Laboratorio 5.

Producción de etanol a partir de Saccharomyces cerevisiae inmovilizada en alginato

de calcio

1
Laura Camila García Orozco
1
Nicolas Ñustes
2
Yomaira Lisnedy Uscategui Maldonado
1,2
Universidad de la Sabana, Facultad de ingeniería.
1
Estudiantes Bioquímica, 2Profesora

Bogotá D.C., 30 de septiembre 2019

RESUMEN: En el presente informe se muestran los resultados obtenidos en la producción de etanol a

partir de Saccharomyces cerevisiae inmovilizada en alginato de calcio al 3% p/v. el alginato forma pequeñas
esferas en las que atrapa a las levaduras, su rendimiento fue del 0,958%. Por otra parte, los procedimientos
utilizados en la práctica fueron: la determinación de azúcares por medio de DNS con la absorbancia medida
a 540 nm y una curva de calibración mediante el índice de refracción para calcular la concentración de
azúcar reductor. Por último, se llevó a cabo un proceso de conteo celular en la cámara de Neubauer en un
medio líquido, todo con la finalidad de obtener el número de células por unidad de volumen (222,75 x 103
células /mL).
PALABRAS CLAVE: etanol, inmovilización en alginato, cámara de Neubauer, fermentación,
Saccharomyces cerevisiae.
ABSTRACT: This report shows the results obtained in the production of ethanol from Saccharomyces
cerevisiae immobilized in 3% w / v calcium alginate. Alginate forms small spheres in which it traps yeasts,
its yield was 0.958%. On the other hand, the procedures used in practice were: the determination of sugars
by means of DNS with the absorbance measured at 540 nm and a calibration curve using the refractive
index to calculate the concentration of reducing sugar. Finally, a cell count process was carried out in the
Neubauer chamber in a liquid medium, all in order to obtain the number of cells per unit volume (222.75 x
103 cells / mL).
KEY WORDS: ethanol, alginate immobilization, Neubauer chamber, fermentation, Saccharomyces
cerevisiae.
INTRODUCCIÓN
La levadura es un microorganismo aerobio (no
𝐶6 𝐻12 𝑂6 → 2𝐶2 𝐻5 𝑂𝐻 + 2𝐶𝑂2 + 𝐸𝑛𝑒𝑟𝑔𝑖𝑎
necesita la presencia de oxigeno) encontrado
dentro de los hongos, este microorganismo
Saccharomyces cerevisiae es la especie más
requiere un ambiente cálido y húmedo y una
común del género Saccharomyces, comúnmente
fuente de alimento (como miel, melaza o azúcar
conocida como levadura de panadería o cerveza.
blanca) para crecer, siendo un agente fermentador
Esta levadura puede fermentar glucosa en etanol
en la producción de etanol. Es decir, estos son
en condiciones anaeróbicas. El microorganismo
capaces de convertir carbohidratos en etanol y
es ideal para la producción de etanol porque
dióxido de carbono sin intervenir directamente en
posee varias propiedades, como: tasas de
el proceso fermentativo como se muestra en la
crecimiento rápidas, utilización eficiente de la
siguiente reacción: (Deák, 2003).
glucosa y producción de etanol, y una tolerancia
al estrés ambiental como la alta concentración de Se depositó 10 gotas de alginato de sodio en 10
etanol, un amplio rango de pH y bajo niveles de mL de solución salina isotónica estéril, se
oxígeno (Willaert, 2015). transfirieron a un balón aforado de 25mL y se
aforaron con solución salina; con esta se realizó
El atrapamiento celular es la técnica más utilizada
conteo celular en cámara de Neubauer y se
para la inmovilización de células enteras. Esta
reportaron número de células/esfera.
técnica, en la que las células se incluyen dentro
de una red rígida, es lo suficientemente porosa Después de haber formado las esferas, se esperó
como para permitir la difusión de sustratos y
unos 60 minutos hasta que endurecieron, luego se
productos, protege el microorganismo
retiraron de la solución de cloruro de calcio,
seleccionado del medio de reacción y tiene una
haciéndolas pasar por un colador al lado del
alta eficiencia de inmovilización (Guisan, 2006).
mechero; se llevaron a un Erlenmeyer con
El atrapamiento en perlas de alginato de calcio
desprendimiento, que contenga 100 mL de medio
insolubles se reconoce como rápido, no tóxico, de cultivo estéril (Glucosa: 100 g/L, KH2PO4:
económico y versátil, y es el método más
g/L, MgSO4*7H2O: 1g/L, ajustar el pH a 4,5. El
utilizado para la inmovilización celular. La medio se esterilizó a (15psi por 15 minutos) con
mayoría de los procesos de inmovilización
agitación, este se conectó a una manguera que
celular se llevan a cabo actualmente utilizando
burbujeaba solución de hidróxido de calcio
alginato. El alginato es una familia de
(0,1%p/v). Se colocó el Erlenmeyer en un
copolímeros binarios no ramificados de origen
agitador orbital a 200rpm y 30°C.
natural que contienen ácido D-manurónico y
ácidos L-gulurónicos unidos por enlaces 1,4- Se tomó una muestra de 1 mL para medir
glucosídicos (Zhu, 2007). azucares reductores y concentración de etanol
El objetivo del presente estudio fue determinar el cada dos horas. Se dejó fermentar 17 horas y al
rendimiento de la producción de etanol a partir de terminar este tiempo se tomó la solución de
glucosa usando Sacharomyces cerevisiae hidróxido de calcio y se filtró el precipitado. Se
inmovilizada. colocó en horno a 60°C para luego determinar la
cantidad de carbonato de calcio y posteriormente
MATERIALES Y METODOS por estequiometria el dióxido de carbono.
Se preparó una solución de 50mL de alginato de
sodio al 3% p/V, se mezcló el alginato hasta Determinación de azúcares reductores por medio
completa solubilidad y se agregó lentamente al de ácido dinitrosalicilico (DNS)
agua para evitar formación de grumos. Se realizó
una esterilización incipiente mediante Se colocaron en 6 tubos de ensayo las cantidades
calentamiento a baño maría (92°C) por 20 que aparecen en la tabla 1.
minutos. Se dejó en reposo la solución a
temperatura ambiente hasta alcanzar una
temperatura por debajo de los 40°C.

Se pesó 1,5g de levadura y se suspendieron en

25mL de agua destilada estéril y se mezclaron
con la solución de alginato preparada
previamente hasta alcanzar una mezcla
homogénea. Se colocó la suspensión en una
jeringa estéril y se descargó de manera lenta (gota
a gota) la suspensión en la solución de cloruro de
calcio 0,1M en agitación.
Tabla 1. Volúmenes utilizados en la Tabla 2. Volúmenes usados para la
preparación de la curva estándar para preparación de la curva de calibración.
determinar los azúcares reductores por medio
de ácido dinitrosalicilico. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 1
0 1
B 1 2 3 4 5 6
Solución 10 12 15

Etanol
- 25 50 75

(µl)

(µl)

100
120
140
160
180
200
20
40
60
80
B (µl) 0 5 0

0
Agua
50 47 45 42 40 37 35
destilada
0 5 0 5 0 5 0
(µl)

Agua destilada
Volumen 50 50 50 50 50 50 50

1000
final (µl) 0 0 0 0 0 0 0

(µl)

980
960
940
920
900
880
860
840
820
800
Concentr
ación - 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
(mg/ml)

De las muestras tomadas a diferentes tiempos, se

%v/v

10%
12%
14%
16%
18%
20%
2%
4%
6%
8%
0
tomaron 50µl de la solución en tubos de ensayo y
se adicionaron 450µl de agua destilada.
A todos los tubos, incluyendo los de la curva de %p(mg) /

12,779%
14,952%
17,232%
19,625%
10,704%
calibración se le adicionaron 500µl de DNS

1,602%
3,271%
5,011%
6,826%
8,722%
v(µl)
(Solución A), después se llevaron los tubos a 0
ebullición durante 5 minutos e inmediatamente se
pasaron a agua-hielo.
Se adicionaron 5mL de agua destilada, se agitó y
se dejó en reposo durante 15 minutos, luego se Cámara de Neubauer
leyó la absorbancia a 540nm. En caso de que la
ABS de las muestras problema hubiera sido Se limpió la cámara y la laminilla de cuarzo
superior a 1,1 se debía hacer diluciones de las suavemente con alcohol. Se colocó la laminilla de
muestras en agua destilada, antes de hacer el cuarzo sobre la cámara en forma vertical, esta
procedimiento de DNS. debía quedar centrada. Se procedió a llenar la
cámara. Se llenó con micropipeta pequeña o con
Curva de calibración de etanol mediante una jeringa.
determinación de índice de refracción
Conteo
Para la realización de la curva de calibración del Se llevó la cámara al microscopio y se enfocó el
índice de refracción en función de la cuadro de conteo con el ocular de 4X. Como las
concentración de etanol se partió de una solución células que se contaron eran pequeñas, se ubicó
de etanol al 99,9%. Se prepararon las siguientes en la cuadricula central y se pasó al cular de 10X.
soluciones (ver tabla 2.) y se midió el índice de En esta cuadricula se visualizaron 25 cuadros, de
refracción a cada tubo. los cuales se contaron las células presentes en 5
campos, se contaron los cuadros de las esquinas
y el central, lo que garantizó un conteo aleatorio.
Para realizar el conteo se pasó al ocular de 40X,
donde se visualizó cada uno de los campos y con
ayuda del carro del microscopio se desplazó la
cuadricula hasta contar en todos los cuadros. Las
células se contaron cuadro por cuadro y se hizo Concentración vs Absorbancia
un total. 0,6

Después de contar las células se procedió a 0,5

calcular el número de células por unidad de
volumen. Para esto se utilizó el área de cada 0,4

Absorbancia
cuadro, el espacio ocupado por el líquido en el
que están las células que es el mismo espacio que 0,3
y = 0,4791x - 0,0107
hay entre la cuadricula de la cámara y la laminilla R² = 0,9917
0,2
de cuarzo.
0,1
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Para la determinación de azucares reductores por 0
medio de ácido dinitrosalicilico (DNS), se 0 0,5 1 1,5
preparó una curva patrón, obteniendo los Concentración (mg/mL)
resultados consignados en la tabla 3.
Tabla 3. Resultados de curva de calibración Figura 1. Curva de calibración para
para determinación de azúcares reductores determinación de azúcares reductores
(Glucosa).
Concentración (mg/mL) Absorbancia
Haciendo uso de la ecuación obtenida en la curva
0,2 0,084 de calibración (ver figura 1.):
0,4 0,164
0,6 0,285 y = 0,4791x - 0,0107
0,8 0,401 Se calcula la concentración de azúcares
1 0,460 reductores, despejando la variable x, los
1,2 0,554 resultados obtenidos se muestran a continuación
(ver tabla 4.):

Con los datos reportados en la tabla 3. se procede Tabla 4. Resultados de concentración de

a realizar la curva de calibración de absorbancia azúcares reductores.
vs concentración (ver figura 1.)
Tiempo Concentración
Muestra (horas) Absorbancia (mg/mL)
1 2,5 0,583 1,239
2 5,0 0,450 0,961
3 7,5 0,416 0,890
4 10,0 0,391 0,838
5 11,5 0,370 0,795
6 14,5 0,329 0,709
7 16,5 0,233 0,509
8 18,5 0,210 0,461
9 20 0,060 0,147
El método DNS es una técnica colorimétrica que
consiste en una reacción redox entre el 3,5 – ácido Concentracion vs IR
dinitrosalicilico y los azucares reductores 1,346
presentes en la muestra. El poder reductor de
1,344
estos azucares viene de si grupo carbonilo, que
puede oxidarse al grupo carboxilo por agentes 1,342
oxidantes suaves, mientras que el DNS (amarillo)

IR (nD)
1,34
se reduce a ácido 3-amino-5-nitrosalicilico (rojo)
1,338
que se cuantifica por espectrofotometría en 540
1,336 y = 0,0006x + 1,3332
nm, la longitud de onda de absorbancia máxima R² = 0,9986
(ver figura 2). La intensidad del color es 1,334
proporcional a la concentración de azucares, esta
1,332
reacción se lleva a cabo en un medio alcalino 0 5 10 15 20
(Miller,1959).
Concentración (%v/v)

Figura 3. Curva de calibración de etanol

(Índice de refracción vs concentración)
Con la curva de calibración se obtiene la siguiente
ecuación:
Figura 2. Conversión de azúcares reductores
y = 0,0006x + 1,3332
por DNS (Miller,1959).
donde
Los datos obtenidos de los índices de refracción
para la curva de calibración del etanol, se x = concentración de etanol
encuentran reportados en la tabla 5.
y = el índice de refracción
Tabla. 5. Resultados de índice de refracción
para la curva de calibración de etanol. Para determinar la concentración se despeja x.
Los resultados de las concentraciones obtenidas
Concentración (%v/v) IR (nD) se encuentran consignados en la tabla 6.
0 1,3335 Tabla 6. Resultados de índice de refracción y
2 1,3344 concentración (azúcares reductores o etanol)
4 1,3355 para muestra fermentada.
6 1,3365
8 1,3377 Tiempo Concentración
Muestras (horas) IR (%v/v)
10 1,3389
1 2,5 1,3425 15,5
12 1,3401
2 5,0 1,3423 15,166
14 1,3412
3 7,5 1,3422 15
16 1,3424
4 10,0 1,3422 15
18 1,3436
5 11,5 1,3421 14,833
20 1,3450
6 14,5 1,3415 13,833
7 16,5 1,3410 13
Los resultados reportados en la tabla 5. son 8 18,5 1,3403 11,833
graficados a continuación (ver figura 3.) 9 20 1,3396 10,667
En la tabla 4 y 6 se evidencia una disminución del La cantidad de carbonato de calcio obtenido se
azúcar reductor a medida que pasa el tiempo. Esto calcula teniendo en cuenta la tabla 7.
se debe a que la vía metabólica del glucolisis de
la levadura empleada convierte la glucosa en 𝐶𝑎𝐶𝑂3 𝑜𝑏𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑜 = (0,4979 − 0,4346)g =
piruvato, que luego puede fermentarse en etanol 0,0633g
en condiciones anaeróbicas. La energía para el Una vez se calcula los gramos de carbonato de
crecimiento de las células S. cerevisiae durante la calcio obtenidos, se procede a efectuar una
fermentación de etanol son proporcionadas relación estequiométrica, lo cual permite calcular
principalmente por las vías glucolíticas, es decir, la cantidad de dióxido de carbono producido.
las levaduras obtienen su carbono y energía al
1𝑚𝑜𝑙 𝐶𝑎𝐶𝑂
3
metabolizar la glucosa, esta se usa comúnmente 0,0633 g 𝐶𝑎𝐶𝑂3 × 100,087𝑔 𝐶𝑎𝐶𝑂 ×
3
como la única fuente de carbono para el 1𝑚𝑜𝑙𝐶𝑂2 −4
crecimiento de la levadura (Walker, 2014). 1𝑚𝑜𝑙 𝐶𝑎𝐶𝑂3
= 6,324 × 10 𝑚𝑜𝑙𝐶𝑂2 ×
2𝑚𝑜𝑙 𝐶2 𝐻5 𝑂𝐻
Para determinar el rendimiento en la producción = 6,324 × 10−4 𝑚𝑜𝑙𝐶2 𝐻5 𝑂𝐻
2𝑚𝑜𝑙 𝐶𝑂2
de etanol, se tiene en cuenta la siguiente ecuación: 0,003𝑚𝑜𝑙𝐶2 𝐻5 𝑂𝐻
%𝑅𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 = × 100
𝑅𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑟𝑒𝑎𝑙 0,066𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠𝐶2 𝐻5 𝑂𝐻
%𝑅𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 = 𝑅𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑡𝑒𝑜𝑟𝑖𝑐𝑜 × 100
%𝑅𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 = 0,958%
Para determinar el rendimiento teórico se tiene en
cuenta que en la práctica se hizo uso de un cultivo El rendimiento de la reacción pudo ser afectado
estéril que contenía 100 g/L de glucosa y que la por diferentes variables como la concentración,
producción de etanol ocurre mediante la siguiente temperatura de fermentación, tipo de azúcar y
reacción: sistema de cultivo. En este caso el rendimiento
fue bajo posiblemente a la concentración de
𝐶6 𝐻12 𝑂6 → 2𝐶2 𝐻5 𝑂𝐻 + 2𝐶𝑂2 + 𝐸𝑛𝑒𝑟𝑔𝑖𝑎 glucosa ya que las altas concentraciones iniciales
de glucosa en los medios fermentativos pueden
100𝑔 𝐶6 𝐻12 𝑂6 1𝑚𝑜𝑙 𝑑𝑒 𝐶 𝐻 𝑂 2𝑚𝑜𝑙 𝐶 𝐻5 𝑂𝐻
× 180,156 𝑔 𝐶6 𝐻12 𝑂6 × 1𝑚𝑜𝑙 𝑑𝑒 2𝐶 causar inhibición del sustrato, lo que disminuye
𝐿 6 12 6 6 𝐻12 𝑂6
sustancialmente la eficiencia de la fermentación
1,110𝑚𝑜𝑙𝐶2 𝐻5 𝑂𝐻 1𝐿 del etanol (Ingledew, 1999).
= × × 60𝑚𝐿
𝐿 1000𝑚𝐿 Con el fin de calcular la cantidad de células
= 0,066𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠𝐶2 𝐻5 𝑂𝐻 atrapada por el alginato de calcio se realiza un
conteo celular en la cámara de Neubauer, los
Tabla 7. Pesos de material y carbonato de resultados se encuentran consignados en la tabla
calcio. 8.
Papel filtro + muestra (g) 0,4979 Tabla 8. Conteo de número de células por
Peso papel filtro (g) 0,4346 cuadrante mediante cámara de Neubauer

Cuadrante # # células
El rendimiento real es calculado a partir de la
1 236
determinación por peso de la cantidad de
2 233
carbonato de calcio obtenido; mediante la
siguiente reacción de descomposición a partir de 3 217
calor: 4 205

𝐶𝑎𝐶𝑂3 ≜ 𝐶𝑂2 + 𝐶𝑎𝑂

Si el conteo celular se realiza en las 4 áreas Encyclopedia of Food Microbiology; Batt, C.,
sombreadas como L, se tiene que el volumen total Tortorello, M.L., Eds.; Elsevier Science
de células por mililitro es: Publishers: Boston, MA, USA.
Willaert R. (2015). Biochemistry of Beer
𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠/𝑚𝐿 = 2500 ×
Fermentation. In: Pires E, Brányik T, editors.
𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑎𝑑𝑎𝑠 𝑒𝑛 𝑙𝑎𝑠 4 𝑎𝑟𝑒𝑎𝑠 ×
Biochemistry of beer fermentation. 2nd ed. New
𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛
𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 1 York: Springer International Publisher. pp. 627–
= 2500 × 891 × = 222,75 × 103 653.
𝑚𝐿 10
Zhu, Y. (2007). Immobilized Cell Fermentation
Con este resultado se puede analizar que por cada for Production of Chemicals and Fuels.
mL de solución el alginato de calcio inmovilizo Bioprocessing for Value-Added Products from
222,75 × 103 células. Renewable Resources, 373–396.
Los errores de este método de recuento de células doi:10.1016/b978-044452114-9/50015-3
están en el rango de 20-30% debido a errores de
pipeteo, errores estadísticos, errores del volumen
de muestra introducido en la cámara.
CONCLUSIONES
El rendimiento experimental para la obtención de
etanol a partir de la fermentación de levadura
Saccharomyces cerevisiae fue de 0,958%. El
rendimiento fue bajo debido a factores como la
alta concentración de glucosa.
La cámara de Neubauer permitió determinar que
por cada mL de solución de alginato de calcio se
inmovilizó 222,75 × 103 células.
BIBLIOGRAFIA
Deák, T. (2003). YEASTS. Encyclopedia of Food
Sciences and Nutrition, 6233–6239.
doi:10.1016/b0-12-227055-x/01302-x
Guisan JM. (2006). Inmobilization of enzymes
and cells. Humana Press, Totowa, NJ
Ingledew, W.M. (1999). Alcohol Production by
Saccharomyces Cerevisiae: A Yeast Primer, in
the Alcohol Textbook, 3rd ed.; Nottingham
University Press: Nottingham, UK.
Miller, G. (1959). Use of Dinitrosalicylic Acid
Reagent for Determination of Reducing Sugar.
Analytical Chemistry 31, pp. 426-428
Walker, G.M. (2014). Fermentation (Industrial).
Media for Industrial Fermentations. In