UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA
LA MOLINA
FACULTAD DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
INFORME 8
“ESPECTROFOTOMETRÍA ”
EJECUTORES:
● Blas Navarro, Christopher Jhamgler
● De la Cruz Yoshiura, Juan Shigeki
● Portella Campos, Paolo
● Villena Velezmoro, Maria Gracia
PROFESORA: Alvarez Chancasanampa , Hermelinda
La Molina,2018
I. INTRODUCCIÓN
Los análisis fisicoquímicos suelen estar apoyados en el empleo de instrumentos que
corresponden a los más variados principios físicos y químicos. entre ellas caben destacar las
técnicas espectrofotométricas, turbidimetricas, de absorción atómica, de emisión atómica,
cromatográficas( tanto en fase líquida como en fase gas líquido), electroforéticas, analitica
térmico diferencial y reológicas (Bello, 2000).
Según Bello (2000), el principio general en el que se basa cualquier técnica óptica radica en
aprovechar de modo cuantitativo, siempre bajo condiciones experimentales muy estrictas y
perfectamente controladas, los fenómenos de interacción que se dan entre las radiaciones y la
materia. ya sean átomos, moléculas o iones. En ellas se utiliza la absorción de la energía
radiante para el análisis de los alimentos y son técnicas que o han dejado de evolucionar hacia
instrumentos cada vez más perfectos y sofisticados.
La Espectrofotometría es una de las técnicas experimentales más utilizadas para la detección
específica de moléculas. Se caracteriza por su precisión, sensibilidad y su aplicabilidad a
moléculas de distinta naturaleza (contaminantes, biomoléculas, etc) y estado de agregación
(sólido, líquido, gas). Los fundamentos físico-químicos de la espectrofotometría son
relativamente sencillos. Según Nielsen (2009) esta técnica sugiere la medición de la cantidad
de energía radiante en forma de luz que absorbe un sistema químico en función de la longitud
de onda de la radiación, así como las mediciones por separado a una longitud de onda
determinada.
El presente informe tuvo por objetivo conocer algunos métodos de determinación
espectrofotométrica para alimentos líquidos y sólidos, en este caso específico, para determinar
el contenido de azúcares reductores por el método del DNS .
II. REVISIÓN DE LA LITERATURA
Ley de Lambert-Beer
Esta ley expresa la relación entre absorbancia de luz monocromática (de longitud de onda fija)
y concentración de un cromóforo en solución:
Figura 1: Representación esquemática de la ley de Lambert-Beer
Fuente: Herrera, 2017
La absorbancia de una solución es directamente proporcional a su concentración –a mayor
número de moléculas mayor interacción de la luz con ellas-; también depende de la distancia
que recorre la luz por la solución –a igual concentración, cuanto mayor distancia recorre la luz
por la muestra más moléculas se encontrará-; y por último, depende de ε, una constante de
proporcionalidad -denominada coeficiente de extinción- que es específica de cada cromóforo.
Como A es adimensional, las dimensiones de ε dependen de las de c y l. La segunda magnitud
(l) se expresa siempre en cm mientras que la primera (c) se hace, siempre que sea posible, en
M, con lo que las dimensiones de ε resultan ser M -1·cm-1. Este coeficiente así expresado, en
términos de unidades de concentración molar (o un submúltiplo apropiado), se denomina
coeficiente de extinción molar (εM). Cuando, por desconocerse el peso molecular del soluto, la
concentración de la disolución se expresa en otras unidades distintas de M, por ejemplo g·L -1,
las dimensiones de ε resultan ser distintas, por ejemplo g-1·L·cm-1, y al coeficiente así expresado
se denomina coeficiente de extinción específico (εs) (Abril et al., 2008).
La ley de Lambert-Beer se cumple para soluciones diluidas; para valores de c altos, ε varía con
la concentración, debido a fenómenos de dispersión de la luz, agregación de moléculas,
cambios del medio, etc.
El espectro electromagnético
El conjunto de radiaciones electromagnéticas se llama espectro electromagnético y es
conveniente agruparlas en regiones para poder conocer sus propiedades. En la figura 4 se
muestran las zonas del espectro según la clasificación más aceptada. Como se puede observar
la zona del visible (radiaciones percibidas por nuestro ojo) es muy pequeña en comparación
con la gran amplitud del espectro. Aunque hablamos de una radiación determinada (λ),
físicamente es imposible aislar dicha radiación. Siempre podremos obtener un rango de
radiaciones pequeño según la exactitud del dispositivo de selección (difractores de radiación y
filtros), pero nunca una sola. De la misma manera que no podemos obtener o aislar un punto de
una recta, sino un trozo pequeño (un conjunto de puntos) (Sosa y Sánchez, 2004).
Obtención de un espectro de absorción
El espectro de absorción es una representación gráfica que indica cantidad de luz absorbida (ε)
a diferentes valores de λ. A partir de una solución diluida de un compuesto, cuya absorbancia
máxima entra dentro del rango de medida del espectrofotómetro, se verá el valor de
absorbancia a diferentes longitudes de onda frente a un blanco que contenga el disolvente de la
solución de la muestra a caracterizar. A partir del espectro de absorción se obtendrá el valor de
λ al que el compuesto presenta la mayor absorbancia (λmax). Dicho λ se utilizará a la hora de
hacer determinaciones cualitativas y cuantitativas del compuesto. El espectro de absorción de
un cromóforo depende, fundamentalmente, de la estructura química de la molécula (Abril et
al., 2008).
Figura 2: Espectros de
absorción de tres pigmentos fotosintéticos cloroplastídicos.
Fuente: Abril et al., 2008
Espectrofotometría
Según Quezada (2007) varios métodos de análisis de material biológico se basan en hacer
reaccionar la sustancia, que se ha de analizar, con otras sustancias (reactivos) para producir una
solución coloreada, de tal forma que la intensidad del color pueda ser usada como una medida
de la concentración de dicha sustancia.
El método de análisis cuantitativo denominado espectrofotometría se basa en la capacidad de
las sustancias de absorber luz, a una longitud de onda determinada, en proporción directa a la
cantidad de materia presente. mediante el espectrofotómetro se obtiene una medida del valor de
la absorbancia de una muestra a determinada longitud de onda. Según Quezada (2007) los
espectrofotómetros presentan cinco componentes básicos:
● Una fuente de luz que puede ser de tungsteno, infrarroja o de luz ultravioleta,
dependiendo del espectro en que se trabajará (visible, infrarrojo, UV respectivamente).
una lampara comun de filamento de tungsteno emite una luz que, al pasar por un
prisma, se descompone en varios colores, como lo que ocurre al formarse un arco iris.
Cada color transmite o refleja una longitud de onda, el conjunto de todas estas
longitudes es el espectro de luz visible, el cual comprende valores desde 280 hasta 700
nm. el espectro de luz ultravioleta cubre longitudes de onda menores de 380 nm y el
espectro infrarrojo abarca longitudes de onda desde 750 nm hasta 2000 nm; estos dos
espectros son invisibles al ojo humano.
● Una celda o cubeta para la muestra
● Un detector para medir la intensidad de la luz transmitida (porcentaje de tramitancia,
%T) o absorbancia (Absorbancia ,A).
● Un sistema de lectura
Debido a la existencia de diferentes tipos de energía: de los electrones en sí, de los
movimientos vibracionales de las moléculas, de la rotación de las mismas,etc, las moléculas
pueden interaccionar con radiaciones electromagnéticas de un rango muy amplio de longitudes
de onda, dando lugar a distintos tipos de espectroscopías según las diferentes regiones (Abril,
2009) . Un esquema podría ser el siguiente:
Curva de Calibración
Denominamos espectro de una sustancia a la representación de absorbancia (A) en función de
longitud de onda (λ), este gráfico presenta ondulaciones con máximos y mínimos. Para hacer
las determinaciones cuantitativas se elige, en general, la longitud de onda correspondiente a un
máximo, pues el error de medición es mínimo y la sensibilidad máxima. Para verificar el
cumplimiento de la ley de Lambert-Beer, se debe realizar la curva de calibración; absorbancia
(A) en función de concentración (c), para lo cual se preparan soluciones de la sustancia de
concentraciones conocidas y se mide la absorbancia a la longitud de onda elegida (Brunatti y
Martín, 2010).
Figura 3: Curva de
calibración
Fuente: Brunatti y Martín, 2010
Método del ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS)
Según Nielsen (2009) el método de DNS (técnica de miller) es una técnica colorimétrica que
nos permite cuantificar los azúcares reductores presentes de forma natural en alimentos o bien
liberados por enzimas. Este método no es muy utilizado y determina las absorbancias en un
espectrofotómetro a 540 nm. Su mecanismo se basa en la reducción de DNS ( de color amarillo
a rojo ladrillo) por acción de glucosa u otros azúcares reductores.
Según Bello et al. (2006) El desarrollo de métodos analíticos es esencial en el seguimiento y
control del proceso de fabricación de azúcar y alcohol. En la Industria sucro-alcoholera es
común el empleo del método desarrollado por Eynon y Lane para la determinación de azúcares
reductores en mieles y caldos de fermentación de destilerías.
El método de Eynon-Lane tiene como principal inconveniente el ser un método volumétrico
donde el punto final de la valoración se detecta por cambio de color, además es un método
poco productivo. Sin embargo, ha demostrado ser exacto y preciso en la determinación de
azúcares reductores en mieles y baticiones de mieles (Bello, 2006).
Sumner y colaboradores desarrollaron otro método utilizando el ácido 3,5 dinitrosalicílico
(DNS) para calcular la concentración de azúcares reductores en distintos materiales. El
procedimiento se basa en una reacción redox que ocurre entre el DNS y los azúcares reductores
presentes en la muestra (6,7,8,9). Este método ha sufrido varias modificaciones a través de los
años para adecuarse al análisis de diferentes materiales y su principal ventaja radica en su alta
sensibilidad y productividad debido a que es un método espectrofotométrico.
El método del DNS no es recomendable utilizarlo para la determinación de azúcares reductores
en muestras intensamente coloreadas como mieles y caldos de fermentación que la contengan.
Estudios de Otero y colaboradores (1986) muestran dispersión en la determinación de azúcares
reductores en mieles por el método del DNS con la modificación de Miller.
III. MATERIALES Y MÉTODOS
❖ 3.1. Muestra Alimentaria
➢ Jugo de frutas
➢ Néctar de durazno
➢ Manzana verde de agua
➢ Manzana chilena
➢ Piña hawaiana
➢ Piña golden
❖ 3.2. Equipos
➢ Espectrofotómetro
❖ 3.3. Utensilios
➢ Papel Tissue
➢ Vaso Precipitado
➢ Papel Filtro
➢ Agua destilada
➢ Termómetro
❖ 3.4. Metodología
3.4.1. Preparación de la curva estándar
● Preparación
Cuadro 1. Preparación de las disoluciones
● Adición de reactivos cromóforos
Cuadro 2. Preparación para la lectura en el espectrofotómetro
● Para realizar la curva se tomó por triplicado cada solución y se incluyó un blanco; estos
puntos fueron sometidos a un análisis de regresión lineal que será expuesto en los
resultados
● Finalmente se pasó graficar la absorbancia en el eje de las ordenadas y concentración
(mg / ml de solución de glucosa)
2.4.2. Análisis de las muestras
● La muestra analizada fue diluida usando agua destilada.
● La muestra es diluida para dar una concentración final comprendida en la concentración
de la curva estándar preparada y se procede al igual que para las soluciones de la curva
estándar. Con la absorbancia obtenida se va a la curva estándar y se determina la
concentración de azúcares reductores expresados como glucosa.
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1 Curva de Calibración
Cuadro 3. Resultados de concentración y absorbancia tomado de la muestra de glucosa diluida
Gráfico 1. Concentración vs Absorbancia
Se observó que la concentración y la absorbancia promedio constituida por tres repeticiones se
encuentran en una relación del tipo lineal. El coeficiente de determinación expresado como (R²)
representa la variación en la variable , en este caso absorbancia, que se explica por la variable
X independiente, concentración, en el modelo de regresión (Berenson,et al. 2006). Por tanto,
bajo esa perspectiva se asume que la mayor parte de la variación de la absorbancia está ligada a
la concentración de la dilución de glucosa medida, siendo el sesgo error bruto de medición
reproducido por los ejecutores.
La determinación de la curva de calibración tiene como objetivo principal encontrar la
concentración de una muestra , partiendo de la medición de su absorbancia a la misma longitud
de onda y con base en ese valor, interpolar la concentración (Quesada,2007). Es por ello,que
mediante las diversas diluciones se halló una relación con la concentración y la absorbancia
medida.
Según Pino y Pérez (1983) la curva de calibrado es lineal, y esta característica depende de las
características intrínsecas de la técnica y de varios factores instrumentales.
Si se analiza la ecuación formada se concluye que el coeficiente 17.864 es el valor del
coeficiente de absortividad medido en cm-1 x mg-1x mL,teniendo presente que la longitud e la
cubeta fue de 1 cm y la longitud de onda fue de 550 nm. Bello et al. (2006) fundamento que
el coeficiente es alrededor de 0.613 mientras que Gonçalves et al. (2010), 0.423. La
notable diferencia con nuestro coeficiente puede explicarse en que para ambos casos
citados los autores emplearon longitud de onda de 540 nm ya que a esta longitud de
onda ocurre la absorción máxima según Garriga et al. (2017) representado en la
siguiente figura:
Figura. Absorción máxima en la prueba química DNS
Por otro lado también se podría justificar que la
curva no presente linealidad por completo
ya que la reacción del DNS y los azúcares
reductores son reacciones del tipo redox
endotérmicas y por tanto requieren una mol de
cada componente para reaccionar,si esta no es lo suficientemente pura no existe la reacción
completa provocando cambios en la linealidad de la curva.
4.2 Determinación de azúcares reductores
Lración de azúcares reductores,representados en mayor proporción por glucosa para las
muestras empleadas.
.
Cuadro 4. Concentración de azúcares reductores expresados como glucosa en la muestra determinados
por la curva de calibración
4.2.1. Manzana
Junto con la textura, el sabor es el atributo con más influencia sobre la aceptabilidad de
consumo en manzana (Stow, 1995).
A medida que el fruto madura y pierde su capacidad fotosintética, los azúcares se obtienen por
importación desde otras partes de la planta, o bien por hidrolisi de las reservas de almidón, cuyo
contenido es variable entre entre especies y entre variedades de la misma especie (Almenar,
2013). En la manzana los azúcares que están presentes son la glucosa, la fructosa como
azúcares reductores y la sacarosa un disacárido no reductor (Raigon et al. 2006)
Según Asif et al. (2004), las manzanas tienen 10.15% de azúcares reductores cuando están
almacenada en las primeras semanas a temperaturas controladas en el laboratorio, Sin embargo
Raigon et al. (2006), las manzanas de producción ecológica tienen 7.38 g de glucosa/100 ml,
mientras que las frutas que vienen de cultivo convencional tienen 3.48 g/100 ml, si es que
consideramos estos valores nuestros resultados estarían muy por encima. De acuerdo con los
valores obtenidos para las manzanas podemos encontrar valores de concentraciones de entre
15.9% para el caso de la manzana roja y 12.361 de manzana verde para los azúcares
reductores.
Los azúcares reductores también pueden variar en su porcentaje según el tipo de manzana por
lo que la cantidad de azúcares reductores va a estar influenciada por las condiciones de la fruta,
por ejemplo en las distintas variedades de manzana, los azúcares reductores encontrados son de:
53.39, 46.01 y de 55.12 mg/ml (Silveira et al, 2007).También se vio que el jugo de manzana
tiene 24.38 g de glucosa/L, cuando está en una destinado y procesado para la alimentación
(Correa et al, 2012). Para la producción industrial de sidra, los azúcares reductores de la
manzana deben disolverse en alcohol etílico, en este caso la concentración de azúcares
reductores es de 129.8 g de glucosa/L (Betancurt et al,2008). Así como también la cantidad de
azúcares reductores va a estar influenciada por cómo se realizó la dilución, y por los solventes
4.2.2. Pulp
El néctar de durazno analizado presentó un porcentaje de la concentración de azúcares
reductores, los cuales en su mayoría son glucosa, del 9.598%. La materia prima a
emplear juega un rol fundamental ya que existe una variación en el porcentaje de
azúcares reductores oscilando de 7 % a 20% como extremo superior (Ubeda, 2012) .
Ya que el néctar es de durazno se precisa que este consta de una composición media de
azúcares totales de 6-16%. De los cuales los más representativos son:glucosa (1.47%),
fructosa (0.93%) y sacarosa (6.66%) ( Herrero y Guardia (1992) ; Haro (2014)) . Esto
indicaría que del porcentaje global asumiendo una concentración de azúcares es de
0.343 mg/mL el 1.47% representa al porcentaje de glucosa que ha reaccionado
.Por otro lado, Lesser (2004) fundamenta que la composición de azúcares reductores
promedio en un néctar varía entre 7-8%, en dicha escala nuestro valor excede, esto
puede darse por un error en la dilución empleada o por inversión de la sacarosa en el
jugo debido a un mal almacenado.
4.2.3. Piña
Martínez (2015), señala que el contenido de azúcares reductores para diferentes variedades de
piñas fue de entre 2.92% y 3.21 % determinado a partir del método del ácido dinitrosalicílico.
Por otro lado el jugo de piña según Bleinroth (1987) en su madurez total puede alcanzar 18.2
grados Brix en su jugo. En adicción para esta fruta se conoce que el 88.8% de los sólidos
solubles corresponden a los azúcares totales; 59.4% de sacarosa y 29.4% de glucosa y fructosa;
esta información nos permite estimar el contenido de azúcares conociendo la cantidad de
sólidos solubles como un 5.5% de contenido de azúcares reductores totales.
De acuerdo con Ramírez y Pacheco (2011), el contenido de azúcares reductores presentes en
muestras de pulpa de piña es de 37.52% en base seca, obtenidos mediante el método de Lane y
Eynon (Método oficial AOAC 925.36), lo cual corresponde a un contenido en base húmeda
(85.8% de humedad) de 5.33% de azúcares reductores en muestras de pulpa de piña. Los
valores obtenidos para las piñas en estos casos es de azúcares reductores para las muestras de
piña en nuestra práctica para hawaiana y golden fueron 5.96 y 5.08 respectivamente, estos
valores se encontraron cercanos a los teóricos señalados anteriormente.
Ademas según Hernández y Sastre (1999), durante la maduración de los frutos los cambios más
acusados se producen en la fracción hidrocarbonada. El almidón se hidroliza dando azúcares
sencillos, lo cual se traduce en un aumento del color dulce, estos cambios indicarían que el
contenido de azúcares aumentaría a medida que se desarrolla la maduración del fruto, sin
embargo, podemos ver que en la práctica la concentración de azúcares reductores varía de
hawaiana y golden fueron 5.96 y 5.08 respectivamente, señalando el caso contrario en forma
aparente.
V. CONCLUSIONES
➢ La determinación de azúcares reductores se determinó con el ácido 3,5
dinitrosalicílico (DNS) hallando la concentración de azúcares en las muestras
alimenticias
➢ El porcentaje de concentración de azúcares reductores de la piña fue de 5.696%
➢ El porcentaje de concentración de azúcares reductores de la piña madura fue de
5.853%
➢ El porcentaje de concentración de azúcares reductores de la manzana roja fue
de 15.901%
➢ El porcentaje de concentración de azúcares reductores de la manzana verde fue
de 12.361%
➢ El porcentaje de concentración de azúcares reductores del néctar de durazno
pulp fue de 9.598%
VI. ANEXOS
Anexo 1. Resultados para la curva patrón
Anexo 2. Conversiones de mg de glucosa en los mL respectivos
Anexo 3. Cuadro de valores estadísticos para la absorbancia con respecto a
los volúmenes
Anexo 4. Cuadro de resultados para las muestras alimenticias
Anexo 5. Conversiones de mg de muestra en la dilución
Anexo 6. Flujo de determinación de azúcares reductores en jugos de caña de
azúcar usando el método DNS
Fuente: Gil et al., 2006
VII. BIBLIOGRAFÍA
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