dicho dato
aún entra dentro de los parámetro del tiempo establecido por las demás muestras.

Debido a que el estándar y las muestras se inyectaron por triplicado y duplicado

respectivamente, fue necesario determinar la desviación estándar relativa (%CV) para
verificar que existiera reproducibilidad en las determinaciones, dichos %CV variaron
notablemente para cada una de la muestra, tal vez se puede asumir que dichos
resultados encontrados se debe precisamente a las fallas técnicas que se presentaron en
un inicio al cambiar de equipo.

Por otro lado, para la cuantificación de la cafeína presente en los refrescos de cola es
necesario comparar el área bajo la curva de las muestras con la del estándar (ver ejemplo
de cálculos realizados), donde el refresco de pepsi kick presentó 23.41 mg/100mL, de
coca energy 58mg/100mL, de coca cola 10.47 mg/100mL y de coca-café 34.3 mg/100mL,
lo cual reflejado en las tablas y en los cromatogramas, el producto “energy” fue el que
presentó una mayor cantidad de cafeína.
Con base en las concentraciones de cafeína de los diferentes refrescos de cola y
comparando con lo establecido en la NOM-218-SSA1-2011 en el apartada 6.3 “Las
bebidas adicionadas con cafeína no deben contener más de 33mg de cafeína/100mL de
producto”, la Coca- café y coca Energy contienen aproximadamente 3 veces más a lo
indicado y sugerido por la norma.

Sin embargo, el refresco de coca cola en sus ingredientes nunca se menciona sobre
algún contenido de cafeína, de manera que también infringe la norma, pues ésta señala
que “toda bebida adicionada con cafeína debe declararse en la lista de ingredientes,
seguido del contenido exacto expresado en mg/100mL”.

El apartado del Apéndice normativo A Listado de aditivos de la NOM-218-SSA1-2011

señala que el límite máximo de consumo de cafeína es de 200 mg/L , de modo que no
existe problema alguno si se consume hasta dos litros de coca cola (sin tomar en cuenta
problemas secundarios que afectan a la salud como diabetes y daño renal), pero un solo
envase de 600 mL de Pepsi kick contiene 104.46 mg de cafeína, tan solo medio litro de
esta bebida contiene el doble del límite máximo de consumo de cafeína.

Tomando en cuenta el apartado 11.6.3 “La ingesta de cafeína por el consumo de estas
bebidas no debe exceder de 165 mg de cafeína por día” es importante moderar las
cantidades en las que se ingiere este tipo de bebidas, ya que se piensa que los refrescos
de cola son bebidas relativamente inofensivas y que un excesivo consumo de estos
productos no causa más daño que caries dental y un aumento de peso, debido al alto
contenido de azúcar. Sin embargo una ingesta excesiva de éstas y por tanto de cafeína
(que es una droga psicotrópica de mayor consumo en el mundo) pueden provocar
cambios mentales, alteraciones cardiovasculares y respiratorias y malestares
gastrointestinales, teniendo como primeros síntomas el insomnio, nerviosismo, excitación,
aumento de la diuresis y problemas gastrointestinales, pues en algunas personas los
síntomas aparecen consumiendo cantidades muy pequeñas, como 250 mg por día.

CONCLUSIONES

La concentración de cafeína en el refresco coca cola es de 10.47 mg/contenido de

envase de 600 mL.
La concentración de cafeína en el refresco pepsi Kick es de 23.41 mg/contenido
de envase de 600 mL.
La concentración de cafeína en el refresco coca Energy es de 58 mg/contenido de
envase de 355 mL.
La concentración de cafeína en el refresco coca- café es de 34.3 mg/contenido de
envase de 235 mL.
 El tiempo de retención es mayor para las moléculas de naturaleza apolar, mientras
que las moléculas polares eluyen más rápidamente.
Un envase de refresco Pepsi kick que se ingiere supera los límites máximos de
consumo establecidos en la NOM-218-SSA1-2011.
Para identificar la presencia de cafeína en bebidas de cola es necesario comparar
sus tiempos de retención con los de un estándar de cafeína.

PREGUNTAS ADICIONALES

1. ¿Cuál es la importancia de filtrar y desgasificar la fase móvil y la muestra?

Eliminar cualquier tipo de partículas que pudieran estar presentes y que puedan ser una
interferencia en la determinación, así como evitar daños futuros en el equipo.

2. Mencionar los métodos de desgasificación más frecuentemente utilizados en

HPLC.

 Sonicación
 Burbujeo con gas inerte de alta pureza (como Helio)
 Desgasificación al vacío.

3. ¿En que difiere la cromatografía en fase normal de la cromatografía de fase

reversa en cuanto a la fase estacionaria, fase móvil y orden de elución?

La cromatografía en fase normal emplea una fase estacionaria polar y una fase móvil no
polar, de manera que aquellos compuestos no polares eluirán rápidamente, mientras que
los polares serán retenidos por mayor tiempo y eluirán al final.

La cromatografía en fase reversa emplea una fase estacionaria no polar y una fase móvil
polar, por lo tanto el tiempo de retención es mayor para las moléculas de naturaleza
apolar, mientras que las moléculas de carácter polar eluyen más rápidamente.

4. Si se cambiara la composición de la fase móvil agua metanol (35:65) a (25:75),

¿Qué sucedería en cuanto al tiempo de retención? y ¿por qué?

El tiempo de retención aumenta con la adición de disolvente polar a la fase móvil y

disminuye con la introducción de disolventes más hidrofóbicos ya que se modifica el
coeficiente de partición de forma que el compuesto se mueve por la columna y eluye.

5. ¿Qué es el C-18?

Las columnas C18 proporcionan buena retencion y resolución con muchas muestras
diferentes. Las columnas C18 tiene una larga duración en muchas fases móviles
diferentes (pH 2-8 o e incluso pH 2-9 y hasta 11.5) son muy flexibles para el desarrollo de
métodos y la optimización, debido a su amplio rango de condiciones de uso.

6. ¿Qué otra característica se puede acomplar al HPLC?

Detector de absorción de UV-visible, de absorción de IR, de fluorescencia, con índice de

refracción, electroquímico, de conductibilidad, de dispersión de luz y acoplado a espectro
de masas.

BIBLIOGRAFÍA.

Rubiano A., Zuluaga-Domínguez C., (2012). Determinación y Estandarización de

un Método para Cafeína en el Proceso de Torrefacción por Cromatografía Líquida
de Alta Eficiencia (HPLC). Revista Especializada en Ingeniería de Procesos de
Alimentos y Biomateriales, Vol. 6. pp.: 40,41.

UAM, Determinación de la concentración de cafeína en una bebida energética por

cromatografía de líquidos (HPLC) a partir de una curva de calibración, (2011).

Diario Oficial, NORMA Oficial Mexicana NOM-218-SSA1-2011, Productos y

servicios. Bebidas saborizadas no alcohólicas, sus congelados, productos
concentrados para prepararlas y bebidas adicionadas con cafeína.
Especificaciones y disposiciones sanitarias. Métodos de prueba, (2012).