Método Kjeldahl
1.- FUNDAMENTO
El método Kjeldahl se utiliza para la determinación del contenido de nitrógeno en muestras
orgánicas e inorgánicas. Gracias a esto nos es posible poder determinar a su vez el
contenido de proteínas de alimentos y bebidas, carne, piensos, cereales y forrajes. También
se puede determinar el nitrógeno en aguas residuales, suelos y otras muestras.
Este método se basa en tres etapas:
❖ DIGESTIÓN
El objetivo del procedimiento de digestión es romper todos los enlaces de nitrógeno de
la muestra y convertir todo el nitrógeno unido orgánicamente en iones amonio (NH4+).
El carbono orgánico y el hidrógeno forman dióxido de carbono y agua. En este proceso la
materia orgánica se carboniza dando lugar a la formación de una espuma negra. Durante
la digestión, la espuma se descompone y finalmente se convierte en un líquido claro que
indica que la reacción química ha terminado. La muestra se mezcla con ácido
sulfúrico a temperaturas entre 350 y 380ºC.
Cuánto más alta sea la temperatura, más rápido será el proceso de digestión. La digestión
también se puede acelerar con la adición de sales y catalizadores (en nuestro caso,
utilizamos sulfato de cobre como catalizador). También se pueden añadir agentes oxidantes
para mejorar aún más la velocidad.
Una vez la digestión ha finalizado, se deja enfriar la muestra a temperatura ambiente,
se diluye con agua desmineralizada y se trasvasa a la unidad de destilación.
❖ DESTILACIÓN
Durante el proceso de destilación los iones amonio (NH4+) se convierten en amoniaco
(NH3) mediante la adición de un álcali (NaOH). El amoniaco (NH3) es arrastrado al vaso
receptor por medio de una corriente de vapor de agua.
El vaso receptor para el destilado se llena con una solución absorbente para capturar el gas
amoniaco disuelto. La solución absorbente más común es el ácido bórico [B(OH)3] en
solución acuosa al 2-4% (la que hemos utilizado nosotros). El amoniaco es capturado
cuantitativamente por la solución de ácido bórico formando iones amonio solvatados,
también pueden utilizarse otros ácidos, dosificados con precisión, como el ácido sulfúrico o
clorhídrico para capturar el amoniaco en forma de iones amonio solvatados.
❖ VALORACIÓN
La concentración de los iones amonio capturados puede determinarse por medio de dos
tipos de valoraciones:
➤ Valoración directa: Cuando se utiliza el ácido bórico como solución absorbente,
posteriormente se lleva a cabo una valoración ácido-base utilizando una solución
estandarizada de ácido sulfúrico o clorhídrico y una mezcla de indicadores. El rango
de concentración de la solución utilizada varía entre 0,01N a 0,5N dependiendo de la
cantidad de iones amonio presentes. El punto final de la valoración también se
puede determinar potenciométricamente con un electrodo de pH. Nosotros hemos
realizado este tipo de valoración con ácido bórico como solución absorbente y con
ácido clorhídrico 0,25 N como solución estandarizada.
➤ Valoración indirecta o por retroceso: Cuando se utiliza una solución valorada de
ácido sulfúrico como solución absorbente, el ácido sulfúrico residual (es decir, el
exceso que no reacciona con NH3) se valora con una solución estandarizada de
hidróxido sódico y la cantidad de amoniaco se calcula por diferencia.
2.- MATERIALES
➔ Los alimentos que hemos utilizado para determinar la cantidad de grasa son:
Cerdo Atún
Huevos (Uno campero y otro de supermercado) Jamón
➔ Disolventes utilizados para la práctica e indicador:
Ácido Bórico 4% Hidróxido de Sodio 32%
Ácido Sulfúrico concentrado
Ácido Clorhídrico 0,25N
Esta disolución se trata de un indicador llamado ``Shiro-Tashiro´´
➔ Los instrumentos que hemos utilizado son:
Bureta Probeta
Vaso de precipitados Pera insufladora
Destilador Aparato Kjeldahl
También hemos utilizado sulfato de cobre como catalizador.
Peso Campana de seguridad
Papel de filtro Cuchillo
Vidrio de reloj Agua destilada
Tijeras
3.- PROCEDIMIENTO
➔ Para empezar debemos preparar los disolventes y el indicador.
✓ Ácido Sulfúrico
■ No es necesario que lo preparemos puesto que ya lo tenemos
disponible en el laboratorio.
✓ Ácido Bórico
■ Necesitamos 40 ml de Ácido Bórico al 4% peso/volumen.
■ Para elaborarlo añadimos 20 ml de agua, 1,6 g de ácido y enrasamos
añadiendo hasta 40 ml de agua.
✓ Hidróxido de Sodio
■ Necesitamos 100 ml de NaOH al 32% peso/volumen.
■ Para elaborarlo utilizamos 32 g de NaOH y enrasamos hasta 100 ml
de agua.
✓ HCl
■ Necesitamos 50 ml de ácido clorhídrico 0,25 N.
■ Para elaborarlo utilizamos 1,2 ml de HCl al 37% y enrasamos hasta
50 ml de agua.
✓ Indicador
■ Necesitamos 50 ml de indicador ``Shiro-Tashiro´´.
■ Para elaborarlo utilizamos 2 g de rojo de metilo, 1 g de azul de
metileno y 1000 ml de alcohol etílico 96%.
➔ Tras haber preparado los disolventes, preparamos nuestra muestra (huevo campero)
cortándolo en trozos pequeños. Utilizamos 7,847 g (pesado previamente) de huevo
campero y la enrollamos papel de filtro.
➔ Introducimos en el aparato Kjeldalh (para la digestión) todas las muestras de la clase
en diferentes tubos y dejamos un tubo sin muestra, en el que añadimos agua
desmineralizada (tubo blanco). Ahora en todos los tubos añadimos un catalizador
(sulfato de cobre) y 15 ml de ácido sulfúrico.
➔ Ponemos la temperatura en 450ºC durante 3h y obtenemos esto:
➔ Luego debemos añadir entre 50-75 ml de agua desmineralizada en cada muestra.
- Tubo 1: Jamón → 70 ml de agua desmineralizada.
- Tubo 2: Carne de cerdo → 50 ml de agua desmineralizada.
- Tubo 3: Huevo de campo → 50 ml de agua desmineralizada.
- Tubo 4: Atún → 75 ml de agua desmineralizada.
- Tubo 5: Huevo de supermercado → 60 ml de agua desmineralizada.
- Tubo blanco → 50 ml de agua desmineralizada.
➔ Ahora preparamos para la destilación el ácido bórico con un par de gotitas de
indicador (ésta será la solución absorbente para recoger el amoniaco resultante de
la destilación).
➔ Introducimos cada muestra en el aparato destilador, a un lado conectaremos ácido
bórico, a otro lado hidróxido de sodio y agua. Este proceso dura 3 minutos.
■ Debemos estar muy atentos durante el
proceso para que la máquina no se
quede sin agua o sin hidróxido sódico.
■ El color de la muestra es morado, esto
significa que tiene un pH ácido.
➔ Tras la destilación, la muestra ha cambiado de color a verde (su pH ha cambiado a
ser básico). Le echamos además, unas cuantas de gotas de shiro tashiro al borato
de amonio para observar mejor el cambio de color de verde a transparente.
➔ Ahora, procedemos a la valoración utilizando los 50 ml de HCl 0,25N. Con la bureta,
vertemos directamente el HCl en el borato de amonio recogido de la destilación.
Echando gota a gota de HCl, la muestra debe llegar un momento en el que se vuelva
de color transparente (en este momento significa que nuestra muestra tiene un pH
ácido).
■ Nosotros nos pasamos con el HCl y
nuestra muestra se volvió otra vez de
color morado, fue ahí cuando recogimos
los datos.
➔ Finalmente, el HCl utilizado en la muestra (32,8 ml) nos servirá para calcular con una
fórmula el porcentaje de nitrógeno de la muestra.
Fórmula: %N = ml HCl muestra - ml HCl blanco ×0'25N × 1'4007
Dependiendo de la muestra que haya utilizado cada grupo, deberemos utilizar un
factor de corrección u otro para determinar el porcentaje de proteínas con la
siguiente fórmula. (En nuestro caso, 6,25 es nuestro factor de corrección)
Fórmula: % proteínas= % Nitrógeno x Factor de corrección
4-RESULTADOS
- Jamón: peso de la muestra → 4,998 g (HCl utilizado: 32,6 ml)
- Carne de cerdo: peso de la muestra → 3,179 g (HCl utilizado: 28,8 ml)
- Huevo de campo: peso de la muestra → 7,847 g (HCl utilizado: 32,8 ml)
- Atún: peso de la muestra---> 6,176 g (HCl utilizado: 34 ml)
- Huevo de supermercado: peso de la muestra → 7,794 g (HCl utilizado: 38,7 ml)
- Muestra blanca: (HCl utilizado: 0,4 ml)
% NITRÓGENO FACTOR DE % PROTEÍNAS
CORRECCIÓN
JAMÓN 2,256% 6,25 14,10%
CARNE DE CERDO 3,128% 6,25 19,55%
HUEVO DE CAMPO 1,446% 6,25 9,037%
ATÚN 1,905% 6,25 11,906%
HUEVO DE 6,25 10,75%
SUPERMERCADO 1,72%
5-OBSERVACIONES E INCIDENCIAS DURANTE LA PRÁCTICA
➔ Durante la digestión, el tubo 1 y 4 se han quedado más secos que las demás
muestras porque tienen más cantidad de grasas, aceites o sal. Además, la cantidad
de grasa de estas muestras también provocó que se quedaran de color más oscuro,
como carbonizadas. En estos casos se debería echar más ácido sulfúrico a la
muestra para que esto no pasase. Por lo tanto obtenemos como conclusión que para
la determinación de proteínas con este método, cuanta menos grasa tenga la
muestra mejor (se le debería de haber eliminado toda la grasa posible a la muestra).
➔ Otro apunte sería que deberíamos haber introducido papel de filtro en el tubo blanco
para que los resultados fueran más exactos.
➔ Y como última indicación, durante el proceso de destilación, podemos apreciar que
las muestras que sufran un cambio de color más brusco y más rápido, serán las que
tengan mayor cantidad de proteínas.
