"Año de la lucha contra la corrupción e

impunidad"

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA Y

CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL
DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

Curso:
 Microbiología General
Profesora:
 [Link] Mallqui Brito

Integrantes:
 Arbildo Vásquez, Henry
 Colquichagua León, Katherine
 Pichilingue Cruz, Hanz
 Larico Yto, Edson
 Soto Valdez, Karen
Ciclo:
 VII

2019
 INTRODUCCIÓN

En la presente practica los microorganismos, como las bacterias, se observarán

directamente al microscopio óptico, sin embargo, debido al bajo contraste entre
las células y su medio que las rodea, se dificultan en su observación, para ello
se emplea la tinción con diversos colorantes, un método sencillo para
incrementar el contraste entre la célula y su entorno y por lo tanto contribuye a
mejorar la imagen observada.

Las tinciones se realizarán a partir de cultivos microbiológicos y muestras

biológicas como hisopadas faríngeas, de piel y oídas, mediante tres pasos
sucesivos, preparación del extendido (frotis), fijado y la coloración. Las bacterias
se diferencian con esta tinción en dos grupos. Los microorganismos Gram
positivos, retienen el colorante, presentan sólo una membrana lipídica y la pared
de peptidoglicano es mucho más gruesa y se tiñen de azul oscuro o violeta;
mientras que las bacterias Gram negativas, presentan dos membranas lipídicas,
entre las que se localiza una fina pared celular de peptidoglicano, y se decoloran,
pierden su color violeta y se tiñen de rosado.

El valor diagnóstico de la tinción, posibilita según la técnica utilizada, diferenciar

microorganismos, observar su morfología, tamaño y agrupación o la observación
de ciertos elementos facultativos como flagelos, capsulas y también tiene valor
en orientar hacia un diagnóstico etiológico, en especial para instaurar un
tratamiento inicial.

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 OBJETIVOS

 Conocer los medios de seguridad y acciones que debemos tener en

cuenta al manipular bacterias.

 Elegir y usar correctamente el tipo de coloraciones que nos permitirá

identificar y diferenciar las bacterias.

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 MARCO TEÓRICO

COLORACIÓN GENERAL

Debido a la naturaleza química de la célula bacteriana, su afinidad por los colorantes,

su propiedad ha sido aprovechada para estudiar los diferentes tipos morfológicos y
estructuras (capsulas, esporas, flagelos, etc.) que ayudan a la identificación de una
especie o grupo en partículas.

TIPOS DE TINCIONES:

 Tinciones simples: Se usa un único colorante, de tipo básico usado solo para
incrementar el contraste, mejorando la observación de la célula completa.

 Tinciones diferenciales: Se utilizan para distinguir entre tipos de microrganismos, esta

técnica primero se hace con una tinción simple seguido de una de contraste en donde
se usa otro colorante. Estas tinciones son muy usados en microbiología por ej. La
tinción gran y la tinción de ácido-alcohol, ambas aplicadas a bacterias.

TÉCNICA DE TINCION GRAM

Existen variaciones de esta técnica, pero en términos generales, la tinción Gram
involucra estos pasos:
1. Tinción inicial: Las células con cristal violeta, el cual es el colorante primario.
En este paso todas las células se tiñen de morado.
2. Mordente: Se adiciona yoduro (lugol) que reacciona con el cristal violeta y
forma un complejo cristal violeta yoduro. En este punto toda la célula continúan
de color morado.
3. Decoloración: Se adiciona un solvente no polar, el cual actúa lavando el
complejo cristal violeta yoduro de las células gran negativas. De manera las
bacterias gran positivas continúan moradas y las negativas quedan incoloras.
4. Contra tinción: Se vuelve a teñir con safranina o fucsina, de manera que las
bacterias gram negativas, que habían sido decoloradas, se tiñen de rosado a
fucsia según el colorante empleado; en tanto, las bacterias gran positivas no se
afectan con la contra tinción y permanecen moradas debido a lo intenso de esta
coloración.

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 COLORANTES

 Cristal de Violeta: es el colorante primario de la coloración de Gram

que se adhiere a la pared celular bacteriana, las bacterias Gram
positivas absorben este colorante porque tienen mayor porcentaje
de ácido teicoico en su estructura y por eso adquieren un color
violeta en el microscopio, por lo tanto como colorante primario
cumple como función permitir la identificación de bacterias cuya
estructura y composición de pared celular se encuentre mayor
proporción y distribución de ácido teicoico.

 El Lugol o Mordiente: cumple la función de fijar el colorante primario

en la preparación, es decir facilita la adhesión del cristal violeta en la
muestra.
 La Safranina: es el colorante de contraste, dado que las bacterias
con baja composición de ácido teicoico y alta composición lipídica en
su pared no absorben el cristal violeta luego de ser removido con el
alcohol ácido absorben este colorante color rojizo; las bacterias que
absorben este colorante y que adquieren una composición rosada o
rojiza se conocen como Gram negativas. Por lo tanto este colorante
facilita la visualización e identificación de las bacterias no Gram
positivas (Gram negativas) en la muestra y por lo tanto la
diferenciación bacteriana.

 Aceite de Inmersión: es un aceite especial que se utiliza cuando

estás trabajando en el microscopio el cual tiene un lente que es el
más aumento creo que son 100x que se llama lente de inmersión,
y se usa para poder analizar estructuras muy pequeñas en
un microscopio electrónico, como por ejemplo para ver las fases de
la mitosis en las células de la sangre, y es por el índice de refracción
que es como el del vidrio.

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 PROCEDIMIENTO

COLORACIONES DE GRAM en:

M.P (muestra problema)

 Staphylococcus aureus  Hisopado faríngeo

 Escherichia coli  Hisopado de oído
 Enterococcus sp.  Hisopado de piel

Para la preparación coloreada tanto en los cultivos de bacterias como la muestra

problema se realizó mediante los siguientes pasos:

 Preparación del extendido

 Se puso una gota de agua en todos los portaobjetos a utilizar.

 Sobre ella con un asa de siembra, previamente puesta al calor rojo vivo, se
hará una extensión de una pequeña muestra tomada del cultivo sólido
(luego nuevamente se pondrá el asa de siembra al rojo vivo para
esterilizarla y volverla a usar).
 En caso de las M.P (muestra problema) que es con hisopo, se extenderá
rápidamente en el porta objeto.
 Fijación
 Pasaremos el porta objeto por encima de la llama, con cada muestra
mirando hacia arriba
 En este paso usaremos el calor del mechero para insolubilizar la proteína,
no contaminarnos y destruir a la bacteria.
 Coloración
 En este paso se dispuso los portaobjetos en una bandeja de tinción
 Se añadió:

 Primer reactivo: Cristal Violeta

- Lo empapamos en el portaobjetos y se dejó actuar por 2 minutos, para
que así tiña a todas las bacterias Gram+ y Gram-
- Pasado el tiempo se inclinó el portaobjeto y se lavó con agua
 Segundo reactivo: Lugol
- Se cubrió con lugol y se esperó a que transcurra 2 minutos, este actúa
como mordiente, fijando el colorante
- Se volvió a lavar con agua
 Tercer reactivo: Alcohol
- Se lavó con alcohol, para producir la decoloración de las bacterias Gram-
, mientras que las bacterias Gram+ permanecieron teñidas de color violeta
 Cuarto reactivo: Safranina

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 - Se añadió por ultimo safranina y se dejó actuar por 2 minutos, para así
teñir a las bacterias Gram-

 Para finalizar se lavó con abundante agua y se dispuso a secar los

portaobjetos con ayuda del mechero.

 Con el objetivo de destruir a las bacterias, de tal manera que no sean

contaminantes para manipularlas.

 Se prosiguió a llevar todos los portaobjetos al microscopio.

 Enfocamos con el objetivo 10X, para así buscar el campo adecuado

y luego al objetivo 100X, colocando una gota de aceite de inmersión
en medio del portaobjetos.

OBSERVACIONES:

1er Portaobjeto: Staphylococcus aureus

Se observa:

 Bacterias Gram
positivas (teñidas de
color violeta)
 Cocos
 Se presentan
agrupadas similar a un
racimo de
uvas(estafilococos)

2do Portaobjeto: Escherichia coli

Se observa:

 Bacterias Gram
negativas (teñidas de
color rosado)
 Bacilos

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3er Portaobjeto: Enterococcus sp (Grupo1)

Se observa:

 Bacterias Gram
positivas (teñidas de
color violeta)
 Cocos
 Están agrupadas en
cadenas cortas

4to Portaobjeto: Hisopado faríngeo (Grupo 1)

Se observa:

 Algunas células

5to Portaobjetos: Hisopado faríngeo (Grupo 2)

Se observa:

 Todas son bacterias

Gram positivas (color
violeta)
 Bacilos en cadenas
largas.
 Cocobacilos.
 Células grandes y
polimorfas nucleares.

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6to Portaobjeto: Hisopado de oído

Se observa:

 Bacterias Gram
positivas(+) y Gram
negativas(-)
 Cocos
 Bacilos
 Leucocitos
 Levadura
 Células sin núcleo
 Gotas de grasa
 Linfocitos

7to Portaobjeto: Hisopado de piel

Se observa:

 Célula en apoptosis
 Bacterias

8vo Portaobjeto: Listeria monocytogenes

Se observa:

 Bacterias Gram
positivas (color
violeta)
 Bacilos
 Se presenta aislados
y en grupos

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9no Portaobjeto: Streptococcus sp

Se observa:

 Bacterias Gram
positivas (color
violeta)
 Cocos
 Están unidas en
cadena en un solo
plano.

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 CONCLUSIONES

 Cuando trabajamos manipulando bacterias hemos recordado y reforzado

la obligación de acatar todas las normas de seguridad a seguir en el
laboratorio, una de las acciones que hemos conocido es la fijación de la
muestra de la bacteria, en el portaobjeto que tiene como finalidad destruir
a la bacteria, mediante fuego (usando un mechero), para evitar ser
contaminados y podemos seguir trabajando con ellas sin peligro. (Fijas en
el portaobjetos, lo observamos en el microscopio)

 Hemos conocido el proceso de coloración diferencial, (en este caso la

Tinción de Gram) donde usamos 4 tipos de colorantes (Cristal violeta,
Lugol, Decolorante Gram y Safranina), el orden es importante, la primera
penetra todas las células, el Lugol lo fija, el siguiente decolora la Gram
negativa y la safranina pode de manifiesto las Gram negativas. Y con
ayuda del microscopio observamos las características morfológicas de la
pared celular de cada bacteria (Gram positiva violeta y Gram negativa
rojo) y algunos microorganismos.

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 CUESTIONARIO
1. ¿Qué es un frotis?

Se denomina frotis a la extensión que se realiza sobre un portaobjetos de una

muestra o cultivo con objeto de separar lo más posible los microorganismos, ya
que si aparecen agrupados en la preparación es muy difícil obtener una imagen
clara y nítida.

2. ¿Qué es un colorante? ¿De qué partes están formados? ¿En base a

qué pueden combinarse de manera distinta a diferentes
componentes de las células?

Los colorantes son sustancias de origen químico o biológico, generalmente

tintes, pigmentos, reactivos u otros compuestos, empleados en la coloración de
tejidos microorganismos para exámenes microscópicos, debiendo tener al
menos, un grupo cromóforo que le proporcione la propiedad de teñir. Estos
pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar
la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos,
esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, entre
otras partes.

3. Investiga el nombre y la molécula de 5 colorantes básicos, 5 ácidos

y 5 neutros.

 Básicos catiónicos: son sales en las que la base, normalmente una amina,
aporta el color, mientras que la parte ácida es incolora. Es decir, con
colorantes catiónicos. Ejemplos de colorantes básicos son la tionina,
safranina, azul de toluidina, el azul de metileno o la hematoxilina.

 Ácidos aniónicos: son sales con el anión coloreado y la base incolora.

Ejemplos de colorantes ácidos son la fucsina ácida, verde rápido, naranja
G o la eosina.

 Sin carga o Neutros: poseen una porción ácida y otra básica, ambas con
capacidad para aportar color. Por tanto un mismo colorante puede teñir
tanto las partes básicas como las ácidas de los tejidos. Por ejemplo, el
eosinato de azul de metileno, rojo nuclear rápido, azul alcian, orceina.

4. ¿Qué factores intervienen en la combinación de los colorantes?

Los principales factores son:

1) Pureza del colorante.- a mayor grado de impurezas a mayor error y menor

calidad de tinción.

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 2) Concentración del colorante.- a mayor concentración mayor error en la
tinción; igual que a menor concentración.
3) El pH del colorante.- este es un factor fundamental ya que depende de las
estructuras que se desee observar para elegir el pH adecuado.
4) Conservación del colorante.- se debe conservarse en lugares frescos,
secos, y oscuros; envasados y etiquetados.
5) Técnica Empleada.- se deberá seguir rigurosamente paso a paso cada
técnica de tinción.
6) Temperatura.- en la mayoría de los casos se utiliza la temperatura
ambiental pero si existen algunas técnicas que requieran de temperatura
adecuada.
7) Cantidad de la muestra.- deberá ser representativa y homogénea pero no
muy grande.
8) Realizar correctamente el frotis.- se debe fijarse bien para que cuando se
les añada los colorantes mordientes y decolorantes no arrastren a los
microorganismos que se desee observar.
9) Soluciones mordientes.- en ciertos casos son necesarios ya que actúan
como fijadores y ayudan a la fijación del colorante a las correspondientes
estructuras.
10) Tiempos de Tinción.- es necesario que todas las sustancias se
mantengan en la preparación un tiempo preciso y variable según la
tinción.

5. ¿Para qué sirve un mordente? ¿Cuáles sustancias o condiciones

actúan como mordentes?

Los mordientes intensifican la tinción porque aumentan la afinidad de la célula

por el colorante. También se pueden utilizar para producir un engrosamiento de
ciertas estructuras celulares externas, como los flagelos, que debido a su
delgadez no podrían ser visualizados de otra forma. Los Mordientes, como el
Lugol, son sustancias que aumentan la afinidad de la célula por el colorante.
Suelen añadirse después del colorante en determinadas tinciones diferenciales.
6. Fundamenta las siguientes tinciones: Gram, Ziehl-Neelsen, esporas,
flagelos y negativa de cápsula.

Tinción de Gram.- Es definida como una tinción diferencial, ya que utiliza dos
colorantes y clasifica a las bacterias en dos grandes grupos: bacterias Gram
negativas y bacterias Gram positivas.

Tinción Ziehl-Neelsen.- La tinción de Ziehl-Neelsen es una coloración

diferencial útil para detectar bacterias acido-alcohol resistentes entre ellas, la
identificación de micro bacterias, aunque no permite la diferenciación de distintas
especies.

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Tinción de esporas.- La tinción de esporas bacterianas, también llamada tinción
Schaeffer-Fulton, es utilizada ampliamente para la identificación de bacterias
esporuladas, generalmente pertenecientes a los géneros Bacillus y Clostridium,
algunas de las cuales son patógenas por naturaleza.

Tinción de flagelos.- Los flagelos bacterianos son estructuras de locomoción

demasiado finas para visualizarlos con el microscopio óptico sin tinción. Para
lograr su coloración se trata de engrosarlos aplicando soluciones coloidales
inestables de ácido tánico, que se depositan sobre estas estructuras engrosando
el diámetro aparente de los mismos, de tal manera que se hacen visibles al
microscopio óptico con una tinción con fucsina básica.

Tinción negativa de capsulas.- La tinción negativa de cápsulas es una tinción

estructural, ya que pone de manifiesto las cápsulas y no tiñe los
microorganismos.

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 BIBLIOGRAFIAS

 Frotis
[Link]
 Colorante y Técnicas de tinción
[Link]
[Link]
 Factores que intervienen en la tinción
[Link]
[Link]
 Mordiente
[Link]
_02/56/[Link]
[Link]
2/[Link]#Anchor5
 Tinciones definiciones
[Link]
[Link]
IVD16_es.pdf

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