Estimación de Biomasa
Proceso de producción
Monitoreo de información
Estrategias
de control
pH Temperatura Biomasa pO2 Concentración Sustrato
de producto consumido
Toma de decisiones
1
Cuál es la importancia ???
Caracterizar nuestro sistema
Ver su evolución
Expresión de los rendimientos del proceso
definir qué es la biomasa en el
sistema en estudio
tiempo estimado del que se dispone para
obtener los resultados
económicamente viable
2
Medidas On-line y Off-line
Elección del método.
Filamentoso
•Tipo Particulado
•Separabilidad o capacidad de disgregación
Propiedades de la biomasa
•Edad del cultivo
•Velocidad de crecimiento
•Viscosidad
Propiedades del medio de •Color
cultivo •Sólidos insolubles
•Potenciales Interferentes
•Exactitud y sensibilidad
Características del proceso
•Rapidez y versatilidad
3
Métodos directos
Análisis físicos Microscopía y recuentos
Peso seco / fresco Recuentos de viables
Volumen
DO Conteo directo en
microscopio
Conteo en campo eléctrico
Citometría de flujo
Permeabilidad dieléctrica
Métodos indirectos
Análisis químicos
Bioluminiscencia y Quimioluminiscencia
Fluorescencia
Espectroscopia de infrarrojo cercano
Masa de componentes celulares
Actividades metabólicas
4
PESO FRESCO.
Ventaja: Desventaja:
Puede aplicarse a Necesidad de
cualquier morfología estandarizar muy bien la
metodología y tiempos de
la técnica
PESO SECO
5
Desventajas:
Se necesitan aproximadamente 24 hs para secar el material.
Interfieren sólidos no disueltos en el medio de cultivo.
No discrimina entre material viable y no viable.
Es muy poco sensible.
METODO VOLUMETRICO
Poco volumen En capilar (como un hematocrito)
Mayor volumen Centrifugación en tubo graduado
En todos los casos se deben estandarizar las condiciones en las que
sedimenta la biomasa
Desventaja:
La sedimentación de la biomasa dependerá de la morfología del
cultivo
6
DENSIDAD OPTICA.
El método está basado en la ley de Lambert y Beer.
Turbidimetría Nefelometría
Se mide la opacidad o El detector se ubica en un
densidad óptica. ángulo distinto del haz
incidente (normalmente
El detector se ubica en la o
90 ).
misma dirección en la que
incide el haz inicial.
Log I0/It= A x l Log I0/Is= -B x l
DO
Desventajas
Solo aplicable a microorganismos unicelulares y que no liberen
sustancias al medio que modifiquen su Absorbancia.
Es afectado por burbujas y sólidos no disueltos.
Es sensible en un rango acotado de concentración.
7
CONTEO EN CAMPO ELECTRICO.
Principio:
Se hace pasar las células por una pequeña apertura en la cual está
aplicado un campo de corriente eléctrica constante.
Como las células son generalmente no-conductoras, al pasar por la
apertura generan un incremento en el voltaje (por aumento de la
resistencia).
La concentración de la muestra debe de ser tal que pase una sola
célula a la vez por la ranura.
También se puede calcular el tamaño de la célula, ya que el cambio
en la resistencia es proporcional al tamaño.
Desventajas:
Restringido a medios de cultivo definidos
(por la conductividad del medio).
Solo aplicable a microorganismos
unicelulares.
Equipo costoso (Coulter counter).
8
CITOMETRIA DE FLUJO.
Principio: Desventajas:
Es similar al se CONTEO EN Alto costo del equipo.
CAMPO ELECTRICO. El
monitoreo del paso de las células Solo para
es por un haz de láser. microorganismos
unicelulares.
El detector registra la interrupción
del haz.
PERMEABILIDAD DIELECTRICA.
Principio:
Al aplicar un campo eléctrico se produce la polarización por
migración de los iones de la solución.
La polarización inducida (Capacitancia) en la suspensión celular
difiere de la del medio esto sucede porque los iones
generados dentro de la célula no pueden migrar al polo opuesto
debido a la membrana celular.
9
Para generar polarización necesita de membranas intactas
Detecta células viables
Ventaja:
Buen sistema para microorganismos filamentosos, los cuales
suelen ser problemáticos.
CONTEO DIRECTO EN
MICROSCOPIO.
Se hace un recuento en cámara tipo hematológica.
Se usan colorantes como contraste ( azul de metileno,
fenoftaleína, rojo neutro).
Ventajas:
Diferencia entre células viables y no viables.
Equipamiento muy accesible.
10
CONTEO DE VIABLES.
Se basa en el recuento de colonias.
Poco práctico para el monitoreo de procesos por la demora en la
obtención de los resultados
Ventaja: Desventaja:
Técnica apta para •Método muy lento.
microorganismos
•Considerar la exigencia
unicelulares y para el cultivo
nutricional de los
de esporas.
microorganismos.
METODOS INDIRECTOS
Refieren el crecimiento al dosaje de un componente celular.
11
BIOLUMINISCENCIA Y
QUIMIOLUMINISCENCIA.
La biomasa es expresada en términos de ATP.
La técnica se basa en la reacción:
ATP + luciferina + O2 oxiluciferina + AMPi + PPi + CO2
LUZ
FLUORESCENCIA
Utiliza la propiedad de algunas sustancias de emitir a distinta de
la que es usada para excitarlos.
NADH y NADPH son muy usados.
La concentración de NADPH es muy variable de acuerdo al estado
fisiológico de la célula.
El NADH depende de la actividad redox de la célula. Es más
constante.
Los componentes del medio pueden contribuir a la fluorescencia.
12
ESPECTROSCOPIA DE
INFRARROJO CERCANO
Basado en la absorción de energía en el rango de 700 a 2500 nm.
Bandas principalmente estudiadas: -OH, -NH, -CH.
El método todavía no es muy aplicado. EN ETAPA DE
INVESTIGACION.
Desventajas:
Alto costo
Análisis de datos complejo
13
MASA DE UN COMPONENTE CELULAR.
Nitrógeno celular. Proteínas.
Método utilizado: Kjeldahl Método más utilizado: Biuret
Desventaja: el contenido de N es Desventaja: Depende de la
variable entre las distintas fases composición de aminoácidos
de crecimiento. (reactivos calibrados son BSA)
DNA.
Colorimetría basada en la reacción entre deoxiribosa y
difenilamina.
Ventaja: la concentración de DNA es bastante constante.
Desventajas: Poco sensible, usa reactivos peligrosos.
ACTIVIDADES METABOLICAS.
Relaciona biomasa con alguna velocidad de reacción metabólica
Se puede monitorear :
– la producción de gases como CO2,
–el consumo de sustratos o de O2,
–reacciones de reducción de colorantes específicos.
* En el caso del consumo de sustratos, se debe tener en cuenta que parte del
consumo se destina al mantenimiento y solo una parte de estos se destina al
crecimiento de la biomasa.
14
