UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA
FACULTAD DE INGENIERÍA AMBIENTAL
“TINCIÓN GRAM”
Informe de laboratorio N°6
CICLO 2019-1
DOCENTE: MSc. Blgo. ALVARO MARTÍN MARTÍNEZ VILA
INTEGRANTES:
Hugo Nelson Huari Ramos 20162212H
Fabricio Torres Silva 20180272I
Joseph Joel reyes Obregón 20180619I
Lima Perú 17 de mayo del 2019
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INDICE
I. Resumen ........................................................................................................... 3
II. Introducción ....................................................................................................... 4
III. Objetivos ........................................................................................................... 5
a. Objetivo General ............................................................................................ 5
b. Objetivos Específicos ..................................................................................... 5
IV. Marco Teórico ................................................................................................ 5
V. Procedimiento Experimental .............................................................................. 9
a. Materiales, medios de cultivo y equipos ......................................................... 9
b. Metodología. ................................................................................................ 11
VI. Resultados ................................................................................................... 12
VII. Discusión de Resultados .............................................................................. 13
VIII. Conclusiones ............................................................................................... 13
IX. Recomendaciones ........................................................................................... 13
X. Fuentes de información ................................................................................... 14
XI. Anexos ............................................................................................................ 14
XII. Apéndice ...................................................................................................... 15
a. Diagrama de flujo ......................................................................................... 15
b. Datos experimentales y observaciones ........... Error! Bookmark not defined.
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I. Resumen
En el siguiente informe se presenta la descripción de un procedimiento en el cual
se llevó acabo la tinción de Gram con el fin de contrastar las bacterias presentes de
una muestra de carne molida, para identificar la presencia de bacterias según su
grupo taxonómico: Gram positivas y Gram negativas.
En este procedimiento, en un portaobjetos limpio y seco, se agregó una gota de
agua destilada y posteriormente se colocó una UFC (unidad formadora de colonia)
encima de esta gota con un asa de siembra previamente esterilizada; seguidamente
se calentó suavemente en la llama de un mechero de alcohol para fijar la muestra.
Posteriormente se tiño con cristal violeta de, luego se lavó con corro de agua,
nuevamente lugol y seguidamente se lavó con alcohol acetona pararetirar el exceso
de colorante, después se aplicó sanfranina para contrastar y por último se lavó con
corro de agua y se dejó secar la muestra. Finalmente se procedió a la identificación
la presencia de bacterias según su grupo taxonómico: Gram positivas o Gram
negativas presentes a través del microscopio con el objetivo de 1000x obteniendo
cocos y estreptococos positivos y ne baterías Gram negativas con forma de bacilo
y cocos.
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II. Introducción
Una de las características más importante de las bacterias es su morfología, definida
por el tamaño, la forma, el arreglo y la estructura. Existen bacterias en forma
redondeada denominadas cocos, en forma cilíndrica, denominadas bacilos y una
tercera morfología como son las que tienen forma de espirales, denominadas
espirilos. A su vez cada categoría puede subclasificarse con base a diferentes
arreglos.
Estas características pueden determinarse examinando muestras al microscopio.
Las células no teñidas son prácticamente transparentes, pero pueden observarse al
microscopio de luz haciendo preparaciones entre lámina y laminilla o con
microscopios especiales como, por ejemplo: de contraste de fases o de campo
oscuro.
Cuando se dispone de un microscopio de luz, se pueden teñir las bacterias para
facilitar su visualización. Si se tiñe una muestra del cultivo extendida y fijada en una
lámina portaobjeto con un colorante dado, las células adquirirán el color del colorante
añadido y podrá observarse la forma, tamaño y el arreglo de las mismas. Este tipo de
coloración se conoce con el nombre de coloración simple.
Para obtener mayor información sobre la morfología y composición química de las
bacterias, debe recurrirse a tinciones diferenciales que involucran el uso de varios
reactivos y éstas pueden diferenciarse con base al color que retienen. Ej. Tinción de
Gram y Tinción de Ziehl Neelsen.
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III. Objetivos
a. Objetivo General
Clasificar especies bacterianas en Gran positivas o en Gram negativas de
acuerdo a la tinción de Gram.
b. Objetivos Específicos
Observar células bacterianas según su forma.
Adquirir destreza en la realización de observaciones microscópicas de
bacterias.
Importancia de la tinción Gram para la caracterización e identificación de las
bacterias.
IV. Marco Teórico
Con el constante interés de estudio y análisis de las bacterias se han desarrollado
técnicas para visualizar cada una de ellas con sus respectivas morfologías, pero se
descubrió que con adicionar colorante a las mismas se podían apreciar aún más cada
una de sus estructuras y características de acuerdo al color que cada bacteria retenga
en su membrana externa, con esto descubierto se desarrolló el siguiente concepto.
Tinción: Es una técnica auxiliar utilizada en microscopía para mejorar el contraste en
la imagen vista al microscopio# $os diferentes colorantes pueden ser utilizados para
aumentar la definición y examinar grandes cortes de tejido, poblaciones celulares o
incluso para resaltar organelas dentro de células individuales.
TIPOS DE TINCIÓN:
Simples: el azul de metileno, por ejemplo: este tipo nos permite observar la existencia
de bacterias, su morfología, su agrupación, la presencia de esporos y la existencia de
otros tipos celulares
Diferenciales: por ejemplo, la coloración Gram y la Ziehl Nielseen, cumple la función
de la tinción simple y, además, permite la diferenciación de las bacterias porque usan
diferentes colorantes que se comportan distinto según el microorganismo en cuestión.
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La coloración Gram es la más usada en bacteriología. Son diferenciales, ya que se
dividen en Gram positivas y Gran negativas. Las primeras se tiñen de color azul
violeta y las segundas adquieren un color rosado o rojo.
Especiales o negativa: se usan para objetivar distintas estructuras como la cápsula,
el núcleo, los flagelos, los esporos, etc.
LA TINCIÓN DE GRAM
También conocida como coloración de Gram, es una técnica de laboratorio que se
utiliza rutinariamente en los estudios microbiológicos de las bacterias. Fue diseñada
por Christian Gram, un científico danés, en el año 1884. El objetivo de Gram era
conseguir una prueba con la que fuera posible diferenciar diferentes grupos de
bacterias para así poder estudiarlas y clasificarlas. La prueba resultó todo un éxito y
pronto se convirtió en una técnica muy útil no solo para el estudio de las bacterias,
sino también para poder identificarlas rápidamente en una infección y seleccionar el
antibiótico más adecuado para tratarla.
La técnica se basa en aplicar una serie de colorantes a una muestra de cualquier
origen (esputo, orina, pus, etcétera) que supuestamente contenga bacterias no
identificadas. Los colorantes tiñen la pared de las bacterias de color morado y, tras
unos minutos, se realiza un lavado del colorante. Después de eso puede que el
colorante permanezca en la pared bacteriana o que se haya ido. En el primer caso
permanecería el color morado, y se trataría de bacterias Gram positivas y, en el
segundo, la pared tendría un color rosado, y serían Gram negativas.
Limitaciones de la tinción Gram
Algunas bacterias no tienen pared, como por ejemplo las Chlamidias, y no se podrán
identificar, al igual que los virus. En esos casos la tinción no coloreará ningún germen.
Otro aspecto negativo de la prueba es que no puede identificar el tipo exacto de
bacteria responsable de la infección. Para ello es necesario realizar un cultivo
microbiológico que se acompaña siempre de un antibiograma para estudiar de forma
exacta el antibiótico más efectivo.
COLORANTES
Cristal violeta: (colorante catiónico) penetra en todas las células bacterianas (tanto
gram positivas como gram negativas) a través de la pared bacteriana.
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El lugol: es un compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de
potasio) y Sl (Siulterio), los cuales están presente para solubilizar el yodo, y actúan
de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared
de la célula bacteriana. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en
solución acuosa con el cristal violeta.
Alcohol acetona: sirve para realizar la decoloración, ya que en la misma es soluble
el complejo I2/cristal violeta. Los organismos gram positivos no se decoloran, mientras
que los gram negativos sí lo hacen.
Safranina: Para poner de manifiesto las células gram negativas se utiliza una
coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la
safranina o la fucsina. Después de la coloración de contraste las células gram
negativas son rojas, mientras que las gram positivas permanecen violetas.
GRAM + GRAM -
Cristal violeta Células color violeta Células color violeta
El lugol Se forma el complejo CV-L Se forma el complejo
Las células continúan CV-L
teñidas de color violeta Las células continúan
teñidas de color violeta
Alcohol Se deshidratan las paredes Eliminación por
acetona celulares. extracción de grasas de
Disminuye la las paredes celulares.
permeabilidad. Aumenta la porosidad.
El complejo CV-L no sale El complejo CV-L se
de las células que separa de la célula.
continúan teñidas de color
violeta
Safranina Células no descoloradas. Células descoloradas.
Quedan teñidas de color violeta. Se tiñen de color rosado.
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PARED CELULAR
Constituye la parte más importante de la célula procariota ya que salvo algunos
micoplasmas y arqueobacterias, parásitas intracelulares, todas las otras bacterias
presentan esta barrera de protección contra el ambiente, sin la cual las células
sufrirían lisis osmótica en ambientes en general hipo o hipertónicos (suelos, agua,
organismos).
Las bacterias se clasifican en dos grupos importantes:
Gram positivas
La pared de una célula Gram positiva está formada por una gruesa capa de unos 20
a 80 nm de espesor, en general formado por una única molécula de peptidoglicano o
mureína, ubicada por fuera de la membrana celular. Esta molécula que no aparece
en las células eucariotas, está formada por una malla de polímeros de dos
aminoazúcares: N-acetil-glucosamina (NAG) y de ácido N-acetil murámico (NAM)
unidas por enlaces β glucosídicos hidrolizados por una enzima conocida como
lisozima, contenida en las lágrimas, saliva (mecanismos de defensa primaria contra
infecciones microbianas
Gram negativas
La pared de una célula Gram negativa es más compleja, con capa de 2 a 7 nm de
grosor formada por peptidoglicano (5-10% del peso total de la pared) y se presenta
en forma de gel, más que como una capa compacta. Luego se encuentra la llamada
membrana externa de 7-8 nm constituida por lipopolisacáridos (LPS) con
lipoproteínas en la cara interna. Algunas de éstas, llamadas porinas, forman canales
de entrada y salida de sustancias de bajo peso molecular.
*Tipos de paredes procariotas
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*Comparación entre ambos tipos de paredes procariotas
Gram positiva Gram negativa
o Puede presentar más de 30 capas o Membrana externa: capa externa con
de peptidoglicano. son altamente lipopolisacáridos (LPS), interna unida al
sensibles a antibióticos β- peptidoglicano por lipoproteínas.
lactámicos (penicilina) o Porinas, proteínas que permiten pasaje
o Acidos teicoicos: le confieren carga de pequeñas moléculas al periplasma.
negativa a la pared (ribitol o glicerol o Proteínas de enlace periplásmicas que
fosfato) unen nutrientes, interactúan con
o Acidos lipoproteícos: fijan la pared a proteínas de transporte en la membrana
la membrana plasmática facilitando ingreso de nutrientes.
V. Procedimiento Experimental
a. Materiales, medios de cultivo y equipos
Cultivos bacterianos
- Caldo BHI
- Nutritivo
- Agar TSA
Porta y cubre objetos
Asa bacteriológica metálica
Mechero de alcohol
Colorantes básicos
- Cristal violeta
- Lugol
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- Alcohol acetona
- Safranina
Aceite de inmersión
Microscopio compuesto
Pinzas
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b. Metodología.
Preparación de frontis y fijación
i. Preparar perfectamente los portaobjetos. Secarlos con papel y etiquetarlos.
ii. Prender el mechero y esterilizar el asa en la flama del mechero hasta que se ponga
al rojo vivo.
iii. Dejar enfriar el asa para evitar que al tomar la muestra los microorganismos sean
destruidos. Después acercar al mechero el tubo de cultivo quitar el tapón y flamear
rápidamente la boca del mismo. Introducir el asa en el tubo de cultivo y tomar
cuidadosamente la muestra.
iv. Para el caso de cultivos líquidos, colocar la muestra en el centro del portaobjetos,
extenderla suavemente en un área circular de 2-3cm de diámetro aproximadamente
y esterilizar nuevamente el asa. Secar el frontis al mechero de alcohol suavemente
y repetir los procedimientos 3 y 4 por 2 veces más (liquido).
v. Si el cultivo es de medio sólido, previamente se colocará en el centro del
portaobjetos unas 2 gotas de agua destilada en la que se mezcla una pequeña
muestra del cultivo que se toma siguiendo las indicaciones del paso3. Extenderla
suavemente y dejar secar al mechero de alcohol, sin quemar a muestra.
Técnica de tinción diferencial Gram
i. Realizar frontis y fijación del cultivo
ii. Cubra el extendido con gotas de cristal violeta. Déjalo actuar por 1 minuto.
iii. Lavar cuidadosamente el frontis con agua de llave de caño para eliminar el exceso
de colorante.
iv. Cubra el extendido con lugol (solución de yodo). Durante 1 minuto, este actúa como
mordiente formando el complejo CV-l
v. Lavar cuidadosamente el frontis con agua.
vi. Descolore la preparación aplicando alcohol acetona gota a gota, durante 30
segundos. Inclinando el portaobjetos.
vii. Inmediatamente lavar con agua suavemente.
viii. Cubra el extendido con safranina, déjala actuar durante 30 segundos.
ix. Lave con agua, seque al mechero de alcohol suavemente y observe al microscopio
1000x de resolución con aceite de inmersión.
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VI. Resultados
Para realizar la técnica de tinción Gram. Seleccionamos 4 tubos en medio sólido: Uno de la
muestra del sarro dental (cultivo mixto) y los otros 3 de las colonias seleccionadas
anteriormente (cultivo puro). Seleccionamos 3 tubos en medio líquido: uno de la muestra
de mano (cultivo mixto) y los otros 2 tubos de las colonias seleccionadas anteriormente
(cultivo puro).
Los resultados que se observaron en el microscopio fueron:
Medio solido: Agar TSA Medio liquido: caldo nutritivo
Característica
Observaciones Característica Observaciones
o N° de tubo
o N° de tubo
Bacilo Gram
negativos, cocos,
Bacilos Gram negativo, la
Tubo N° 3 Tubo N° 4 aparentan ser cocos,
mayoría en cadenas.
Gram positivos en
racimos.
No se observó nada
Cocos Gram negativos, se
debido a que el
Tubo N° 5 observa que están muy Tubo N° 7
inoculo en el porta
juntos.
objetos es muy poco.
Se observa que están
teñidas de color rojo.
Tubo N° 6
Cocos y estreptococos Cocos en cadena,
Gram positivos. mano estreptococos Gram
Cocos, bacilos y positivos.
Sarro dental estreptococos Gram
positivo.
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VII. Discusión de Resultados
Los fundamentos de la técnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de
las bacterias Gram positivas y Gram negativas. La pared celular de las bacterias Gram
positivas posee una gruesa capa de peptidoglicano, en cambio en Gram negativas la capa
de peptidoglicano es delgada.
En la realización de este laboratorio presentamos inconvenientes con los tintes que se
usaron para a tinción Gram, estos no estaban bien elaborados.
La mala elaboración de los tintes nos dificulto en la observación y diferenciación de
bacterias Gram positiva y negativa.
En el cultivo mixto observamos que se encuentra cocos y estreptococos Gram positivos,
podemos decir que en la boca como en la mano encontramos bacterias Gram positiva.
VIII. Conclusiones
La tinción Gram es una prueba potente y rápida que nos permite diferenciar dos
clases de bacterias estas son: Bacterias Gram positivas y las Gram negativas.
Las Gram positivas se tiñen de morado ya que el colorante se queda atrapad en la
capa gruesa de peptidoglucanos que rodea a la célula.
Las Gram negativas tienen una capa de petidoglucano mucho más delgada es por
ello que no retiene el violeta cristal y por esto las células se tiñen con safranina y las
observamos rojas.
La técnica de tinción Gam Proporciona una información entre el microorganismo y
el medio que lo rodea, Permite el estudio de las estructuras internas de la célula
bacteriana.
IX. Recomendaciones
o En la elaboración de los tintes de Gram debería de haber una supervisión.
o Una mejora en los materiales de observación, como los microscopios. Solo un
microscopio tenía una cámara para visualizar y tomar fotografías.
o No tratar de tener mucho tiempo el portaobjetos en el mechero, porque se quemaría.
o Manipular de una manera eficiente el microscopio para obtener buenos resultados
o Realizar bien el frontis en el portaobjetos para no tener mucha carga de bacterias y
la visualización sea adecuada.
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X. Fuentes de información
Frioni, L. (2005). Microbiología Básica, ambiental y agrícola. Uruguay.
MONTOYA CAMPUZANO , O. I. (1999). MANUAL DE microbiologia. colombia.
rojas triviño , a. (2011). conceptos y prácticas de microbiología general. colombia.
I. Anexos
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II. Apéndice
a. Diagrama de flujo
Cubra el extendido Lavar Cubra el extendido
con gotas de cristal cuidadosamente el con lugol
violeta frontis con agua
Lavar Lavar
cuidadosamente el Descolore la preparación cuidadosamente el
frontis con agua aplicando alcohol frontis con agua
acetona gota a gota
Cubra el extendido Cubrir aceite de inmersión para la
con safranina observación en microscopio.
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