GUIA PRACTICA DE BACTERIOLOGIA

Elaborado por: Br. Girene Hernández

 CONCEPTOS BASICOS

ASA o AGUJA BACTERIOLÓGICA: instrumento indispensable en el trabajo microbiológico, utilizado

en el transporte de pequeñas cantidades de material de inoculación en los medios de cultivo. El asa
o aguja de inocular están fabricados de alambre de platino o de alguna aleación de metales
altamente resistentes al calor y estos alambres están fijados en el mango de Kolle. Se llama asa
cuando el alambre termina en anillo cerrado y aguja cuando termina en punta.

ANTIBIOGRAMA: método in vitro que permite estudiar el comportamiento de las bacterias antes
concentraciones conocidas del agente antibiótico.

CALDO: medio de cultivo liquido con componentes orgánicos indefinidos (peptona, extractos de
órganos y tejidos, etc.).

COLONIA BACTERIANA: masa de desarrollo macroscópicamente visible, cuando se les inocula en

medios de cultivos adecuados, con una atmosfera favorable, e incubación de 18 a 24 horas.

CULTIVO PURO: población de células bacterianas provenientes de una única célula. Permite estudiar
las características propias del microorganismo.

Importancia del cultivo puro:

 Conservar cepas en congelación

 Liofilizar cepas
 Realizar test diferenciales
 Realizar antibiograma
 Observar características morfológicas

CULTIVO MIXTO: es aquel en el cual dos o más especies se desarrollan simultáneamente en el medio
de cultivo.

INCUBACION: es el periodo en el cual se debe proporcionar a los cultivos la temperatura y las

condiciones atmosféricas que favorezcan su desarrollo durante un tiempo determinado, estas
condiciones serán variables para cada grupo de microorganismos.

JARRAS GAS-PAK: sistema utilizado para el cultivo de bacterias anaerobias, en este se crea un
ambiente anaerofilico o de microaerofilia.

MEDIO DE CULTIVO: medio que suministra a las bacterias los elementos necesarios para su
multiplicación.

MEDIO FLUIDO: medios semisólidos con un contenido de agar igual o superior al 1%.

MEDIO SELECTIVO: es aquel que solo permite el crecimiento de un biotipo o unos pocos biotipos
entre los que se presentan en el inoculo.

MEDIO DIFERENCIAL: es aquel que permite la distinción entre tipos celulares próximos y
relativamente parecidos.

Elaborado por: Br. Girene Hernández

MEDIO DE ENRIQUECIMIENTO: es aquel que favorece más el crecimiento de un determinado
biotipo por encima de los otros presentes en el inoculo.

MEDIO GENERAL: es aquel que soporta el crecimiento de una amplia variedad de microorganismos
sin exigencias nutricionales especiales.

METODO DE LA GOTA COLGANTE: este método se emplea específicamente para constatar

mediante la observación microscópica si el microorganismo en estudio es móvil o no.

MIC (Concentración Inhibitoria Mínima): menor concentración de un determinado antibiótico

capaz de inhibir el crecimiento bacteriano. La MIC refleja la potencia del antibiótico y la unidad
utilizada es mg/L. Se puede realizar por metodologías de macrodilución, microdilución y grado de
difusión (E-Test).

MECHERO DE BUNSEN: instrumento capaz de generar fuego directo. Consta de un tubo de

combustión atornillado a una base por la cual entra gas combustible a través de un conducto. El
tubo, en su parte inferior, presenta agujeros por los que puede entrar aire. Una pequeña pieza
provista de orificios similares, se ajusta a la base del tubo, de modo que al girarla, los orificios de
entrada de aire pueden cerrarse o abrirse.

RESIEMBRA: cuando en el cultivo mixto, nos interesa estudiar un solo tipo de colonia, se procede a
extraer una pequeña porción con un asa de platino estéril procediendo a sembrarla en un medio de
cultivo idóneo, para de esta manera obtener un cultivo puro.

TINCION COMPUESTA: en este tipo de tinción se utilizan más de una sustancia tintorial. Los
colorantes se aplican a la preparación, separados o juntos, formando parte de una solución. En
consecuencia, se puede determinar algunas características propias de diversos órganos que
permiten diferenciarlo de los demás, por lo que también reciben el nombre de coloraciones
diferenciales. Un ejemplo de estas son la coloración de Gram y la coloración de Ziehl-Neelsen.

Elaborado por: Br. Girene Hernández

 MORFOLOGIA BACTERIANA

Tamaño

Por lo general, oscila entre 0,5 – 3 micras de diámetro y 1 – 6 micras de largo.

Disposición y forma

Cocos:

Un plano:

 2 cocos: DIPLOCOCOS
 4 – 20 cocos: ESTREPTOCOCOS

Dos planos:

 MICROCOCOS

Tres planos:

 SARCINA

Varios planos:

 ESTAFILOCOCOS

Células alargadas o bacilos:

 Morfología regular: BACILOS

 Si son bacilos cortos: COCOBACILOS
 Con algún extremo ensanchado: CORINEIFORME
 Curvos: VIBRIONES

Espirales o espiroquetas:

 Forma laxa (alrededor de 4 vueltas)

 Menos laxa (4 – 20 vueltas)

Elaborado por: Br. Girene Hernández

Elaborado por: Br. Girene Hernández
Elaborado por: Br. Girene Hernández
 COLORACIONES

COLORACIÓN DE GRAM

Esta coloración fue empleada por primera vez por el danés “Hans Christian Gram” en el año 1884,
de ahí su nombre.

Es la coloración más sencilla y útil empleada en el laboratorio de bacteriología. Es la coloración

DIFERENCIAL más comúnmente usada en el examen microscópico directo de muestras y cepas
bacterianas, debido a su amplio espectro de coloración.

La mayor parte de las bacterias se tiñen al principio con el cristal violeta y yodo, que forman
complejos insolubles dentro de la pared bacteriana. Las bacterias que poseen capas gruesas de
peptidoglucano en sus paredes celulares, y en consecuencia retienen la tinción después del
tratamiento con acetona y adquieren una tonalidad morada, se definen como “Grampositivas”. Los
microorganismos que tienen capas más delgadas de peptidoglucano, pierden con rapidez el
complejo por la acción de la acetona y por lo tanto se tiñen con el reactivo de tinción rosa
“Safranina” y se conocen como “Gramnegativas”.

 GRAM DE MUESTRA: morfología, afinidad tintorial y disposición.

 GRAM DE COLONIA: morfología y afinidad tintorial.

NOTA: la disposición solo se ve en el GRAM DE MUESTRA.

Fundamento técnico:

En el primer paso de la coloración, cuando los

microorganismos presentes en el frotis son
expuestos a la acción colorante de la violeta de
genciana, todos los géneros que se encuentran
en el frotis se tiñen de color violeta.

Al adicionar el lugol, no se produce ningún

cambio de color, ya que el lugol no es un
colorante, sino un mordiente, que se adiciona
con el objetivo de formar un complejo cristal
violeta – lugol, para fijar el colorante en la
bacteria.

Al adicionar el decolorante (alcohol acetona)

algunos géneros no son afectados por este
solvente, reteniendo por consiguiente el color
violeta aplicado inicialmente, en tanto que
otros son decolorados quedando la bacteria nuevamente incolora.

Elaborado por: Br. Girene Hernández

Al agregar finalmente la solución de safranina (que es de color rojo) las especies que no fueron
decoloradas, mantienen la coloración violeta ya que la safranina es un colorante más débil que la
violeta, mientras que los géneros que fueron decolorados por el alcohol, se tiñen con la safranina,
adquiriendo un color rosado o rojo.

Utilidad:

Su principal utilidad es que permite dividir las bacterias en dos grandes grupos:

1. Grampositivos: retienen el colorante primario “Cristal violeta”, por lo tanto se tiñen de color
violeta o violeta azulado.

2. Gramnegativos: pueden ser decolorados, perdiendo el colorante primario y

subsecuentemente toman el colorante secundario “Safranina”, tiñéndose de color rosado
o rojo.

El espectro que abarca la coloración de Gram incluye la mayoría de las bacterias, algunos hongos y
parásitos tales como Trichomonas spp., larvas de Strongyloides stercoralis y quistes de protozoarios.
Las excepciones incluyen:

 Mycoplasma spp. y Ureaplasma spp. (NO tienen pared celular)

 Chlamydia y Rickettsia spp. (demasiado pequeñas)
 Legionella spp. (solo se colorea después que crece en medio de cultivo)

También puede ser utilizada para diferenciar células epiteliales e inflamatorias, definiendo el estado
de infección y la calidad de la muestra.

Técnica:

1. Realizar un extendido del material para estudio, y permitir que se seque al aire.

2. Fijar el material al portaobjeto, pasándolo 3 o 4 veces a través de la llama del mechero. De

modo que el material no se lave durante el procedimiento de tinción.

3. Colocar el extendido en una rejilla para teñirlo y cubrir la superficie con solución de cristal
violeta.

4. Dejar actuar durante 1 min. y lavar con agua destilada o buffer.

5. Cubrir con la solución de Yodo para Gram por 1min. y lavar nuevamente con agua.

6. Cubrir con unas pocas gotas del decolorante alcohol acetona, 10 segundos o menos.

7. Lavar con agua corriente.

Elaborado por: Br. Girene Hernández

 8. Cubrir con safranina por 1min. y Lavar con agua corriente.

9. Ubicar el extendido en posición vertical para que se escurra el exceso de agua y seque.

10. Examinar al microscopio con obj. 100x (inmersión)

Apariencia del material clínico al microscopio:

 Grampositivos: azul – purpura

 Gramnegativos: rosado – rojo
 Hongos y levaduras: Grampositivos
 Células inflamatorias: Gramnegativas
 Células epiteliales: pueden aparecer como Grampositivos y/o Gramnegativos, dependiendo
del grosor.
 Nocardia y Actinomyces spp.: Grampositivos débiles.
 Fibrina, moco y eritrocitos: frecuentemente se colorean como Gramnegativos.

Blastoconidias gemantes

Algunos ejemplos de géneros bacterianos clasificados de acuerdo a su morfología y tinción de Gram:

Forma Grampositivos Gramnegativos

Staphylococcus Neisseria
Cocos Streptococcus Moraxella

Bacillus
Bacilos Listeria Enterobacteriaceae
Corynebacterium Pseudomonas
Clostridium

Elaborado por: Br. Girene Hernández

Comparación entre bacterias Grampositivas y Gramnegativas:

Grampositivas Gramnegativas
Capa gruesa de peptidoglucano en Capa fina de peptidoglucano.
forma de estratos.
Unidos al peptidoglucano: ácidos Membrana externa (fosfolípidos,
teicoicos y lipoteicoicos. lipopolisacarido y proteínas).

COLORACIÓN DE ZIEHL – NEELSEN

La coloración de Ziehl – Neelsen se emplea para teñir los Bacilos Acido – Alcohol Resistentes (BAAR),
estas bacterias tienen la propiedad de captar en su pared la fucsina fenicada (de color fucsia) y
retenerla aun con la acción de decolorantes, como la mezcla de ácido y alcohol. Esta característica
se debe al alto contenido en lípidos, particularmente a los ácidos micólicos, que poseen en la pared
celular. Así, utilizando una técnica adecuada es posible identificar al bacilo de la tuberculosis en la
muestra del enfermo como un bastoncito rojo – fucsia, sobre una coloración de fondo que facilita
su visualización.

Esta propiedad no es específica del bacilo de la tuberculosis, sino que la tienen todos los bacilos del
género Mycobacterium, aun las micobacterias ambientales y otros pocos microorganismos.

La coloración de Ziehl – Neelsen es la técnica más apropiada para ser utilizada en todos los
laboratorios de los países de América Latina. Es la recomendada por la Organización Mundial de la
Salud (OMS) y la Unión Internacional Contra la Tuberculosis y Enfermedades Respiratorias (UICTER),
por ser la que asegura resultados reproducibles con un entrenamiento sencillo y la más económica.

Fundamento:

Las micobacterias, como el Mycobacterium tuberculosis y otras especies susceptibles de ser

coloreadas por esta técnica, se caracterizan por tener una alta proporción de ácido micólico (lípidos)
en su pared celular. La acción del calor, introducido en este método, hace que la pared celular se
permeabilice y haga accesible la penetración de la fucsina, tiñéndose la pared celular. Al
normalizarse la temperatura de la preparación, el compuesto lipídico impermeabiliza la pared a la
acción del decolorante acido, con lo cual el microorganismo se mantiene teñido. El resto de las
especies, así como las células epiteliales y bronquiales, y artefactos, que no disponen de ácido
micólico en su pared o membrana, son decolorados, después de teñidos por la fucsina, tiñéndose
entonces con el colorante de contraste azul de metileno.

Elaborado por: Br. Girene Hernández

Técnica:

Preparación y fijación del extendido:

1. Rotular la lámina portaobjetos donde se realizara el extendido, en un borde de la lámina.

2. Tomar la muestra y lamina correspondiente y colocarlas detrás del mechero, de manera que
la llama quede entre el operador y el frasco con la muestra.
3. Con dos aplicadores de manera seleccionar la partícula más densa o purulenta de la muestra
de esputo. Si la muestra contiene varias porciones mucopurulentas, tratar de mezclarlas con
movimientos suaves con el palillo y luego tomar una porción de la mezcla.

¡La selección de la partícula más purulenta de la muestra es uno de los pasos más importantes para
aumentar la probabilidad de identificar los casos de tuberculosis mediante la baciloscopia!

4. Colocar la partícula seleccionada sobre el portaobjetos y extenderla con el aplicador con

movimientos suaves, circulares, tratando de dispensarla en forma homogénea en el centro
de la lámina. Sin llegar a los bordes para evitar que el operador se contamine al manipularla.
El grosor adecuado del extendido es el que permite ver pero no leer un texto impreso a
través del preparado.
5. Dejar secar el extendido a temperatura ambiente.
6. Tomar el extendido ya seco con una pinza manteniendo la cara que contiene la muestra
hacia arriba y pasarla rápidamente sobre la llama de un mechero 3 o 4.
7. Colocar la lámina fijada en un soporte para realizar la coloración.

Coloración:

8. Cubrir la totalidad de la superficie del extendido con fucsina básica fenicada recién filtrada.
Dispensar el colorante con suavidad, sin salpicar y sin tocar con el gotero o el embudo el
extendido
9. Con la llama de un hisopo embebido en alcohol calentar suavemente por debajo del
extendido, con movimientos de vaivén, hasta que se observe que se desprenden los
primeros vapores blancos. No calentar con mechero.
10. En el término de aproximadamente 5 minutos calentar 3 veces hasta la emisión de vapores,
esto es suficiente para que la fucsina penetre adecuadamente en el bacilo y se fije a sus
lípidos. No hervir la fucsina, esto puede alterar la morfología de las células bacterianas.
11. Con una pinza, levantar cuidadosamente la lámina portaobjetos desde el extremo más
cercano al operador. Enjuagar con abundante agua a baja presión, con un frasco o grifo.
Lavar muy suave y cuidadosamente la superficie eliminando totalmente la solución de
fucsina. Girar el extendido y lavar también la parte posterior.

Decoloración:

12. Cubrir la totalidad del extendido con solución decolorante y dejar actuar por 3 minutos.
13. Enjuagar con abundante agua a baja presión.
14. Eliminar el exceso de agua inclinando el portaobjetos.

Elaborado por: Br. Girene Hernández

Coloración de fondo o de contraste:

15. Cubrir todo el extendido con azul de metileno.

16. Dejar actuar durante 1 minuto.
17. Enjuagar la lámina por ambas caras con agua a baja presión.
18. Dejar secar a temperatura ambiente, apoyándolas en posición vertical en un soporte sobre
papel absorbente.

Observación microscópica y lectura de los extendidos:

Para la lectura se realiza con obj. 100x (inmersión).

Contar el número de campos que ha leído y el número de BAAR que ha identificado. Se puede utilizar
una cuadricula de 10 cuadrados x 10 cuadrados, que representa los 100 campos microscópicos,
como ayuda para registrar la cuenta.

5 3 4 0 2 3 2 4 1 0

Para calcular el promedio de BAAR encontrados por campo, sumar el total de BAAR contados y
dividir ese total por el número de campos observados. Cuando los bacilos se presentan agrupados,
una estimación aproximada del número de bacilos presentes en el cumulo es suficiente para calcular
este promedio.

Ejemplo:

52 bacilos contados/ 100 campos = 0,5

Reporte: <1 BAAR por campo

Elaborado por: Br. Girene Hernández

En la baciloscopia (BK) se cuentan cuantos bacilos se observaron en un campo útil. En el pasado se
debían contar 100 campos, hoy se toman en cuenta los siguientes criterios:

Promedio de BAAR Número mínimo de campos

encontrados útiles a examinar
Ninguno 100 campos
<1 por campo 100 campos
1 – 10 por campo 50 campos
>10 por campo 20 campos
1 – 9 en todo el extendido 100 campos

Esto quiere decir:

 Si se observan de 1 – 10 bacilos por campo hasta llegar a 50 campos, se cuenta hasta ahí.
 Si se observan más de 10 bacilos por campo, solo cuento hasta llegar a 20 campos.
 Si no observo ninguno bacilo por campo debo seguir leyendo hasta los 100 campos.

¿Campos microscópicos útiles?:

Los campos leídos en la BK deben ser “Campos microscópicos útiles”. Se considera campo
microscópico útil a aquel en el cual se observan células bronquiales (leucocitos, células ciliadas) o
fibras mucosas, que aparecen teñidas de azul. Por lo tanto, un campo microscópico se puede
considerar útil si cumple la siguiente norma:

>40% de Células bronquiales

<10% de Células epiteliales

Los campos sin elementos no deben ser considerados para contar el total de campos observados,
A MENOS que CONTENGAN BAAR.

¿Menos de 5 BAAR en 100 campos observados?:

¿Qué procedimiento se debe seguir frente al hallazgo de menos de 5 BAAR en 100 campos
observados?:

Debido a la posibilidad de que se trate de artefactos de coloración, se recomienda:

 Ampliar la lectura a 200 campos

 Si con esa lectura no se cuentan más bacilos, hacer otro extendido de la misma muestra,
tratando de elegir partículas purulentas.
 Si la lectura del segundo extendido no modifica el resultado anterior, la muestra debe
informarse con el número exacto de bacilos observados, y solicitar una nueva muestra.

Elaborado por: Br. Girene Hernández

Informe de los resultados:

El informe utilizando la escala semicuantitativa estandarizada asegura la reproducibilidad de los

resultados y permite evaluar:

 La gravedad de la enfermedad
 Infectividad del paciente
 Evaluación del paciente bajo tratamiento

La siguiente es la escala adoptada internacionalmente para el informe de los resultados de

extendidos examinados por la técnica de Ziehl – Neelsen:

Resultado del examen microscópico Informe

No se encuentran BAAR en los 100 campos No se observaron Bacilos Acido-Alcohol
observados Resistentes en la muestra analizada
Se observan de 1 – 9 BAAR en 100 campos Número exacto de bacilos en 100 campos
observados observados
Se observan de 10 – 99 bacilos BAAR en 100 Positivo (1+)
campos observados
Se observan de 1 – 10 BAAR por campo en 50 Positivo (2+)
campos observados
Se observan >10 BAAR por campo en 20 Positivo (3+)
campos observados

COLORACIONES SIMPLES

Son aquellas en la que los microorganismos se tiñen con un solo colorante y sin empleo de
mordientes. Lac bacterias se teñirán en relación a la sustancia colorante empleada.

Las tinciones simples se utilizan cuando se desea teñir rápidamente un microorganismo, utilizando
fundamentalmente para observar su morfología.

Los colorantes generalmente empleados para este fin son:

 Cristal violeta
 Azul de metileno
 Safranina

Elaborado por: Br. Girene Hernández

 MEDIOS DE CULTIVO

Para el cultivo in vitro de los microorganismos es necesario la preparación de medios especiales, con
el fin de que sean utilizados como nutrientes. Estas sustancias nutritivas en su conjunto son llamadas
“Medios del cultivo”. Estas son sustancias o mezclas de sustancias naturales o artificiales que
proporcionan a los microorganismos los principios nutritivos necesarios para su desarrollo y
reproducción.

Entre los principales componentes de los medios de cultivo, se encuentran: agar, peptona, extracto
de carne, extracto de levadura, sangre, plasma, suero, bilis, carbohidratos, etc.

Además, deben reunir ciertas condiciones, sin las cuales no es posible obtener resultados confiables
en el laboratorio, entre ellas:

 Contenido nutritivo apropiado

 Que el oxígeno sea aprovechado de acuerdo con los requerimientos del microorganismo
 Cierto grado de humedad
 pH apropiado (alrededor de 6,8 – 7,2)
 Temperatura conveniente
 Esterilidad absoluta

Para que un medio de cultivo resulte eficaz, sus componentes deben responder a las exigencias
nutricionales de las especies que se pretenden cultivar. Debido a que existen diferencias en los
elementos constitutivos de cada género o especie, así como en sus actividades metabólicas y los
mecanismos para obtener los nutrientes, se comprenderá que no haya un medio de cultivo
estándar que posibilite el desarrollo de todas las especies, existiendo por lo tanto una amplia
variedad.

Objetivos a lograr con el uso del Medio de cultivo:

 Aislar colonias puras a partir del medio de cultivo.

 Identificar y clasificar al microorganismo aislado, de acuerdo a aspectos morfológicos

(macroscópico de la colonia y microscópico – tintoriales) y aspectos fisiológicos (por
ejemplo; producción de ácido y gas en medios de fermentación de carbohidratos).

 Conservar indefinidamente las distintas especies bacterianas, ya sea por repiques sucesivos
o liofilización. Con la ventaja de disponer en un momento determinado algunas de ellas, ya
sea para estudio – investigación, preparación de antígenos, de vacunas (por ejemplo:
Haemophylus influenzae), antitoxinas (por ejemplo: Clostridium tetani), entre otros.

 Facilitar la producción de alguna sustancia determinada, por los microorganismos. Ejemplo:

Penicilum notatum productor de penicilina.

Elaborado por: Br. Girene Hernández

  Facilitar la replicación de virus, específicamente en este caso a los medios de cultivo se les
denomina “Medios o Líneas celulares”.

Clasificación de los Medios de cultivo:

Según su composición:

 EMPIRICOS: presentan en su composición sustancias orgánicas. Son llamados también

“Medios naturales”.

 SINTETICOS: presentan sustancias químicas definidas.

 SEMI-SINTETICOS: contienen moléculas naturales hidrolizadas.

Según su estado físico:

La consistencia del medio de cultivo se logra con la adición a la fórmula de un compuesto

denominado “Agar”.

Agar en malayo significa jalea. Es una sustancia mucilaginosa que se obtiene de algas pertenecientes
al grupo Agarofitas que comprende los géneros: Gellidium, Pteraloida, Gracilaria y Acanthopeltis.
Las paredes de la planta posee una capa interna de celulosa y otra más externa de sustancias
pécticas. Para la producción de agar se extraen las capas pécticas ricas en agarosa y agaropectina,
para ser procesadas industrialmente, siendo comercializado en forma deshidratada.

Bioquímicamente se trata de un éster sulfúrico de una molécula lineal galactano que es insoluble
en agua fría pero soluble en agua caliente. Una solución de 1,5% de Agar, forma un gel firme entre
32 – 39°C, que no se funde por debajo de 85°C.

 SOLIDOS: son medios de cultivos que contienen en su composición alrededor de 1,5% de

Agar, cantidad suficiente para la gelificación del medio. La solidez proporcionada por el Agar
impide a los microorganismos su migración en el cultivo por lo que se multiplican en un
mismo sitio, dando lugar a un cumulo de millones de descendientes que forman sobre el
cultivo estructuras macroscópicas denominadas colonias de diferentes formas, aspectos y
tamaños. Cada género y especie producirá un tipo de colonia con caracteres diferentes, que
permitirán al investigador orientarse hacia la identificación ulterior de la especie. Ejemplos:
Agar sangre, agar chocolate, agar GC, agar McConkey, agar S-S, entre otros.

 SEMISOLIDOS: estos medios contienen un porcentaje de Agar menos que el empleado para
los medios solidos (<1%), lo que facilita una mayor migración de sustancias y la movilidad
de los gérmenes. Ejemplos: Medio Cary-Blair, Agar semisólido para motilidad.

Elaborado por: Br. Girene Hernández

  LIQUIDOS: no contienen agente solidificante. También son llamados “Caldos de cultivo”. Los
medios líquidos NO contienen Agar, siendo trabajados en forma de caldo. Los
microorganismos desarrollados en medios líquidos, se mueven con libertad y su desarrollo
provoca la formación de un enturbiamiento difuso o sedimento visible. Ejemplos: Caldo
Selenito, Agua peptonada alcalina, Caldo lactosado, entre otros.

Según el uso al cual se destina:

 MEDIOS ENRIQUECIDOS: presentan nutrientes enriquecedores. Permiten el desarrollo de

microorganismos exigentes. Se utilizan con el propósito de favorecer el desarrollo de una
especie determinada que por encontrarse en pequeñas cantidades en la muestra,
conjuntamente con otras especies que se hayan en mayor proporción, se encontrarían en
desventaja si la colocamos en un medio de cultivo, donde se puedan desarrollar ambas. Los
medios de enriquecimiento satisfacen los requerimientos nutricionales del germen objeto
de estudio, al mismo tiempo que no favorece las necesidades esenciales del resto. Ejemplo:
El Caldo Selenito, en la investigación del coprocultivo favorece el desarrollo de los géneros
Salmonella y Shigella, dificultando al mismo tiempo el de otras bacterias entéricas
predominantes en la muestra.

 MEDIOS DIFERENCIALES: contienen colorantes, azucares e indicadores, con el fin de

provocar una respuesta bioquímica conocida. En este tipo de medio de cultivo se pueden
desarrollar sin dificultad diferentes especies bacterianas. Se utiliza para diferenciar la
especie desarrollada por las reacciones bioquímicas que genera su actividad metabólica, lo
cual es determinado por cambios y reacciones evidentes que de manera específica produce
cada especie en el medio de cultivo, cuyas diferencias permiten encaminar la investigación
hacia su identidad. Ejemplo: Medio de Kligler.

 MEDIOS SELECTIVOS O INHIBIDORES: sirven para aislar un microorganismo en particular,

inhibiendo al resto de la flora bacteriana acompañante. Por lo general, resultan específicos
para un solo tipo de germen al no poder desarrollarse en ellos ningunas de las demás
especies, por las características del medio. Ejemplos: Agar Manitol Salado, Agar S-S
(Salmonella – Shigella), entre otros.

 MEDIOS DE TRANSPORTE Y MANTENIMIENTO: medios no nutritivos, semisólidos, muy

reductores, inhiben las reacciones enzimáticas acetodestructivas dentro de la célula
bacteriana. No potencian el crecimiento excesivo. Ejemplos: Medio Cary-Blair, Medio
Stuart, entre otros.

 MEDIOS DE USO GENERAL: soportan el crecimiento de una variedad de microorganismos

sin exigencias nutritivas especiales. Ejemplo: Agar Tripticasa Soya.

 MEDIOS PARA FILTROS DE MEMBRANAS: permiten el examen de grandes volúmenes de

líquidos con una población muy baja de microorganismos. No existe interrupción del ciclo

Elaborado por: Br. Girene Hernández

 de crecimiento bacteriano aunque se separe el microorganismo del medio de cultivo o se
traslade de un medio de cultivo a otro.

Posibles fallas en la preparación y manipulación de los medios de cultivo:

 Apelmazamiento de los medios de cultivo:

 Conservación en atmosfera excesivamente húmeda
 El envase ha permanecido abierto demasiado tiempo
 Si se utilizó un medio de cultivo deshidratado, este estaba vencido
 El envase no quedo suficientemente cerrado después de su uso

 Desviación del valor de pH:

 Se utilizó agua no neutra
 El medio de cultivo fue sobrecalentado durante su preparación
 Si se utilizó un medio de cultivo deshidratado, este estaba vencido

 Punto de solidificación demasiado elevado:

 Excesiva proporción de medio de cultivo deshidratado
 Utilización de Agar – agar inadecuado

 Escasa estabilidad del Gel:

 Proporción demasiado pequeña del medio de cultivo deshidratado
 Disolución incompleta
 Sobrecalentamiento durante la preparación del medio de cultivo, sobre todo en los
casos de pH demasiado bajo
 El medio de cultivo se agito insuficientemente en su recipiente de preparación,
cuando fue vertido en las placas

 Desviación del color del medio de cultivo:

 Valor erróneo del pH, en el caso de medios de cultivo que contengan indicador de
pH
 Sobrecalentamiento del medio de cultivo durante su preparación, evidenciado
posteriormente por un medio de cultivo oscuro, pigmentos alterados, azúcar
caramelizado
 El recipiente en el cual se hizo la preparación, no estaba suficientemente limpio

 Medios de cultivos contaminados:

 Esterilización insuficiente
 Contaminación accidental posterior a la esterilización

 Crecimiento de microorganismos demasiado pobre:

Elaborado por: Br. Girene Hernández

  Presencia de residuos de sustancias inhibidoras de crecimiento, ya sea en los
recipientes de preparación o cultivo (ejem: detergente), en el agua de preparación
o en el material de ensayo
 Gérmenes ya encontrados en el material de ensayo
 pH incorrecto, que afecta el crecimiento de microorganismo
 medio cultivo sobrecalentado durante su preparación

 Crecimiento de microorganismos demasiado intenso:

 Medios de cultivo sobrecalentado durante su preparación, con la subsiguiente
destrucción de sustancias inhibidoras selectivas

 Crecimiento atípico:
 Medio de cultivo erróneo defectuosamente preparado
 Medio de cultivo deshidratado vencido
 El medio de cultivo ha sido almacenado durante un tiempo excesivo, envejeciendo
o deteriorándose
 Condiciones de cultivo no relacionadas con las normas establecidas
 Residuos de sustancias extrañas, ya sea en los recipientes de preparación o de
cultivo, en el agua o en el material de ensayo

Guía general para la preparación de Medios de cultivo:

 Elegir el medio de cultivo adecuado.

 Pesar los componentes del medio y añadir el volumen de agua destilada necesaria.
 Disolver los componentes ya pesados, calentándolo y agitándolo constantemente.
 Esterilizar el medio, después de preparado. Generalmente en autoclave a 121°C durante 15
minutos, para volúmenes de un litro y medio.
 Bajar la temperatura del medio, una vez extraído del autoclave, si se necesita añadir
suplementos.
 Llevar un control de esterilidad y crecimiento.

Elaborado por: Br. Girene Hernández

SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS EN MEDIOS DE CULTIVO

Para el aislamiento de cultivos puros en el medio de cultivo, se requiere realizar una adecuada
siembra (Inocular de manera aséptica la cepa bacteriana u otro microorganismo en el medio de
cultivo preciso). Esta depende de las características fisiológicas del microorganismo que se quiere
aislar, por ejemplo, requerimientos de oxígeno.

La siembra microbiológica es un procedimiento técnico que consiste en colocar una pequeña

fracción o volumen de la muestra, sobre o dentro, de uno o varios medios de cultivo que contengan
los nutrientes necesarios para las especies que presuntivamente contiene la muestra, con la
finalidad de que pueden desarrollarse adecuadamente, para facilitar su estudio y posterior
identificación. El número de células microbianas que se encuentran en el volumen o fracción
sembrada se denomina inoculo.

Instrumentos de siembra:

Los instrumentos de siembra son los objetos empleados para tomar el volumen o fracción de la
muestra y sembrarla en el medio de cultivo.

Aguja bacteriológica:

Consiste en un fino alambre recto, de platino o nicrón, que tiene aproximadamente una longitud de
7cm, el cual se encuentra insertado por uno de sus extremos a un cabo metálico, el cual sirve para
que el manipulador pueda tomar en su mano este instrumento de siembra.

Tanto el platino como el nicrón tienen la propiedad de calentarse rápidamente y ponerse al rojo
vivo, cuando son expuestos directamente a la llama de un mechero y de enfriarse a los pocos
segundos, después de haber sido retiradas de esa fuente de calor. Esta característica se aprovecha
en el trabajo diario del laboratorio, para esterilizar en pocos segundos este instrumento en cada
ocasión en que se requiere su uso.

Elaborado por: Br. Girene Hernández

Asa bacteriológica:

Es similar en todos los aspectos a la aguja, con la diferencia de que el extremo terminal del alambre
de platino o nicrón, en lugar de ser recto, forma un pequeño círculo en el extremo, con un diámetro
de 4 a 5mm. El método de esterilización es igual al empleado por la aguja.

Espátula de Drigalski:

Puede ser metálica o de vidrio fusible. Al igual que la aguja y el asa, cuando son metálicas, consisten
en un alambre de platino o de nicrón insertado a un cabo metálico, pero con la particularidad de
que el extremo terminal tiene la forma de un triángulo. Se esteriliza a la llama del mechero igual
que la aguja y el asa.

La espátula de Drigalski de vidrio fusible, consiste en un tubo

fino de varios milímetros de diámetro por unos 12cm de largo,
el cual esta doblado por uno de sus extremos en forma de un
triángulo equilátero, que mide unos 2cm por cada uno de sus
lados. Para su esterilización la parte triangular de la espátula se
introduce en un recipiente que contenga alcohol y de
inmediato se aproxima a la llama para que se encienda y flamee
el triángulo de la espátula. Cuando la llama se apague, se debe
esperar unos segundos para que se enfrié y en esas condiciones utilizarla en la realización de la
siembra.

Pipeta:

Las pipetas utilizadas como instrumentos de siembra, deben ser previamente esterilizadas en
autoclave y estar provistas de un bulbo de caucho por su parte posterior, similar a las empleadas en
los goteros. Las más utilizadas en el trabajo diario son las de “Pasteur”.

Elaborado por: Br. Girene Hernández

Hisopos:

Consiste en un fino aplicador, generalmente de madera, con una pequeña mota de algodón
adherida a uno de sus extremos. Los hisopos, una vez confeccionados, deben ser colocados en el
interior de tubos de ensayo de tamaño apropiado, taponeados y re-tapados antes de proceder a su
esterilización en autoclave. Cuando se emplean para tomar las muestras, casi siembre se utilizan a
continuación para realizar la siembre en el medio de cultivo.

Métodos de siembra:

El método de siembra a emplear dependerá de los objetivos que se pretendan alcanzar con el
cultivo, ya que en ocasiones se requiere que el desarrollo del microorganismo se produzca de forma
masiva, mientras que en otras resulta indispensable que las colonias queden aisladas o que las
manifestaciones del metabolismo tengan lugar con tensiones reducidas o privadas de oxígeno, los
métodos de siembra más empleados son los siguientes:

1. Siembra por estrías

2. Siembra por punción
3. Siembra masiva

Siempre que se utilicen instrumentos de siembre de platino o nicrón, deben ser calentados en la
llama del mechero hasta el rojo vivo, antes y después de realizar la siembra, con el objetivo de
destruir a los microorganismos contaminantes de la superficie del instrumento.

Con independencia del tipo de medio y el método de siembra a emplear, esta debe realizarse en las
proximidades de la llama del mechero ya que el calor emanado reduce el número de
microorganismos presentes en sus inmediaciones, lo cual es utilizado como un recurso a favor del
proceder aséptico.

Elaborado por: Br. Girene Hernández

Siembra por estrías:

Este método de siembra se realiza sobre la superficie de los medios de cultivo solidos distribuidos
en placas de Petri o en tubos de ensayo solidificados en forma de cuña (Slam).

Ejemplos;

Siembra en medios sólidos en cuñas (tubos de ensayo):

A) Trazando una línea perpendicular desde fondo hacia arriba.

B) Deslizando el instrumento con el inóculo de abajo hacia arriba en forma de zig-zac.
C) Roturando el medio

Siembra por agotamiento en placa de Agar:

Elaborado por: Br. Girene Hernández

Siembra por diseminación cruzada o técnica del asa calibrada:

Inóculo inicial Estrías secundarias

Para esta técnica se emplea un asa bacteriología que tiene 4mm de diámetro. Su mayor aplicación
es para el urocultivo, un método cuantitativo en el cual se deben contar las colonias aisladas. El asa
calibrada puede contener 0,001ml de orina, por lo tanto, el número de colonias se multiplicara 1000
veces.

Por ejemplo;

50 colonias contadas x 1000= 50.000 UFC/ml de orina

Cuando la cantidad de colonias es incontable se reporta: >100.000 UFC/ml de orina.

Siembra por punción:

El instrumento de siembra a emplear será la aguja bacteriológica y el medio de cultivo sólido,

generalmente, en tubo de ensayo. Las manipulaciones y las observaciones de las precauciones de
asepsia son similares que cuando se utiliza el asa. La particularidad que tiene este método, es que
la aguja (con el inoculo) debe atravesar perpendicularmente el medio de cultivo.

Elaborado por: Br. Girene Hernández

Siembra masiva:

Cuando se desea realizar una siembra masiva se puede utilizar la espátula de Drigalski. En
este caso la gota de muestra liquida se esparce con la espátula por toda la superficie del medio de
cultivo solido imprimiendo un movimiento en espiral. La siembra masiva también se puede realizar
con un hisopo grueso embebido de un cultivo líquido, procediendo a su deslizamiento sobre toda la
superficie de una placa de agar.

Espátula de Drigalski Hisopo

Manifestaciones del crecimiento bacteriano:

En medios de cultivo líquidos:

En general, el crecimiento se manifiesta por turbidez, la cual podrá opacar todo el cultivo o darle un
aspecto granuloso o nebuloso.

Izq: sin inocular, Dcha: con crecimiento

Elaborado por: Br. Girene Hernández

En medios de cultivo solidos:

Como la bacteria se encuentra impedida de desplazarse por la solidez del medio, al multiplicarse en
un punto específico, sus descendientes que alcanzan magnitudes millonarias en menos de 24 horas,
ocasionan agregados bacterianos, que dan lugar a estructuras visibles de diferentes formas,
aspectos y colores, denominadas colonias bacterianas, cuyos caracteres serán típicos para cada
género o especie.

Elaborado por: Br. Girene Hernández

 MEDIOS DE CULTIVO MAS EMPLEADOS EN EL LABORATORIO DE
BACTERIOLOGIA

Agar para bacteriología

Agar – Agar purificado, de tipo americano, que cumple las especificaciones USP/NE XX y APHA
especialmente indicado para la preparación de medios de cultivo. Las soluciones al 1,5% dan geles
suficientemente consistentes para poder hacer estrías en superficie.

Sus características más importantes son:

 Punto de fusión: 85°C

 Temperatura de gelificación: 34°C
 Tiempo de disolución: 1min a 100°C
 Humedad: 10%
 pH de la solución al 1,5% después de esterilizar: 6,8

Agar Sangre

Es un medio enriquecido, sin inhibidores que permite el crecimiento tanto de bacterias

“Grampositivas como Gramnegativas”. Los hongos también pueden desarrollarse.

Composición:

 Infusión de musculo de corazón

 Extracto de levadura
 Cloruro de sodio
 Agar base
 Digerido pancreático de caseína

Fundamento:

 La infusión de musculo de corazón y

la peptona de caseína proporcionan
una fuente de nitrógeno, carbono,
aminoácidos y proteínas.
 El extracto de levadura provee vitaminas y
aminoácidos esenciales.
 El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico.
 El Agar base es usado como agente solidificante.

Elaborado por: Br. Girene Hernández

Utilidad:

El agar sangre aporta muchos factores de enriquecimiento. Se usa también para ver la capacidad
hemolítica de los microorganismos patógenos (que es un factor de virulencia).

Resultados:

Los Streptococcus spp. β-hemolíticos presentan colonias translucidas y opacas, grises, pequeñas y
mucoides con una zona de aclaramiento alrededor.

Las colonias de neumococos se observan placas, lisas, translucidas, grisáceas y algunas mucoides,
rodeadas por una pequeña zona verdosa (α-hemolisis).

Las colonias de Staphylococcus spp. tienen una apariencia opaca, de color blanco o amarillo y
rodeadas de una zona transparente (β-hemolisis).

Elaborado por: Br. Girene Hernández

El patrón de reacciones hemolíticas puede variar dependiendo del tipo de sangre utilizada.

Agar chocolate

El agar chocolate se obtiene agregando sangre de carnero a una base de agar enriquecido que se
encuentre a una temperatura lo suficientemente alta (alrededor de 80°C) como para lisar los
hematíes y liberar el factor V y Factor X.

La preparación de medios selectivos a partir del agar

chocolate se consigue fácilmente con la adición de los
inhibidores adecuados. Así por ejemplo, para
conseguir el agar Thayer – Martín selectivo para
Neisseria basta añadir al agar chocolate antes de
solidificar una mezcla estéril que contenga
Vancomicina, Nistatina y Colistina, en este medio
se desarrollan muy bien Neisseria meningitidis y
Neisseria gonorrheae consiguiéndose eliminar la
mayoría de contaminantes indeseados oxidasa
positivos.

Composición:

Hoy en día la mayoría de los laboratorios compran el agar chocolate y otros medios bacteriológicos
que ya vienen preparados y liofilazados para reconstituir. El “Agar chocolate” preparado
comercialmente contiene:

 Una mezcla sintética de hemina (factor X) y un coctel de factores de desarrollo

químicamente definidos (Factor V, Vit. B12, minerales como hierro y magnesio, cisteína,
glutamina y glucosa) agregados a una base de agar GC (para gonococos).

Elaborado por: Br. Girene Hernández

El Agar GC base contiene:

 Digerido de proteína – peptona

 Almidón de maíz
 Buffers monobásicos y dibásicos
 Cloruro de sodio
 Agar – Agar

Utilidad:

El Agar chocolate es ampliamente utilizado para la recuperación de especies de Haemophilus a partir

de muestras clínicas. La mayor parte de las especies de Haemophilus no crecen en agar sangre ya
que requieren que los factores X y V estén libres en el medio. El factor X no es una sola sustancia
sino un grupo de compuestos tetrapirrólicos termoestables, proporcionados por varios pigmentos
que contienen hierro (p. ej., hemina, hematina). Esos compuestos son utilizados en la síntesis de
catalasas, peroxidasas y citocromos del sistema de transporte de electrones. El factor V, que es
termosensible, es el dinucleótido de nicotinamida adenina (NAD; coenzima I) o el fosfato de
dinucleótido de nicotinamida adenina (NADP; coenzima II). Tanto el factor X como el factor V están
presentes en los eritrocitos.

El ligero calentamiento durante el agregado de la sangre a la base de agar fundido cuando se prepara
el agar chocolate produce lisis de los eritrocitos, liberando los factores X y V necesarios para la
recuperación y crecimiento de las especies de Haemophilus.

Sin embargo, también es un excelente medio para la recuperación de otros microorganismos con
requerimientos especiales de cultivo, como Neisseria meningitis o Neisseria gonorrheae, a partir de
muestras que no están habitualmente contaminadas con otros microorganismos, como LCR o
liquido articular.

Agar Thayer – Martin

Medio basal para el transporte, aislamiento y cultivo

de Neisseria gonorrheae y Neisseria meningitidis.

Al igual que el Agar chocolate, este medio se debe

incubar en una atmosfera enriquecida hasta un
10% en CO2 (Microaerofilia).

Composición:

 Peptona
 Almidón soluble
 Cloruro sódico
 Suplemento GC
 Hemoglobina

Elaborado por: Br. Girene Hernández

  VNC (Vancomicina, Nistatina y Colistina)
 Agar base

Fundamento:

El medio de Thayer – Martin es el que hasta el momento se ha demostrado más eficaz para el
aislamiento de neisserias patógenas.

Además de una buena base nutritiva constituida por el medio basal, incorpora factores de
crecimiento indispensables en el suplemento GC y la hemoglobina indispensable para el buen
desarrollo de estos microorganismos. La selectividad del medio se consigue gracias a la
incorporación de antibióticos como son Vancomicina, Nistatina y Colistina:

 Vancomicina: elimina cocos Grampositivos.

 Colistina: elimina cocos Gramnegativos.
 Nistatina: elimina levaduras.

Técnicas de uso recomendadas:

Las muestras en las mujeres se deben tomar en los siguientes puntos:

 En la cérvix, cuando sea posible, y tras eliminar la mucosidad cervical.

 Si el cultivo cervical es negativo deben hacerse cultivos rectales a partir de muestras
tomadas en el canal anal.
 Si el cultivo cervical es poco satisfactorio, por ejemplo en niñas o después de histerectomías
se harán cultivos vaginales o uretrales.

En los hombres:

 Lo usual es el cultivo uretral, tomando muestras de la mucosa con un asa. Si se trata de

homosexuales deben hacerse además cultivos de recto y faringe.

Por lo general, para el diagnóstico de la gonorrea en las mujeres se precisa un crecimiento positivo
de diplococos Gramnegativos intracelulares, de morfología característica y reacción positiva de
oxidasa. En cambio, en el hombre suele ser suficiente la demostración de gonococos intracelulares
en los exudados uretrales, y solo cuando sea posible se cultivara para demostración bioquímica.

La muestra se inocula en el medio con un asa bacteriológica y se incuba a 35°C, en una atmosfera
húmeda y enriquecida con un 10% de CO2.

Neisseria spp. producen colonias incoloras y translucidas, como gotas de rocío.

Elaborado por: Br. Girene Hernández

Agar EMB – Levine

Es un medio selectivo y diferencial utilizado para el aislamiento selectivo de Bacilos entéricos

Gramnegativos de rápido desarrollo y escasas exigencias
nutricionales. Permite el desarrollo de todas las
especies de la familia Enterobacteriaceae.

Composición:

 Digerido pancreático de gelatina

 Lactosa
 Sacarosa
 Fosfato dipotásico
 Eosina y Azul de metileno
 Agar base

Elaborado por: Br. Girene Hernández

Fundamento:

 Las peptonas provocan la fuente de nitrógeno.

 Los fosfatos actúan como Buffer.
 Los carbohidratos (Lactosa y Sacarosa) proporcionan la fuente de energía.
 El Agar como agente solidificante.
 La eosina y el azul de metileno son colorantes que se combinan para formar un precipitado
a pH acido permitiendo diferenciar entre las colonias fermentadoras de lactosa y sacarosa.
Los colorantes actúan como inhibidores e indicadores (Fermentadores y no
Fermentadores).

Resultados:

Las colonias no fermentadoras se ven translucidas o transparentes, pueden formar colonias

mucoides. Las fermentadoras se ven de color purpura. Escherichia coli y Citrobacter spp. presentan
un brillo verde metálico característico debido a la fuerte fermentación de la lactosa.

Brillo verde metálico Fermentadores No fermentadores

Los fermentadores débiles, incluidos Klebsiella, Enterobacter, Serratia y Hafnia producen colonias
purpuras.

Los no fermentadores de la lactosa, que incluyen Proteus, Salmonella y Shigella, producen colonias
transparentes.

Elaborado por: Br. Girene Hernández

Agar McConkey

Es un medio selectivo y diferencial recomendado para el cultivo y aislamiento de microorganismos

Gramnegativos a partir de muestras clínicas, de alimentos, agua, productos lácteos y productos
farmacéuticos.

En este medio se aíslan bacilos entéricos Gramnegativos fermentadores y no fermentadores de

lactosa.

Composición:

 Digerido pancreático de gelatina

 Sales biliares
 Digerido péptido de tejido animal
 Cloruro de sodio
 Digerido pancreático de caseína
 Cristal violeta
 Lactosa
 Rojo neutro
 Agar base

Fundamento:

 Las peptonas aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano.

 La lactosa es el carbohidrato fermentable.
 La mezcla de sales biliares y cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben gran parte
de la flora Grampositiva y de algunas Gramnegativas exigentes.
 La fermentación de la lactosa disminuye el pH alrededor de la colonia, esto produce un
viraje del color del indicador de pH (Rojo neutro), la absorción en las colonias y la
precipitación de las sales biliares.

Utilidad:

Sirve como un indicador visual del pH, distinguiéndose así las bacterias Gramnegativas que pueden
fermentar la lactosa de las que no.

 Lactosa (+)= disminuye el pH 6,8 = colonias rosadas o rojas

 Lactosa (-)= aumenta el pH 6,8 = colonias incoloras

Elaborado por: Br. Girene Hernández

Resultados:

Los microorganismos no fermentadores de la lactosa producen colonias incoloras y los

fermentadores colonias rosadas. Mientras más fuerte en la fermentación más rosada se observara
la colonia.

Izq: Lactosa (-), Cntro y Dcha: Lactosa (+)

Los fermentadores fuertes de la lactosa típicos, como especies de Escherichia, Klebsiella y

Enterobacter producen colonias rojas o fucsias rodeadas de una zona de bilis precipitada.

Los fermentadores lentos o débiles de la lactosa, como Citrobacter, Providencia, Serratia y Hafnia
producen un color rosa pálido o pueden aparecer sin color después de 24 horas.

Las especies de Proteus, Salmonella y Shigella, con raras excepciones, producen colonias
transparentes.

Elaborado por: Br. Girene Hernández

Agar Salmonella – Shigella (S-S)

Es un medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento de especies de Salmonella

y Shigella a partir de muestras clínicas y alimentos.

Composición:

 Extracto de carne
 Citrato de sodio
 Mezcla de peptonas
 Tiosulfato de sodio
 Lactosa
 Citrato férrico
 Rojo neutro
 Verde brillante
 Agar base

Fundamento:

 Las sales biliares y el verde brillante actúan como inhibidores de bacilos Grampositivos, de
la mayoría de bacilos coli y del Swarming en Proteus spp. mientras que permite el
crecimiento de Salmonella y Shigella.
 El tiosulfato de sodio y el citrato férrico permiten la detección de la producción de H2S.
 La lactosa proporciona la fuente de carbohidratos.
 El rojo neutro y el verde brillante actúan como indicadores de pH.
 Agar como agente solidificante.

Sales biliares y Verde Rojo neutro y Verde Tiosulfato de sodio y

brillante brillante citrato férrico

Inhibidores Indicadores Detección de H2S

Resultados:

Las colonias fermentadoras de lactosa se ven de color rosado (pH acido), las no fermentadoras son
incoloras (pH básico).

 Las colonias de Salmonella spp. y Proteus spp. son incoloras con centro negro por
producción de H2S.
 Las colonias de Shigella spp. son incoloras sin precipitados negros.

Elaborado por: Br. Girene Hernández

 Colonias Colonias NO fermentadoras Colonias NO
fermentadoras de de lactosa, con centro fermentadoras de
lactosa negro (H2S). Característico lactosa. Característico
de Salmonella spp. y de Shigella spp.
Proteus spp.

Agar C.L.E.D (Agar de Cistina y Lactosa Deficiente en Electrolitos)

Medio de Cistina y Lactosa, deficiente en electrolitos, recomendado para el aislamiento e

identificación de bacterias en orina.

Este medio de utilización general se ha recomendado ampliamente para el análisis bacteriológico

de orina, este medio es capaz de soportar el crecimiento de la mayoría de las bacterias que pueden
aparecer en la orina.

La presencia de lactosa, como azúcar

fermentable, permite la diferenciación
clásica de estos microorganismos y al mismo
tiempo la deficiencia notable de
electrolitos impide totalmente la
formación de Swarming en los miembros
del genero Proteus spp.

Composición:

 Extracto de carne
 Peptona
 Lactosa
 L-cistina
 Azul de bromotimol
 Agar base

Elaborado por: Br. Girene Hernández

Características de las colonias crecidas en Agar CLED:

 Escherichia coli  colonias amarillas, opacas, las cepas no fermentadoras dan colonias de
color azul.
 Klebsiella sp.  colonias muy mucosas de color variable, desde amarillo a blanco azulado.
 Proteus sp.  colonias translucidas azules, más pequeñas que las de E. coli
 Staphylococcus aureus  colonias convexas, amarillas.
 Pseudomonas aeruginosa  colonias planas, rugosas, de color verde a verde azulado y
borde irregular.

Agar TCBS (Tiosulfato – Citrato – Bilis – Sacarosa)

El Agar TCBS está especialmente recomendado para el aislamiento selectivo de Vibrios que provocan
afecciones coléricas, diarreas disentéricas y el examen de alimentos sospechosos de portadores de
los mismos.

Composición:

 Peptona de caseína
 Peptona de carne
 Extracto de levadura
 Citrato sódico
 Tiosulfato sódico
 Bilis bovina
 Clorato sódico
 Sacarosa
 Cloruro de sodio
 Citrato férrico
 Azul de timol

Elaborado por: Br. Girene Hernández

  Azul de bromotimol
 Agar base

Fundamento:

El Agar TCBS actualmente está aceptado de forma universal como el mejor para el aislamiento
diferencial de vibriones enteropatógenos, consiguiendo una fuerte inhibición de toda la flora
acompañante. Su formulación permite un abundante crecimiento de Vibrio cholerae y Vibrio
parahaemolyticus. También crecen en el Vibrio alginolyticus y los Vibrios NAG.

Las enterobacterias quedan fuertemente reprimidas por las elevadas concentraciones de citrato,
tiosulfato, bilis y cloruro sódico. Aunque pueden aparecer algunas colonias entéricas, su tamaño y
aspecto es fácilmente discernible de los vibrios.

Excepcionalmente pueden aparecer colonias muy pequeñas y amarillas que corresponden a

Enterococcus sp. resistentes.

Normalmente, de este medio, se seleccionan las colonias y se identifican con las pruebas primarias
(Oxidasa, reacciones en Agar Kligler, Voges-Proskauer y antibiograma) antes de pasar a la
seroidentificación y fagotipado.

Debido a su alta selectividad el medio admite inóculos masivos del material patológico.

Resultados:

Aspecto de las colonias sobre Agar TCBS a las 24 horas a 37°C:

Microorganismo Aspecto de las colonias

Vibrio alginolyticus Grandes, amarillas
Vibrio cholerae Medianas, amarillas, con halo amarillo
brillante en el medio
Vibrio parahaemolyticus Pequeñas, amarillas, sin halo y con núcleo
verdoso

Elaborado por: Br. Girene Hernández

Agar X.L.D. (Agar Xilosa – Lisina – Desoxicolato)

Ampliamente usado en el coprocultivo para el aislamiento de enteropatógenos, especialmente

Shigella sp.

El Agar Xilosa – Lisina – Desoxicolato es un medio diferencial, ligeramente selectivo, muy adecuado
para la detección de enterobacterias patógenas exigentes, sobre todo del genero Shigella.

La baja cantidad de Desoxicolato hace que la flora Grampositiva sea inhibida, pero en cambio
permite el crecimiento de Shigella con mayor facilidad que otros medios más selectivos.

Este Agar fue diseñado para detectar shigellae en heces después de enriquecimiento en caldo para
Gramnegativos.

Composición:

 Xilosa
 L-lisina
 Lactosa
 Sacarosa
 Cloruro sódico
 Extracto de levadura
 Rojo fenol
 Desoxicolato sódico
 Tiosulfato sódico
 Citrato férrico amónico
 Agar base

Fundamento:

La fermentación de la Xilosa, Lactosa o Sacarosa provoca una acidificación del medio que se
manifiesta por un viraje del indicador a color amarillo alrededor de la colonia. Este color se va
debilitando, llegando a desaparecer a las 24 horas, por lo cual es recomendable la lectura entre las
18 – 24 horas.

La producción de H2S a partir del tiosulfato se detecta fácilmente por el ennegrecimiento de las
colonias en las que se deposita sulfuro de hidrogeno.

Resultados:

Todas las reacciones permiten una buena diferenciación de Shigella que no fermenta la xilosa y por
lo tanto dan una reacción de fermentación negativa.

Los miembros del gen ero Salmonella si pueden fermentar la xilosa, pero la agotan rápidamente y
la alcalinización del medio debido a la descarboxilación de la lisina enmascaran la reacción pudiendo

Elaborado por: Br. Girene Hernández

confundirse con Shigella, si no fuera porque la colonia se ennegrece con los precipitados de
hidrogeno sulfurado.

Con los restantes géneros de enterobacterias no ocurre este fenómeno debido a que el acumulo de
ácido por fermentación de lactosa y sacarosa es tan grande que impide la reversión del pH por
descarboxilación e incluso el depósito de precipitados de H2S, durante las primeras 24 horas.

Aspecto de algunas bacterias entéricas en XLD a las 18 horas a 37°C:

Microorganismos Aspecto de las colonias

Shigella spp. Colonias rojas, transparentes
Salmonella sp. Colonias rojas, transparentes con núcleo
negro.
Salmonella typhi Anaranjado y lig. opaco
Escherichia, Enterobacter, Aeromonas y Amarillas opacas
Citrobacter
Klebsiella sp. Amarillas opacas, mucosas.
Proteus vulgaris y Proteus mirabilis Amarillas transparentes y con núcleo negro

Elaborado por: Br. Girene Hernández

Agar D-Manitol Salado

Se trata de un medio altamente selectivo debido a su alta concentración salina lo que inhibe el
desarrollo de otros microorganismos (excepto los enterococos). Los Staphylococcus coagulasa
positivo hidrolizan el manitol acidificando el medio, las colonias aparecen rodeadas de una zona
amarilla brillante. Los Staphylococcus coagulasa negativos, presenten colonias rodeadas de una
zona roja o purpura.

Composición:

Sus componentes más resaltantes son:

 Manitol (1%)
 NaCl al 7,5%
 Indicador: “Rojo fenol”
 Peptonas

Izq: Staphylococcus coagulasa negativo, Dcha: Staphylococcus coagulasa positivo

Elaborado por: Br. Girene Hernández

Agar Campy – BAP (Medio de Blaser)

Es un medio de cultivo altamente selectivo utilizado para la recuperación de especies de

Campylobacter a partir de heces.

Entre los inhibidores que lo hacen altamente selectivo

tenemos:

 Vancomicina
 Trimetoprima
 Polimixina B
 Cefalotina
 Anfotericina B

Recomendaciones para su uso:

Este medio debe incubarse a temperaturas elevadas de

42°C y con una atmosfera de incubación:

 5% de oxigeno
 10% de CO2
 85% de nitrógeno

Durante un periodo de incubación de 48 – 72 horas.

Características de las colonias:

La morfología de las colonias de especies de Campylobacter en medios solidos varía desde planas,
grises, de forma irregular que puede ser secas o húmedas, a colonias redondas y convexas,
brillantes, de bordes enteros.

Elaborado por: Br. Girene Hernández

La identificación puede ser confirmada rápidamente mediante una prueba rápida de catalasa y
oxidasa (C. jejuni, C. coli y C. lari son positivas para ambas) y una observación de preparados de
Gram de las colonias donde se observan las características formas Gramnegativas de “S”, ala de
gaviota o de largas espirales.

Agar de Müeller – Hinton

Medio ampliamente recomendado para el ensayo de sensibilidad de antibióticos y sulfamidas, por

el método de Kirby – Bauer y por el de Ericcson.

Utilidad:

Este medio ha demostrado ser uno de los más eficaces

en los ensayos de sensibilidad a antimicrobianos, si
se desea realizar ensayos de este tipo, es
recomendable hacer las lecturas de los halos de
inhibición entre las 12 – 18 horas, antes de que se
produzca el típico sobrecrecimiento que, en la
mayoría de los casos impide la lectura de
sensibilidad a las 24 horas.

Método de Kirby – Bauer (resumido):

Es el método más utilizado en la práctica rutinaria para los ensayos de sensibilidad a

antimicrobianos. El método de Kirby – Bauer es más preciso y entra en la categoría de los
semicuantitativos. Como los demás utiliza el Agar Müeller – Hinton y discos con diversas
concentraciones de antibióticos.

Elaborado por: Br. Girene Hernández

El inoculo se normaliza con un simple nefelómetro de McFarland a 0,5. La placa se inocula con un
hisopo humedecido con la suspensión normalizada y acto seguido se disponen los discos y se incuba
la placa durante 18 – 24 horas a 37°C y luego se miden los halos de inhibición, dándose los resultados
en términos de Resistente, Intermedio y Sensible, según sea el caso.

Agar de Kligler

Medio diferencial para la identificación primaria de entobacterias basado en la fermentación de dos

azucares, producción de gas y producción de H2S.

Fundamento:

El Agar de Kligler es un medio diferencial que reúne las características del agar
de dos azucares de Rusell y del medio de acetato de plomo para la detección de
H2S. En este medio se puede detectar la fermentación de la lactosa y la
producción de H2S, lo cual permite un diagnostico presuntivo de la mayor parte
de los géneros de la familia Enterobacteriaceae.

La fermentación de la glucosa se manifiesta por la producción de ácido que hace

virar el indicador de rojo a amarillo, pero como existe poca azúcar, la producción
de ácido es muy limitada y en la superficie del medio se produce una reoxidación
del indicador que permanece rojo. En cambio cuando se fermenta la lactosa la
abundante producción de ácido impide la reoxidación y todo el medio
permanece amarillo.

La producción de hidrogeno sulfurado se manifiesta por un ennegrecimiento del

medio de cultivo provocado al reaccionar el H2S liberado a partir del tiosulfato con el citrato férrico
amónico.

Elaborado por: Br. Girene Hernández

Resultados:

1) Pico alcalino/fondo alcalino: No fermenta la glucosa, ni la lactosa.

2) Pico acido/fondo acido: Fermenta la glucosa y la lactosa.
3) Pico acido/fondo acido: Fermenta la glucosa y la lactosa con producción de gas.
4) Pico alcalino/fondo acido: Fermenta la glucosa pero no la lactosa.
5) Pico alcalino/fondo acido: Fermenta la glucosa pero no la lactosa. Produce H2S.

Características de diferentes enterobacterias en el Agar Kligler:

Comportamiento en medio Kligler Microorganismos

Pico acido/fondo acido, con o sin gas Escherichia, Klebsiella, Enterobacter
Pico acido/fondo acido, con producción de Citrobacter
H2S
Pico alcalino/fondo acido, con o sin gas Serratia, Shigella, Providencia, Proteus
rettgeri, Morganella morganii
Pico alcalino/fondo acido, producción de gas Citrobacter, Salmonella, Proteus mirabilis,
y H2S Proteus vulgaris
Pico alcalino/fondo alcalino Acinetobacter, Pseudomonas aeruginosa,
otros bacilos Gramnegativos no
fermentadores.

Elaborado por: Br. Girene Hernández

Técnicas de uso recomendadas:

El Agar de Kligler se utiliza en tubos inclinados con una corta cuña y fondo abundante, que se
inoculan tanto en la superficie como en profundidad. El inoculo debe ser abundante y obtenido de
un medio sólido, ya que si se parte de caldo las lecturas pueden retrasarse hasta 2 – 3 días, cuando
lo normal es una incubación de 18 horas a 37°C.

Se recomienda utilizar tubos con tapones que permitan el acceso del aire por ejemplo: algodón,
celulosa o cap-o-test o bien si son cierres roscados dejarlos flojos (medio abiertos) ya que de otro
modo puede dificultarse la reoxidación del indicador.

Cuando la producción de H2S es muy abundante puede dificultarse la lectura, por lo que se
recomienda hacer lecturas tempranas.

Medio LIA (Lisina Hierro Agar)

Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente Salmonella spp.,

basado en la descarboxilación/desaminación de la lisina y en la producción de ácido sulfhídrico.

Composición:

 Peptona de gelatina
 Extracto de levadura
 Glucosa
 Lisina
 Citrato de hierro y amonio
 Tiosulfato de sodio
 Purpura de bromocresol
 Agar base

Fundamento:

En este medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el
desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable y la lisina es el sustrato
utilizado para detectar la presencia de las enzimas descarboxilasas y desaminasa. El citrato de hierro
y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la producción de ácido sulfhídrico. El
purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o menor a 5,2
y de color violeta a pH igual o mayor a 6,8.

Por descarboxilación de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el medio y esto
produce un viraje del indicador al color violeta. La descarboxilación de la lisina, tiene lugar en medio
acido, por lo que es necesario que la glucosa sea previamente fermentada.

Elaborado por: Br. Girene Hernández

 Lisina descarboxilasa (positivo)

Los microorganismos que no producen lisina descarboxilasa, pero que son fermentadores de la
glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo a amarillo, pero a las 24 horas de
incubación se observa el pico de color violeta debido al consumo de las peptonas y el fondo amarillo.

Lisina descarboxilasa (negativo)

La producción de sulfuro de hidrogeno (H2S), se visualiza por el ennegrecimiento del medio debido
a la formación de sulfuro de hierro.

Elaborado por: Br. Girene Hernández

Las cepas de los géneros Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella, desaminan la lisina,
esto produce un ácido alfa-ceto-carbónico, el cual, con la sal de hierro y bajo la influencia del oxígeno
forman un color rojizo en la superficie del medio (muy característico).

Lisina desaminasa (positivo)

Lisina descarboxilasa (negativo)

Siembra:

Se siembra por punción profunda con aguja de inoculación, y se incuba en aerobiosis durante 24
horas a 37°C.

Interpretación:

A B C

A) LIA (negativo), H2S (negativo)

B) LIA (positivo), H2S (negativo)
C) LIA (positivo), H2S (positivo)

Elaborado por: Br. Girene Hernández

Resultados:

Ejemplos de reacciones para algunas enterobacterias:

A B C D

A) Lisina desaminasa: Proteus spp., Providencia spp. y Morganella spp.

B) LIA negativo: Citrobacter freundii

C) LIA positivo, H2S positivo: Salmonella spp.

D) LIA positivo, H2S negativo: Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli

Caldo Selenito

El caldo selenito esta formulado para el enriquecimiento selectivo de Salmonella y

Shigella (especialmente esta última) a partir de muestras muy contaminadas (Heces).

El enriquecimiento es particularmente efectivo durante las primeras 8 – 12 horas del

cultivo, ya que en este periodo de tiempo solo parecen crecer con facilidad las
Salmonella y Shigella, algunos Proteus y ciertas cepas de Pseudomonas, por este
motivo se recomienda no prolongar la fase de enriquecimiento y pasar rápidamente
a un medio selectivo, solido o líquido.

Composición:

 Peptona
 Lactosa
 Fosfato potásico
 Selenito sódico
 pH aproximado 7,0

Elaborado por: Br. Girene Hernández

Caldo Tetrationato

Es un medio clásico para el enriquecimiento de patógenos intestinales, sobre todo los miembros del
genero Salmonella, a partir de muestras muy contaminadas con otras bacterias, como heces, orina,
aguas fecales, etc.

Composición:

 Peptona de carne
 Peptona de caseína
 Sales biliares
 Carbonato cálcico
 Tiosulfato sódico
 Verde brillante
 Solución Yodo – yodurada
 Novobiocina

Recomendaciones para su uso:

La técnica usual de empleo es añadir una cantidad de muestra al caldo, en la proporción 1:10 y
después de homogeneizarlo, se incuba a 37°C durante un periodo no superior a las 48 horas, ya que
pasado este tiempo el medio pierde selectividad y la flora reprimida puede producir
sobrecrecimiento.

Luego de este periodo con un asa se toman alícuotas y se realizan siembras por agotamiento sobre
la superficie de medios selectivos, como el Agar S-S o el X.L.D.

Caldo BHI (Infusión Cerebro – Corazón)

La infusión de cerebro y corazón es un medio de cultivo clásico muy utilizado en microbiología clínica
para el cultivo de organismos patógenos, ya que mantiene muy bien las características de
antigenicidad, virulencia y toxicidad, y además está perfectamente adaptado para la adición de
sangre.

Composición:

 Extracto de corazón
 Extracto de cerebro
 Proteosa peptona
 Dextrosa
 Cloruro sódico
 Fosfato disódico

utilidad:

Sobre este medio se obtienen excelentes resultados en el cultivo de estreptococos que requieren
sangre para su crecimiento, meningococos e incluso hongos patógenos.

Elaborado por: Br. Girene Hernández

En general, la infusión de cerebro y corazón se utiliza con diversas adiciones para adecuarla a
distintas finalidades. Así por ejemplo, con un 10% de sangre desfibrinada se comporta como un
excelente medio para el cultivo de hongos patógenos como Histoplasma.

Medio fluido Thioglicolato (TH)

Es un medio liquido de enriquecimiento de uso general, utilizado en procedimientos cualitativos, en

microbiología clínica se usa como medio de enriquecimiento para muestras clínicas.

En este medio crecen bien todo tipo de bacterias aerobias o anaerobias, permite el desarrollo de
una amplia variedad de microorganismos, incluidos los nutricionalmente exigentes. Además, se
observa que las bacterias estrictamente aerobias crecen en la parte superior, mientras que las
anaerobias facultativas o anaerobias estrictas crecen en las profundidades del medio. Sirve para el
aislamiento tanto de anaerobios estrictos y facultativos como de microorganismos microaerofilicos.
La elevada viscosidad del medio de cultivo thioglicolato impide la penetración rápida de oxígeno.

Fundamento:

El medio fluido de thioglicolato fue diseñado

para el cultivo rápido tanto de anaerobios como
aerobios. Este medio favorece un buen
crecimiento de una amplia variedad de
organismos, incluidos los anaerobios estrictos,
sin incubación en una atmosfera anaerobia.

El thioglicolato sódico no solo reduce el

potencial de oxidación-reducción, sino también
son capaces de neutralizar la actividad
antibacteriana de los compuestos con mercurio,
por lo tanto, los medios de thioglicolato son adecuados para la investigación de materiales que
contengan metales pesados o conservantes en cuya composición participen dichos metales
pesados.

Es usado como medio de enriquecimiento en microbiología clínica, en especial para muestras de

zonas corporales principalmente estériles.

La glucosa, la peptona y el extracto de levadura proporcionan los factores de crecimiento necesarios

para el crecimiento bacteriano. El thioglicolato sódico y L-cistina son agentes reductores que
previenen la acumulación de peróxidos, que son letales para algunos microorganismos. Además
contiene un indicador de oxidación-reducción, que presenta un color rosado cuando la muestra esta
oxidada y es incoloro cuando la muestra esta reducida.

La pequeña cantidad de Agar ayuda al mantenimiento de un bajo potencial de oxidación-reducción,

al estabilizar el medio contra las corrientes de conversión, por lo que mantiene la anaerobiosis a

Elaborado por: Br. Girene Hernández

mayores profundidades del medio. Debido a su contenido de agar, el medio de thioglicolato parece
ligeramente opaco.

Resultados:

A) El oxígeno penetra solo una corta distancia en el tubo, de modo que los aerobios estrictos
solo crecen en la superficie.
B) Los anaerobios estrictos, como son sensibles al oxígeno, solo crecen en las profundidades.
C) Los aerobios facultativos, son capaces de crecer tanto en presencia como en ausencia de
oxígeno y crecen en todo el medio.
D) Los microaerófilos, crecen apartándose en la zona entre el oxígeno y ausencia de oxígeno.
E) Los anaerobios aerotolerantes crecen por todo el tubo, no obstante el crecimiento no es
mejor cerca de la superficie porque estos organismos solo son fermentadores.

Elaborado por: Br. Girene Hernández

 MEDIOS DE TRANSPORTE

MEDIO DE TRANSPORTE SEGÚN AMIES

El medio de transporte de Amies es una modificación al de Cary-Blair, que a su vez lo es del de Stuart.

En la formulación de Amies la solución salina está más equilibrada y además se ha suprimido el azul
de metileno ya que se había observado que podía resultar toxico para ciertos microorganismos.

Aunque originalmente Amies incluyo el carbón en el medio para poder usar hisopos limpios, muchos
clínicos prefieren aun el sistema clásico del hisopo impregnado de carbón y utilizar la base de
transporte sin él.

MEDIO DE TRANSPORTE SEGÚN CARY Y BLAIR

Basándose en la formulación de Stuart, Cary y Blair diseñaron este medio de cultivo para el
transporte de muestras fecales a los laboratorios. La principal modificación consistió en la supresión
del glicerofosfato por un tampón de fosfatos, que privaba a los microorganismos de toda fuente
energética y evitaba así el sobrecrecimiento de los gérmenes menos exigentes durante el
transporte. Además, suprimieron el azul de metileno que en algunos casos se había mostrado toxico
para ciertos biotipos y subieron el pH a 8,4 ya que facilita la viabilidad de las bacterias fecales.

Técnicas de uso recomendadas:

Cuando las muestras son fecales se recomienda el uso de hisopos normales, sin preparación
especial, pero si el muestreo se realiza en tracto respiratorio, el mantenimiento de la viabilidad se
mejora utilizando hisopos impregnados de carbón.

MEDIO DE TRANSPORTE SEGÚN STUART

Elaborado por: Br. Girene Hernández

El medio de transporte de Stuart, se utiliza para el transporte de muestras patológicas con bacterias,
hongos o protozoos, desde los sitios de muestreo hasta los laboratorios de análisis.

Esencialmente se trata de un medio semisólido, sin capacidad nutritiva debido a la ausencia de

nitrógeno, altamente reductor, gracias al tioglicolato incorporado y capaz de inactivar las enzimas
autolíticas de las células durante los periodos de transporte, manteniéndose viable durante 24 horas
en los casos más exigentes (Neisseria y Haemophilus) y hasta varias semanas en las menos exigentes
(Salmonella y Shigella).

MEDIO DE TRANSPORTE Y RECUPERACIÓN SEGÚN HAJNA

Medio para el muestreo y transporte al laboratorio de muestras presuntamente contaminadas con

bacterias entéricas.

Este medio está recomendado para el transporte o estacionamiento de las muestras tanto fecales
como de otros orígenes, actuando selectivamente en favor de los bacilos Gramnegativos, gracias a
su contenido en desoxicolato y citrato. Por este motivo puede ser utilizado como sustrato de
preenriquecimiento de enterobacterias patógenas, ya que inhibe el sobrecrecimiento de la flora
Grampositiva acompañante.

La ausencia de fuentes energéticas y de nitrógeno impide el crecimiento, al mismo tiempo que el

extracto de levadura actúa manteniendo a un nivel muy restringido el metabolismo proteico. Su
fuerte taponamiento impide cambios de pH que podrían afectar la viabilidad.

Recomendaciones para su uso:

Si se emplean hisopos rectales, se recomienda sumergirlos en 5ml de medio. Si se trata de heces u

otro tipo de muestras deben sumergirse en proporción de 1:1 con el medio y en cualquier caso debe
someterse a una enérgica agitación para homogeneizar el contenido. Su empleo como sistema de
preenriquecimiento es especialmente efectivo si luego se pasa a caldo de selenito o tetrationato
antes de las placas con agares selectivos.

Elaborado por: Br. Girene Hernández

 PRUEBAS BIOQUIMICAS DE IDENTIFICACION BACTERIANA

Prueba de la Catalasa

Investiga la presencia en el microorganismo de la enzima catalasa, capaz de descomponer el

peróxido de hidrógeno (H2O2) en agua (H2O) y oxigeno O2, que se desprende en forma de burbujas
en el medio.

Técnica:

Con un palillo de madera estéril recoger el centro de una colonia pura del agar y colocarla sobre un
portaobjetos limpio, luego agregarle 2 o 3 gotas de H2O2.

Interpretación:

A. Catalasa negativo
B. Catalasa positivo

Utilidad:

Permite diferenciar entre los cocos Grampositivos, Staphylococcus spp. (Positivo) de Streptococcus
spp. (Negativo)

Prueba de la Coagulasa

Permite comprobar la facultad de un microorganismo de coagular el plasma por acción de la enzima

coagulasa, con actividad semejante a la protrombina, capaz de transformar el fibrinógeno en fibrina,
provocando la formación de un coagulo visible.

Técnica:

Debido a que hay microorganismos que tienen dos tipos de coagulasa; libre y unida, existen dos
técnicas, en tubo y portaobjetos.

Elaborado por: Br. Girene Hernández

Para realizar la técnica de la coagulasa en portaobjetos no se pueden tomar colonias crecidas en
medios con alta concentración de Na+ porque puede dar un falso positivo, se deben tomar de las
colonias crecidas en medios nutritivos no selectivos como el agar sangre.

Para la prueba en tubo, esta debe ser leída a las 4 horas de incubación, luego de las 4 horas la lectura
puede arrojar falsos negativos porque puede ocurrir fibrinólisis.

1. Prueba en portaobjetos:
a) Colocar una gota de agua destilada sobre un
portaobjetos
b) Agregar una gota de suspensión bacteriana y
homogeneizar
c) Agregar una gota de plasma
d) Se observa una reacción positiva (grumos blanquecinos) en 5 a 20 segundos.

2. Prueba en tubo:
a) En un tubo de vidrio agregar 0.5ml de plasma + __
b) Tomar una asada de una colonia y mezclar suavemente
c) Incubar a 37°C por 4 horas (observar cada 30 minutos)
d) Inclinar suavemente él tuvo para ver si hay coagulo

Utilidad:

Permite diferenciar entre Staphylococcus aureus (coagulasa positivo) de otras especies de

Staphylococcus (coagulasa negativo).

Elaborado por: Br. Girene Hernández

Prueba de DNAsa

Se basa en la presencia de la enzima termoestable DNAsa que es capaz de clivar los enlaces
fosfodiester internos de la molecula de DNA. Se utiliza un medio solido que contiene verde de
metilo, el cual se combina con DNA altamente polimerizado. Cuando la combinacion ocurre, por
accion de la enzima DNAsa, se produce una decoloracion del medio.

Interpretacion:

La formacion de un halo transparente alrededor de la siembre indica presencia de DNAsa.

Utilidad:

Permite diferenciar Staphylococcus aureus, la unica especie dentro del genero Staphylococcus que
posee DNAsa, de las otras especies.

Esta prueba es especialmente util cuando algunas cepas de S. aureus producen reacciones de
coagulasa equivocas o debiles en tubo y en realidad algunos aislamientos raros pueden ser
coagulasa negativos. En estas circunstancias puede ser de utilidad llevar a cabo este prueba.

Elaborado por: Br. Girene Hernández

Prueba de Sensibilidad a la Novobiocina

Staphylococcus saprophyticus es la unica especie dentro del genero Staphylococcus resistente a la

novobiocina, lo que permite identificarlo y diferenciarlo de las demas especies de este genero.

Tecnica:

Se siembra una asada de una colonia pura en un placa de Agar Müeller-Hinton con un hisopo
embebido con la suspension de la cepa a estudiar. Luego se aplica el disco de novobiocina (5ug) y
se incuba a 35°C por 18 – 24 horas.

NOTA: NO es un antibiograma, es un prueba de IDENTIFICACIÓN.

Interpretacion:

Izq: sensible a la novobiocina, Dcha: resistente a la novobiocina

Prueba del Taxo A (Prueba de la bacitracina)

Se basa en la sensibilidad de Streptococcus pyogenes a bajas concentraciones de bacitracina (0,02 –

0,04 U), caracteristica que permite diferencias de otros Streptococcus β-hemoliticos.

Tecnica:

Se realiza una siembra masiva de una colonia pura en una placa de Agar Sangre y se coloca el disco
de bacitracina en el centro, incubar en CO2 a 35°C por 18 – 24 horas.

NOTA: NO es un antibiograma, es un prueba de IDENTIFICACIÓN. Debe realizarse en Agar Sangre,

ya que los Streptococcus requieren sangre para crecer

Elaborado por: Br. Girene Hernández

Interpretacion:

Cualquier zona de inhibicion se considera como positiva la prueba.

Prueba de Taxo A: positiva

Prueba de la Urea

Mide la capacidad que tienen algunas bacterias para producir Ureasa, una enzima que hidroliza la
urea originando amonio lo que producirá un incremento del pH que puede detectarse con el
indicador de pH “Rojo Fenol”.

Interpretación:

 Proteus: positivo
 Klebsiella: positivo
 Escherichia: negativo
 Providencia: negativo
 Salmonella: negativo

Izq: Urea (-), Dcha: Urea (+)

Elaborado por: Br. Girene Hernández

Prueba del citrato

Este medio indica la capacidad de las bacterias de metabolizar el citrato. Contiene citrato como
única fuente de carbono, fosfato de amonio como única fuente de fosfato y “Azul de bromotimol”
como indicador de pH.

Interpretación:

 Salmonella: positivo
 Klebsiella: positivo
 Enterobacter: positivo
 Citrobacter: positivo
 Serratia: positivo
 Proteus: positivo
 Escherichia coli: negativo

Izq: Citrato (+), Dcha: Citrato (-)

Prueba de la fenilalanina

La formación de la enzima desaminasa está condicionada por la alcalinidad del medio. La

fenilalanina es desaminada a ácido fenilpirúvico, produciéndose una coloración verdosa al agregarse
el reactivo revelador “Cloruro férrico”.

Interpretación:

 Proteus: positivo
 Providencia: negativo
 Otras Enterobacteriaceae: negativo

Izq: negativo, Dcha: Positivo

Elaborado por: Br. Girene Hernández

Prueba de la oxidasa

Permite evidenciar la presencia del citocromo C oxidasa en la cadena de transporte de electrones,

que puede detectarse utilizando un aceptor de electrones artificial como la “P-fenilendiamina”.

Interpretación:

 Pseudomonas: positivo
 Moraxella: positivo
 Neisseria: positivo
 Plesiomonas shigelloides: positivo
 Enterobacteriaceae: negativos
 Acinetobacter: negativo

Arriba: positivo, abajo: negativo

Prueba del Taxo P (Sensibilidad a la Optoquina)

Se basa en la sensibilidad de Streptococcus pneumoniae a una concentración ≤ 5ug/ml de

hidroxicuprina (Optoquina).

Técnica:

 Estriar un cuadrante de una placa de agar sangre en varias direcciones con una asada de la
colonia pura en estudio.
 Colocar un disco de Optoquina o taxo P en el centro del área estriada.
 Incubar 18 – 24 horas a 35°C.

Interpretación:

Halos de inhibición >14mm son característicos de Streptococcus pneumoniae

Elaborado por: Br. Girene Hernández

 Izq: Taxo P (negativo), Dcha: Taxo P (positivo)

NOTA: la prueba del taxo P debe realizarse en Agar Sangre, ya que los Streptococcus requieren
sangre para crecer. NO es un antibiograma, es un prueba de IDENTIFICACIÓN.

Prueba de solubilidad en bilis

Controlar la capacidad de las células bacterianas de producir lisis en presencia de sales biliares, en
un tiempo y con una temperatura específicas.

Utilidad:

Se utiliza específicamente para diferenciar entre Streptococcus pneumoniae soluble en bilis, de otras
especies de Streptococcus alfa-hemolíticos no solubles en bilis.

Interpretación:

Caldo bilis turbio: otros Caldo bilis claro o límpido:

Streptococcus No lisados Streptococcus pneumoniae
en presencia de Bilis. lisado en presencia de Bilis.

Elaborado por: Br. Girene Hernández

Prueba de Bilis – Esculina

Determinar la facultad de un organismo de hidrolizar el glucósido esculina en esculetina y glucosa,

en presencia de sales biliares.

Fundamento técnico:

La esculetina reacciona con una sal de hierro para formar un complejo castaño oscuro o negro. El
citrato de hierro se incorpora al medio de esculina con bilis en una concentración del 0,05% como
indicador de la hidrolisis de la esculina y de la formación de esculetina resultante.

Interpretación:

 Precipitado negro: positivo

 Crecimiento sin precipitado: negativo

Tanto Streptococcus grupo D como Enterococcus pueden

crecer e hidrolizar la esculina en presencia de bilis al 1 o 4%.

Utilidad:

Esta prueba es especialmente útil en el cultivo de exudados vaginales de mujeres embarazadas para
diferenciar Streptococcus agalactiae negativo (un patógeno importante en recién nacidos) de
Enterococcus positivo.

Elaborado por: Br. Girene Hernández

Prueba de NaCL al 6,5%

Se basa en la capacidad de los Enterococcus de crecer a una concentración de NaCL de 6,5%. Se trata
de un medio líquido que además contiene glucosa y un indicador de pH “Purpura de bromocresol”.

Interpretación:

Se considera positiva la presencia de turbidez, con o sin acidificación del medio, que se observa
como un viraje de color purpura a amarillo.

Prueba del Indol

Determina la capacidad de una bacteria para hidrolizar el triptófano mediante la triptofanasa,

liberando indol, acido pirúvico y amonio.

El medio contiene triptófano, y la liberación de indol por acción de la enzima se detecta por la
aparición de un anillo de color rojo después de agregar una solución del revelador “Kovac o Erlich”.

Interpretación:

 Escherichia coli: positivo

 Salmonella: negativo
 Klebsiella: negativo
 Enterobacter: negativo

Utilidad:

Ayuda a diferenciar las especies:

 Proteus mirabilis: negativo

 Proteus vulgaris: positivo

Elaborado por: Br. Girene Hernández

Prueba de MIO (Motilidad, Indol, Ornitina)

MOTILIDAD: permite distinguir la motilidad de algunas bacterias la cual es

consecuencia de la presencia de flagelos.

INDOL: capacidad de una bacteria para hidrolizar el triptófano mediante la

triptofanasa.

DESCARBOXILACIÓN DE ORNITINA: si la bacteria es capaz de producir la

enzima descarboxilasa, va a transformar la ornitina a putrescina.

Interpretación:

Motilidad Indol Descarboxilación de ornitina

Turbidez (+) Anillo rojo (+) Morado (+)
Sin turbidez (-) Sin anillo (-) Amarillo (-)

Bacterias móviles:

 Enterobacter
 Proteus
 Vibrio
 Plesiomonas shigelloides
 Entre otros.

Bacterias que descarboxilan la ornitina:

 Enterobacter
 Proteus mirabilis
 Yersinia enterocolitica

Elaborado por: Br. Girene Hernández

Pruebas de las descarboxilasas (Lisina, Ornitina, Arginina)

Medir la capacidad enzimática de un organismo para descarboxilar un aminoácido para formar una
amina, con la consiguiente alcalinidad. Las pruebas de las descarboxilasas se emplean
fundamentalmente para determinar grupos bacterianos entre las Enterobacteriaceae.

 El aminoácido L-lisina sufre la descarboxilación para dar cadaverina (una diamina) y

anhídrido carbónico por acción de la enzima especifica lisina – descarboxilasa.

 El aminoácido L-ornitina es descarboxilado por la enzima ornitina-descarboxilasa para dar

la diamina putrescina y anhídrido carbónico.

 La L-arginina sufre la descarboxilación para dar agmatina, una molécula más grande que la
putrescina, que no puede ser considerada el producto final en el catabolismo de la arginina
por las bacterias vivas. La acción catalítica de la enzima agmatinasa desdobla la agmatina en
putrescina y urea. Si se encuentra la enzima ureasa, la urea es también catabolizada en
amoniaco.

El indicador “Pupura de bromocresol” produce los mismos cambios para cualquier aminoácido,
prueba positiva (color purpura) y prueba negativa (color amarillo).

Interpretación:

Lisina-descarboxilasa:

 Salmonella: positivo
 Citrobacter: negativo
 Enterobacter: negativo

Ornitina-descarboxilasa:

 Enterobacter: positivo
 Proteus mirabilis: positivo
 Klebsiella: negativo
 Proteus vulgaris: negativo

Arginina-deshidrolasa:

 Enterobacter cloacae: positivo

 Otros Enterobacter: negativo

Elaborado por: Br. Girene Hernández

Prueba de Rojo de metilo

Comprobar la capacidad de un organismo de producir y mantener estables los productos terminales

ácidos de la fermentación de la glucosa, y vencer la capacidad amortiguadora del sistema.

Es una prueba cualitativa de la producción de ácido (determinación del pH), algunos organismos
producen más ácidos que otros.

Fundamento técnico:

La prueba de RM (Rojo de Metilo) se basa en el empleo de un indicador del pH, rojo de metilo, para
determinar la concentración de iones hidrogeno (pH) presente cuando un organismo fermenta la
glucosa.

Todos los miembros de la familia Enterobacteriaceae son, por definición, fermentadores de la

glucosa. En el caldo RM/Voges-Proskauer, después de 18 a 24 horas de incubación, la fermentación
resultante da productos metabólicos ácidos, por lo tanto, inicialmente todos los entéricos darán una
reacción positiva con el rojo de metilo. Sin embargo, después de más tiempo de incubación como
lo exige la prueba (2 a 5 días), aquellos microorganismos que son RM positivos continúan
produciendo más ácidos, y dan como resultado un bajo pH terminal, venciendo el sistema
amortiguador de fosfato y manteniendo el medio acido.

Los organismos RM negativos continúan metabolizando los productos iniciales de la fermentación

por descarboxilación, produciendo acetilmetilcarbinol (acetoína)
neutra, lo que da un elevado pH terminal que disminuye la acidez del
medio, elevando el pH hacia la neutralidad (pH 6 o >).

Interpretación:

 Escherichia coli: positivo

 Yersinia: positivo
 Enterobacter: negativo
 Klebsiella: negativo

Reacción de Voges-Proskauer

Determina la capacidad de algunos organismos de producir un producto final neutro, el

acetilmetilcarbinol (acetoína), a partir de la fermentación de la glucosa.

Fundamento técnico:

La reacción de Voges-Proskauer (VP) se basa en la detección del acetilmetilcarbinol, un producto

final neutro derivado del metabolismo de la glucosa. Esta es metabolizada en acido pirúvico,

Elaborado por: Br. Girene Hernández

intermediario clave en la glucolisis. A partir del ácido pirúvico, una bacteria puede seguir muchas
vías. La producción de acetoína es uno de los ciclos para la degradación de la glucosa en las bacterias.

Utilidad:

La reacción de Voges-Proskauer para la acetoína se usa sobre todo para separar a la E. coli de los
grupos Klebsiella y Enterobacter, aun cuando otros miembros de las Enterobacteriaceae son capaces
de producir una reacción de VP positiva.

Reactivos reveladores:

- Alfa-naftol 5%, intensificador de color

- KOH 40% o NaOH 40%, agente oxidante

El primer reactivo agregado es una alícuota incubada del catalizador alfa-naftol, actúa como
intensificador de color, lo que aumenta la sensibilidad de la reacción sin pérdida de su especificidad.

El segundo reactivo es KOH al 40% (o NaOH al 40%), que cuando se agrega al medio VP, contribuye
a la absorción de CO2. No debe exceder un volumen exacto de 0,2ml. El KOH reaccionara con la
peptona dando un color rosado salmón.

Interpretación:

VP positivo VP negativo
Color rojo rosado en la superficie del Color amarillo en la superficie del medio,
medio, y permanece 10min. o el anillo rojo rosado desaparece en
10min.

VP negativo VP positivo

 Klebsiella pneumoniae: positivo

 Enterobacter: positivo
 Escherichia coli: negativo

Elaborado por: Br. Girene Hernández