INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS
BIOLOGICAS
LABORATORIO DE METODOS DE
ANALISIS
PRACTICA: Determinación de cafeína en
refrescos de cola por HPLC
ALUMNA: Maturano Téllez Ana Florencia
COLABORADOR: Mayen Banda Oscar
GRUPO: 5QV2
SECCION: I
PROFESOR: Arturo Rivas Farías
Fechas de realización: 15 y 29 de abril
Fecha de entrega: 13 de mayo
Situación escolar: Inscrita
Determinación de cafeína en refrescos de cola por HPLC
Objetivo extra: Calcular la imprecisión o por ciento de error relativo
Resultados
Tabla 1. Tiempos de retención y áreas bajo la curva en muestras y sustancia de referencia
Sustancia de Área bajo la
Promedio
referencia tR (min) curva [mg/mL] % E.R (cafeína)
Sustancia de Σ= 705106
referencia %DER=1 10,4 Estándar
[10.4mg/100mL] 2,533 710471 ΣtR= 2.504
2,467 695017
2,5 708905
2,517 705631
Σ= 1283766.67
Pepsi Kick
%DER=0.012 18,93 -0,1996
[0.0195%]
2,533 1298614 ΣtR= 2.499
2,483 1301232
2,483 1301454
Σ= 362629
Schweepers
%DER=1.07 5,34 -0,6389
[9g/100mL]
2,5 359555 ΣtR= 2.488
2,483 366999
2,483 361333
Σ= 639364.33
coca-cola light
%DER=0.503 9,43 -0,3993
[12mg/mL]
2,517 841885 ΣtR= 2.494
2,483 837490
2,483 841718
Preguntas extra.
1. ¿Cuál es la importancia de desgacificar la fase móvil y de filtrar la fase móvil y la
muestra?
En el instante que se abre una nueva botella de solvente para HPLC se expone el interior del
solvente a la atmósfera y empieza a acumular gases disueltos que se encuentran en la
atmósfera. El Oxígeno Disuelto que constituye el 21% de la atmósfera puede producir mayor
interferencia en los detectores de fluorescencia y electroquímicos. El Nitrógeno Disuelto es el
otro componente de la atmósfera que puede producir burbujas en la columna de HPLC y
cuando el solvente entra al detector produce picos falsos y desviaciones de la línea base. El
Dióxido de Carbono disuelto algunas veces puede ser la causa de los cambios de pH en el
sistema de solvente.
2. Menciona los métodos de desgasificación más frecuentemente utilizados en HPLC.
Existen cuatro métodos comunes usados para desgasificar solventes en HPLC previos a su uso:
Sonificación, Burbujear Helio, Desgasificación Electrónica en la Línea del Flujo y Desgasificación
al Vacío en Línea
3. ¿En que difiere la cromatografía en fase normal de la cromatografía de fase reversa
empleada, en cuanto a la fase estacionaria, fase móvil y orden de elución?
Cromatografía de fase reversa: el mecanismo de separación depende de interacciones
hidrofóbicas entre las moléculas de soluto en la fase móvil y el ligando hidrofóbico
inmovilizado en la fase estacionaria. La naturaleza actual de las interacciones de unión
hidrofóbica asume que la interacción de unión es el resultado de un efecto entrópico
favorable. Las condiciones iniciales de unión de la fase móvil usadas en la cromatografía de
fase reversa son acuosas lo cual indica un grado alto de estructuras de agua organizadas
alrededor de las moléculas de soluto y el ligando inmovilizado. A medida que el soluto se une
al ligando hidrofóbico inmovilizado disminuye el área hidrofóbica expuesta hacia el disolvente.
Así, el grado de organización de la estructura de agua disminuye con un favorable aumento de
entropía en el sistema.
4. Si se cambiara la composición de la fase móvil agua-metanol (35:65) a (25:75), ¿Qué
sucedería en cuanto al tiempo de retención, por qué?
Discusión de resultados HPLC
La máxima inexactitud permitida es igual a la máxima imprecisión permitida; La máxima
imprecisión permitida en el método de HPLC es menor a 1.5. El tiempo de retención esperado
de cafeína en la Coca-cola es el estándar, el cual es necesario saber este valor para realizar los
cálculos y como se puede observar, ninguna de nuestras muestras rebasa la máxima
inexactitud permitida; así con respecto al tiempo de retención de las muestras, podemos decir
que, en función a la cafeína obtenida, es que realmente estamos leyendo cafeína. Si
tuviéramos al menos un ± 5% de inexactitud, entonces no sería cafeína. La imprecisión nos
ayuda a decidir si las réplicas son confiables y el triplicado es confiable; el porciento de error
nos dice que es cierto que tenemos cafeína.
En los tres casos el signo es negativo, aunque dentro de la tolerancia, aquí ocurre una
tendencia ya que la cafeína de las muestras de refresco se retrasa en la columna menos que la
cafeína del estándar, aunque está dentro de la tolerancia esta misma sale más rápido. La
interpretación para esto es que no es un error al azar, ya que si así fuera, habría porcientos de
errores positivos, también, entonces podemos decir que es una cuestión sistemática, además
de estar relacionado con los otros componentes de las muestras. Sin embargo, el tiempo de
retención fue manual, no automática, pero el coeficiente de variación nos está indicando que
al momento de mover la palanca fue bastantes simultaneo, por eso tenemos baja dispersión.
El área bajo la curva es directamente proporcional a la concentración del analito y nos indica
cuanta cafeína hay; el área bajo la curva está relacionada con 10.4 mg por 100 mL. Entonces,
nos dieron diferentes los valores (al meter la muestra por triplicado), ya que pudimos haber
metido el asa en diferente posición, es decir, cuando hay un cambio de intra muestra o inter
muestra es de donde puede venir el producto. Para evitar el acarreo, es necesario colocar el
triple del volumen del asa o hasta 6 volúmenes, es decir 120 mL (si es de 20). Otro problema,
es que podrían ser que algo estaba diluyendo las muestras. Si no hubiera entrado el estándar a
nuestro máximo de erro permitido, los resultados no serían confiables.
Según la norma NOM-218-SSA1-2011 la concentración máxima permitida de cafeína es de 200
mg por L (20 mg en 100 mL), es decir la Pepsi kick tiene al menos unos 9 mg, lo que nos quiere
decir que compite con la Coca-Cola. El coeficiente de variación de la última muestra es bueno
ya que tiene los valores confiables.
Conclusiones.
La HPLC nos es útil para la separación de componentes y por medio de computadora
podemos observar los picos de absorbancia.
La muestra con mayor concentración de cafeína fue Pepsi Kick.
Por errores manuales, la muestra con el error relativo más alto es la Schweepers.
Bibliografía.
[Link]
lquidos-hplc
Cromatografía liquida de alta resolución-PDF
NORMA Oficial Mexicana NOM-218-SSA1-2011, Productos y servicios. Bebidas
saborizadas no alcohólicas, sus congelados, productos concentrados para prepararlas y
bebidas adicionadas con cafeína. Especificaciones y disposiciones sanitarias. Métodos
de prueba.
