PRUEBA DE COOMBS

Cecilia Catacora T.

En 1945 Coombs, Mourant y Race describen una prueba para detectar anticuerpos anti-
Rho (anti D), que no aglutinaban en el suero de un paciente. Más tarde esta misma prueba
fue usada para demostrar in vivo la presencia de anticuerpos incompletos que cubrían los
eritrocitos como en la AHAI.
Es un examen de sangre que se usa en inmunología y hematología también llamado Prueba
de antiglobulina. Este análisis puede detectar la presencia de anticuerpos en sueros que
reaccionan con antígenos en la superficie de los glóbulos rojos.
Los principios de la prueba de antiglobulina son los siguientes: como los anticuerpos y el
complemento de origen humano (globulinas) se inyectan en un conejo, éste va a producir
antiglobulinas humanas como respuesta.
Las moléculas de antiglobulina actúan como un puente, que une a los anticuerpos
incompletos a los glóbulos rojos.
Hay dos variantes de esta prueba:

 Cuando la antiglobulina humana se emplea para detectar anticuerpos unidos a

eritrocitos in vivo, se le llama prueba de antiglobulina directa o Coombs directo.
directa se hace sobre una muestra de glóbulos rojos del cuerpo. Se realiza a
pacientes en los primeros momentos de una reacción hemolítica y en el diagnóstico
de anemias hemolíticas auto inmunes, hemólisis inducidas por drogas, y
enfermedad hemolítica del recién nacido.

 En cambio, cuando la antiglobulina humana se usa para detectar la reacción de

anticuerpos y antígenos in vitro, después de una apropiada fase de incubación, se
le denomina prueba de antiglobulina indirecta o Coombs indirecto. Se realiza a
pacientes politransfundidos, embarazadas, multíparas.
Las siguientes condiciones provocan que se formen anticuerpos:

 Reacción a una transfusión

La sangre humana se clasifica de acuerdo a ciertos marcadores
(llamados antígenos ) que se encuentran en la superficie de los glóbulos rojos . Si
recibe una transfusión de sangre, la sangre transfundida debe ser compatible con
su tipo de sangre. Eso quiere decir que la sangre transfundida debe tener los
mismos antígenos de sus glóbulos rojos. Si recibe una transfusión de sangre con
antígenos diferentes a los suyos (sangre incompatible), su sistema
inmunitario destruye los glóbulos transfundidos. Esto se conoce como una reacción
a la transfusión y puede causar enfermedades graves o, incluso, la muerte.

 Sensibilización al Rh
El Rh es un antígeno. Si una mujer embarazada con sangre Rh negativo está
gestando a un bebé (feto) con sangre Rh positivo, puede ocurrir la sensibilización al
Rh. El bebé podría tener sangre Rh positivo si el padre tiene sangre Rh positivo. La
sensibilización al Rh ocurre cuando la sangre del bebé se mezcla con la sangre de
la madre durante el embarazo o el parto. Esto hace que el sistema inmunitario de la
madre produzca anticuerpos contra los glóbulos rojos del bebé en embarazos
futuros. Esta respuesta de anticuerpos se llama sensibilización al Rh y, según
cuándo ocurra, puede destruir los glóbulos rojos del bebé antes o después de su
nacimiento. Si ocurre la sensibilización, el feto o el recién nacido puede desarrollar
problemas de leves a graves (llamados enfermedad del Rh o eritroblastosis fetal ).
En casos poco comunes, si la enfermedad del Rh no se trata, el feto o el recién
nacido puede morir.
Una mujer con Rh negativo puede recibir una inyección de inmunoglobulina Rh
(como RhoGAM) que casi siempre evita que ocurra la sensibilización. Los
problemas de la sensibilización al Rh se han vuelto muy poco frecuentes desde que
se desarrolló la inmunoglobulina Rh.

 Anemia hemolítica autoinmunitaria

Un tipo de anemia hemolítica , llamada anemia hemolítica autoinmunitaria, es una
enfermedad poco frecuente que provoca que se formen anticuerpos contra los
propios glóbulos rojos de una persona.
Aplicaciones de la prueba de la antiglobulina o de coombs:
1. Prueba de Coombs directa
a) En la investigación de autoanticuerpos, como en la anemia hemolítica autoinmune.
b) En la investigación de aloanticuerpos, como en la enfermedad hemolítica del recién
nacido.
c) Para documentar una reacción hemolítica transfusional.
2. Prueba de Coombs indirecta
a) Permite la detección de anticuerpos irregulares en un suero problema.
b) Se utiliza para la determinación del fenotipo de los glóbulos rojos.
c) Como parte de las pruebas cruzadas.
Muestra
Glóbulos rojos
a) Recolección: la sangre debe ser obtenida asépticamente, con o sin anticoagulante.
b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: EDTA, heparina, ACD (ácido
cítrico, citrato, dextrosa), CPD (citrato, fosfato, dextrosa) o CPDA-1 (citrato, fosfato,
dextrosa, adenina).
c) Sustancias interferentes conocidas: las muestras contaminadas o con hemólisis
marcada no deben utilizarse.
d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras deben ser analizadas lo
antes posible. Si el análisis no se realiza en el momento, las muestras deberán
conservarse entre 2-10°C. Si se utilizó heparina o EDTA, la tipificación debe llevarse a
cabo dentro de las 48 horas de obtenida la muestra. Las muestras obtenidas con ACD,
CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35 días de extraídas. Si se emplean
coágulos, deberá efectuarse la tipificación dentro de los 7 días de obtenida la muestra.
Los coágulos no deben ser refrigerados antes de las pruebas directas. Cuando se
efectúan pruebas antiglobulina directas, la sangre debe ser preferentemente fresca
(menos de 24 horas de la extracción). Las muestras de sangre de donantes pueden ser
analizadas hasta su fecha de vencimiento. Los sueros deben conservarse no más de 24
horas a 2-10°C o 1 mes a -20°C. Sueros almacenados a -20°C o menos por períodos
prolongados pierden la actividad del complemento. Las pruebas antiglobulínicas directas
deben realizarse en eritrocitos frescos obtenidos con EDTA para evitar la sensibilización
“in vitro” con factores del complemento.
Material requerido

 Centrífuga
 Baño de agua a 37o C
 Tubos de hemólisis
Procedimiento
Prueba antiglobulina indirecta (en solución salina de fuerza iónica normal)
1. En un tubo de hemólisis colocar 2 gotas del suero a probar.
2. Agregar 1 gota de suspensión de glóbulos rojos a probar al 3%, lavados 3 veces y
resuspendidos en PBS (Solución Salina Buffer Fosfato). El gotero provisto dispensa
un volumen de 50 ± 5 ul. Es importante que se mantenga la relación reactiva: células
en todos los sistemas de ensayo.
3. Mezclar e incubar a 37°C durante 30-60 minutos.
4. Lavar los glóbulos 3 veces con PBS. Asegurarse de remover la mayor cantidad
posible de solución salina al final de cada lavado. Descartar completamente el
sobrenadante luego del último lavado.
5. Agregar 2 gotas de Suero Anti-humano (poliespecífico) al botón de células. Mezclar
perfectamente y centrifugar durante 15 segundos a 1.000 g.
6. Agitar suavemente el tubo a fin de deshacer el botón celular y observar
macroscópicamente. La observación puede facilitarse si se emplea una fuente de
 luz difusa. Tener en cuenta que agitaciones demasiado vigorosas pueden dar lugar
a lecturas negativas de un aglutinado débil (falso negativo).
7. Los resultados negativos deben confirmarse por adición de glóbulos rojos
sensibilizados con IgG débiles (Control de Coombs).
Prueba Antiglobulina Indirecta (en solución fisiológica de baja fuerza iónica).
El empleo de esta solución permite reducir el tiempo de incubación a 15 minutos. Los
glóbulos rojos deben lavarse 2 veces con PBS y una vez con LISS. Finalmente preparar
con esta solución una suspensión de glóbulos rojos al 3%.
1. Colocar en un tubo de hemólisis 1 gota de suero a probar.
2. Agregar 1 gota de glóbulos rojos a probar al 3% en LISS.
3. Mezclar e incubar a 37°C durante 15 minutos en baño de agua.
4. Lavar los glóbulos 3 veces con PBS. Asegurarse de remover la mayor cantidad
posible de solución salina al final de cada lavado. Descartar completamente el
sobrenadante luego del último lavado.
5. Agregar 2 gotas de Suero Anti-humano (poliespecífico) al botón de células. Mezclar
perfectamente y centrifugar durante 15 segundos a 1.000 g.
6. Agitar suavemente el tubo a fin de deshacer el botón celular y observar
macroscópicamente. La observación puede facilitarse si se emplea una fuente de
luz difusa. Tener en cuenta que agitaciones demasiado vigorosas pueden dar lugar
a lecturas negativas de un aglutinado débil (falso negativo).
7. Los resultados negativos deben confirmarse por adición de glóbulos rojos
sensibilizados con IgG débiles (Control de Coombs).
Prueba Antiglobulina Directa
Se emplea para demostrar la absorción “in vivo” de IgG y/o fracciones del complemento en
la superficie de los glóbulos rojos.
1) Preparar una suspensión de glóbulos rojos a probar en PBS al 3%.
2) En un tubo de hemólisis colocar 1 gota de esta suspensión.
3) Lavar los glóbulos 3 veces con PBS. Asegurarse de remover la mayor cantidad
posible de solución salina al final de cada lavado. Descartar completamente el
sobrenadante luego del último lavado.
4) Agregar 2 gotas de Suero Anti-humano (poliespecífico) al botón de células. Mezclar
perfectamente y centrifugar durante 15 segundos a 1.000 g.
5) Agitar suavemente el tubo a fin de deshacer el botón celular y observar
macroscópicamente. La observación puede facilitarse si se emplea una fuente de
luz difusa. Tener en cuenta que agitaciones demasiado vigorosas pueden dar lugar
a lecturas negativas de un aglutinado débil (falso negativo).
6) Los resultados negativos deben confirmarse por adición de glóbulos rojos
sensibilizados con IgG débiles (Control de Coombs).
Interpretación

 Prueba de Coombs directa

Cuando la prueba de antiglobulina de tipo directa es positiva, están presentes
anticuerpos incompletos IgG o existe C3d unido a los eritrocitos. En cambio, cuando
 no existe aglutinación (negativa), están ausentes los anticuerpos en la superficie de
los eritrocitos. Una prueba de Coombs directa negativa no necesariamente significa
que hay ausencia de anticuerpos incompletos sobre los glóbulos rojos, pues los
reactivos usuales de antiglobulina humana poliespecífico y anti-IgG que se usan
únicamente reaccionan cuando hay 200 moléculas o más de IgG por eritrocito. De
la misma manera, si el anticuerpo involucrado es una IgA, como en algunos casos
de anemia hemolítica autoinmune, la prueba será negativa, pues el reactivo usual
no contiene anti-A.

 Prueba de Coombs indirecta

La prueba de antiglobulina de tipo indirecta es positiva (aglutinación) cuando hay
anticuerpos incompletos libres en el suero.

Resultados

Una prueba de Coombs directa anormal (positiva) significa que el paciente tiene anticuerpos
que actúan contra sus glóbulos rojos, lo cual puede deberse a:

 Anemia hemolítica autoinmunitaria sin otra causa

 Leucemia linfocítica crónica u otro trastorno linfoproliferativo
 Anemia hemolítica inducida por fármacos (muchos fármacos han sido asociados
con esta complicación)
 Eritroblastosis fetal (enfermedad hemolítica del recién nacido)
 Mononucleosis infecciosa
 Infección por micoplasma
 Sífilis
 Lupus Eritematoso Sistémico u otra afección reumatológica.
 Reacción a transfusión como la ocasionada por unidades de sangre cotejadas de
manera impropia

Esta prueba también es anormal en algunas personas sin una causa clara, especialmente
entre los ancianos. Hasta el 3% de las personas que están hospitalizadas sin un trastorno
sanguíneo conocido tendrán un resultado anormal en la prueba de Coombs directa.
Una prueba de Coombs indirecta anormal (positiva) significa que el paciente presenta
anticuerpos que actuarán contra los glóbulos rojos que el cuerpo asume como extraños.
Esto puede sugerir la presencia de:

 Anemia hemolítica autoinmunitaria o inducida por fármacos.

 Eritroblastosis fetal (enfermedad hemolítica).
 Incompatibilidad sanguínea (cuando se utiliza en bancos de sangre).

Control de la prueba de antiglobulina

Como un control del procedimiento de las pruebas cruzadas y del suero de Coombs, en
cada prueba interpretada como negativa se deben agregar eritrocitos D+ sensibilizados con
IgG anti-D, a esto se le conoce como “control de la antiglobulina”. Este control sólo se
emplea en las pruebas negativas, que son la mayoría en la práctica diaria del banco de
sangre.

Interpretación del control de Coombs

Los eritrocitos D+ sensibilizados se agregan a las pruebas de antiglobulina humana

negativas, tanto a las de tipo directa como a las de la variedad indirecta, para confirmar el
resultado. Cuando la aglutinación es positiva, se confirma que la prueba es una verdadera
negativa. Cuando la aglutinación es negativa se tratará de una prueba falsamente negativa.

Limitaciones del procedimiento

Reacciones falsas positivas y falsas negativas pueden ocurrir por las siguientes causas:

 Contaminación química o bacteriana de la muestra u otros materiales empleados

para la prueba.
 Lavado inadecuado de las células. Los pasos de lavado deben completarse lo antes
posible y sin interrupción. Retrasos en completar los pasos de lavado o en la lectura
pueden ocasionar la disociación del complejo antígeno-anticuerpo obteniendo
resultados falsos negativos o positivos débiles.
 Todo resto de solución lavadora puede diluir el reactivo más allá de la concentración
óptima de funcionamiento. Por lo tanto es importante remover la mayor cantidad del
líquido de lavado al finalizar dicho proceso.
 Tiempo o temperatura de incubación inadecuados.
 Tiempo o velocidad de centrifugación inadecuados.
 Concentración inadecuada de glóbulos rojos.
 Agitación excesiva para despegar los glóbulos rojos aglutinados.
 Luego de agregar el reactivo Anti-globulina humana, los ensayos deben ser
centrifugados y leídos inmediatamente.
 Los eritrocitos positivos en una prueba antiglobulínica directa no deben utilizarse
para una prueba antiglobulínica indirecta.
 Los reactivos han sido estandarizados para detectar inmunoglobulinas humanas y
fragmentos C3 unidos a los glóbulos rojos. No son aptos para detectar anticuerpos
de otro origen.
BIBLIOGRAFÍA

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directa) | NorthShore. [online] [Link]. Available at:
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