VALIDACIÓN DE LA DETERMINACIÓN DE HIDROXIMETILFURFURAL (HMF)

EN MIEL DE ABEJAS POR EL MÉTODO 980.23 DE LA AOAC PARA EL

LABORATORIO DE ANÁLISIS DE AGUAS Y ALIMENTOS DE LA UNIVERSIDAD
TECNOLÓGICA DE PEREIRA

PAOLA ANDREA ZAMBRANO CORREA

STEPHANY ORTEGA ALARCÓN

UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA

FACULTAD DE TECNOLOGÍA

ESCUELA DE QUÍMICA

PEREIRA

2015
 VALIDACIÓN DE LA DETERMINACIÓN DE HIDROXIMETILFURFURAL (HMF)
EN MIEL DE ABEJAS POR EL MÉTODO 980.23 DE LA AOAC PARA EL
LABORATORIO DE ANÁLISIS DE AGUAS Y ALIMENTOS DE LA UNIVERSIDAD
TECNOLÓGICA DE PEREIRA

PRESENTADO POR:

PAOLA ANDREA ZAMBRANO CORREA

STEPHANY ORTEGA ALARCON

DIRIGIDO POR:

CARLOS HUMBERTO MONTOYA NAVARRETE

QUÍMICO INDUSTRIAL

PROYECTO DE GRADO

PRESENTADO COMO REQUISITO PARCIAL PARA OPTAR AL TÍTULO DE

TECNÓLOGO EN QUÍMICA

UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA

FACULTAD DE TECNOLOGÍA

ESCUELA DE QUÍMICA

PEREIRA

2015
 DEDICATORIA

Stephany Ortega Alarcón

A Dios por ser mi guía y mi guardián de vida.

Este proyecto se lo dedico a mi madre Luz Nidia Alarcón Amariles, mi padre Luis
Emilio Ortega Millán y a mi hermano Edwin David Ortega Alarcón por la
dedicación, guía, responsabilidad, amor y apoyo incondicional que me brindaron
para poder culminar este peldaño en mi vida; la fortaleza y motivación que me
daban con sus palabras cuando no veía el camino para continuar.

Paola Andrea Zambrano Correa

A Dios y a la vida misma por darme la oportunidad de alcanzar un peldaño más,

en el que espero sea un largo y fructuoso camino. E indudablemente a mi familia,
a mi madre Margoth Correa Vallejo, mi padre Jorge Alberto Zambrano Sánchez y
mi hermano Jorge Andrés Zambrano Correa, a quienes guardo un profundo
agradecimiento por su gran amor, guía, dedicación y apoyo incondicional, los
cuales han sido los cimientos de la gran estructura que conforma mi vida.
 AGRADECIMIENTOS

Agradecemos a Dios por guiarnos en cada paso de nuestra vida y permitirnos

llegar hasta este momento con sabiduría.

Agradecemos a nuestras familias por el continuo afecto, comprensión y apoyo

ofrecido durante la carrera.

Agradecemos a nuestro director, el QI. Carlos Humberto Montoya Navarrete jefe

de laboratorios de la Escuela de Química de la Universidad Tecnológica de
Pereira por habernos brindado la oportunidad, el apoyo necesario y el tiempo
disponible para llevar a cabo este proyecto.

Agradecemos al profesor Ariel Felipe Arcila Zambrano y a los integrantes del

Laboratorio de Aguas y Alimentos de la Universidad Tecnológica de Pereira por
permitirnos desarrollar nuestro proyecto en sus instalaciones y facilitarnos sus
materiales y equipos para poder llevar a la culminación, este trabajo.

Agradecemos al Tecnólogo Químico William Alexander Hernández Herrera por su

asesoramiento, paciencia, colaboración en la realización de este proyecto y junto
con el Químico Industrial Alexis Gonzales Díaz por el acompañamiento durante el
desarrollo experimental.

Agradecemos a la profesora Gloria Edith Guerrero Álvarez por asesorarnos

durante todo el proyecto y por estar pendiente en cada detalle para la continua
mejoría de este.

Agradecemos a nuestros amigos que fueron una grata compañía en nuestro

proceso de aprendizaje y nos apoyaron durante la realización de este trabajo.

Por último agradecemos a todas las personas que contribuyeron en nuestro

crecimiento profesional en especial a nuestros profesores de la Escuela de
Química de la Universidad Tecnológica de Pereira.
 TABLA DE CONTENIDO
Pág.

LISTA DE FIGURAS ________________________________________________________ 10

Pág. ___________________________________________________________________ 10
LISTA DE TABLAS _________________________________________________________ 11
Pág. ___________________________________________________________________ 11
LISTAS DE GRÁFICAS ______________________________________________________ 13
Pág. ___________________________________________________________________ 13
1. RESUMEN ___________________________________________________________ 3
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA __________________________________________ 6
3. JUSTIFICACIÓN _________________________________________________________ 7
4. OBJETIVOS____________________________________________________________ 10
5. MARCO TEÓRICO ______________________________________________________ 11
5.1. ¿QUÉ ES LA MIEL? _________________________________________________________ 11
5.1.1 DESCRIPCIÓN ________________________________________________________________ 11
5.1.2. CLASIFICACIÓN ______________________________________________________________ 11
5.1.3. FACTORES ESENCIALES DE COMPOSICIÓN Y CALIDAD. (Instituto Colombiano de Normas
Técnicas y Certificación.( ICONTEC), 2007) ______________________________________________ 12
5.2. ¿QUÉ ES EL HIDROXIMETILFURFURAL (HMF)? ___________________________________ 13
5.2.1. ETAPAS CRÍTICAS EN LA PRODUCCIÓN DE MIEL DONDE EXISTE EL RIESGO DE FORMACIÓN DE
HMF.____________________________________________________________________________ 15
5.3. DEFINICIONES DE ALGUNOS PARÁMETROS Y VOCABULARIO A UTILIZAR EN LA
VALIDACIÓN (SEGÚN NTC-2194 E ISO 8402). (IVM, 1997). ____________________________ 16
5.4. REQUISITOS DE LA NORMA NTC/ISO/IEC 17025:2005. (ISO, 2005). _________________ 18
5.5. ¿QUÉ ES LA VALIDACIÓN DE UN MÉTODO ANÁLITICO? (Duffau et al., 2010). _________ 19
5.5.1. ESTABLECER PLAN DE VALIDACIÓN ______________________________________________ 23
5.5.2. DESARROLLO DE PRUEBAS DE PARÁMETROS DE VALIDACIÓN ________________________ 23
5.5.3. ELEMENTOS DE CALIDAD ANALÍTICA A CONSIDERAR: ___________________________ 24
5.5.4. EVALUAR RESULTADOS DE LA VALIDACIÓN _______________________________________ 25
5.5.5. INFORME DE VALIDACIÓN _____________________________________________________ 25
5.5.6. SELECTIVIDAD _______________________________________________________________ 25
5.5.7. LINEALIDAD _________________________________________________________________ 25
5.5.8. SENSIBILIDAD _______________________________________________________________ 28
5.5.9. LÍMITES ____________________________________________________________________ 29
5.5.10. Límite de detección (LOD)_____________________________________________________ 29
5.5.11. Límite de cuantificación (LOQ) _________________________________________________ 30
5.5.12. EXACTITUD_________________________________________________________________ 32
5.5.13. ROBUSTEZ _________________________________________________________________ 36
 5.5.14. APLICABILIDAD _____________________________________________________________ 36
5.5.15. INCERTIDUMBRE ___________________________________________________________ 37
5.6. ESPECTROFOTOMETRÍA UV __________________________________________________ 39
5.7. CONDUCTIMETRÍA _________________________________________________________ 40
5.8. POLARIMETRÍA: ___________________________________________________________ 40
5.9. REFRACTOMETRÍA _________________________________________________________ 41
5.10. ASPECTOS BÁSICOS DE LA METROLOGÍA ______________________________________ 42
5.10.1. METROLOGÍA Y CALIDAD _____________________________________________________ 43
5.10.2. METROLOGÍA QUÍMICA ______________________________________________________ 44
5.11. NORMATIVIDAD DE LA MIEL ________________________________________________ 45
5.11.1. CODEX STAND-012-1981 ______________________________________________________ 45
5.11.2. RESOLUCIÓN 1057 del 2010 ___________________________________________________ 45
5.11.3. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC. 1273 _______________________________ 47

6. METODOLOGÍA ________________________________________________________ 47
6.1. MÉTODOS Y EQUIPOS ______________________________________________________ 47
6.2. MUESTRA DE ANÁLISIS _____________________________________________________ 47
6.3. ESPECTROFOTÓMETRO UV-VIS _______________________________________________ 48
6.4. MATERIALES: _____________________________________________________________ 48
6.5. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO 980.23 DE LA AOAC_________________________________ 49
6.6. ACTIVIDADES PRINCIPALES PARA DAR CUMPLIMIENTO A LOS PARÁMETROS DE
VALIDACIÓN. _________________________________________________________________ 51
6.7. ANÁLISIS FISICOQUÍMICOS DE LA MIEL. ________________________________________ 53
6.7.1. Determinación de sólidos insolubles en miel ______________________________________ 53
6.7.2. Determinación del contenido aparente de sacarosa ________________________________ 54
6.7.3. Determinación del contenido de humedad. _______________________________________ 55
6.7.4 Determinación del contenido de cenizas y metales pesados ___________________________ 57
6.7.5. Determinación de conductividad ________________________________________________ 58
6.7.6. Determinación de acidez libre __________________________________________________ 58
6.7.7. Determinación de azúcares reductores ___________________________________________ 59
6.7.8. Determinación de pH _________________________________________________________ 63

7. RESULTADOS __________________________________________________________ 64
7.1. LINEALIDAD_______________________________________________________________ 64
7.2 SELELECTIVIDAD/ESPECIFICIDAD ______________________________________________ 72
7.3. LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN Y LÍMITE DE DETECCIÓN ____________________________ 74
7.4. REPETIBILIDAD Y REPRODUCIBILIDAD _________________________________________ 77
7.5. ROBUSTEZ ________________________________________________________________ 89
7.6. RESULTADOS BROMATOLÓGICOS ____________________________________________ 99
8. DISCUSIÓN DE RESULTADOS ____________________________________________ 110
8.1 LINEALIDAD ______________________________________________________________ 111
8.2. SELECTIVIDAD/ESPECIFICIDAD ______________________________________________ 111
8.3. LÍMITE DE DETECCIÓN Y LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN ___________________________ 111
8.4. REPETIBILIDAD Y REPRODUCIBILIDAD ________________________________________ 112
8.4.1. REPETIBILIDAD______________________________________________________________ 112
8.4.2. REPRODUCIBILIDAD _________________________________________________________ 112
8.5. ROBUSTEZ _______________________________________________________________ 113
8.5.1. Aumento del contenido de HMF por elevación de temperatura en una muestra de miel de
abejas. _________________________________________________________________________ 113
8.5.2. Aumento del contenido de HMF por aumento en la humedad en una muestra de miel de
abejas. _________________________________________________________________________ 114
8.6. ANÁLISIS BROMATOLÓGICOS _______________________________________________ 115
8.6.1. CONTENIDO APARENTE DE SACAROSA __________________________________________ 115
8.6.2. CONTENIDO DE CENIZAS ______________________________________________________ 115
8.6.3. ACIDÉZ LIBRE _______________________________________________________________ 115
8.6.4. HUMEDAD _________________________________________________________________ 116
8.6.5. SÓLIDOS INSOLUBLES EN AGUA ________________________________________________ 116
8.6.6. CONDUCTIVIDAD ____________________________________________________________ 116
8.6.7. PH ________________________________________________________________________ 116
8.6.8. SÓLIDOS SOLUBLES __________________________________________________________ 116
8.6.9. HIDROXIMETILFURFURAL _____________________________________________________ 116
8.6.10. AZÚCARES REDUCTORES _____________________________________________________ 116
8.6.11. METALES PESADOS _________________________________________________________ 117

9. CONCLUSIONES _______________________________________________________ 118

11. BIBLIOGRAFÍA _______________________________________________________ 120
 LISTA DE FIGURAS
Pág.

Figura 1. Estructura del 5- (hidroximetil) furfural ______________________________________________ 13

Figura 2. Reacción de formación del HMF.(James A. Dumesic, Yomaira J. Pagán Torres, Tianfu Wang, 2014)14
Figura 3. Flujograma del proceso de la miel de abeja.(Feldman, Etcheverry, Nimo, Janin, & Pons, 2AD) ___ 15
Figura 4. Proceso de validación (Duffau et al., 2010). ___________________________________________ 21
Figura 5. Curva para establecer el rango lineal. _______________________________________________ 26
Figura 6. Curva de calibración. ____________________________________________________________ 26
Figura 7. Curva de calibración (regresión lineal). ______________________________________________ 28
Figura 8. Representación gráfica de la precisión y la veracidad. __________________________________ 32
Figura 9. Diagrama para la determinación de la incertidumbre (Duffau et al., 2010). _________________ 38
Figura 10. Mejoramiento continuo del Sistema de Gestión de Calidad (CORRALES MONTOYA & MONTOYA
CORRALES, 2012). ______________________________________________________________________ 43
Figura 11. Procedimiento para la determinación de sólidos insolubles en miel de abejas (Navarrete, 2013). 53
Figura 12. Procedimiento para la preparación de patrones para la determinación del contenido aparente de
sacarosa (Navarrete, 2013). ______________________________________________________________ 54
Figura 13. Procedimiento para la determinación del contenido aparente de sacarosa (Navarrete, 2013).__ 54
Figura 14. Procedimiento para determinar el contenido de humedad en miel de abejas (Navarrete, 2013) . 55
Figura 15. Procedimiento para determinar cenizas y metales pesados en miel de abejas (Navarrete, 2013). 57
Figura 16. Procedimiento para la determinación de la conductividad en una muestra de miel de abejas
(Navarrete, 2013). ______________________________________________________________________ 58
Figura 17. Procedimiento para la determinación de acidez libre en una muestra de miel de abejas (Navarrete,
2013). ________________________________________________________________________________ 58
Figura 18. Procedimiento para la preparación de los reactivos necesarios en la determinación de azucares en
una muestra de miel de abejas (Navarrete, 2013). ____________________________________________ 59
Figura 19. Procedimiento para determinar el título de Fehling (Navarrete, 2013). ____________________ 60
Figura 20. Procedimiento para la determinación de azucares en una muestra de miel de abejas (Navarrete,
2013). ________________________________________________________________________________ 61
Figura 21. Procedimiento para la determinación de azucares invertidos en una muestra de miel de abejas
(Navarrete, 2013). ______________________________________________________________________ 62
Figura 22. Procedimiento para determinar el pH de una muestra de miel de abejas (Navarrete, 2013). ___ 63
 LISTA DE TABLAS
Pág.
Tabla 1. Parámetros que se deben evaluar según el tipo de método que se pretende utilizar (Duffau et al.,
2010). ________________________________________________________________________________ 22
Tabla 2. Parámetros que se deben determinar para los análisis hechos por espectrofotometría (Laboratorio
de Aguas y Alimentos de la Universidad Tecnológica de Pereira, 2011). ____________________________ 24
Tabla 3. Ejemplo para la determinación de límites. ____________________________________________ 31
Tabla 4. Valores permisibles para los requisitos exigidos por la resolución 1057 del 2010 para la miel de
abejas (Palacio Betancourt, 2010). _________________________________________________________ 46
Tabla 5. Requisitos Microbiológicos para la miel de abejas (Palacio Betancourt, 2010). ________________ 46
Tabla 6. Materiales. ____________________________________________________________________ 48
Tabla 7. Actividades realizadas para llevar a cabo la determinación de cada parámetro. ______________ 51
Tabla 8. Valores de índice de refracción para la determinación del % de humedad en miel de abejas
(Navarrete, 2013). ______________________________________________________________________ 56
Tabla 9. Patrones de Hidroximetilfurfural para la determinación de la linealidad. ____________________ 65
Tabla 10. Patrones y absorbancias para la determinación de la linealidad.__________________________ 66
Tabla 11. Datos de las absorbancias y las concentraciones teóricas de los patrones de la curva de
comprobación. _________________________________________________________________________ 69
Tabla 12. Relación entre la concentración teórica y la concentración experimental obtenida a partir de la
ecuación según el método 980.23 de la AOAC. ________________________________________________ 71
Tabla 13. Relación entre la concentración teórica y la concentración experimental obtenida a partir de la
ecuación de la curva de verificación. ________________________________________________________ 71
Tabla 14. Concentración ponderada de la muestra de miel fortificada. ____________________________ 73
Tabla 15. Concentración de Hidroximetilfurfural en miel sin fortificar. _____________________________ 73
Tabla 16. Absorbancia y concentración de los patrones de hidroximetilfurfural. _____________________ 74
Tabla 17 Resultados de la determinación de la concentración de hidroximetilfurfural por el analista A en el
día 1. ________________________________________________________________________________ 78
Tabla 18. Cálculos de los resultados de de la determinación de la concentración de hidroximetilfurfural por el
analista A en el día 1.____________________________________________________________________ 78
Tabla 19. Resultados de la determinación de la concentración de hidroximetilfurfural por el analista B en el
día 1. ________________________________________________________________________________ 79
Tabla 20. Cálculos de los resultados de la determinación de la concentración de hidroximetilfurfural por el
analista B en el día 1. ____________________________________________________________________ 79
Tabla 21. Resultados de la determinación de la concentración de hidroximetilfurfural por el analista A en el
día 2. ________________________________________________________________________________ 80
Tabla 22. Cálculos de los resultados de la determinación de la concentración de hidroximetilfurfural por el
analista A en el día 2.____________________________________________________________________ 80
Tabla 23. Resultados de la determinación de la concentración de hidroximetilfurfural por el analista B en el
día 2. ________________________________________________________________________________ 81
Tabla 24. Cálculos de los resultados de la determinación de la concentración de hidroximetilfurfural por el
analista B en el día 2. ____________________________________________________________________ 81
Tabla 25. Resultados de la determinación de la concentración de hidroximetilfurfural por el analista A en el
día 3. ________________________________________________________________________________ 82
Tabla 26. Cálculo de los resultados de la determinación de la concentración de hidroximetilfurfural por el
analista A en el día 3.____________________________________________________________________ 82
Tabla 27. Resultados de la determinación de la concentración de hidroximetilfurfural por el analista B en el
día 3. ________________________________________________________________________________ 84
Tabla 28. Cálculos de los resultados de la determinación de la concentración de hidroximetilfurfural por el
analista B en el día 3. ____________________________________________________________________ 84
Tabla 29. Resultados de la determinación de la concentración de hidroximetilfurfural por el analista A en el
día 4. ________________________________________________________________________________ 85
Tabla 30. Cálculos de los resultados de la determinación de la concentración de hidroximetilfurfural por el
analista A en el día 4.____________________________________________________________________ 85
Tabla 31. Resultados de la determinación de la concentración de hidroximetilfurfural por el analista B en el
día 4. ________________________________________________________________________________ 86
Tabla 32. . Cálculos de los resultados de la determinación de la concentración de hidroximetilfurfural por el
analista B en el día 4. ____________________________________________________________________ 86
Tabla 33. Resultados de la determinación de la concentración de hidroximetilfurfural por el analista A en el
día 5. ________________________________________________________________________________ 87
Tabla 34. Cálculo de los resultados de la determinación de la concentración de hidroximetilfurfural por el
analista A en el día 5.____________________________________________________________________ 87
Tabla 35. . Resultados de la determinación de la concentración de hidroximetilfurfural por el analista B en el
día 5. ________________________________________________________________________________ 88
Tabla 36. Cálculos de los resultados de la determinación de la concentración de hidroximetilfurfural por el
analista A en el día 5.____________________________________________________________________ 88
Tabla 37. Resultados de dos repeticiones del calentamiento de la miel a siete temperaturas diferentes para
lograr una modificación en el aumento del contenido de Hidroximetilfurfural. _______________________ 89
Tabla 38 Análisis de varianza de un factor ANOVA, temperatura en Hidroximetilfurfural.. _____________ 90
Tabla 39. Datos y resultados obtenidos para la observación del efecto de la humedad en la concentración del
Hidroximetilfurfural en miel de abejas. _____________________________________________________ 91
Tabla 40. Análisis de varianza de un factor ANOVA, humedad en Hidroximetilfurfural. ________________ 92
Tabla 41. Datos de miel de abejas con la variable acidez sin fortificar. _____________________________ 92
Tabla 42. Datos miel de abejas con la variable acidez fortificada. _________________________________ 92
Tabla 43. Resultados de análisis bromatológicos._____________________________________________ 100
Tabla 44. Relación concentración Vs ángulo de giro de soluciones patrón para la determinación del
contenido de sacarosa en miel. ___________________________________________________________ 101
Tabla 45. Resultados de la determinación del contenido de cenizas en miel de abejas. ______________ 102
Tabla 46. Resultados de la valoración de la acidez en la miel. ___________________________________ 102
Tabla 47. Resultados del índice de refracción de la miel de abejas. _______________________________ 103
Tabla 48. Resultados de los ensayos de la determinación de HMF para bromatología. _______________ 104
Tabla 49. Título de Fehling. ______________________________________________________________ 104
Tabla 50. Azúcares reductores. ___________________________________________________________ 105
Tabla 51. Azúcares reductores totales. _____________________________________________________ 105
Tabla 52. Reporte resultados de la determinación de Cobre en la muestra de miel de abejas. __________ 106
Tabla 53. Reporte de la concentración de Cobre en la muestra de miel de abejas. ___________________ 107
Tabla 54. Reporte de la concentración de Potasio en la muestra de miel de abejas. _________________ 107
Tabla 55. Reporte de la concentración de Calcio en la muestra de miel de abejas. __________________ 108
Tabla 56. Reporte de la concentración de Sodio en la muestra de miel de abejas. ___________________ 108
Tabla 57. Reporte de la concentración de Hierro en la muestra de miel de abejas. ___________________ 108
Tabla 58. Reporte de la concentración de Zinc en la muestra de miel de abejas. ____________________ 108
Tabla 59. Reporte dela concentración de Magnesio en la muestra de miel de abejas. ________________ 109
Tabla 60. Reporte resultados de la determinación de Manganeso en la muestra de miel de abejas. _____ 109
Tabla 61. Valores aceptados para cada uno de los criterios.(Laboratorio de Aguas y Alimentos de la
Universidad Tecnológica de Pereira, 2011) __________________________________________________ 110
Tabla 62. Resultados promedio obtenidos por el analista A durante los 5 días; %CV y %E para tres soluciones.
____________________________________________________________________________________ 112
Tabla 63. Resultados promedio obtenidos por el analista B durante los 5 días; %CV y %E para tres soluciones.
____________________________________________________________________________________ 113
Tabla 64. Registro de concentración de minerales encontrados en la muestra de miel de abejas analizada.117
 LISTAS DE GRÁFICAS
Pág.
Gráfica 1. Curva de calibración N°1 para la determinación de Hidroximetilfurfural en miel de abeja por el
método de la AOAC 980.23._______________________________________________________________ 65
Gráfica 2. Curva de calibración N°2 para la determinación de Hidroximetilfurfural en miel de abeja por el
método de la AOAC 980.23._______________________________________________________________ 67
Gráfica 3. Comprobación de la curva de calibración. ___________________________________________ 69
Gráfica 4. Promedio del aumento en la concentración del Hidroximetilfurfural con respecto a la temperatura.
_____________________________________________________________________________________ 90
Gráfica 5. Concentración versus ángulo de giro de soluciones patrón de sacarosa. __________________ 101
Gráfica 6. Curva de calibración para el análisis de Cobre. ______________________________________ 107
 1. RESUMEN

La validación de un método analítico es una verificación de determinados

parámetros de un método en la que los requisitos especificados para estos,
demuestran que el método es idóneo para un uso previsto (Oficina Internacional
de Pesas y Medidas, 2007).
En el presente trabajo se validó el método 980.23 de la AOAC (Horwitz & Latimer,
2011) en miel de abejas para la determinación de Hidroximetilfurfural (HMF) en el
laboratorio de análisis de aguas y alimentos de la Universidad Tecnológica de
Pereira.
El hidroximetilfurfural es un compuesto formado por la deshidratación de la
fructosa, asociada a factores tales como: el pH ácido, agua, composición rica en
monosacáridos, también influye el aumento de la temperatura, la acidez en función
del tiempo y la humedad tiene repercusión en menor grado (López, Castillo, &
Cano, 2004).

En Colombia la comercialización de la miel de abejas está regulada por la

resolución 1057 del 2010 y la NTC 1273, en las que se establece los parámetros
fisicoquímicos y microbiológicos que debe cumplir la miel para que pueda ser
comercializada.
Una de las principales regiones en el país, que cuenta con un gran número de
granjas apícolas, es el eje cafetero; de allí surge la necesidad de que un
laboratorio especializado en el análisis de alimentos y certificado bajo la norma
ISO 17025, tal como lo es el Laboratorio de Análisis de Aguas y Alimentos de la
Universidad Tecnológica de Pereira, tenga en su portafolio de servicios el análisis
de determinación de HMF debidamente validado, ya que en la actualidad las
únicas ciudades cercanas al eje cafetero que cuentan con este tipo de laboratorios
son: Bogotá, Medellín y Cali. Esto simboliza una gran desventaja para los
apicultores de ésta región, puesto que tienen que enviar las muestras a estas
ciudades, lo cual produce sobrecostos en el valor de los análisis y además puede
llegar a generar errores en los resultados, ya que las muestras durante su
transporte y almacenamiento sufriendo alteraciones en su composición y
formándose interferencias tanto positivas como negativas.
Por lo anterior, se realizó una revisión bibliográfica para tener conocimientos
fundamentales sobre los parámetros a revisar en la validación, la metodología y
la técnica espectrofotométrica de absorción ultravioleta (UV).

Después, se inició con la etapa práctica donde se llevaron a cabo las mediciones
cuantitativas; y posteriormente, se realizaron los análisis de datos estadísticos, de
acuerdo con los parámetros a validar (linealidad, rango de trabajo, límite de

3
detección, límite de cuantificación, porcentaje de recuperación precisión e
incertidumbre).

Finalmente estos parámetros se compararon con los criterios de aceptación

establecidos por el Laboratorio de análisis de aguas y alimentos; determinando así
que los parámetros son acordes a lo establecido en los instructivos del laboratorio.

4
 ABSTRACT

The validation of an analytical method is a verification of certain parameters of a

method in which the requirements for these show that the method is suitable for an
intended use (Oficina Internacional de Pesas y Medidas, 2007).

In this paper the method AOAC 980.23 (Horwitz & Latimer, 2011) in honey for the
determination of hydroxymethylfurfural (HMF) in laboratory analysis of water and
food at the Technological University of Pereira was validated.
Hydroxymethylfurfural is a compound formed by dehydration of fructose, linked to
factors such as acidic pH, water, rich in monosaccharides composition also
influences the increase in temperature, acidity function of time and moisture
downstream in less (López et al., 2004).

In Colombia the marketing of honey is regulated by Resolution 1057 of 2010 and

NTC 1273, in which the physicochemical and microbiological parameters that
honey must meet in order to be marketed are established.

One of the major regions in the country, which has a large number of bee farms, is
the coffee; there arises the need for a dedicated food testing and certified under
ISO 17025 laboratory, as is the Laboratory of Analysis of Water and Food
Technological University of Pereira, has in its service portfolio analysis HMF
determination properly validated, as currently the only cities near the coffee belt to
have such laboratories are: Bogota, Medellin and Cali. This symbolizes a major
disadvantage for beekeepers in this region, because they have to send their
samples to these cities, which produces about costs in the value of analysis and
also can generate errors in the results, since the samples during transportation and
storage they may be undergoing changes in its composition, thereby forming
positive and negative interference.
Therefore, a literature spectrophotometric technique ultraviolet absorption (UV)
review to take fundamental knowledge on the parameters for review on the
validation methodology and it performed.

Then began the practice stage where carried out quantitative measurements; and
then the analysis of statistical data, according to validate parameters (linearity,
working range, detection limit, quantification limit, precision and recovery rate
uncertainty) were performed.

Finally these parameters were compared with the acceptance criteria established
by the laboratory analysis of water and food; thus determining the parameters are
consistent with the provisions of instructional laboratory.

5
 2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

El 5-Hidroximetilfurfural (HMF) es uno de los compuestos formados por la

degradación de los productos azucarados, en particular por deshidratación de la
fructosa. Su aparición en la miel está directamente relacionada con alteraciones
de color, el desarrollo de sabores y olores extraños. Esta conjunción de factores
hace que el contenido de dicho aldehído sea considerado uno de los parámetros
de calidad más a tener en cuenta.

Para el año 2012 la producción bruta en Colombia de miel de abejas fue de

5’018.850 dólares internacionales según datos estimados por la FAO (FAO, 2012).
Según datos recogidos por la cadena apícola en Colombia se puede considerar
que en el país existen unos 2100 apicultores que manejan unas 40.000 colmenas.
Los principales núcleos de producción están en Santander del Sur, Cundinamarca,
Boyacá, el eje cafetero, Sucre, Santa marta, Antioquia, Cauca y Huila (Espinal &
Nieto, 2006). Justamente el eje cafetero al ser una de las regiones de mayor
producción de miel de abejas en el país, requiere de laboratorios capaces de
determinar todos los parámetros exigidos por la Resolución 1057 del 23 de marzo
de 2010 (Palacio Betancourt, 2010) sobre la miel de abejas del Ministerio de
Protección Social de Colombia, y la Norma Técnica Colombiana 1273 (Instituto
Colombiano de Normas Técnicas y Certificación.( ICONTEC), 2007) ; para poder
de ésta manera optimizar la producción de éste alimento en la región.

A través de un sondeo telefónico a los principales laboratorios de análisis de

alimentos del eje cafetero, se logró conocer que en la región no existe ningún
laboratorio que esté habilitado para brindar el servicio de determinación de
Hidroximetilfurfural (HMF) en miel de abejas, por lo que los apicultores se ven
obligados a enviar sus muestras a ciudades capitales más lejanas tales como
Medellín, Cali y/o Bogotá para poder realizar este análisis. Es por esto, que surge
la necesidad de implementar el método 980.23 de la AOAC para la determinación
de HMF en el Laboratorio de Análisis de Aguas y Alimentos de Universidad
Tecnológica de Pereira.

Según todo lo establecido anteriormente se formula la siguiente pregunta ¿Es

posible validar el método espectrofotométrico de la AOAC 980.23 para la
determinación de HMF en miel de abejas para el Laboratorio de Análisis de Aguas
y de alimentos de la Universidad Tecnológica de Pereira?

6
 3. JUSTIFICACIÓN

El contenido de Hidroximetilfurfural (HMF) en la miel de abejas es un indicativo de

las condiciones en que la misma ha sido almacenada, el tratamiento que ha
recibido tanto en su procesamiento como en su transporte y su edad (Jr. Jonathan
& W. White, 1978) . El máximo permitido en la normativa actual según la
Resolución 1057 del 23 de marzo de 2010 (Palacio Betancourt, 2010) sobre la
miel de abejas del Ministerio de Protección Social de Colombia, y la Norma
Técnica Colombiana 1273 (Instituto Colombiano de Normas Técnicas y
Certificación.( ICONTEC), 2007) es de 60 ppm, el cual debe ser determinado a
través del método de la AOAC 980.23. Valores superiores indican mieles viejas de
baja calidad y/o excesivamente calentadas o adulteradas, por lo cual cambian sus
propiedades organoléptica (López et al., 2004). De aquí surge la importancia de la
determinación de éste compuesto dentro de los parámetros para el control de
calidad que se le realizan a la miel.

En el caso del Hidroximetilfurfural (HMF), una de las restricciones más fuertes

responde a “la calidad”. En efecto, tanto los consumidores, mayoristas y las
industrias procesadoras están exigiendo métodos validados que garanticen la
trazabilidad, las características diferenciales y la confiabilidad, al igual que los
gobiernos quienes están implementando estas mismas exigencias dentro de las
normas que dan permisibilidad a la comercialización de la miel dentro y fuera de
cada país. Por otro lado, al ser la miel un producto percibido no sólo como
“natural” sino consumido por sus propiedades terapéuticas y sus características
nutricionales, los países importadores incrementan sus exigencias al punto de
requerir certificados sanitarios, análisis de residuos e incluso la identificación de
los apiarios de donde proceden (Fundación Fortalecer. & Ingeniero Gustavo
Secilio., 2005).

Una de las técnicas analíticas más usadas por su confiabilidad y practicidad para
llevar a cabo la determinación de Hidroximetilfurfural (HMF) en la miel de abejas
es la espectrometría de absorción UV-vis, el modo de uso de esta técnica para
llevar a cabo el análisis de dicha sustancia se encuentra documentado en el
método de la AOAC (Association of Official Agricultural Chemists) con código
980.23 (Horwitz & Latimer, 2011).

La implementación de éste método en el control de calidad de la miel de abejas

trae grandes beneficios, ya que el conocimiento de la composición de un producto
antes de que éste sea comercializado, determina si es un procedimiento útil,
puesto que se podrían tomar medidas y corregir errores procedimentales para que
de esta manera se pueda lograr el cumplimiento de las exigencias legales,
asegurar la calidad y eficacia del producto, con el fin de que éste logre salir al
mercado; razón por la cual se debe asegurar que el método analítico sea sometido

7
a un proceso de validación, para que de éste modo se compruebe si el método es
lo suficientemente confiable, adecuado para el propósito y aplicación analítica
propuesta en determinado laboratorio, que en este caso vendría siendo el
Laboratorio de Análisis de Aguas y Alimentos de la Universidad Tecnológica de
Pereira.

El laboratorio que implementa un método analítico seleccionado para un propósito

determinado, sea este normalizado, no normalizado o desarrollado por el
laboratorio, es responsable de verificar su desempeño contra las especificaciones
de esa validación, tanto antes de ponerlo en uso como durante su utilización
rutinaria, para demostrar que lo domina y usa correctamente (Velandia
Castellanos, 2008). Para el cumplimiento del Sistema de Garantía de Calidad, la
validación es un factor muy importante a tener en cuenta, ya que es un factor muy
apreciado tanto por los productores y/o comercializadores de la miel, como por los
entes reguladores en el país (INVIMA e ICA).

La validación del método de la AOAC 980.23 para su posterior implementación en

el portafolio de servicios del Laboratorio de Aguas y Alimentos de la Universidad
Tecnológica de Pereira, trae buenos beneficios, ya que el uso de éste método, el
cual se basa en la técnica espectrofotométrica de absorción UV-vis para el
análisis, resulta más económico que el análisis a través de otras técnicas, además
la norma colombiana sólo admite los resultados de los análisis de
Hidroximetilfurfural (HMF) realizados por el método de la AOAC 980.30. Es por
esto que realizar la validación de este método en el Laboratorio de la Análisis de
Aguas y Alimentos de la Universidad Tecnológica de Pereira se podría considerar
como una buena opción tanto para el laboratorio como para los usuarios de éste,
los cuales serían los primeros beneficiados, ya que el eje cafetero no cuenta con
laboratorios autorizados que presten el servicio para esta determinación. Los
apicultores de ésta región del país se ven obligados a enviar las muestras de su
producto a ciudades más lejanas tales como Cali, Medellín y Bogotá, puesto que
estas son las tres ciudades relativamente más cercanas que cuentan con
laboratorios de alimentos que brindan el servicio de determinación de
Hidroximetilfurfural (HMF) en miel de abejas.

El Laboratorio de Análisis de Aguas y Alimentos de la Universidad Tecnológica de

Pereira se desempeña como un laboratorio de extensión en el que se realizan
análisis fisicoquímicos y microbiológicos para diferentes matrices y el cual ha sido
acreditado por el Organismo Nacional de Acreditación ONAC. NTC-ISO / IEC
17025: 2005. Los análisis más relevantes que están dentro del alcance de la
acreditación son: pH, alcalinidad total, dureza total, Aluminio, Nitratos, Nitritos,
Fluoruros, Turbiedad, Hierro, Hidróxidos, Bicarbonatos, Sulfatos, Conductividad,
entre otros (Universidad Tecnológica de Pereira. 2014).

Se pretende que implantando este servicio dentro del portafolio del laboratorio de
Aguas y Alimentos de la Universidad Tecnológica de Pereira, se pueda suplir la

8
necesidad de los apicultores de la región cafetera, brindándoles ventajas
importantes, tales como una reducción en los costos y tiempo para el análisis
previo a la comercialización de la miel exigido por los entes reguladores; y a su
vez éste mismo laboratorio pueda entrar a competir dentro del mercado de los
análisis bromatológicos de la miel, al proporcionar este servicio y a la vez
encontrarse en una posición geográfica estratégica, ya que éste laboratorio se
encontraría dentro del llamado “triángulo de oro” del país, lo que en éste caso
significaría estar en el centro de las ciudades en donde se presta este servicio, en
una región productora de miel.

El proveedor de miel de abeja solicitó quedar en anonimato para su protección

legal, y privada.

9
 4. OBJETIVOS

4.1 OBJETIVO GENERAL

Validar la determinación de hidroximetilfurfural (HMF) en miel de abejas con base

en el método 980.23 de la AOAC para el laboratorio de Análisis de Aguas y
Alimentos de la Universidad Tecnológica de Pereira.

4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

● Adoptar, acoplar y documentar el método de la AOAC 980.23 para el

análisis de HMF en miel de abejas para el Laboratorio de Análisis de
Aguas y Alimentos de la Universidad Tecnológica de Pereira.

● Planear y desarrollar la validación de la determinación de

Hidroximetilfurfural en miel de abejas de acuerdo al método 980.23 de la
AOAC siguiendo como guía el instructivo para verificación de los métodos
de ensayo 123 – LAA – INT – 17 establecido en el Laboratorio de Análisis
de Aguas y Alimentos.

● Elaborar el informe de validación de la determinación de HMF en miel de

abejas de acuerdo al método 980.23 de la AOAC siguiendo como guía el
instructivo para verificación de los métodos de ensayo 123 – LAA – INT –
17 establecido en el Laboratorio de Análisis de Aguas y Alimentos.

10
 5. MARCO TEÓRICO

5.1. ¿QUÉ ES LA MIEL?

Según el CODEX norma para la miel dice que se entiende por miel la sustancia
dulce natural producida por abejas Apis melífera a partir del néctar de las plantas o
de secreciones de partes vivas de éstas o de excreciones de insectos
succionadores de plantas que quedan sobre partes vivas de las mismas y que las
abejas recogen, transforman y combinan con sustancias específicas propias, y
depositan, deshidratan, almacenan y dejan en el panal para que madure y añeje
(Codex Alimentarius, 2001).
Según la Resolución 1057 de 2010, la miel de abejas es una sustancia natural
azucarada producida por abejas obreras de diferentes especies, a partir del néctar
de las plantas o de secreciones de partes vivas de plantas o excreciones de
insectos chupadores sobre partes vivas, recolectadas por las abejas, transformada
por combinación con sustancias específicas propias de las abejas, depositada,
deshidratada, almacenada y colocada dentro de celdillas del panal para su
madurez (Palacio Betancourt, 2010).

5.1.1 DESCRIPCIÓN

La miel se compone esencialmente de diferentes azúcares, predominantemente

fructosa y glucosa además de otras sustancias como ácidos orgánicos, enzimas y
partículas sólidas derivadas de la recolección.
El color de la miel varía de casi incoloro a pardo oscuro. Su consistencia puede
ser fluida, viscosa, o total o parcialmente cristalizada. El sabor y el aroma varían,
pero derivan de la planta de origen (Codex Alimentarius, 2001).

5.1.2. CLASIFICACIÓN

Según la Norma Técnica Colombiana NTC-1273 (Instituto Colombiano de Normas

Técnicas y Certificación.( ICONTEC), 2007) la miel dependiendo su origen se
clasifica en:
- La miel de flores o néctar: es la miel que procede del néctar de las plantas, en
nectarios florales y/o extra florales.

11
 a) Miel mono floral: el producto procede totalmente o en su mayor parte de una
sola especie de planta y posee las características organolépticas,
fisicoquímicas, microscópicas propias de las mieles de dicha planta.
b) Miel multiflora: del néctar de varias especies vegetales diferentes, y en
proporciones muy variables.
- Miel de mielato: es la miel que proviene principalmente de las excreciones de
los insectos que succionan las partes vivas de las plantas.
- Miel de mielada: es la miel que procede principalmente de secreciones de
partes vivas de las plantas diferentes a las flores.
- Miel de abejas nativas: es la miel producida por especies de abejas originarias
de América Tropical presentes en el territorio colombiano, no introducidas, no
naturalizadas cuyas características sensoriales y fisicoquímicas son propias de las
mieles de cada especie.

5.1.3. FACTORES ESENCIALES DE COMPOSICIÓN Y CALIDAD.

La miel no deberá tener ningún sabor, aroma o contaminación inaceptable que

haya sido absorbido de una materia extraña durante su elaboración y
almacenamiento. La miel no debe haber comenzado a fermentar o producir
efervescencia.
No debe calentarse la miel en medida tal que se menoscabe su composición y
calidad esenciales (Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación.(
ICONTEC), 2007).
- CONTENIDO APARENTE DE AZÚCAR REDUCTOR, CALCULADO COMO
AZÚCAR INVERTIDO: Miel de abejas 65 % como mínimo.

- CONTENIDO DE HUMEDAD: Miel de abejas 18 % como máximo.

- CONTENIDO APARENTE DE SACAROSA: Miel de abejas 5 % como máximo.
- CONTENIDO DE SÓLIDOS INSOLUBLES EN AGUA:

a) Mieles distintas de la miel prensada 0,1 % como máximo

b) Miel prensada 0,5 % como máximo
- CONTENIDO DE SUSTANCIAS MINERALES (CENIZAS): Miel de abejas 0,6 %
como máximo.
- ACIDEZ: 40 miliequivalentes de ácido por 1000 gramos como máximo.
- ACTIVIDAD DE LA DIASTASA: 3 como mínimo

12
- CONTENIDO DE HIDROXIMETILFURFURAL: 40 mg/kg como máximo.
- ADITIVOS ALIMENTARIOS: No se permite ninguno.
La miel de abejas no debe contener glucosa comercial

5.2. ¿QUÉ ES HIDROXIMETILFURFURAL (HMF)?

El Hidroximetilfurfural (HMF) (ver figura 1.) es una sustancia común que se

produce ampliamente en una variedad de alimentos procesados. Se forma durante
el calentamiento y / o almacenamiento de alimentos como resultado de la reacción
de Maillard y / o caramelización del azúcar, miel, mermeladas, jugos
concentrados, café tostado, caramelos, vinagre balsámico y frutos secos son
algunos de los alimentos que contienen cantidades significativas de HMF. El
aumento de temperatura también aumenta la tasa de formación de HMF en los
alimentos durante el procesamiento y almacenamiento. Además, las condiciones
ácidas aceleran fuertemente la formación de HMF (ver figura 2.). El nivel de HMF
se considera generalmente como un índice de la calidad del producto en los
alimentos procesados (Gökmen & Morales, 2014).

Figura 1. Estructura del 5- (hidroximetil) furfural(ACD/Chem Sketch, 2015).

13
Figura 2. Reacción de formación del HMF (James A. Dumesic, Yomaira J. Pagán Torres, Tianfu Wang,
2014).

14
5.2.1. ETAPAS CRÍTICAS EN LA PRODUCCIÓN DE MIEL DONDE EXISTE EL
RIESGO DE FORMACIÓN DE HMF.

Figura 3. Flujograma del proceso de la miel de abeja (Feldman, Etcheverry, Nimo, Janin, & Pons, 2AD).

La miel es un producto alimenticio y, como tal, el proceso de obtención requiere

prácticas de higiene muy cuidadosas. Por esta razón el lugar destinado a la
extracción de miel sólo debe servir para esta operación y debe estar libre de todo
lo que sea extraño a la manipulación de la misma.

15
En la etapa separación miel – cera, existen varios tipos de sistemas y modelos
de separación de miel y de cera. Dentro de los más difundidos, se encuentran los
que actúan mediante calor (fundidores de cera, clarificadores de nivel, etc.).
Estos sistemas presentan la gran desventaja de que su empleo incorrecto produce
graves alteraciones en la calidad de la miel. Los niveles de HMF se elevan en gran
medida y la disminución de la actividad diastásica también se ve afectada.
En la etapa almacenamiento de tambores; las condiciones de almacenamiento
son un punto crítico en la cadena. Si no se tiene un local resguardado de los rayos
solares, la lluvia, con piso de cemento y una correcta manipulación de tambores,
la miel envasada sufrirá modificaciones físicas y químicas que afectarán
negativamente su calidad.
Por lo anterior se debe almacenar los tambores en locales que impidan la entrada
del agua y no exponerlos a los rayos solares. La acción del sol eleva los valores
de HMF y disminuye la actividad diastásica de la miel.
Mantener el lugar de almacenamiento siempre fresco (no superior a los 20°C) a fin
de evitar temperaturas altas por periodos prolongados. (Producen elevación de
HMF).
Etapa de fraccionamiento; durante el licuado es necesario elevar la temperatura
de la miel. Para evitar su deterioro se recomienda contar con el asesoramiento de
expertos, ya que su eficacia depende década equipo y del equilibrio entre la
temperatura y tiempo de exposición al calor.
Como última etapa antes del fraccionado, se realiza la pasteurización. La misma
consiste en un tratamiento térmico que tiene por objeto disminuir la actividad de
mohos y levaduras sin degradas las características esenciales de la miel. Una
medida para comprobar el desarrollo de este proceso es la observación de los
valores de HMF (Feldman, Etcheverry, Nimo, Janin, & Pons, 2AD).

5.3. DEFINICIONES DE ALGUNOS PARÁMETROS Y VOCABULARIO A

UTILIZAR EN LA VALIDACIÓN (SEGÚN NTC-2194 E ISO 8402).

Metrología-Ciencia de la medición: la metrología incluye aspectos teóricos y

prácticos relacionados con las mediciones, cualquiera que sea su incertidumbre y
cualquiera que sea el campo de la ciencia o de la tecnología al cual se aplique.
Exactitud de la medición: cercanía del acuerdo entre el resultado de una
medición y un valor verdadero de la magnitud por medir.
Incertidumbre de la medición: parámetro asociado con el resultado de una
medición, que caracteriza a la dispersión de los valores que en forma razonable se
le podrían atribuir a la magnitud por medir.

16
El resultado de la medición es la mejor estimación del valor de la magnitud por
medir, y que todos los componentes de la incertidumbre, incluyendo los
ocasionados por efectos sistemáticos, tales como los componentes asociados con
correcciones y con patrones de referencia contribuyen a la dispersión (IVM, 1997).
Instrumento de medición: dispositivo destinado para efectuar mediciones, solo o
en conjunto con uno o varios dispositivos adicionales.
Patrón de trabajo: patrón que se utiliza rutinariamente para calibrar o comprobar,
instrumentos de medida.
Calibración: conjunto de operaciones que establecen bajo condiciones
específicas, la relación entre los valores de las magnitudes que indiquen un
instrumento de Medición o un sistema de medición, o valores representados por
una medida materializada o por un material de referencia, y los valores
correspondientes determinados por medio de los patrones.
Trazabilidad: propiedad del resultado de una medición o el valor de un patrón tal
que puede estar relacionado a referencias establecidas, generalmente normas
nacionales o internacionales, a través de una cadena ininterrumpida de
comparaciones, con todas las incertidumbres declaradas.
NOTAS
1. El concepto es a menudo expresada por el adjetivo trazable.
2. La cadena ininterrumpida de comparaciones se llama cadena de trazabilidad.
Calidad: conjunto de propiedades y de características de un producto o servicio,
que le confieren su aptitud para satisfacer unas necesidades explícitas e
implícitas.
Aseguramiento de la calidad: son todas aquellas acciones planificadas y
sistemáticas necesarias para proporcionar la confianza adecuada de que un
producto o servicio satisface los requisitos de calidad establecidos. Para que sea
efectivo, el aseguramiento de la calidad requiere, generalmente, una evaluación
permanente de aquellos factores que influyen en la adecuación del diseño y de las
especificaciones según las aplicaciones previstas, así como también verificaciones
y auditorías a las operaciones de producción, instalación e inspección. En una
organización, el aseguramiento de la calidad sirve como una herramienta de la
gestión.
Confirmación metrológica: es necesario tener presente el marco dentro del cual
se requiere del proceso de confirmación metrológica, este proceso se entiende
como necesario dentro de una organización para: Conocer, controlar, o minimizar
el efecto de mediciones erróneas en la calidad resultante de un producto o
servicio. Al revisar el concepto de Calidad declarado por ISO 9000 (2000), dice

17
que es el grado en el que un conjunto de características inherentes cumple Con
los requisitos, esa necesidad o expectativa establecida que conforman el conjunto
de especificaciones de un producto o servicio (International Organization For
Standardization, 2003).

5.4. REQUISITOS DE LA NORMA NTC/ISO/IEC 17025:2005.

El numeral 5.4.5 Validación de los métodos, de la norma ISO/IEC/17025:2005 dice

que El laboratorio debe validar los métodos no normalizados, los métodos que
diseña o desarrolla, los métodos normalizados empleados fuera del alcance
previsto, así como las ampliaciones y modificaciones de los métodos
normalizados, para confirmar que los métodos son aptos para el fin previsto. La
validación debe ser tan amplia como sea necesario para satisfacer las
necesidades del tipo de aplicación o del campo de aplicación dados. El laboratorio
debe registrar los resultados obtenidos, el procedimiento utilizado para la
validación y una declaración sobre la aptitud del método para el uso previsto (ISO,
2005).
El numeral 5.4.6 Estimación de la incertidumbre de la medición, de la norma
ISO/IEC/17025:2005 dice que Los laboratorios de ensayo deben tener y deben
aplicar procedimientos para estimar la incertidumbre de la medición. En algunos
casos la naturaleza del método de ensayo puede excluir un cálculo riguroso,
metrológicamente y estadísticamente válido, de la incertidumbre de medición. En
estos casos el laboratorio debe, por lo menos, tratar de identificar todos los
componentes de la incertidumbre y hacer una estimación razonable, y debe
asegurarse de que la forma de informar el resultado no dé una impresión
equivocada de la incertidumbre. Una estimación razonable se debe basar en un
conocimiento del desempeño del método y en el alcance de la medición y debe
hacer uso, por ejemplo, de la experiencia adquirida y de los datos de validación
anteriores.
El numeral 5.6 Trazabilidad de las mediciones, la norma NTC/ISO/IEC/17025:2005
dice que Todos los equipos utilizados para los ensayos y/o las calibraciones,
incluidos los equipos para mediciones auxiliares (por ejemplo, de las condiciones
ambientales) que tengan un efecto significativo en la exactitud o en la validez del
resultado del ensayo, de la calibración o del muestreo, deben ser calibrados antes
de ser puestos en servicio. El laboratorio debe establecer un programa y un
procedimiento para la calibración de sus equipos.
El numeral 5.9 aseguramiento de la calidad de los resultados de ensayo y
calibración, de la norma ISO/IEC/17025:2005 dice que el laboratorio debe tener
procedimiento de control de calidad de ensayo y calibración, apropiados para el
tipo y volumen de trabajo del laboratorio, para realizar el seguimiento de la validez
de los ensayos y calibraciones llevados a cabo, registrarlos con el objetivo de

18
detectar tendencias, y en la medida de lo posible aplicar técnicas estadísticas para
la revisión de resultados y puede incluir los elementos siguientes:
a) Uso regular de materiales de referencia certificados (MRC) o secundarios.
b) Participación en comparaciones interlaboratorio o ensayos de aptitud.
c) Repetición de ensayos o calibraciones o de la calibración utilizando el mismo
método o métodos diferentes.
d) Repetición del ensayo o de la calibración de los objetos retenidos.
e) Correlación de resultados para diferentes características de un instrumento.

5.5. ¿QUÉ ES LA VALIDACIÓN DE UN MÉTODO ANÁLITICO?

La validación de un método analítico es un paso fundamental para asegurar que

los resultados entregados por dicho método son confiables. Cuando se realiza la
validación de un método por parte del laboratorio, lo que se busca es poder
determinar con fundamento estadístico que el método es adecuado para los fines
previstos (Duffau et al., 2010).
En este sentido, es importante que para el proceso de validación se asigne a un
responsable de realizar dicha tarea. De manera que, la validación se efectúe en
forma metódica, ordenada, trazable y confiable.
Es importante que el laboratorio tenga claridad antes de iniciar la validación de
cuáles son los requerimientos del método para establecer el alcance de la
validación.
Es esencial, entonces conocer el método a validar y su aplicabilidad, es decir, el
analito, su concentración (nivel, LMP, LMR, etc.) y la matriz (o matrices) en las
cuales se desea utilizar.
En general, se establece que el laboratorio debe validar:
1. Métodos no normalizados: corresponden a métodos desarrollados por el
laboratorio o métodos nuevos (ejemplo: publicado en revista científica), o bien, a
métodos que tradicionalmente se han utilizado en el laboratorio pero que no están
normalizados.
2. Método normalizado con una modificación significativa.
Cuando se trata de un método empleado tradicionalmente por el laboratorio que
no esté normalizado, se puede realizar una Validación Retrospectiva, es decir, en
base a los datos experimentales que el laboratorio dispone, para la cual se
realizará la recopilación de la mayor cantidad de datos históricos disponibles, para

19
luego realizar un proceso de ordenamiento y selección de los datos recopilados,
estos datos pueden ser: curvas de calibración, resultados de ensayos, cartas de
control, ensayos de aptitud, etc. A través de estos, se deberán determinar los
parámetros de validación, y evaluar si los resultados obtenidos para los fines de la
son aceptable.
En caso de ser un método nuevo (o uno antiguo del que no se dispongan de datos
suficientes) se debe realizar una Validación Prospectiva, generando a través de
análisis datos experimentales.
En algunos casos se puede realizar lo que se conoce como validación menor o
verificación cuando se trate de:
1. Métodos normalizados.
2. Métodos normalizados usados fuera de su alcance propuesto. Ejemplo: uso en
otra matriz.
3. Ampliaciones y modificaciones menores de métodos normalizados. Ejemplo:
uso en otros analitos.
4. Cuando se trate de métodos previamente validados, que haya sufrido alguna
alteración significativa por lo cual deben volver a evaluarse. Estas variaciones
pueden ser; cambio de equipo, cambio de componentes de equipo como
columnas, detectores, cambio analista, cambio de la matriz que contiene la
muestra o de nivel de concentración del analito de interés, entre otros.
La verificación, tiene generalmente como objetivo, el comprobar que el
laboratorio domina el método de ensayo normalizado y lo utiliza correctamente, en
caso de tratarse de un método normalizado modificado para la verificación se
requiere solo realizar aquellas pruebas que indiquen que la variación realizada no
afecta el ensayo.
En ocasiones, lo que se busca a través de una validación es demostrar que un
método es equivalente a otro.
El objetivo de la validación y la verificación, es demostrar que el método utilizado
por un laboratorio es adecuado para la aplicación en la que se propone utilizar,
así, como también demostrar que las modificaciones que pudieron haberse
realizado no afectan su desempeño, ni la confiabilidad de los resultados por este
entregado.

20
Figura 4. Proceso de validación (Duffau et al., 2010).

21
- Validación Prospectiva: Validación que se lleva a cabo durante la etapa de
desarrollo en que se realiza un análisis de riesgo de cada etapa del proceso, el
cual se divide en pasos individuales, que son luego evaluados basándose en la
experiencia pasada a fin de determinar qué pasos pueden llevar a situaciones
críticas (Tapia & Morales, 2013).

- Validación Retrospectiva: Involucra la evaluación de experiencias pasadas a

través de la documentación de producción, bajo la condición de que la
composición, procedimientos y equipos permanezcan sin cambios (Tapia &
Morales, 2013).

En relación a los parámetros de validación o verificación estos deberán

determinarse de acuerdo al tipo de método. Para este fin la siguiente tabla puede
ser utilizada como guía:

Tabla 1. Parámetros que se deben evaluar según el tipo de método que se pretende utilizar (Duffau et
al., 2010).

De acuerdo a los antecedentes anteriormente mencionados, el responsable de la

validación o verificación deberá así elaborar el Plan de Validación que se va a
realizar.

22
5.5.1. ESTABLECER PLAN DE VALIDACIÓN

Se entiende como Plan de Validación, a un documento (tipo protocolo) en el cual

se definen previamente a la experiencia; las pruebas o parámetros de validación
necesarios y el diseño experimental a desarrollar en base a los requerimientos del
método.
El “Plan de Validación” deberá contener a lo menos:
• Alcance de la validación (método, analito, matrices y requerimientos del método
• Diseño experimental:
Establecer la(s) muestra(s) a ser analizada(s): testigos reactivos, blanco matriz,
material certificados, material control, material(es) de referencia certificado,
matrices de las muestras, muestras sin fortificar, muestras fortificadas, etc.
El (los) parámetro(s) y pruebas a desarrollar, en caso, de que la prueba no sea
una convencional, sino diseñada por el responsable, también deberá indicarse en
el documento.
-Número de análisis requeridos para cada prueba y/o parámetro.
-Criterios de aceptabilidad para cada parámetro de validación.
-Analista(s) responsable de realizar la(s) prueba(s) analítica(s).

5.5.2. DESARROLLO DE PRUEBAS DE PARÁMETROS DE VALIDACIÓN

Para el desarrollo de las pruebas de validación, los analistas a cargo deberán

conocer el procedimiento de método de ensayo y el número de ensayos o
mediciones a realizar de acuerdo a lo establecido en el plan de validación.
(IMPORTANTE: El personal responsable de realizar los análisis se encuentre
debidamente calificado, y los equipos asociados al método deberían encontrarse
calibrados o controlados antes de su uso.)
Los resultados obtenidos en cada prueba deben ser debidamente registrados y
almacenados.
Los ensayos o mediciones realizadas serán con el fin de poder realizar las
siguientes pruebas de parámetros de validación:
- Selectividad
- Linealidad

23
- Sensibilidad
- Límites
- Exactitud
- Precisión
- Robustez
- Aplicabilidad
El analista o responsable de la validación deberá con los resultados obtenidos de
cada prueba realizar los cálculos matemáticos, comparativos y/o estadísticos
correspondientes a cada ensayo para lo cual podrá utilizar para ese fin un
software estadístico, calculadora o una planilla de cálculo (ejemplo: Excel).
5.5.3. ELEMENTOS DE CALIDAD ANALÍTICA A CONSIDERAR:

Con base en el instructivo de validación 124-LAA-INT-17 del Laboratorio de

Análisis de Aguas y Alimentos de Universidad Tecnológica de Pereira, establece
que los elementos de calidad analítica a considerar según el método instrumental
de espectrofotometría de UV para la determinación del Hidroximetilfurfural (HMF)
en miel, son los siguientes:

Tabla 2. Parámetros que se deben determinar para los análisis hechos por espectrofotometría
(Laboratorio de Aguas y Alimentos de la Universidad Tecnológica de Pereira, 2011).

TÉCNICA DE MEDICIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA

SI NO
RANGO DE TRABAJO X

LÍMITE DE DETECCCIÓN X

LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN X

PORCENTAJE DE RECUPERACIÓN X

PRESICIÓN X

INCERTIDUMBRE X

LINEALIDAD X

24
5.5.4. EVALUAR RESULTADOS DE LA VALIDACIÓN

Se deberá evaluar para cada parámetro de validación, si los resultados de las

pruebas son satisfactorios, es decir, si cumplen con los criterios de aceptabilidad
establecidos en el plan, se considera que el método es aceptable.
5.5.5. INFORME DE VALIDACIÓN

El responsable de la validación, deberá realizar un informe en el cual presentará

los resultados obtenidos y conclusiones. El informe debe contener la declaración
de la aplicabilidad del método.
El laboratorio debe tener disponible el procedimiento usado para la validación, y
una declaración acerca de que el método se ajusta para el uso propuesto.
Este informe deberá ser revisado por una tercera persona que tenga conocimiento
en el área, y que no haya formado parte del proceso de validación. En dicha
revisión se deberá establecer si los criterios de aceptabilidad establecidos en el
plan son aceptables, y si el método es idóneo para el fin previsto.
5.5.6. SELECTIVIDAD

La selectividad es el grado en que un método puede cuantificar o cualificar al

analito en presencia de interferentes. Estos interferentes normal o frecuentemente
se encuentran en la matriz de interés.
La prueba de selectividad puede diseñarse de acuerdo al método, en el caso de
cromatografía la resolución entrega información sobre la selectividad del método,
en el caso de espectrofotometría el espectro de absorción o un espectro de masas
entrega información al respecto, en especial cuando es comparado en presencia
de una interferencia.
Una prueba de Selectividad comúnmente utilizada, consiste en analizar un mínimo
de tres testigo reactivos, tres blancos de matriz y tres muestras o estándares de
concentración conocida del analito de interés.
Se deben comparar las lecturas (señales de medición) obtenidas para cada caso,
y observar si existen variaciones entre los testigos reactivos, blancos de matrices y
estándares o muestras con analito. Si se encuentran diferencias significativas
deberán ser identificadas y en lo posible eliminadas.

5.5.7. LINEALIDAD
La linealidad es la capacidad de un método de análisis, dentro de un determinado
intervalo, de dar una respuesta o resultados instrumentales que sean
proporcionales a la cantidad del analito que se habrá de determinar en la muestra
de laboratorio.

25
Con el fin de determinar el rango lineal se puede realizar mediante un gráfico de
concentración versus respuesta, que se conoce como Función Respuesta
(normalmente llamada recta de calibrado). Ésta se establece cada día con una
cierta cantidad de valores formados por un blanco y los patrones de trabajos
limpios de valor teórico conocido, que cubran el intervalo de trabajo. En este
sentido se recomienda abarcar valores desde cercano al cero y valores superiores
al LMP o al valor de interés. El número de puntos a analizar deberá ser
establecido por el analista (en general, se utiliza un mínimo de 5 valores).
Luego de realizar el gráfico se puede observar el comportamiento de la curva y
establecer cualitativamente el rango lineal (figura 3.). Después de establecer el
comportamiento lineal del método se deberá realizar la Curva de trabajo o curva
de calibración (figura 4.). Graficar los datos de concentración de los estándares de
calibración estimados (X) v/s la lectura observada (Y).

Figura 5. Curva para establecer el rango lineal.

.
Figura 6. Curva de calibración.

26
Evaluar los estimadores de regresión lineal del gráfico: la pendiente (m), el
coeficiente de correlación (r o r’) y el punto de corte (intercepto) con el eje de las Y
(L0).

𝒀 = 𝑿 𝒙 𝒎 + 𝑳𝒐
En general el criterio de aceptación cualitativo que se usa para determinar la
linealidad es el coeficiente de correlación:
El coeficiente de correlación indica el grado de relación entre la variable
concentración (X) y la variable respuesta (Y) de la curva de calibración. Los
valores máximos que puede alcanzar son –1 y 1. El valor máximo de 1 indica una
correlación positiva perfecta (entre X e Y) con una pendiente positiva. Cuando
r = 0, no existe correlación alguna, independencia total de los valores X e Y.
En la práctica si r tiene un valor cercano a uno (1), esto significa que existe
correlación con una probabilidad elevada. Para una curva de calibración o trabajo,
es recomendable que el coeficiente de correlación obtenido sea mayor o igual a
0.999, aunque para el caso de trazas se admite un valor igual o mayor que 0.99.
𝑆𝑥𝑦
𝑟=−
𝑆𝑥 . 𝑆𝑦

∑𝑛𝑖=1 𝑋𝑗 . 𝑌𝑗
𝑆𝑥𝑦 = − (𝑋𝑝𝑟𝑜𝑚 . 𝑌𝑝𝑟𝑜𝑚 )
𝑛

𝑋𝑖2⁄ 2
𝑆𝑥 = √((∑ 𝑛 ) − (𝑋𝑝𝑟𝑜𝑚))

𝑌𝑖2⁄ 2
𝑆𝑦 = √((∑ 𝑛 ) − (𝑌𝑝𝑟𝑜𝑚 ))

Dónde:
Sxy= covarianza de las variable X y Y.
Sx= desviación típica de la variable X.
Sy= desviación típica de la variable Y.

Coeficiente de correlación (ɤ o r): r > 0.99

Coeficiente de correlación al cuadrado r2 > 0.99.

27
5.5.8. SENSIBILIDAD

La sensibilidad es el cociente entre el cambio en la indicación de un sistema de

medición y el cambio correspondiente en el valor de la cantidad objeto de la
medición.
En una regresión lineal la sensibilidad corresponde a la pendiente (m) de la recta
de calibración.
Se calcula como:

𝒎 = 𝛴𝑋𝑖 𝑌𝑖 − (𝛴 𝑋𝑖 𝛴𝑌𝑖/ 𝑛) / 𝛴𝑋2 𝑖 − ((𝛴𝑋𝑖)2 /𝑛)

El valor de sensibilidad obtenido [m] debe permitir una adecuada discriminación de
los valores de concentración con base a la lectura.
En la figura 5., se puede observar que mientras más próxima al eje de las Y esté
la recta, significa que a ligeros cambios en las concentraciones esperadas habrá
grandes variaciones en los resultados de las lecturas observadas [m2] En el caso
de [m3] grandes cambios en la concentración no son significativos para la lectura.

Figura 7. Curva de calibración (regresión lineal).

Se dice, que un método es sensible cuando una pequeña variación de

concentración determina una gran variación de respuesta. La sensibilidad permite
observar la capacidad de respuesta instrumental frente a una determinada
cantidad de analito. En el tiempo, visualiza cómo se comporta el instrumento.

28
5.5.9. LÍMITES

Se debe tener en consideración los siguientes parámetros: Valor crítico, límite

detección (LOD) y límite de cuantificación (LOQ).
Valor crítico (LC): El valor de la concentración o cantidad neta que en caso de
superarse da lugar, para una probabilidad de error dada α, a la decisión de que la
concentración o cantidad del analito presente en el material analizado es superior
a la contenida en el material testigo (Referencia: Codex Alimentarius).
Se recomienda para su cálculo a lo menos seis mediciones de blanco matriz o
testigo reactivo.

𝐿𝐶 = 𝑡 (1 − 𝛼; 𝜈) 𝑥 𝑆𝑜 𝑆í: 𝑡 (0.05, ∞) → 1,645 𝐿𝐶 = 1,645 𝑥 𝑆𝑜

Dónde:

𝑡 = 𝑎𝑛𝑎𝑙𝑖𝑡𝑜

1 − 𝛼 = 𝑝𝑟𝑜𝑏𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑏

𝑉 = 𝐺𝑟𝑎𝑑𝑜𝑠 𝑑𝑒 𝑙𝑖𝑏𝑒𝑟𝑡𝑎𝑑

𝑆𝑜 = 𝐷𝑒𝑠𝑣𝑖𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑒𝑠𝑡á𝑛𝑑𝑎𝑟 𝑑𝑒 𝑙𝑎𝑠 𝑙𝑒𝑐𝑡𝑢𝑟𝑎𝑠 𝑑𝑒𝑙 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜 𝑚𝑎𝑡𝑟𝑖𝑧 𝑜 𝑡𝑒𝑠𝑡𝑖𝑔𝑜 𝑟𝑒𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑜.

Un resultado inferior al LC que determine la decisión “no detectado” no deberá
interpretarse como demostración de que el analito está ausente. No se
recomienda notificar tal resultado como “cero” o como < LOD. Deberá hacerse
constar en todo los casos el valor estimado y su incertidumbre.
5.5.10. Límite de detección (LOD)

Concentración o cantidad real del analito presente en el material objeto de análisis

que llevará, con una probabilidad (1-β), a la conclusión de que la concentración o
cantidad del analito es mayor en el material analizado que en el material testigo
(Referencia del Manual del Codex Alimentarius).
Se recomienda para su cálculo a lo menos seis mediciones de blanco matriz,
testigo reactivo o concentración estimada cercana al blanco.

𝑳𝑶𝑫 = 2 𝑡 (1 − 𝛼; 𝜈) 𝑥 𝑆𝑜 𝑺í ∶ 𝑡 ( 0.05, ∞) → 1.645 𝑳𝑶𝑫 = 3.29 𝑥 𝑆𝑜

LOD = 3.29 So, cuando la incertidumbre del valor medio (esperado) del material
testigo es insignificante, α=β = 0,05 y el valor estimado tiene una distribución
normal con una varianza constante conocida.

29
Un criterio de aceptación adecuado es LC < LOD < LMP. En general también se
sugiere, para un LMP >0,1 ppm un LOD < 1/10 LMP y para un LMP <0,1 ppm un
LOD < 1/5 LMP.

5.5.11. Límite de cuantificación (LOQ)

una característica del funcionamiento del método que suele expresarse como
señal del valor (verdadero) de la medición que producirá estimaciones con una
desviación estándar relativa (RSD) generalmente de 10 % (o 6 %). El LOQ se
calcula mediante la siguiente fórmula:

𝐿𝑂𝑄 = 10 𝑆𝑜
Se recomienda para su cálculo a lo menos seis mediciones de blanco matriz ,
testigo reactivo o concentración estimada cercana al blanco.
En este caso, el LOQ es exactamente 3,04 veces el límite de detección, dada la
normalidad y α= β = 0,05. En el LOQ es posible lograr una identificación positiva
con un nivel de confianza razonable.
Un criterio de aceptación adecuado es LC < LOD<< LOQ <LMP. En general
también se sugiere, para un LMP > 0,1 ppm un LOQ < 1/5 LMP y para un LMP
<0,1 ppm un LOQ < 2/5 LMP.
Ejemplo ejercicio de límites:
Para el analito mercurio en marisco fresco el límite máximo permisible es 0,5
mg/Kg. Se realiza la experiencia de medir 10 veces el blanco matriz:

30
 Tabla 3. Ejemplo para la determinación de límites.

La desviación estándar obtenida para los blancos: So = 0,013

Por lo cual el LC seria: LC = 1,645 x 0,013 = 0,022 mg/Kg
Por lo cual el LOD seria: LOD = 3,29 x 0,013 = 0,044 mg/Kg
Se puede observar que se cumple que el LC es inferior al LOD, ya que 0,022 <
0,044.
El LMP establecido por el analito es de 0,5 ppm es decir es > 0,1 ppm, por lo cual
el LOD debe ser <1/10 del LMP, es decir, debe ser inferior o igual a una décima
parte de 0,5.
(0,5 mg/L/10) = 0,05 mg/Kg
0,044 mg/L es inferior a 0,05 mg/Kg, por lo cual se estaría aceptando el LOD
calculado de acuerdo al criterio de aceptación establecido.
Si el LOQ seria: LOD = 10 x 0,013 = 0,13 mg/Kg
Para un LMP de 0,5 ppm un LOQ < 1/5 LMP, es decir, se debe determinar el
(LMP/5), que es: 0,5/5 de 0,1 mg/Kg.
Por lo cual no se estaría cumpliendo el criterio pues 0,13 mg/Kg es mayor 0,1
mg/Kg. El LOQ no sería aceptable para el campo de aplicabilidad que le quiere dar
al método.

31
En este sentido se puede tomar la decisión de buscar otro método que cumpla con
estos requisitos para este fin previsto o aceptar su aplicabilidad, considerando en
la declaración de la aplicabilidad estas reservas u observaciones en cuanto a su
LOQ.
Es importante realizar posteriormente la experiencia analítica de la determinación
del analito en el nivel de concentración determinado para el LOD o LOQ, es decir
evidenciar resultados experimentales, que demuestren la validez del resultado
obtenido.

5.5.12. EXACTITUD

El manual del Codex Alimentarius define la exactitud como el grado de

concordancia entre el resultado de un ensayo y el valor de referencia.
El término “exactitud”, esta aplicado a un conjunto de resultados de un ensayo, y
supone una combinación de componentes aleatorios y un componente común de
error sistemático o sesgo.
Cuando se aplica a un método de ensayo, el término “exactitud” se refiere a una
combinación de veracidad y precisión. En el siguiente esquema de “Tiro al
Blanco”, ampliamente utilizado para ejemplificar esto, los punto u orificios
equivaldrían a los resultados analíticos y el círculo rojo al centro el rango en el cual
se espera esté el valor de referencia (o verdadero).

Figura 8. Representación gráfica de la precisión y la veracidad.

Como se puede observar entre más veraz y preciso sea un resultado analítico, es
más exacto.

32
VERACIDAD: determina el grado de coincidencia existente entre el valor medio
obtenido de una serie de resultados y un valor de referencia aceptado.
La veracidad puede ser determinada por sesgo o recuperación.
a) Sesgo (s): La diferencia entre la expectativa relativa a los resultados de un
ensayo o una medición y el valor verdadero. En la práctica el valor convencional
de cantidad puede sustituir el valor verdadero. El sesgo es el error sistemático
total en contraposición al error aleatorio.
Para determinar el sesgo puede utilizarse material de referencia, material
fortificado, material control, material ensayo de aptitud: Para este fin, se debe
medir un analito de concentración conocido y se determina la diferencia en valor
absoluto entre el valor conocido y la media del valor obtenido. Una diferencia
sistemática importante en relación al valor de referencia aceptado se refleja en un
mayor valor del sesgo, cuanto más pequeño es el sesgo, mayor veracidad indica
el método.

𝒔 = 𝑿 – 𝑿𝒂
Dónde:
𝑺 = 𝑠𝑒𝑠𝑔𝑜

𝑿 = 𝑙𝑒𝑐𝑡𝑢𝑟𝑎 𝑜𝑏𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑎 𝑜 𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑝𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎𝑠 𝑙𝑒𝑐𝑡𝑢𝑟𝑎𝑠 𝑜𝑏𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑎𝑠.

𝑿𝒂 = 𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑎𝑠𝑖𝑔𝑛𝑎𝑑𝑜, 𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑐𝑒𝑟𝑡𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑑𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑚𝑎𝑡𝑒𝑟𝑖𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑓𝑒𝑟𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑜 𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑟𝑎𝑑𝑜.

Para evaluar el sesgo, se debe realizar la prueba t, en la cual el tobs < t crit:

𝒕 𝒄𝒂𝒍𝒄 = [ 𝑿𝒂 – 𝑿] / 𝑺 𝒙 √𝒏
Dónde:

𝒕 𝒄𝒂𝒍𝒄 = 𝑡 𝑜𝑏𝑠𝑒𝑟𝑣𝑎𝑑𝑜 𝑜 𝑐𝑎𝑙𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑜

𝑿𝒂 = 𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑟𝑎𝑑𝑜 𝑜 𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑐𝑒𝑟𝑡𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑑𝑜 𝑒𝑛 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛

𝑿 = 𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑑𝑒 𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟𝑒𝑠 𝑙𝑒í𝑑𝑜𝑠 𝑢 𝑜𝑏𝑠𝑒𝑟𝑣𝑎𝑑𝑜𝑠 𝑒𝑛 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛

𝑺 = 𝐷𝑒𝑠𝑣𝑖𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑒𝑠𝑡á𝑛𝑑𝑎𝑟

𝒏 = 𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑒𝑐𝑡𝑢𝑟𝑎𝑠 𝑜 𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟𝑒𝑠 𝑜𝑏𝑠𝑒𝑟𝑣𝑎𝑑𝑜𝑠.

33
b) Recuperación (R): Es la fracción de la sustancia agregada a la muestra
(muestra fortificada) antes del análisis, al ser analizadas muestras fortificadas y sin
fortificar.
La recuperación permite ver el rendimiento de un método analítico en cuanto al
proceso de extracción y la cantidad del analito existente en la muestra original. Por
lo cual, la recuperación está intrínsecamente relacionada a las características de
la matriz de la muestra.
Se recomienda realizar a lo menos 6 mediciones de cada uno en lo posible en tres
niveles. Se debe considerar al elegir estos niveles el rango de la curva de
calibración del método, el LOD y el LMP establecido. De manera que los niveles
seleccionados permiten entregar la mejor información posible respecto a la
capacidad de recuperación del método, en cuanto a estos valores críticos.

Se calcula de la siguiente manera:

𝑹 = ((𝑪𝒆 – 𝑪𝒐)/𝑪𝒂)

Siendo:

𝑹 = 𝑅𝑒𝑐𝑢𝑝𝑒𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛

𝑪𝒆 = 𝑒𝑠 𝑙𝑎 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑎𝑛𝑎𝑙𝑖𝑡𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑒𝑛𝑟𝑖𝑞𝑢𝑒𝑐𝑖𝑑𝑎.

𝑪𝒐 = 𝑒𝑠 𝑙𝑎 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑎𝑛𝑎𝑙𝑖𝑡𝑜 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑑𝑎 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑠𝑖𝑛 𝑎𝑑𝑖𝑐𝑖𝑜𝑛𝑎𝑟.

𝑪𝒂 = 𝑒𝑠 𝑙𝑎 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑎𝑛𝑎𝑙𝑖𝑡𝑜 𝑎𝑑𝑖𝑐𝑖𝑜𝑛𝑎𝑑𝑜 𝑎 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑒𝑛𝑟𝑖𝑞𝑢𝑒𝑐𝑖𝑑𝑎.

Se puede igualmente expresar en porcentaje de recuperación (%R): se calcula de

la siguiente manera:

%𝑹 = [ 𝑹 ] 𝒙 𝟏𝟎𝟎

En caso de evaluar la recuperación, se deberá realizar prueba t, en la cual la t calc

< t crit:

34
 𝒕 𝒄𝒂𝒍𝒄 = [ 𝟏𝟎𝟎 – %𝑹] / 𝑺 𝒙 √𝒏

Dónde:

𝒕 𝒄𝒂𝒍𝒄 = 𝑡 𝑜𝑏𝑠𝑒𝑟𝑣𝑎𝑑𝑜 𝑜 𝑐𝑎𝑙𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑜

𝑹 = 𝑅𝑒𝑐𝑢𝑝𝑒𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛
𝑺 = 𝐷𝑒𝑠𝑣𝑖𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑒𝑠𝑡á𝑛𝑑𝑎𝑟 𝑑𝑒 𝑙𝑎𝑠 𝑙𝑒𝑐𝑡𝑢𝑟𝑎𝑠 𝑑𝑒𝑙 𝑝𝑜𝑟𝑐𝑒𝑛𝑡𝑎𝑗𝑒 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑐𝑢𝑝𝑒𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛

𝒏 = 𝑁º 𝑑𝑒 𝑙𝑒𝑐𝑡𝑢𝑟𝑎𝑠 𝑜 𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟𝑒𝑠 𝑜𝑏𝑠𝑒𝑟𝑣𝑎𝑑𝑜𝑠

PRECISIÓN: La precisión podrá establecerse en términos de repetibilidad y

reproducibilidad. El grado de precisión se expresa habitualmente en términos de
imprecisión y se calcula como desviación estándar de los resultados (Referencia:
Manual Codex Alimentarius 18º Ed.).
a) Repetibilidad: Es la precisión bajo las condiciones de repetibilidad, es decir,
condiciones donde los resultados de análisis independientes se obtienen con el
mismo método en ítems de análisis idénticos en el mismo laboratorio por el mismo
operador utilizando el mismo equipamiento dentro de intervalos cortos de tiempo.
Se puede determinar registrando a lo menos 6 mediciones bajo las mismas
condiciones (mismo operador, mismo aparato, mismo laboratorio y en corto
intervalo de tiempo) de un analito en un Material de Referencia. Calcular la
Desviación Estándar (Sr) y el porcentaje de coeficiente de variación (CVr%).
b) Reproducibilidad: Es la precisión bajo las condiciones de reproducibilidad, es
decir, condiciones donde los resultados de los análisis se obtienen con el mismo
método en ítem idénticos de análisis en condiciones diferentes ya sea de
laboratorio, diferentes operadores, usando distintos equipos, entre otros.
Para determinar la precisión de la reproducibilidad intralaboratorio (Ri) (es decir, la
precisión dentro de un laboratorio), se sugiere realizar 3 mediciones de un Material
de Referencia (MRC o material control) una vez por cada semana o el
comportamiento de la curva de calibración en 3 días distintos.
También, se puede determinar registrando a lo menos 10 mediciones en días
distintos, o en un mismo día cambiando a lo menos una condición analítica
(ejemplo: operador, aparato, reactivos y largo intervalo de tiempo) de un analito en
un Material de Referencia. Calcular la desviación estándar (SRi) y el porcentaje de
coeficiente de variación (CVRi%).
Cuando se desea determinar la reproducibilidad interlaboratorios para fines de
validación de un método, deben participar diferentes laboratorios, se debe tener en
consideración que estos utilicen el mismo método y misma muestra, en un

35
intervalo de tiempo preferentemente establecido, se determina de este modo la
desviación estándar de los resultados obtenidos por los diferentes laboratorios
(SR).
El criterio de aceptabilidad para la precisión se puede hacer con base a coeficiente
de variación de Horwitz:
CVh% = 2 (1-0.5) log C o también se expresa como; CVh%= 0,02 x c 0.8495
Dónde:
C= valor nominal del analito expresado en potencia de 10, ejemplo 1ppm = 1mg/L
=10-6
En este sentido se establece para la repetibilidad, el CVr% obtenido debe ser <
(CVh%/2).
En el caso de la reproducibilidad interlaboratorios el CVR% <CVh%, para la
reproducibilidad interna (intralaboratorio) CVRi% < (2CVh%/3).
El Codex menciona que para coeficientes de concentración < 10-7, se aplica la
teoría de Horwitz-Thompson, esto es, CVT= 22%.

5.5.13. ROBUSTEZ

La robustez es una medida de la capacidad de un procedimiento analítico de no

ser afectado por variaciones pequeñas pero deliberadas de los parámetros del
método; proporciona una indicación de la fiabilidad del procedimiento en un uso
normal. En este sentido el objetivo de la prueba de robustez es optimizar el
método analítico desarrollado o implementado por el laboratorio, y describir bajo
qué condiciones analíticas (incluidas sus tolerancias), se pueden obtener a través
de estos resultados confiables.
Un método de ensayo es más robusto entre menos se vean afectados sus
resultados frente a una modificación de las condiciones.
Entre las condiciones analíticas que podrían afectar un método se encuentran:

 Analistas  Temperatura

 Equipos  Tiempo de reacción

 Reactivos  Estabilidad de la muestra

 pH  Otros.

36
 Para calcularlo en determinaciones cuantitativas se pueden tomar las siguientes
consideraciones:
1. Identificar las variables que puedan tener un efecto significativo en el
desempeño del método.
2. Establecer experimentos para observar el efecto sobre la exactitud y la
precisión de variables que se van cambiando sistemáticamente, se
determina los efectos de cada cambio sobre las condiciones de medida, de
ser posible se diseñan controles de calidad para las variables críticas.
Se puede utilizar el análisis de varianza (ANOVA) de las herramientas de Excel,
mediante el uso de la aplicación análisis de datos, análisis de varianza de un
factor, la cual es utilizada para aislar y estimar las varianzas que contribuyan para
el error total de un experimento, para analizar si hay o no diferencia entre los
lotes de análisis.
Para estudiar la validez del modelo es necesario confirmar estas hipótesis
mediante el estudio de los residuos (valores predichos - valores observados):
normalidad, tendencias, etc. y la realización de un contraste de homocedasticidad
(homogeneidad de varianzas entre los grupos). Para el estudio de la normalidad
de los errores, se puede recurrir al estudio de la normalidad de cada pero no es
recomendable, debido a que puede requerir un gran número de pruebas. La
solución utilizada habitualmente es el estudio del gráfico de dispersión entre los
residuos y los valores predichos (Laboratorio de Aguas y Alimentos de la
Universidad Tecnológica de Pereira, 2011).

5.5.14. APLICABILIDAD

Se utiliza el término de Aplicabilidad, cuando un método de análisis puede

utilizarse satisfactoriamente para los analitos, matrices y concentraciones
previstas. La declaración de aplicabilidad (o ámbito de aplicación), además de una
declaración del margen de funcionamiento satisfactorio para cada factor, puede
incluir también advertencias acerca de la interferencia conocida de otros analitos,
o de la inaplicabilidad a determinadas matrices y situaciones.
Es decir, la aplicabilidad consiste en una declaración de las especificaciones del
rendimiento del método, que se entrega en el informe de validación y que
normalmente incluye la siguiente información:
• La identidad de la sustancia analizada, incluyendo en su caso, de especiación
(por ejemplo, "el arsénico total",”metil-mercurio”).

36
• El intervalo de concentraciones cubierto por la validación (por ejemplo, "0-50
ppm")
• Una especificación de la gama de las matrices del material de prueba cubierto
por la validación (por ejemplo, “marisco", “productos lácteos”, etc.).
• La aplicación prevista y de sus requisitos de incertidumbre críticos. (Ejemplo:
análisis de residuos de plaguicidas en frutas cítricas de acuerdo al reglamento
sanitario de alimentos).
En este sentido, la prueba de aplicabilidad, consiste en el ámbito de aplicación del
método declarado por el responsable de la validación, una vez concluida esta.
En aquellos casos que se trate de un método normalizado u oficializado, esta
declaración se realiza de acuerdo a los antecedentes bibliográficos o normativos
del método.

5.5.15. INCERTIDUMBRE

La incertidumbre de una medición es el parámetro asociado al resultado, es decir,

caracteriza la dispersión de los valores que razonablemente pueden ser atribuidos
al mesurando.
En este sentido, es importante que para un método validado o verificado por el
laboratorio, se realice la determinación de las diferentes fuentes o componentes
de la incertidumbre de la medición presentes:
a) Muestreo
b) Efectos de la muestra: Tipo de matriz, almacenamiento, etc.
c) Sesgos Instrumentales: Las debidas a las características de los equipos
utilizados para realizar las medidas tales como: deriva, resolución, magnitudes de
influencia. Ejemplo: temperatura
d) Pureza de Reactivos: Materiales de referencia, preparación de estándares.
e) Analista: Las debidas a la serie de mediciones: variaciones en observaciones
repetidas bajo condiciones aparentemente iguales. Ejemplo: paralelaje.
f) Condiciones de medición: Las debidas al certificado de calibración: en él se
establecen las correcciones y las incertidumbres asociadas a ellas, para un valor
de k determinado, en las condiciones de calibración. Ejemplo: material
volumétrico, etc.
g) Condiciones de medición: Temperatura, humedad, etc.

37
h) Otras: Método (por ejemplo al interpolar en una recta), tablas (por ejemplo las
constantes), pesada, alícuota, efectos computacionales, etc.
Generalmente para el análisis de las fuentes de incertidumbre se utiliza el
diagrama de espina de pescado u otro tipo de diseño esquemático que permita
con facilidad identificar las fuentes de incertidumbre presentes durante el proceso
analítico.
La incertidumbre de la medición comprende, en general, muchos componentes.
Algunos de estos pueden ser evaluados por tipo.
Para este fin el laboratorio deberá realizar una evaluación de las incertidumbres
tipo A y B que están presentes en el método:
Evaluación de incertidumbre tipo A: Evaluación de un componente por un
análisis estadístico de los valores de mediciones obtenidos en condiciones de
medición definidas. Ejemplo: realizar varias mediciones en condiciones de
repetibilidad.
Evaluación de incertidumbre tipo B: Evaluación de un componente
incertidumbre de la medición realizada por otros medios distinto a los del tipo A.
Ejemplos: La evaluación basada en la información, obtenidos a partir de un
certificado de calibración, obtenidos a partir de los límites deducirse a través de
personal la experiencia, etc.
En general, la incertidumbre está dada por los errores sistemáticos y aleatorios
presentes en el ensayo analítico.

Figura 9. Diagrama para la determinación de la incertidumbre (Duffau et al., 2010).

38
5.6. ESPECTROFOTOMETRÍA UV

Estas técnicas se basan en la capacidad de los compuestos para absorber

energía. El análisis espectrofotométrico puede ser cualitativo o cuantitativo. En el
cualitativo se compara el espectro de absorción de la muestra con espectros de
patrones de composición conocida para identificar las bandas de absorción
coincidentes. Se realiza frecuentemente en el infrarrojo, como por ejemplo en el
análisis de cálculos urinarios. Mucho más frecuente es el análisis cuantitativo,
basado en la ley de Beer, para calcular la concentración de una sustancia en una
muestra.
Si se conoce ε, que es característico de cada sustancia, se puede calcular la
concentración de la sustancia en una solución:
c (mol/L)=A / (ε x b), siendo b la anchura de la cubeta en cm.
Otra forma de calcular la concentración de determinada sustancia en una solución
consiste en medir la absorbancia de dicha solución (Ap) y compararla con la de
otra solución de calibración (Ac) de concentración conocida (Cc). Así:
Solución de calibración: Ac= Cc x ε
Solución problema: Ap= Cp x ε
Por tanto, la concentración de la solución problema se puede calcular como:

Cp = Cc x Ap /Ac = Ap x K, siendo K = Cc / Ac

Cuanto mayor sea ε, mayor será la absorción del compuesto (cromógeno) y más
sensible será la determinación. Siempre que sea posible se debe, se ha de medir
la absorbancia a la longitud de onda de máxima absorción del compuesto o en su
cercanía ya que de este modo se consigue la máxima sensibilidad y menores
errores (Hernández, 2010).

39
5.7. CONDUCTIMETRÍA

La conductimetría mide la capacidad de los iones de una solución de transportar la

corriente eléctrica cuando se les somete a una diferencia de potencial. Cuanto
menor sea la resistencia de la solución, mayor será su conductividad. La
conductividad en un medio acuoso depende de varios factores:
1. Cantidad de iones: cuando mayor sea la concentración, mayor será la
conductividad.
2. Tipo de iones: los iones más pequeños y móviles, como Cl-, K+ o Na+,
conduce mejor la corriente.
3. Temperatura: la movilidad de los iones aumenta con la temperatura,
aproximadamente el 1-3% por grado Celsius.
Esta técnica se aplica a la determinación de la concentración de cloruro en
agua, ya que, cuanto mayor sea la concentración de este ión, mayor será la
corriente que puede pasar. No obstante, la conductividad también depende de
otras especies iónicas presentes en el espécimen (Hernández, 2010).
5.8. POLARIMETRÍA:

La polarimetría se basa en la medida de la rotación óptica que sufre un haz de luz

polarizada en un plano al atravesar una sustancia ópticamente activa, y tiene su
origen en la asimetría estructural de las moléculas. Las determinaciones
polarimétricas se realizan midiendo con un polarímetro el ángulo de desviación
que experimenta la luz polarizada al incidir sobre una solución transparente que
contenga especies ópticamente activas.
Un polarímetro consta básicamente de una fuente de radiación monocromática, un
polarizador (prisma de Nicol), una celda con la disolución, un analizador y por
último, un detector que puede ser el ojo humano o un fototubo.
La polarimetría se trata de una técnica no selectiva, pero que es muy útil para la
determinación de ciertas sustancias como los azúcares en productos lácteos. La
determinación del contenido de sacarosa en leche condensada es un ejemplo
(Aucejo, Estellés, & Hernández, 2011).

Sustancia ópticamente activa: Cuando un rayo polarizado atraviesa ciertas

sustancias, ocurre una interacción entre las radiaciones y las moléculas de la
sustancia ocasionando un giro del rayo fuera de su plano de oscilación.
Sustancias ópticamente activas son aquellas que hacen girar el plano de vibración
de la luz polarizada. Se dice que la sustancia es Dextrógira (+ positiva) si el giro
ocurre en el sentido de las manecillas del reloj para un observador que mira hacia
la fuente de luz, y Levógira (- negativo) si el giro ocurre en sentido contrario.

40
Análisis cuantitativo: Las mediciones polarimétrica se adaptan fácilmente al
análisis cuantitativo de compuestos ópticamente activos. Se emplean gráficas de
calibración empíricas que relacionan la rotación óptica con la concentración. Estas
gráficas pueden ser lineales, parabólicas o hiperbólicas, frecuentemente se
construyen con el ángulo de giro () Vs concentración, buscando una relación
lineal; el uso más extenso de la rotación óptica para análisis cuantitativo se
encuentra en la industria azucarera (Eusse, 2014).

5.9. REFRACTOMETRÍA

Cuando la radiación atraviesa un medio transparente, se produce acción recíproca

entre el campo eléctrico de la radiación y los electrones de enlace de la materia,
como consecuencia la velocidad de propagación del haz es menor que en el
vacío. La radiación se refracta cuando al incidir de un medio a otro en forma no
perpendicular, se desvía su dirección y cambia su velocidad. En forma
experimental, se observa un cambio brusco en la dirección, cuando la radiación
incide con un ángulo en la interface de dos medios transparentes que tienen
densidades diferentes.
El índice de refracción que se simboliza por la letra (n) es igual a la relación de la
velocidad de la radiación en el vacío (V Vacío), con la relación a la velocidad de la
radiación en el medio i, (V i) valor que es constante a una longitud de onda (λ) y
temperatura dadas. Cuando el medio es el vacio todas las radiaciones se
propagan con igual velocidad, dicha velocidad se simboliza con la letra (c) la cual
es constante y tiene un valor aproximado 3 X 10 10 cm.s-1. Esta relación es
conocida como constante de refracción:
𝒄
𝒏=
𝒗𝒕
El índice de refracción no tiene unidades y es mayor o igual a la unidad, varia en
líquidos 1,3 y 1,8 y en solidos entre 1,3 y 2,5, el cual es muy usado para describir
una especie química por su pureza; también es empleado para análisis
cuantitativo de mezclas o soluciones teniendo en cuenta la concentración. El
ángulo formado entre el rayo en el primer medio y la normal se llama ángulo de
incidencia, i, mientras que el correspondiente ángulo en el segundo medio se
denomina ángulo de refracción, r. El índice de refracción, n, es la razón entre las
velocidades de la luz en ambos medios.
La ley de Snell representa a este índice como la razón de los senos de los ángulos
de incidencia y refracción.
𝑠𝑒𝑛 𝑖
𝑛=
𝑠𝑒𝑛 𝑟

41
 El símbolo del índice de refracción es 𝑛𝐷20 , se refiere a que es medido a 20 °C, con
la linea D del sodio y con relación al aire (Echeverri, Henao, & Ramírez, 2009).

5.10. ASPECTOS BÁSICOS DE LA METROLOGÍA

Obtener mediciones exactas y confiables, es un requisito fundamental para toda

organización que desee estar entre las más competitivas, “puesto que lo que no se
mide no se mejora”. A partir de las mediciones se asegura la calidad de los bienes
o servicios que se comercializan, generando gran relevancia al momento de tomar
decisiones al interior de las organizaciones.
La metrología es la ciencia de la medición, cuyo objeto de estudio comprende los
patrones, las magnitudes y los sistemas de unidades. En ella se realiza una
continua búsqueda de tolerancias más reducidas, y se evalúan las implicaciones
económicas de mediciones erróneas en un mundo donde se ha vuelto imperante
la protección del medio ambiente.
La metrología presenta tres subdivisiones:
- La metrología científica que se encarga de establecer y mantener las unidades
de medida.
- La metrología industrial mejora los sistemas de medición que están directamente
relacionados con la calidad del producto.
- La metrología legal se ocupa de la protección al consumidor, verificando que los
procesos de medición implementados cumplan con los requerimientos técnicos
que garanticen que el cliente se encuentre satisfecho con el bien o servicio
adquirido.
Las organizaciones cambiaron su percepción hacia la metrología ya que sólo la
consideraban relevante para cumplir unos requisitos y así obtener una
certificación. Han trascendido de cumplir con unas exigencias sobre los
dispositivos de medida a una gestión de las medidas con el fin de que equipos y
procesos de medición sean adecuados para su uso previsto.
Para avanzar en un programa de mejoramiento de calidad es necesario contar,
entre otras cosas con un sistema de mediciones confiable. Las mediciones y
ensayo usualmente requieren de patrones de medición reproducible. Los
resultados de las mediciones y ensayos están siempre sujetos a una
incertidumbre.

42
5.10.1. METROLOGÍA Y CALIDAD

Un proceso productivo es un conjunto de transformaciones en las que se controlan

múltiples variables para lograr un producto final que cumpla con las expectativas
requeridas, en el caso de un laboratorio el producto será un dato, por lo anterior no
es posible admitir un proceso en el que no se controlen las características del
producto a través de las mediciones. Producir y medir son actividades intrínsecas
que se deben planear, ejecutar. Controlar y mejorar de manera simultánea.
Para garantizar un Sistema de la Gestión de la Calidad en cualquier tipo de
organización es relevante contar con calidad en las medidas, ya que se recopila
una cantidad de datos que determinan el cumplimiento de las especificaciones
técnicas o criterios de calidad de los productos, a su vez permiten detectar
tendencias en los procesos, lo que conduce a su regulación por lo tanto a la
búsqueda del mejoramiento continuo, como se observa en la figura 10.

Figura 10. Mejoramiento continuo del Sistema de Gestión de Calidad (CORRALES MONTOYA &
MONTOYA CORRALES, 2012).

La calidad de las medidas es exigida por medio de normatividades, referencias,

solicitudes directivas y reglamentos internos, esta puede alcanzarse a través de
calibraciones, verificaciones de equipos, cálculo de incertidumbres, validación de
procesos de medida o control estadístico.
El aseguramiento de la medida tiene como finalidad lograr que los productos y
procesos se encuentren exentos de errores significativos, por consiguiente integra

43
procedimientos de obtención y análisis de datos, con el fin de minimizar la
probabilidad de tomar decisiones incorrectas.
Para saber las condiciones en que se encuentra cada uno de los instrumentos
utilizados dentro de un proceso industrial, es necesario realizarles la calibración
correspondiente a intervalos periódicos de tiempo de tal manera que se pueda
contar con la seguridad de que las mediciones realizadas con dichos instrumentos
son confiables.
Sin embargo la calibración y ajuste de los instrumentos de medida no garantiza
por sí sola la calidad de las medidas ya que esta no actúa sobre: Los posibles
errores humanos, los defectos que pueda presentar una pieza o las condiciones
ambientales, lo que hace es contribuir al correcto funcionamiento de los
instrumentos.

5.10.2. METROLOGÍA QUÍMICA

Cada día se realizan en nuestro país miles de mediciones químicas, muchas de

estas mediciones se realizan como parte de procesos industriales. Esto hace que
su importancia en la economía sea fundamental.
Los resultados de los análisis químicos permiten desde el aseguramiento de la
calidad de nuestros alimentos hasta el control de calidad de las materias primas
en los procesos de manufactura en todo el país, pasando por el control de la
contaminación ambiental y los aspectos relacionados con la salud.
Las mediciones que se realizan en el campo de la química han mostrado un rápido
crecimiento principalmente en el área de la química analítica. Gran parte de este
crecimiento se atribuye a diversos problemas relacionados con la contaminación
ambiental, el tratamiento de desechos y en general a un mayor compromiso por el
mejoramiento en la calidad de los productos siendo este último un factor clave en
la competitividad de los mismos.
Los resultados que un laboratorio analítico emite pueden afectar las decisiones
que en un momento dado determinaran el éxito o el fracaso de una organización,
la aplicación de una política correcta de control ambiental, las decisiones en un
litigio en transacciones comerciales ya sea a nivel nacional e internacional, etc.
La metrología química tiene como misión apoyar a los diversos sectores de la
sociedad en la satisfacción de sus necesidades metrológicas presentes y futuras,
estableciendo patrones nacionales de medición, desarrollando materiales de
referencia y diseminando sus exactitudes por medio de servicios tecnológicos de

44
la más alta calidad, para incrementar la competitividad del país, contribuir al
desarrollo sustentable y a mejorar la calidad de vida de la población.
En metrología química se asume que al efectuar mediciones existe un control y
aseguramiento efectivos de la calidad de modo que los procesos de medición
sean estables y bajo control estadístico tanto como sea posible (CORRALES
MONTOYA & MONTOYA CORRALES, 2012).

5.11. NORMATIVIDAD DE LA MIEL

El marco legal técnico de apicultura regula los requisitos sanitarios que debe
cumplir la miel de abeja para consumo humano. Dentro del ámbito nacional se cita
la Norma Técnica Colombiana (NTC) 1273 y la Resolución 1057 de 2010
Ministerio de Protección Social; a nivel internacional existen: directiva
2001/110/CE Comunidad Europea y Codex Alimentarius. (Ver Anexo 1.
Comparativo de los límites fisicoquímicos entre las cuatro normas)

5.11.1. CODEX STAND-012-1981

El nivel aconsejable de HMF sigue siendo una cuestión conflictiva y las opiniones
continúan divididas, reflejando las prácticas y las condiciones de mercado de los
países particulares. El nivel de HMF en la miel depende del tiempo y la
temperatura. Una gran cantidad de países ha pedido que el límite de 80 mg/kg que
se establece en la presente norma (CODEX STAND-012-1981) se reduzca a 40
mg/kg. No obstante, hay una cantidad similar de países que se opone a toda
reducción del nivel de HMF, alegando que eso podría crear una barrera técnica al
comercio mundial para la miel producida en países con altas temperaturas
ambiente. Por consiguiente, el nivel de 80 mg/kg se ha retenido en la norma, pero
entre corchetes (Codex Alimentarius, 2001).

5.11.2. RESOLUCIÓN 1057 del 2010

La presente resolución tiene por objeto establecer el reglamento técnico a través

del cual se señalan los requisitos sanitarios que debe cumplir la miel de abejas
para consumo humano, con el fin de proteger la salud y la seguridad humana y
prevenir las prácticas que puedan inducir al error, confusión o engaño a los
consumidores (Palacio Betancourt, 2010).

Según lo determina la presente resolución, el contenido de hidroximetilfurfural en

la miel de abejas producida y/o comercializada en Colombia debe ser menor o
igual a 40 mg/kg, y para mieles de origen tropical debe ser menor o igual a 60
mg/kg. Esta norma también establece otros parámetros fisicoquímicos y

45
microbiológicos que la miel debe cumplir para poder salir al mercado; estos
parámetros están determinados en la siguiente tabla:
Tabla 4. Valores permisibles para los requisitos exigidos por la resolución 1057 del 2010 para la miel
de abejas (Palacio Betancourt, 2010).

REQUISITOS VALORES PERMISIBLES

≤ 0.1 para miel diferente a la prensada

Sólidos insolubles en agua %
≤ 0.5 para miel prensada

≤ 20
Contenido de humedad % m/m
≤ 21 para mieles de origen tropical

Contenido aparente de azúcar reductor, ≥ 45 (miel de mielato)

calculado como azúcar invertido % m/m ≥ 60 (miel floral)

≤5
Contenido aparente de sacarosa % m/m
≤ 10 para mieles de origen tropical

Contenido de sustancia minerales (cenizas)

≤ 0.5
% m/m

Conductividad eléctrica (mS/cm) ≤ 0.8

Acidez libre Meq de ácido/1000g ≤ 50

Índice de diastasa (escala Shade) ≥8

≤ 40
Contenido de Hidroximetilfurfural (mg/Kg)
≤ 60 para mieles de origen tropical
Los límites máximos permitidos, serán los
Determinación de metales pesados
establecidos por el Ministerio de la Protección
(Cu, Cr, Cd, Pb, Hg)
Social.

Tabla 5. Requisitos Microbiológicos para la miel de abejas (Palacio Betancourt, 2010).

MIEL DE ABEJAS

REQUISITOS
N m M C

Recuento de esporas de Clostridium Sulfito UFC/g 3 10 100 3

Recuento de Mohos y Levaduras UFC/g 3 10 100 3

46
5.11.3. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC. 1273

Esta norma aplica a todas las mieles producidas por abejas obreras y regula
todos los tipos de formas de presentación que se ofrecen para el consumo
directo. De igual forma se aplica a la miel envasada en envases no destinados a
la venta al por menor (al granel) y destinada al reenvasado en envases para la
venta al por menor (Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación.(
ICONTEC), 2007).

6. METODOLOGÍA

Para el proceso de validación de la determinación de HMF en miel de abejas a

través de la técnica espectrofotométrica UV en el Laboratorio de Análisis de aguas
y Alimentos de la Universidad Tecnológica de Pereira se hizo uso del método de la
AOAC 980.23 (Horwitz & Latimer, 2011).
El plan de validación se desarrolló según los parámetros establecidos para la
técnica de medición espectrofotométrica dictados por el instructivo para la
verificación de los métodos de ensayo con código 123-LAA-INT-17, versión 2 del
Laboratorio de Análisis de Aguas y Alimentos de la Universidad Tecnológica de
Pereira.

6.1. MÉTODOS Y EQUIPOS

- ESTÁNDAR: se trabajó con un estándar de Hidroximetilfurfural (HMF) comercial
de marca SIGMA-ALDRICH con una concentración del 99%. A partir de este
estándar se realizaron las curvas de calibración planteadas y se determinaron los
demás parámetros requeridos para la validación del método 980.23 de la AOAC.

6.2. MUESTRA DE ANÁLISIS

Se utilizó una miel de abejas fresca comercial con el fin de llevar a cabo la
determinación de HMF que esta poseía y de ésta manera lograr poner en uso el
método de la AOAC 980.23.

47
6.3. ESPECTROFOTÓMETRO UV

Se hizo uso del espectrofotómetro DR 5000 presente en el Laboratorio de Análisis

de Aguas y Alimentos de la Universidad Tecnológica de Pereira.

6.4. MATERIALES:
Tabla 6. Materiales.

Cantidad Especificaciones #

3 Agitador de vidrio 1

2 Vidrio reloj 2

2 Espátula metálica 3

1 Bureta 4

100 Papel filtro Whatman® Nº2 o similar. 5

5 Matraces Aforados de 50 mL 6

5 Matraces Aforados de 100 mL 7

10 Vasos de precipitado de 50 mL 8

4 Cubetas de cuarzo con camino óptico de 1 cm. 9

1 Frasco lavador 10

250 Micropipetas de 1 mL y de 5 mL 11

100 Tubos de ensayo de 18 x 150 mm 12

2 Soporte universal 13

6 Pinzas 14

48
 6.5. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO 980.23 DE LA AOAC

Ésta metodología está basada en el método para la determinación de

Hidroximetilfurfural HMF en miel 980.23 de la AOAC.
Ésta metodología de análisis de análisis fue empleada para la determinación de
los parámetro de validación y para los análisis bromatológicos.

A. REACTIVOS Y EQUIPOS
(a) Espectrofotómetro.- UV. Medir la muestra a 284 y 336 nm.
(b) Solución Carrez I.- Disolver 15 g de K4 [Fe (CN)6] · 3 H2O y diluir con H2O
hasta 100 mL.
(c) Solución Carrez II.- Disolver 30 g de Zn (CH3COO)2· 2 H2O y diluir con H2O
hasta 100 mL.
(d) Solución de bisulfito de sodio.- 0.20%. Disolver 0.20 g de NaHSO3 y diluirlo
hasta 100 mL con H2O. Diluir 1+1 de la solución de referencia, si es necesario. Realizar la
preparación cada vez que se vaya a medir para que se conserve fresca,

B. DESARROLLO:

Pesar con precisión 5 g de miel en un beaker pequeño, y luego transferirla diluida

en 25 mL de H2O a un matraz de 50 mL. Añadir 0.50 mL de solución Carrez I,
mezclar, y añadir 0.50 mL de solución Carrez II, mezclar bien, y luego se afora con
agua hasta 50 mL. Una gota de alcohol puede ser adicionada para evitar la
formación de espuma. Filtrar a través de un papel filtro, el cual puede ser P5 O
Whatman 2, descartando los primeros 10 mL del filtrado.

Introducir 5 mL del filtrado en cada uno de los dos tubos de ensayo de 18 x 150
mm. Añadir 5 mL de agua al tubo 1 (solución de prueba) y 5 mL de solución
NaHSO3 al otro tubo (blanco). Mezclar bien en el Vortex y proceder a hacer la
lectura del primer tubo en el espectrofotómetro a 284 y 336 nm en una celda de 1
cm. Si el resultado de la solución de prueba es > 0.6 diluir con agua y el blanco
con NaHSO3 al 0.1% debe diluirse al mismo grado de la solución de prueba.

49
Lectura en Espectrofotómetro UV
-Cálculo de resultados:

𝒎𝒈 (𝑨𝟐𝟖𝟒𝒏𝒎 – 𝑨𝟑𝟑𝟔𝒏𝒎) 𝒙 𝟏𝟒, 𝟗𝟕 𝒙 𝟓

𝑯𝑴𝑭 ( )=
𝟏𝟎𝟎 𝒈 𝑷𝒐𝒓𝒄𝒊ó𝒏 𝒆𝒏𝒔𝒂𝒚𝒂𝒅𝒂 (𝒈)
Dónde:

𝟏𝟒, 𝟗𝟕 = (126/16830) 𝑥 (1000/10) 𝑥 (100/5)

𝟏𝟐𝟔 = 𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑐𝑢𝑙𝑎𝑟 𝑑𝑒𝑙 𝐻𝑀𝐹 𝑒𝑛 𝑔/𝑚𝑜𝑙

𝟏𝟔𝟖𝟑𝟎 = 𝐶𝑜𝑒𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑑𝑒 𝑒𝑥𝑡𝑖𝑛𝑐𝑖ó𝑛 𝑚𝑜𝑙𝑎𝑟 𝑑𝑒 𝐻𝑀𝐹 𝑎 284 𝑛𝑚 (𝑐𝑚 − 1 𝑥 𝑚𝑜𝑙 − 1 𝑥 𝐿)

𝟏𝟎𝟎𝟎 = 𝑚𝑔/𝑔

𝟏𝟎 = 𝑐𝑒𝑛𝑡𝑖𝑙𝑖𝑡𝑟𝑜𝑠/𝐿
𝟏𝟎𝟎 = 𝑔𝑟𝑎𝑚𝑜𝑠 (𝑔) 𝑑𝑒 𝑚𝑖𝑒𝑙 𝑖𝑛𝑓𝑜𝑟𝑚𝑎𝑑𝑜𝑠

𝟓 = 𝑝𝑜𝑟𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑒𝑛𝑠𝑎𝑦𝑜 𝑛𝑜𝑚𝑖𝑛𝑎𝑙 (𝑔).

Debe informarse la concentración de HMF en la muestra como mg/Kg de
producto. (Horwitz & Latimer, 2011)

- Control de Calidad

Se efectuarán controles sistemáticos y periódicos para comprobar la validez de los

ensayos realizados con el método analítico recogido en este procedimiento, según
disponibilidad.
a) Nivel I: Ensayos de intercomparación ó utilización de materiales de referencia
certificados ó patrones de referencia certificados, según disponibilidad.
b) Nivel II: Durante el desarrollo de la serie de trabajo se incluye:

- Ajuste del cero del equipo.

- Control de blanco al inicio de las lecturas (para estándar de referencia).
- Control de estándar de concentración conocida.(Laboratorio, Aditivos, & Chile.,
2011)

50
6.6. ACTIVIDADES PRINCIPALES PARA DAR CUMPLIMIENTO A LOS
PARÁMETROS DE VALIDACIÓN.

Tabla 7. Actividades realizadas para llevar a cabo la determinación de cada parámetro.

PARÁMETRO ACTIVIDAD PRINCIPAL

Para llevar cabo la determinación de éste parámetro, se
prepararon diez patrones de HMF, partiendo desde una
concentración mínima aproximada de diez partes por millón
hasta llegar a una máxima aproximada de cien partes por
millón. Luego de que cada uno de los patrones fueran tratados
por el método 980.23 de la AOAC; con los valores obtenidos de
la Absorbancia y los valores teóricos de la concentración de
cada uno de los patrones, se construyó una curva de
LINEALIDAD calibración, ubicando los valores de las concentraciones
teóricas en el eje de las abscisas y los valores de las
absorbancias en el eje de las ordenas. De éste modo se logró
determinar el coeficiente de correlación que determina la
linealidad.
Para poder llevar a cabo la determinación de éste parámetro,
se procedió a preparar con el estándar de HMF, diez soluciones
de concentraciones teóricas aproximadas a 10 ppm.
Posteriormente y haciendo uso del método 980.23 de la AOAC
se le estableció a cada solución, su concentración
LÍMITE DE
experimental.
DETECCIÓN
Con los datos tanto teóricos como experimentales obtenidos, se
/LÍMITE DE
CUANTIFICACI procedió a calcular el promedio de los resultados y su
ÓN respectiva desviación estándar. De este modo y haciendo uso
de las ecuaciones ya establecidas en el instructivo de
validación del Laboratorio de Análisis de Aguas y Alimentos de
la Universidad Tecnológica de Pereira 123-LAA-INT-17, se llevó
a cabo la determinación de cada uno de los límites.
Para determinar la selectividad/especificidad, se tomó una
muestra de miel comercial y se determinó su contenido inicial
de Hidroximetilfurfural (HMF), luego de conocer su
concentración, se procedió a preparar una solución madre de
50 ppm aproximadamente, con el reactivo patrón de HMF.
Posteriormente se pesaron 5 g aproximadamente de la miel de
SELECTIVIDAD abejas comercial y 5 g aprox. de la solución madre de HMF, y
/ESPECIFICIDA se mezclaron. Después de obtenida esta mezcla se procedió a
D hacer el tratamiento a la muestra según lo dicta el método
980.23 de la AOAC, para poder de este modo hallar la

51
 concentración total de HMF en ésta solución.
Teniendo conocimiento de la concentración de la muestra no
fortificada, de la muestra fortificada y la concentración de la
fortificación se pudo determinar el % de recuperación del
método.
Se identificó teóricamente que variables pueden tener un efecto
significativo en el desempeño del método y se determinó que
las condiciones de humedad, acidez y calor pueden afectar el
contenido de Hidroximetilfurfural (HMF) en una muestra de miel.
Es por esto que se tomaron 6 muestras de miel y se agruparon
en tres parejas; cada una de éstas parejas fue sometida a una
condición de afectación diferente.
El contenido de humedad, acidez e Hidroximetilfurfural (HMF)
en cada muestra de miel se determinó previo a su
manipulación.
para simular el aumento de la acidez en la miel, se le adicionó a
la muestra una cantidad determinada de ácido acético al 15%
v/v, se dejó en reposo durante sesenta minutos y
posteriormente se determinó la concentración de HMF presente
ROBUSTEZ en la muestra.
Para la modificación de la humedad en la miel, se le adicionó a
la muestra una cantidad determinada de agua destilada, y a las
12 horas se determinó su contenido de HMF.
Para modificar las condiciones de temperatura, se sometió la
miel de muestra a un baño maría, hasta que su temperatura se
elevó a unos 80°C aproximadamente durante quince minutos,
después de pasado éste tiempo se determinó el contenido de
Hidroximetilfurfural (HMF) en la muestra.

Con el fin de evaluar la exactitud del método se analizaron

diariamente 2 réplicas de tres concentraciones diferentes,
EXACTITUD
(%E) durante 5 días, de estándares a concentraciones teóricas de
100 ppm, 50 ppm y 5 ppm.

Para evaluar la precisión del método se analizaron diariamente

por dos analistas diferentes durante cinco días y por duplicado,
tres soluciones del patrón de Hidroximetilfurfural (HMF) de una
concentración alta de 100 ppm, una media de 50 ppm y otra
PRECISIÓN
baja de 5 ppm. Estas concentraciones están dentro del rango
(%CV) de aplicación del método.

La precisión se evaluó en términos de Reproducibilidad y

Repetibilidad.

52
6.7. ANÁLISIS FISICOQUÍMICOS DE LA MIEL.

Se realizaron los análisis fisicoquímicos exigidos por la Resolución colombiana

1057 del 2010 para la miel de abejas, en la cual se establece el reglamento
técnico sobre los requisitos sanitarios que debe cumplir la miel de abejas para
consumo humano.
Pero, se tomó una muestra real con elevada concentración de Hidroximetilfurfural
para comprobar si la fundamentación teórica respecto a la alteración de los
parámetros relacionados con una elevada concentración de este compuesto se
hacía evidente en la muestra de miel de abejas de estudio de la validación.

6.7.1. Determinación de sólidos insolubles en miel

Figura 11. Procedimiento para la determinación de sólidos insolubles en miel de abejas (Navarrete,
2013).

Los sólidos insolubles en agua se calculan con la siguiente ecuación:

𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑟𝑒𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑎 𝑒𝑛 𝑒𝑙 𝑝𝑎𝑝𝑒𝑙
% de sólidos insolubles en agua: 𝑥100
𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑚𝑖𝑒𝑙

53
6.7.2. Determinación del contenido aparente de sacarosa
6.7.2.1. Preparación de patrones:

Figura 12. Procedimiento para la preparación de patrones para la determinación del contenido
aparente de sacarosa (Navarrete, 2013).

6.7.2.2. Tratamiento de la muestra

Figura 13. Procedimiento para la determinación del contenido aparente de sacarosa (Navarrete, 2013).

54
Lectura en el polarímetro

Efectuar las lecturas polarimétricas, corregirlas a 20°C.

CONCENTRACIÓN DE SACAROSA (𝑪𝒎):

𝑨𝒎 × 𝑪𝟏
= 𝑪𝒎
𝑨𝟏
Dónde:
Am: ángulo de giro de la miel.
C1: concentración del primer patrón.
A1: ángulo de giro de la solución patrón.

6.7.3. Determinación del contenido de humedad.

Figura 14. Procedimiento para determinar el contenido de humedad en miel de abejas (Navarrete,
2013) .

Si la temperatura a la cual se realiza la lectura es > 20°C, se debe realizar una corrección
de la temperatura añadiendo un valor al resultado 0.00023 por cada °C que sobrepasaba
los 20°C. El porcentaje de humedad se calculó en la tabla 44. La cual relaciona el índice
de refracción contra humedad a 20°C.

55
Tabla 8. Valores de índice de refracción para la determinación del % de humedad en miel de abejas
(Navarrete, 2013).

INDICE DE
INDICE DE %
REFRACCIÓN A % HUMEDAD
REFRACCIÓN A 20ºC HUMEDAD
20ºC

1.5041 13 1.494 17

1.5035 13.2 1.4935 17.2

1.503 13.4 1.493 17.4

1.5025 13.6 1.4925 17.6

1.502 13.8 1.492 17.8

1.5015 14 1.4915 18

1.501 14.2 1.491 18.2

1.5005 14.4 1.4905 18.4

1.5 14.6 1.490 18.6

1.4995 14.8 1.4895 18.8

1.499 15 1.489 19

1.4985 15.2 1.4885 19.2

1.498 15.4 1.4880 19.4

1.4975 15.6 1.4876 19.6

1.497 15.8 1.4871 19.8

1.4965 16 1.4866 2

1.496 16.2 1.4862 20.2

1.4955 16.4 1.4858 20.4

1.495 16.6 1.4853 20.6

1.4945 16.8 1.4849 20.8

56
6.7.4 Determinación del contenido de cenizas y metales pesados

Figura 15. Procedimiento para determinar cenizas y metales pesados en miel de abejas (Navarrete,
2013).

57
6.7.5. Determinación de conductividad

Figura 16. Procedimiento para la determinación de la conductividad en una muestra de miel de abejas
(Navarrete, 2013).

6.7.6. Determinación de acidez libre

Figura 17. Procedimiento para la determinación de acidez libre en una muestra de miel de abejas
(Navarrete, 2013).

58
6.7.7. Determinación de azúcares reductores

Figura 18. Procedimiento para la preparación de los reactivos necesarios en la determinación de

azucares en una muestra de miel de abejas (Navarrete, 2013).

59
 Figura 19. Procedimiento para determinar el título de Fehling (Navarrete, 2013).

Título de Fehling
𝐴 𝑥𝐵
𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 =
100 𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎

𝐴 = 𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 (𝑝𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜)

𝐵 = 𝑚𝑙 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑖𝑑𝑜𝑠 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑡𝑖𝑡𝑢𝑙𝑎𝑐𝑖ó𝑛 (𝑝𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜)

60
 Figura 20. Procedimiento para la determinación de azucares en una muestra de miel de abejas
(Navarrete, 2013).

Azúcares reductores
𝑔 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 𝑡í𝑡𝑢𝑙𝑜 𝑑𝑒 𝐹𝑒ℎ𝑙𝑖𝑛𝑔 𝑥 𝐴 𝑥 100
=
100 𝑔 𝑜 𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝐵𝑥 𝐶 𝑥 1000

𝑇í𝑡𝑢𝑙𝑜 𝑑𝑒 𝐹𝑒ℎ𝑙𝑖𝑛𝑔 = 𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎

𝐴 = 𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑎𝑓𝑜𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑚𝑎𝑑𝑟𝑒 𝑑𝑒 𝑚𝑖𝑒𝑙

𝐵 = 𝑚𝐿 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑖𝑑𝑜𝑠 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑚𝑎𝑑𝑟𝑒 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑡𝑖𝑡𝑢𝑙𝑎𝑐𝑖ó𝑛 (𝑝𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜)

𝐶 = 𝑔 ó 𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑡𝑜𝑚𝑎𝑑𝑜𝑠 𝑝𝑎𝑟𝑎 𝑙𝑎 𝑝𝑟𝑒𝑝𝑎𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑚𝑎𝑑𝑟𝑒

Azúcares no reductores

𝐴𝑧ú𝑐𝑎𝑟𝑒𝑠 𝑛𝑜 𝑟𝑒𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜𝑟𝑒𝑠 = (𝑎𝑧ú𝑐𝑎𝑟𝑒𝑠 𝑟𝑒𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜𝑟𝑒𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠 – 𝑎𝑧ú𝑐𝑎𝑟𝑒𝑠 𝑟𝑒𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜𝑟𝑒𝑠) 𝑥 0,95

61
Figura 21. Procedimiento para la determinación de azucares invertidos en una muestra de miel de
abejas (Navarrete, 2013).

62
Azúcares reductores totales

𝑔 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 𝑡í𝑡𝑢𝑙𝑜 𝑑𝑒 𝐹𝑒ℎ𝑙𝑖𝑛𝑔 𝑥 𝐴 𝑥 𝐹𝐷 𝑋 100

=
100 𝑔 𝑜 𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝐵𝑥 𝐶 𝑥 1000

𝑇í𝑡𝑢𝑙𝑜 𝑑𝑒 𝐹𝑒ℎ𝑙𝑖𝑛𝑔 = 𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎

𝐴 = 𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑎𝑓𝑜𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒𝑠𝑝𝑢é𝑠 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑖𝑛𝑣𝑒𝑟𝑠𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎

𝐵 = 𝑚𝐿 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑖𝑑𝑜𝑠 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑖𝑛𝑣𝑒𝑟𝑡𝑖𝑑𝑎 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑡𝑖𝑡𝑢𝑙𝑎𝑐𝑖ó𝑛 (𝑝𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜)

𝐶 = 𝑔 ó 𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑡𝑜𝑚𝑎𝑑𝑜𝑠 𝑝𝑎𝑟𝑎 𝑙𝑎 𝑝𝑟𝑒𝑝𝑎𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑚𝑎𝑑𝑟𝑒

𝐹𝐷 = 𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑝𝑎𝑟𝑎 𝑙𝑎 𝑖𝑛𝑣𝑒𝑟𝑠𝑖ó𝑛

6.7.8. Determinación de pH

Figura 22. Procedimiento para determinar el pH de una muestra de miel de abejas (Navarrete, 2013).

Nota: Registrar la temperatura a la cual se determina el pH.

63
 7. RESULTADOS

7.1. LINEALIDAD

Para determinar la linealidad se siguió el procedimiento de la tabla N.

7.1.1. Datos de la curva 1:

 Concentración de la madre 1:
Masa de Hidroximetilfurfural: 0,09305 g

1000 𝑚𝑔
0,09305 𝑔 × 0,99 × 𝑚𝑔
1𝑔
𝐶𝑚 = = 92,1105
1𝐿 𝐿

 Concentración real :

𝑽𝟏 𝒙 𝑪𝟏 = 𝑽𝟐 𝒙 𝑪𝟐

Dónde:

V1: Volumen de solución madre (mL)

V2: Volumen final de solución (mL)

C1: Concentración real solución madre (mg/L)

C2: Concentración final de la muestra fortificada (mg/L)

5 𝑚𝐿 × 92,1105 𝑚𝑔/𝐿
𝐶1 = = 9,2110 𝑚𝑔/𝐿
50 𝑚𝐿

64
 Tabla 9. Patrones de Hidroximetilfurfural para la determinación de la linealidad.

PATRÓN CONCENTRACIÓN REAL Volumen (mL) de la

ABSORBANCIA
(mg/Kg) solución madre *
1 9,2110 5 0,06
2 18,4221 10 0,118
3 27,6331 15 0,178
4 36,8442 20 0,237
5 46,0552 25 0,308
6 55,5663 30 0,354
7 64,4773 35 0,434
8 73,6884 40 0,484
9 82,8994 45 0,543
10 92,1105 50 0,628
 Se lleva a 50 mL

Curva de Calibración N° 1
0,7
0,6
y = 0,0067x - 0,0075
0,5 R² = 0,9981
Absorbancia

0,4
ABSORBANCIA
0,3
0,2 Lineal
0,1 (ABSORBANCIA)

0
0 20 40 60 80 100
Concentración (mg/Kg

Gráfica 1. Curva de calibración N°1 para la determinación de Hidroximetilfurfural en miel de abeja por
el método de la AOAC 980.23.

65
7.1.2. Datos de la curva 2:

 Concentración de la madre 2:
Masa de Hidroximetilfurfural: 0,0982 g

1000 𝑚𝑔
0,0982𝑔 × 0,99 × 𝑚𝑔
1𝑔
𝑪𝒎 = = 97.218
1𝐿 𝐿

 Concentración real:
5 𝑚𝐿 × 97.218 𝑚𝑔/𝐿
𝑪𝟏 = = 9,7218 𝑚𝑔/𝐿
50 𝑚𝐿

Tabla 10. Patrones y absorbancias para la determinación de la linealidad.

PATRÓN CONCENTRACIÓN REAL Volumen (mL) de la

ABSORBANCIA
(mg/Kg) solución madre
1 9,7218 5 0,047
2 19,4436 10 0,116
3 29,1654 15 0,18
4 38,8872 20 0,247
5 48,609 25 0,318
6 58,3308 30 0,385
7 68,0526 35 0,452
8 77,7744 40 0,516
9 87,4962 45 0,574
10 97,218 50 0,644
 Se lleva a 50 mL

66
 Curva de calibración N° 2
0,7
0,6 y = 0,0068x - 0,0168
0,5 R² = 0,9997
Absorbancia
0,4
0,3 ABSORBANCIA
0,2 Lineal (ABSORBANCIA)
0,1
0
0 50 100 150
Concentración (mg/Kg)

Gráfica 2. Curva de calibración N°2 para la determinación de Hidroximetilfurfural en miel de abeja por
el método de la AOAC 980.23.

7.1.3 CONFIRMACIÓN DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN:

Un mes después de la realización de las dos curvas de calibración anteriores, se

realizó una repetición de la curva de calibración; con el objetivo de ratificar esta
curva en contextos diferentes, tales como el tiempo, las concentraciones de los
patrones empleados y las condiciones ambientales.
La forma de proceder para la realización de ésta tercer curva, fue la misma que se
empleó para el desarrollo de las dos curvas preliminares, la única diferencia radicó
en que los patrones que se emplearon en esta última curva tenían valores
intercalados respecto a los patrones de las curvas anteriores, ya que como se
puede observar en las gráficas 1 y 2, estas dos curvas estaban compuestas por
diez patrones, cuyas concentraciones comenzaban a partir de 10 ppm y así
seguían sucesivamente de 10 en 10 hasta llegar a 100 ppm, mientras que en esta
curva de confirmación se emplearon nueve patrones que comenzaban en 15 ppm
aproximadamente, y seguían así, aumentando progresivamente en 10 ppm hasta
llegar a 95 ppm.

67
 ● Concentración de la solución madre:

Masa de Hidroximetilfurfural: 0,1044 g

1000 𝑚𝑔
0,1044 𝑔 × 0,99 × 𝑚𝑔
1𝑔
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑎𝑑𝑟𝑒 = = 103.356
1𝐿 𝐿
Concentración teórica:

𝑽𝟏 𝒙 𝑪𝟏
𝑪𝟐 =
𝑽𝟐

Dónde:

V1: Volumen de solución madre (mL)

V2: Volumen final de solución (mL)

C1: Concentración real solución madre (mg/L)

C2: Concentración final de la muestra fortificada (mg/L)

Nota: Los patrones no tienen valores enteros en sus concentraciones, debido a

que los volúmenes requeridos para la obtención de concentraciones más fieles,
eran de difícil medición, por tal motivo se diluyeron cantidades instrumentalmente
más medibles y exactas.

7. 5 𝑚𝐿 × 103.356𝑚𝑔/𝐿
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 1 = = 15.5034 𝑚𝑔/𝐿
50 𝑚𝐿

68
 Tabla 11. Datos de las absorbancias y las concentraciones teóricas de los patrones de la curva de
comprobación.

Volumen (mL)
CONCENTRACIÓN
de la solución ABSORBANCIA
PATRÓN TEÓRICA (mg/Kg) MASAS (g)
madre

1 7.5 15.5034 5.0064 0.081

2 12.5 25.8390 5.0013 0.141

3 17 35.1410 5.0015 0.208

4 22 45.4766 5.0023 0.267

5 27 55.8120 5.0195 0.337

6 32 66.1478 5.0918 0.425

7 37 76.4834 4.9994 0.486

8 42 86.8190 5.0040 0.562

9 46 95.0875 5.0021 0.623

 Se lleva a 50 mL

Curva de calibración 3
0,7
0,6 y = 0,0069x - 0,0365
0,5 R² = 0,9983
Absorvancia

0,4
0,3 Series1
0,2 Lineal (Series1)
0,1
0
0 20 40 60 80 100
Concentración (mg/Kg)

Gráfica 3. Comprobación de la curva de calibración.

69
Haciendo uso de la ecuación que arrojó la curva, se determinó la concentración de
cada uno de los patrones con el objetivo de realizar una comparación entre los
valores de las concentraciones obtenidos a través de la ecuación de la curva y a
través de la fórmula que se encuentra en el método de la AOAC 980.23.

Ecuación de la curva:
Y= 0.006x- 0.036
Dónde:
Y: la absorbancia de cada patrón arrojada por el equipo.
X: concentración en mg/L de cada patrón.
Por lo tanto:
𝒀 + 𝟎. 𝟎𝟑𝟔
𝑿=
𝟎. 𝟎𝟎𝟔

Patrón 1:
𝟎. 𝟎𝟖𝟏 + 𝟎. 𝟎𝟑𝟔
𝑿= = 𝟏𝟗. 𝟓 𝒎𝒈/𝑳
𝟎. 𝟎𝟎𝟔

Ecuación del método 980.23:

𝑨𝑩𝑺 × 𝟏𝟒. 𝟗𝟕 × 𝟓
𝑪𝒐𝒏𝒄𝒆𝒏𝒕𝒓𝒂𝒄𝒊ó𝒏 𝒅𝒆 𝑯𝒊𝒅𝒓𝒐𝒙𝒊𝒎𝒆𝒕𝒊𝒍𝒇𝒖𝒓𝒇𝒖𝒓𝒂𝒍 = × 𝟏𝟎
𝒎𝒂𝒔𝒂 𝒅𝒆 𝒎𝒖𝒆𝒔𝒕𝒓𝒂 (𝒂𝒑𝒓𝒐𝒙. 𝟓𝒈)

Patrón 1:
𝟎. 𝟎𝟖𝟏 × 𝟏𝟒. 𝟗𝟕 × 𝟓
𝑷𝟏 = × 𝟏𝟎 = 𝟏𝟐. 𝟏𝟏 𝒎𝒈/𝑳
𝟓. 𝟎𝟎𝟔𝟒

70
Tabla 12. Relación entre la concentración teórica y la concentración experimental obtenida a partir de
la ecuación según el método 980.23 de la AOAC.

Concentración según Porcentaje

Concentración
ecuación del método de error
Patrón teórica (mg/Kg)
980.23 (mg/Kg) (%)
1 15.5034 12.1 21.9
2 25.8390 21.1 18.2
3 35.1410 31.1 11.3
4 45.4766 39.9 12.1
5 55.8120 50.2 10.0
6 66.1478 62.4 5.5
7 76.4834 72.7 4.8
8 86.8190 84.0 2.7
9 95.0875 93.2 1.8
Promedio 9.8

Tabla 13. Relación entre la concentración teórica y la concentración experimental obtenida a partir de
la ecuación de la curva de verificación.

Concentración según Porcentaje

Concentración
ecuación de la curva de error
Patrón teórica (mg/Kg)
(mg/Kg) (%)
1 15.5 19.5 25.8
2 25.8 29.5 15.5
3 35.1 40.6 15.6
4 45.4 50.5 11.2
5 55.8 62.1 11.2
6 66.1 76.8 16.1
7 76.4 87.0 13.8
8 86.8 99.6 14.7
9 95.0 109.8 15.5
Promedio 15.4

71
7.2 SELELECTIVIDAD/ESPECIFICIDAD
7.2.1. Para determinar la selectividad se tomó una muestra de miel por duplicado
y se les halló su contenido de HMF. Posteriormente se preparó una solución
madre con el patrón de HMF; ésta solución quedó con una concentración
aproximada de 40 ppm; todo esto se hizo con el objetivo de fortificar cada una de
la muestras de miel con cierta cantidad de la solución madre y de esta manera
determinar la selectividad/ especificidad de este método.

7.2.2. Cálculos y resultados:

 Concentración teórica de la madre:

Masa de Hidroximetilfurfural: 0,04009 g
1000 𝑚𝑔
0,04009 𝑔 × 0,99 × 𝑚𝑔
1𝑔
𝐶𝑚 = = 40,09
1𝐿 𝐿

Para poder tener mayor seguridad sobre la concentración real de la solución

madre, se hizo una determinación espectrofotométrica del contenido real de HMF
en la solución, utilizándose la ecuación de determinación de HMF del método de la
AOAC 980.23, obteniéndose los siguientes resultados.

 Concentración experimental de la solución madre:

Absorbancia de la solución madre: 0,256

Masa medida de la solución madre: 5,0444 g

0,03879 𝑔 × 14,97 × 5 𝑚𝑔
𝐶𝑚 = 𝑥 10 = 37,99
5,0444 𝑔 𝐿

En ésta etapa se mezclaron aproximadamente 5 g de miel pura y 5 g de solución

madre para poder de esta manera aumentar la concentración de HMF en la
muestra de miel, obteniéndose así una miel fortificada.

72
 Tabla 14. Concentración ponderada de la muestra de miel fortificada.

Masa de la
Masa de miel Concentración
solución Absorbancia
(g) (mg/Kg)
madre (g)
5,0108 5,0102 0,386 57,66

5,0040 5,0061 0,389 58,16

Promedio de la
concentración de HMF
_____ _____ 57,91
en miel fortificada

Tabla 15. Concentración de Hidroximetilfurfural en miel sin fortificar.

Masa de miel Concentración

Absorbancia
(g) (mg/Kg)
5,0659 0,108 15,96

5,0740 0,116 17,11

Promedio de la
concentración de HMF
_____ 16,53
en miel NO fortificada

Ecuación para la determinación del porcentaje de recuperación:

𝑪𝟏 − 𝑪𝟐
%𝑹𝑬𝑪𝑼𝑷𝑬𝑹𝑨𝑪𝑰Ó𝑵 =
𝑪𝟑

Dónde:
C1: Promedio de la concentración determinada en la muestra fortificada.
C2: Promedio de la concentración determinada en la muestra no fortificada.
C3: concentración de fortificación.

73
 𝒎𝒈
𝟓𝟕, 𝟗𝟏 𝑲𝒈 − 𝟏𝟔, 𝟓𝟑𝒎𝒈/𝑲𝒈
%𝑹 = 𝑿 𝟏𝟎𝟎 = 𝟏𝟎𝟖, 𝟗𝟐 %
𝟑𝟕, 𝟗𝟗 𝒎𝒈/𝑲𝒈

7.3. LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN Y LÍMITE DE DETECCIÓN

7.3.1 El procedimiento experimental para la determinación del límite de

cuantificación y límite de detección fue el mismo, lo que cambia, son las
ecuaciones que se utilizaron para determinar cada parámetro.
Para hacer las determinaciones cuantitativas se tomaron 10 réplicas de una
solución madre de 10 ppm aproximadamente; preparada a partir de un patrón de
HMF. A cada una de estas réplicas se les realizó el mismo pretratamiento; el cual
está dictado por el método 980.23 de la AOAC para la determinación de HMF
(Hidroximetilfurfural) en miel.

7.3.2 Cálculos y resultados:

Tabla 16. Absorbancia y concentración de los patrones de hidroximetilfurfural.

NÚMERO MASA (g) ABSORBANCIA CONCENTRACIÓN

REAL (mg/Kg))
1 5,0045 0,042 6,2817
2 5,0459 0,051 7,5652
3 5,0121 0,051 7,6162
4 5,0159 0,053 7,9089
5 5,0477 0,053 7,8591
6 5,0438 0,053 7,8652
7 5,0311 0,057 8,4801
8 5,0272 0,053 7,8911
9 5,5098 0,056 7,6053
10 5,0042 0,045 6,7308
PROMEDIO 0,051 7,5803

74
 Concentración del patrón 1:

0,042 𝑥 14,97 𝑥 5
𝑪𝟏: 𝑥 10 = 6,2817 𝑝𝑝𝑚
5,0045 𝑔

 Masa de Hidroximetilfurfural en solución madre: 0,00872 g

1000 𝑚𝑔
0,00872𝑔 × 0,99 × 𝑚𝑔
1𝑔
𝑪𝒎 = = 8,6328
1𝐿 𝐿

 Ecuación para la desviación estándar

𝑆 = 0,6309

 LÍMITE DE DETECCIÓN:

LD= B + 3,3 SB
B: valor promedio de los resultados obtenidos.
SB: valor de la desviación estándar.

LD= 7,5803 + 3,3 (0,6309) = 9,6626 mg/Kg

75
  LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN (LC):

LC= B + (5,6 o 10) * SB

B: valor promedio de los resultados obtenidos
(5,6 o 10): número de muestras analizadas.
SB: valor de la desviación estándar.

LC= 7,5803 + (10 x 0,6309) = 13,8901 mg/Kg

 PRECISIÓN:

Desviación estándar relativa (coeficiente de variación %CV):

RSD= (S/X) x 100

0,6309
RDS = 7,5803 𝑥 100 = 𝟖, 𝟑𝟐 %

 EXACTITUD:

|𝑥𝑖 − |
%℮ = 𝑥 100
𝑥𝑖

La veracidad del método se aplicó a los resultados obtenidos en repetibilidad y

reproducibilidad y observándose en las tablas de cálculos de los resultados de
cada una de las analistas.

76
 7.4. REPETIBILIDAD Y REPRODUCIBILIDAD

7.4.1. Para la determinación de la repetibilidad y reproducibilidad se siguió el

procedimiento establecido en la tabla 7.
A través de la medición de la repetibilidad y la reproducibilidad se pretende
determinar los parámetros de exactitud y precisión del método.

7.4.2. Cálculos y resultados:

 Soluciones madre:

 Madre 1: se pesó 0,0872 g del patrón de Hidroximetilfurfural y diluyéndolo en 1 L

de agua destilada.

1000 𝑚𝑔
0,0872𝑔 × 0,99 × 𝒎𝒈
1𝑔
𝑪𝒎 = = 𝟖𝟔, 𝟑𝟐𝟖
1𝐿 𝑳

 Madre 2: se pesó 0,0456 g del patrón de Hidroximetilfurfural y diluyéndolo en 1 L

de agua destilada.
1000 𝑚𝑔
0,0456𝑔 × 0,99 × 𝒎𝒈
1𝑔
𝑪𝒎 = = 𝟒𝟓, 𝟏𝟒𝟒
1𝐿 𝑳

 Madre 3: se pesó 0,0109 g del patrón de Hidroximetilfurfural y diluyéndolo en 2 L

de agua destilada.
1000 𝑚𝑔
0,0109𝑔 × 0,99 × 𝒎𝒈
1𝑔
𝑪𝒎 = = 𝟓, 𝟑𝟗𝟓𝟓
1𝐿 𝑳

Los resultados arrojados por el analista A para la determinación de la repetibilidad

fueron tomados en cuenta también para la determinación de la reproducibilidad.

77
 DIA 1:
Tabla 17. Resultados de la determinación de la concentración de hidroximetilfurfural por el analista A
en el día 1.

Absorbancia Concentración
N° N° Concentración
Solución experimental
solución Repetición Teórica (mg/Kg)
madre (mg/Kg)
madre
1 0,036 5,3820
1
5,5122 5,3955
(BAJA) 2 0,037
43,8366
1 0,293
2 45,1440
(MEDIA) 42,5476
2 0,289
1 0,517 77,0313
3 86,3281
(ALTA) 2 0,521 77,8116

Tabla 18. Cálculos de los resultados de de la determinación de la concentración de hidroximetilfurfural

por el analista A en el día 1.

Concentración
N° Concentración
Teórica
solución experimental
S %CV %E (mg/Kg)
madre (mg/Kg)

1 5,4471 0,0920 1,68% 0,95% 5,3955

45,1440
2 43,1921 0,0911 0,21% 4,32%

86,3281
3 77,4214 0,0551 0,071% 10,31%

78
 Tabla 19. Resultados de la determinación de la concentración de hidroximetilfurfural por el analista B
en el día 1.

Absorbancia Concentración Concentración

N° N°
Solución experimental Teórica
solución repetición
Madre (mg/Kg) (mg/Kg)
madre
1 0,042 5,8350
1
5,4993 5,3955
(BAJA) 2 0,037

1 0,298 44,4650 45,1440

2
(MEDIA) 43,0352
2 0,288

1 0,551 82,1511
3 86,3281
(ALTA)
2 0,563 83,6919

Tabla 20. Cálculos de los resultados de la determinación de la concentración de hidroximetilfurfural

por el analista B en el día 1.

Concentración
N° solución Concentración
experimental S %CV %E
madre Teórica (mg/Kg)
(mg/Kg)

5,6671 5,3955
1 0,2373 4.1873% 5.00%

45,1440
2 43,7501 1.0110 2.3108% 3,08%

86,3281
3 82.9215 1.0895 1.3108% 3.94%

79
  DIA 2:

Tabla 21. Resultados de la determinación de la concentración de hidroximetilfurfural por el analista A

en el día 2.

Absorbancia Concentración Concentración

N° solución N° repetición Solución experimental Teórica
madre Madre (mg/Kg) (mg/Kg)

1 0,034 5,0491
1 5,3955
(BAJA) 2 0,033 4,9196

1 0,293 43,6751
2 45,1440
(MEDIA)
2 0,297 44,3889

3 1 0,569 84,9313 86,3281

(ALTA)
2 0,561 83,8107

Tabla 22. Cálculos de los resultados de la determinación de la concentración de hidroximetilfurfural

por el analista A en el día 2.

Concentración Concentración
N°
experimental Teórica
solución S %CV %E
(mg/Kg) (mg/Kg)
madre

4.9844 5,3955
1 0,0916 1.84% 7.62%

45,1440
2 44.0320 0,5048 1.15% 2.46%

86,3281
3 84.3710 0.7924 0.94% 2.27%

80
Tabla 23. Resultados de la determinación de la concentración de hidroximetilfurfural por el analista B
en el día 2.

N° Absorbancia Concentración Concentración

N° solución repetición Solución experimental Teórica
madre Madre (mg/Kg) (mg/Kg)

1 0,033 4,9399
1 5,3955
(ALTA) 2 0,031 4,6033

1 0,293 43,2829
2 45,1440
(MEDIA)
2 0,287 42,5174

3 1 0,552 82,4974 86,3281

(ALTA)

2 0,551 81,2817

Tabla 24. Cálculos de los resultados de la determinación de la concentración de hidroximetilfurfural

por el analista B en el día 2.

Concentración Concentración
N° experimental S %CV %E Teórica
solución (mg/Kg) (mg/Kg)
madre

1 4.7716 0,2380 4.98% 11.56% 5,3955

2 42.9001 0,5412 1.26% 4,97% 45,1440

3 81.8895 0.8596 1.05% 5.14% 86,3281

81
 DÍA 3:
Tabla 25. Resultados de la determinación de la concentración de hidroximetilfurfural por el analista A
en el día 3.

N° Absorbancia Concentración Concentración

N° solución repetición Solución experimental Teórica
madre Madre (mg/Kg) (mg/Kg)

1 0,039 5,5873
1 5,3955
(BAJA) 2 0,034 5,0444

1 0,288 43,0326
2 45,1440
(MEDIA)
2 0,292 43,5720

3 1 0,542 80,7948 86,3281

(ALTA)
2 0,554 82,7682

Tabla 26. Cálculo de los resultados de la determinación de la concentración de hidroximetilfurfural por

el analista A en el día 3.

Concentración Concentración
N° experimental S %CV %E Teórica
solución (mg/Kg) (mg/Kg)
madre

1 5.3155 0,383 7.20% 7.62% 5,3955

2 43.3023 0,381 0.87% 2.46% 45,1440

3 81.7815 1.395 1.70% 2.27% 86,3281

82
 En la tarde del tercer día, se pudo observar mediante análisis espectroscópicos que
la concentración de las tres soluciones patrón que se venían analizando, cambiaron
su concentración, notándose una evidente descomposición de las mismas, por este
motivo y para evitar cambios bruscos en el resultado de la exactitud del
procedimiento, se optó por volver a preparar tres soluciones patrón de
concentraciones similares a las anteriores (alta, media y baja).

 Soluciones madre:

 Madre 1 (alta): se pesó 0,0737 g del patrón de Hidroximetilfurfural y diluyéndolo

en 1 L de agua destilada.

1000 𝑚𝑔
0,0737𝑔 × 0,99 × 𝒎𝒈
1𝑔
𝑪𝒎 = = 𝟕𝟑. 𝟎𝟐𝟐𝟎
1𝐿 𝑳

 Madre 2 (media): se pesó 0,0385 g del patrón de Hidroximetilfurfural y diluyéndolo

en 1 L de agua destilada.
1000 𝑚𝑔
0,0385 𝑔 × 0,99 × 𝒎𝒈
1𝑔
𝑪𝒎 = = 𝟑𝟖, 𝟏𝟗𝟒𝟎
1𝐿 𝑳

 Madre 3 (baja): se preparó pesando 0,0044 g del patrón de Hidroximetilfurfural y

diluyéndolo en 2 L de agua destilada.

1000 𝑚𝑔
0,0044𝑔 × 0,99 × 𝒎𝒈
1𝑔
𝑪𝒎 = = 𝟒. 𝟒𝟎𝟓𝟔
1𝐿 𝑳

83
Tabla 27. Resultados de la determinación de la concentración de hidroximetilfurfural por el analista B
en el día 3.

N° Absorbancia Concentración Concentración

N° solución repetición Solución experimental Teórica
madre Madre (mg/Kg) (mg/Kg)

1 0,027 4,0271
1 4,4056
(BAJA) 2 0,025 4,7212

1 0,244 36,1701
2 38,1940
(MEDIA)
2 0,252 37,4316

3 1 0,468 69,4360
(ALTA) 73.0220

2 0,469 69,9393

Tabla 28. Cálculos de los resultados de la determinación de la concentración de hidroximetilfurfural

por el analista B en el día 3.

Concentración Concentración
N° experimental S %CV %E Teórica
solución (ppm) (mg/Kg)
madre

1 4.3742 0,4908 11.22% 2.98% 4.4056

2 36.8008 0,8920 1.03% 3.64% 38,1940

3 69.6876 0.3560 2.00% 4.56% 73.0220

84
 DÍA 4:
Tabla 29. Resultados de la determinación de la concentración de hidroximetilfurfural por el analista A
en el día 4.

N° Absorbancia Concentración Concentración

N° solución repetición Solución experimental Teórica
madre Madre (mg/Kg) (mg/Kg)

1 0,028 4,1830
1 4.6056
(BAJA) 2 0,028 4,1651

1 0,248 36,9078
2 40.1940
(MEDIA) 2 0,252 37,6453

3 1 0,477 70,9346
(ALTA) 76,0220

2 0.485 72.7100

Tabla 30. Cálculos de los resultados de la determinación de la concentración de hidroximetilfurfural

por el analista A en el día 4.

Concentración Concentración
N° experimental S %CV %E Teórica
solución (mg/Kg) (mg/Kg)
madre

1 4.1740 0,012 0.29% 5.26% 4.4056

2 37.2765 0,521 1.40% 2.40% 38,1940

3 71.8223 1.255 1.75% 1.64% 73.0220

85
Tabla 31. Resultados de la determinación de la concentración de hidroximetilfurfural por el analista B
en el día 4.

N° solución N° Absorbancia Concentración Concentración

madre repetición Solución experimental Teórica
Madre (mg/Kg) (mg/Kg)

1 0,027 4,0101
1 4.4056
(BAJA) 2 0,030 4,4851

1 0,247 36,8675
2 38.1940
(MEDIA)
2 0,246 36,2991

3 1 0,465 68,8844
(ALTA) 73.0220
2 0,468 69,8946

Tabla 32. . Cálculos de los resultados de la determinación de la concentración de hidroximetilfurfural

por el analista B en el día 4.

N° Concentración Concentración
solución experimental S %CV %E Teórica
madre (mg/Kg) (mg/Kg)

1 4.2476 0.3358 7.90% 3.59% 4.4056

2 36.5833 0.4019 1.10% 4.22% 38,1940

3 69.3895 0.7143 1.03% 4.97% 73.0220

86
 DÍA 5:
Tabla 33. Resultados de la determinación de la concentración de hidroximetilfurfural por el analista A
en el día 5.

N° solución N° Absorbancia Concentración Concentración

madre repetición Solución experimental Teórica
Madre (mg/Kg) (mg/Kg)

1 0,024 4.5830
1 4.4056
(BAJA) 2 0,023 4.4356

1 0,229 34.2030
2 38.1940
(MEDIA)
2 0,237 35.4456

3 1 0,458 69.5240
(ALTA) 73.0220

2 0,466 69.1842

Tabla 34. Cálculo de los resultados de la determinación de la concentración de hidroximetilfurfural por

el analista A en el día 5.

N° Concentración Concentración
solución experimental S %CV %E Teórica
madre (mg/Kg) (mg/Kg)

1 4.5093 0.1042 2.97% 2.19% 4.4056

2 36.8243 0.8787 2.52% 3.59% 38,1940

3 69.6541 0.4875 0.70% 4.61% 73.0220

87
Tabla 35. . Resultados de la determinación de la concentración de hidroximetilfurfural por el analista B
en el día 5.

N° Absorbancia Concentración Concentración

N° solución repetición Solución experimental Teórica
madre Madre (mg/Kg) (mg/Kg)

1 0,023 4,4310
1 4.4056
(BAJA) 2 0,023 4,4353

1 0,229 34,2586
2 38.1940
(MEDIA)
2 0,237 35,3424

3 1 0,439 69,6880
(ALTA) 73.0220
2 0,452 70,4122

Tabla 36. Cálculos de los resultados de la determinación de la concentración de hidroximetilfurfural

por el analista A en el día 5.

Concentración Concentración
N° experimental S %CV %E Teórica
solución (mg/Kg) (mg/Kg)
madre

1 4.4331 0.0030 0.067% 0.62% 4.4056

2 34.8005 0.7663 2.20% 8.88% 38,1940

3 70.0501 0.5120 0.73% 4.07% 73.0220

88
7.5. ROBUSTEZ

Cuando se llegó a la determinación de este parámetro, se comenzó a trabajar con

una miel que tenía una concentración de Hidroximetilfurfural distinta, ya que ésta
provenía de un lote de miel diferente.
La concentración de Hidroximetilfurfural en esta nueva miel era de: 98,7895
(mg/Kg).

7.5.1. Según la bibliografía los factores que pueden generar cambios en la

concentración de HMF presente en la miel, son el aumento de la humedad, la
acidez y la temperatura, por este motivo para llevar a cabo la determinación del
parámetro de robustez, se sometió la miel a distintas condiciones para poder
originar modificaciones en las variables que podían generar un efecto significativo
n en el desempeño del método.
Para poder determinar la robustez, es fundamental la determinación del análisis de
varianza de los resultados, los cuales se hicieron a través de la herramienta de
Excel ANOVA, la cual es utilizada para aislar y estimar las varianzas que
contribuyan al error total de un experimento, para analizar si hay o no varianzas
entre los lotes de análisis.

7.5.1.1. Sometimiento de la miel a siete temperaturas diferentes para observar

cambios en la concentración de Hidroximetilfurfural presente en la miel.

Siguiendo la metodología consignada en la tabla 7, se obtuvieron los siguientes

resultados (este análisis se realizó por duplicado):

Tabla 37. Resultados de dos repeticiones del calentamiento de la miel a siete temperaturas diferentes
para lograr una modificación en el aumento del contenido de Hidroximetilfurfural.

TEMPERATURA CONCENTRACIÓN (1) CONCENTRACIÓN (2) PROMEDIO

°C (mg/Kg) (mg/Kg)

30 99,678 98,118 98,898

40 104,692 105,245 104,968
50 107,130 108,675 107,902
60 110,770 109,987 110,378
70 111,995 112,023 112,009
80 112,095 113,021 112,558
90 115,051 116,015 115,5333

89
 118 CONCENTRACIÓN Vs TEMPERATURA
116

CONCENTRACIÓN (g/mL)
114
112
110
108
106
104
102
100
98
0 20 40 60 80 100
TEMPERATURA °C

Gráfica 4. Promedio del aumento en la concentración del Hidroximetilfurfural con respecto a la

temperatura.

7.5.1.2. Análisis de varianza de un factor (ANOVA) a partir de los datos de la

TABLA 38.

Tabla 38 Análisis de varianza de un factor ANOVA, temperatura en Hidroximetilfurfural..

RESUMEN

Grupos Cuenta Suma Promedio Varianza

Columna 1 2 197,796 98,898 1,2168

Columna 2 2 209,937 104,9685 0,1529045

Columna 3 2 215,805 107,9025 1,1935125

Columna 4 2 220,757 110,3785 0,3065445

Columna 5 2 224,018 112,009 0,000392

Columna 6 2 225,116 112,558 0,428738

Columna 7 2 231,066 115,533 0,464648

90
 ANÁLISIS DE VARIANZA

Origen de
Suma de Grados de Promedio de Probabili Valor crítico
las F
cuadrados libertad los cuadrados dad para F
variaciones

Entre grupos 371,44161 6 61,906935 115,143881 1,23E-06 3,865968853

Dentro de
3,7635395 7 0,5376485
los grupos

Total 375,2051495 13

7.5.1.3 HUMEDAD

Siguiendo la metodología consignada en la tabla 7, se obtuvieron los siguientes

resultados (este análisis se realizó por duplicado):

Tabla 39. Datos y resultados obtenidos para la observación del efecto de la humedad en la
concentración del Hidroximetilfurfural en miel de abejas.

Masa de Promedio masa

Concentración Concentración
agua de de la Promedio
de agua absorbancia Experimental
# Adicionada humedad solución (mg/Kg)
(%) (mg/Kg)
(g) (%) (g)
1a 1,2623 25,20 5,0090 0,454 67,7740
25,54 67,3808
66,9876
1b 1,2987 25,89 5,0145 0,448
2a 1,0219 20,37 5,0108 0,519 77,2373
20,13 77,6643
2b 1,0024 19,90 5,0365 0,526 78,0913
3a 0,7614 15,16 5,0203 0,559 83,5402
13,55 83,2762
3b 0,6014 11,94 5,0354 0,558 83,0123

91
7.5.1.4. Análisis de varianza de un factor (ANOVA) a partir de los datos de la
TABLA 40.

Tabla 40. Análisis de varianza de un factor ANOVA, humedad en Hidroximetilfurfural.

RESUMEN

Grupos Cuenta Suma Promedio Varianza

Columna 1 2 134,7616 67,3808 0,30921248

Columna 2 2 155,3286 77,6643 0,364658

Columna 3 2 166,5525 83,27625 0,1393392

ANÁLISIS DE VARIANZA
Grados Promedio
Origen de las Suma de Valor crítico
de de los F Probabilidad
variaciones cuadrados para F
libertad cuadrados
Entre grupos 259,939791 2 129,969895 479,470047 0,00017416 9,552094496
Dentro de los
0,81320969 3 0,2710699
grupos
Total 260,753 5

7.5.1.4. Acidez

Siguiendo la metodología consignada en la tabla 7, se obtuvieron los siguientes

resultados (este análisis se realizó por duplicado):
Tabla 41. Datos de miel de abejas con la variable acidez sin fortificar.

Acidez Concentración de HMF

Masa miel de abejas (g) absorbancia
inicial(ppm) inicial (mg/Kg)
5,0763 57.12 0,265 3,90
5,0138 55,84 0,262 3,99
5,0300 57,64 0,263 3,91

Tabla 42. Datos miel de abejas con la variable acidez fortificada.

Masas miel de Acidez con fortificación Concentración de HMF

absorbancia
Abejas (g) (ppm) final (mg/Kg)
5,0703 254.12 -0,001 -0,14
5,0459 255.29 -0,017 -2,52
5,0176 256.42 -0,043 -6,41

92
7.6. RESULTADOS BROMATOLÓGICOS

7.6.1. De acuerdo a la resolución 1057 del 2010 del ministerio de la protección

social, la cual establece los requisitos que debe cumplir la miel de abejas para ser
comercializada en el país, se realizaron los análisis fisicoquímicos generales que
se le realizan a la miel y además también los exigidos por dicha resolución, entre
los cuales se encuentran:

 Cenizas

 Humedad

 Acidez

 pH

 Sólidos solubles

 Sólidos Insolubles

 Contenido aparente de azúcar reductor

 Contenido de sacarosa

 Azúcares reductores

 Conductividad eléctrica

 Metales pesados

La determinación de estos parámetros se hizo con el objetivo de controlar que la

miel de estudio fuera la adecuada para llevar a cabo la validación, y además
observar la relación posible entre los parámetros fisicoquímicos y el contenido de
HMF (Hidroximetilfurfural) presente en la miel de abejas analizada.

99
 7.6.2 RESULTADOS:
Tabla 43. Resultados de análisis bromatológicos.

PARÁMETROS RESULTADOS VALORES PERMSIIBLES

CONDUCTIVIDAD 0.365 mS/cm ≤ 0.6 mS/cm

≤ 20 %
HUMEDAD 19%
≤ 21 % para mieles
tropicales

SÓLIDOS INSOLUBLES EN 0.1318% ≤ 0.1 para miel diferente

AGUA a la prensada

≤ 0.5 para miel prensada

pH 3.95 N.E

≤5%
CONTENIDO DE SACAROSA 1.46 %
≤ 10%para mieles de
origen tropical

CONTENIDO DE 0.0715 % ≤ 0.5 %

SUSTANCIAS MINERALES
(CENIZAS)

AZÚCARES REDUCTOR 39,5976 % ≥ 45 %(miel de mielato)

(calculado como azúcar
≥ 60% (miel floral)
invertido)

ACIDÉZ LIBRE 44.067 meq/Kg ≤ 50 meq/Kg

CONTENIDO DE ≤ 40 mg/Kg
HIDROXIMETILFURFURAL 105.90 ppm
≤ 60 mg/Kg para mieles
(HMF)
de origen tropical

SÓLIDOS SOLUBLES 77.9 ° Brix N.E

 N.E: No Especifica

100
7.6.3 CÁLCULOS Y RESULTADOS:

7.6.3.1 DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO APARENTE DE SACAROSA:

Tabla 44. Relación concentración Vs ángulo de giro de soluciones patrón para la determinación del
contenido de sacarosa en miel.

CONCENTRACIÓN (ppm) ÁNGULO DE GIRO (α)

5 7,1
10 13,05
15 20,85
20 26,1

solución patrón de sacarosa

30

y = 1,296x + 0,575
25
R² = 0,9948
ángulo de giro (α)

20

15 solución patrón de
sacarosa

10 Lineal (solución patrón de

sacarosa)
5

0
0 5 10 15 20 25
Concentración (ppm)

Gráfica 5. Concentración versus ángulo de giro de soluciones patrón de sacarosa.

101
7.6.3.2 DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE CENIZAS:

Para llevar a cabo la determinación del contenido de cenizas en la miel de abejas

se llevó a cabo el procedimiento dela figura 15.

Tabla 45. Resultados de la determinación del contenido de cenizas en miel de abejas.

Masa crisol Masa crisol

Masa miel de Contenido de
vacío con con cenizas y
abejas (g) cenizas (%)
tapa (g) tapa (g)
Contenido de
cenizas crisol 1,2383 45,4411 45,4431 0,16
1
Contenido de
cenizas crisol 1,2701 41,7029 41,7036 0,055
2
Promedio del contenido de cenizas (%) 0,1075

7.6.3.3 DETERMINACIÓN DE ACIDÉZ LIBRE:

Para llevar a cabo la determinación del contenido de acidez libre en miel de

abejas se siguió el procedimiento de la figura 17, por triplicado.

Tabla 46. Resultados de la valoración de la acidez en la miel.

Concentración de
𝒎𝒆𝒒
NÚMERO DE MASA DE ANALITO VOLUMEN DE NaOH acidez ( 𝑲𝒈 )
ENSAYO CONSUMIDO
45.23
1 5.0110 g 2.25 mL
44.22
2 5.0112 g 2.20 mL
42.75
3 5.0661 g 2.15 mL
Promedio de la concentración de acidez 𝟒𝟒. 𝟎𝟔𝟕

102
7.6.3.4 DETERMINACIÓN DE HUMEDAD:

Para poder realizar la determinación del contenido de humedad en la miel se

siguió el procedimiento establecido en la figura 14. La lectura en el refractómetro
se realizó por triplicado.

Tabla 47. Resultados del índice de refracción de la miel de abejas.

INDICE DE INDICE DE HUMEDAD

REFRACCIÓN (α) REFRACCIÓN (α) (%)
a 22.5 °C a 20°C
ENSAYO 1 1.4895 1,4897 18,72
ENSAYO 2 1.4855 1,4857 20,44
ENSAYO 3 1.4890 1,4892 18,92
PROMEDIO 1.4880 1.4882 19,36

7.6.3.5 DETERMINACIÓN DE SÓLIDOS INSOLUBLES EN AGUA:

Esta determinación se realizó siguiendo la metodología del numeral 6.7.9.

% de sólidos insolubles en agua = 𝟎. 𝟏𝟑𝟏𝟖%

7.6.3.6 DETERMINACIÓN DE CONDUCTIVIDAD:

Esta determinación se llevó a cabo siguiendo el procedimiento de la figura 16.

El resultado arrojado por el conductímetro para la muestra de miel de abejas fue:
0.365 mS/cm.

7.6.3.7 DETERMINACIÓN DE pH:

Para realizar ésta determinación se siguió el procedimiento de la figura 22.

El valor de pH de en la miel de abejas fue: 3.95
7.6.3.8 DETERMINACIÓN DE SÓLIDOS SOLUBLES:

Se empleó un refractómetro de ABBE calibrado y se realizó el mismo

procedimiento que el empleado para determinar el contenido de Humedad. Se
dejó caer sobre los prismas unas gotas de miel y se determinó el porcentaje de
sólidos solubles en la escala de los grados Brix.
Resultado de los ° Brix: 77.9

103
7.6.3.9 DETERMINACIÓN DE HIDROXIMETILFURFURAL:

El procedimiento y los cálculos que se llevaron a cabo para la determinación de

Hidroximetilfurfural en la miel que se designó para que se llevaran a cabo los
análisis bromatológicos han sido exactamente los mismos que se han mencionado
en todo el transcurso del documento. El análisis se llevó a cabo por triplicado.

Tabla 48. Resultados de los ensayos de la determinación de HMF para bromatología.

MASA DE CONCENTRACIÓN
ENSAYO ABSORBANCIA
MUESTRA (g) DE HMF (mg/Kg)
1 5,0146 0,708 105,680
2 5,0348 0,717 106,593
3 5,0606 0,713 105,457
PROMEDIO 5,03666667 0,71266667 105,91

7.6.3.10 DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES:

El procedimiento llevado a cabo para la determinación de azúcares reductores se

encuentra en el numeral 6.7.7. A continuación se muestran los resultados
obtenidos al realizar cada una de las titulaciones por triplicado.

Masa de miel para la solución patrón = 5,1465 g

Tabla 49. Título de Fehling.

Volumen (mL)
ENSAYO masa de glucosa consumido de
(g) solución de glucosa

1 0,5095 10,2

2 0,5060 10,3

3 0,5071 10,5

PROMEDIO 0,5075 10,3333

104
 Tabla 50. Azúcares reductores.

Volumen (mL)
consumido de
ENSAYO
solución madre de
miel
1 11,75
2 13,15
3 13,7
Promedio 12,8666

Tabla 51. Azúcares reductores totales.

Volumen (ml)
ENSAYO consumido de
solución madre de
miel
1 17,15
2 17,8
3 17,3
Promedio 17,4166

Las concentraciones de azucares en la miel de abejas fueron:

Título de Fehling

𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 = 52,4415 𝑚𝑔
Azúcares reductores
𝑔 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎
𝐴𝑧𝑢𝑐𝑎𝑟𝑒𝑠 𝑟𝑒𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜𝑟𝑒𝑠 = 39,5976
100 𝑔 𝑑𝑒 𝑚𝑖𝑒𝑙
Azúcares reductores totales
𝑔 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎
𝐴𝑧𝑢𝑐𝑎𝑟𝑒𝑠 𝑟𝑒𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜𝑟𝑒𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠 = 58,5059
100 𝑔 𝑑𝑒 𝑚𝑖𝑒𝑙
Azúcares no reductores
𝑔 𝑑𝑒 𝑠𝑎𝑐𝑎𝑟𝑜𝑠𝑎
𝐴𝑧ú𝑐𝑎𝑟𝑒𝑠 𝑛𝑜 𝑟𝑒𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜𝑟𝑒𝑠 = 17,9628
100 𝑔 𝑜 𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

105
7.6.3.11 DETERMINACIÓN DE METALES PESADOS:

Mediante el procedimiento descrito en el numeral 6.7.4. utilizando el método de

espectroscopia de absorción atómica se realizó por duplicado la determinación de
los siguientes metales: K, Ca, Na, Fe, Zn, Mg, Mn, y Cu presentes en la muestra
de miel de estudio, y se obtuvieron los siguientes resultados.
Para cada metal se realizó una curva de calibración, por el método de
espectroscopia de absorción atómica, como ejemplo se reporta los resultados
para la curva de calibración del Cu:

Determinación de Cu:

Tabla 52. Reporte resultados de la determinación de Cobre en la muestra de miel de abejas.

Curva de Cu

Concentración
Muestra Señal
(mg/L)

Blanco -0,001 0

1 0,009 0,1

2 0,017 0,3

3 0,025 0,5

4 0,048 1

5 0,072 1,5

6 0,097 2

7 0,118 2,5

8 0,139 3

9 0,164 3,5

10 0,19 4

106
 Curva de calibración de Cu
0,2

0,15
y = 0,0468x + 0,0013
R² = 0,9994
Absorbancia

0,1
Series1
0,05 Lineal (Series1)

0
0 1 2 3 4 5
-0,05
Concentración ppm

Gráfica 6. Curva de calibración para el análisis de Cobre.

7.6.3.11.1. Concentración de Cobre:

Tabla 53. Reporte de la concentración de Cobre en la muestra de miel de abejas.

concentración
muestra
(mg/L)

Miel 1 0

Miel 2 0

Promedio Ausencia de Cu

7.6.3.11.2. Concentración de Potasio:

Tabla 54. Reporte de la concentración de Potasio en la muestra de miel de abejas.

concentración
muestra
(mg/L)
miel 1 4,5086
miel 2 3,7237
Promedio 4,11615

107
7.6.3.11.3. Concentración de Calcio:
Tabla 55. Reporte de la concentración de Calcio en la muestra de miel de abejas.

concentración
muestra
(mg/L)
Miel 1 0,8305
Miel 2 0,669
Promedio 0,74975

7.6.3.11.4. Determinación de Sodio:

Tabla 56. Reporte de la concentración de Sodio en la muestra de miel de abejas.

concentración
muestra
(mg/L)
Miel 1 1,0781
Miel 2 0,081
Promedio 0,57955

7.6.3.11.5. Determinación de Hierro:

Tabla 57. Reporte de la concentración de Hierro en la muestra de miel de abejas.

Concentración
Muestra
(mg/L)
Miel 1 -0,1935
Miel 2 -0,3457
Promedio Ausencia de Fe

7.6.3.11.6. Determinación de Zinc:

Tabla 58. Reporte de la concentración de Zinc en la muestra de miel de abejas.

Concentración
Muestra
(mg/L)
Miel 1 -0,09
Miel 2 -0,0585
Promedio Ausencia de Zn

108
7.6.3.11.7. Determinación de Magnesio:
Tabla 59. Reporte dela concentración de Magnesio en la muestra de miel de abejas.

Concentración
Muestra
(mg/L)
Miel 1 0,4592
Miel 2 0,4394
Promedio 0,4493

7.6.3.11.8. Determinación de Manganeso:

Tabla 60. Reporte resultados de la determinación de Manganeso en la muestra de miel de abejas.

Concentración
Muestra
(mg/L)
Miel 1 -0,0336
Miel 2 -0,0135
Promedio Ausencia de Mn

109
 8. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Los criterios establecidos para determinar si el método cumple con las características
establecidas para cada parámetro se registran en la siguiente tabla:

Tabla 61. Valores aceptados para cada uno de los criterios.(Laboratorio de Aguas y Alimentos de la
Universidad Tecnológica de Pereira, 2011)

CARACTERÍSTICAS EXPRESADA EN ACEPTACIÓN DEL RESULTADO

COEFICIENTE DE
PRESICIÓN ≤ 10%
VARIACIÓN

PORCENTAJE DE
EXACTITUD ≤5%
ERROR

LÍMITE DE UNIDADES DEL Debe ser mucho menor a lo que piden las
DETECCIÓN MÉTODO respectivas normas ( HMF < 60 mg/Kg)

COEFICIENTE DE
LINEALIDAD 0,9900 – 1
CORRELACIÓN

No se deben encontrar diferencias

COEFICIENTES
ROBUSTEZ significativas entre los resultados
CALCULADOS
reportados.

SELECTIVIDAD/ PORCENTAJES DE
80 % < % R > 120 %
ESPECIFICIDAD RECUPERACIÓN

110
8.1 LINEALIDAD

Utilizando el método de la AOAC 980.23 y mediante regresión lineal con el procedimiento

descrito en la TABLA 7. Se realizaron dos curvas de calibración como se observa en la
gráfica 1. Y gráfica 2. Obteniendo como resultados que las concentraciones de HMF son
proporcionales a la absorbancia entregada por el equipo. Además, se encontraron unos
coeficientes de correlación de 0,9981 (gráfica 1.) y 0,9997 (gráfica 2.); cumpliendo con el
rango establecido para este parámetro en el Laboratorio de Análisis de Aguas y
Alimentos de la U.T.P que es de 0,9900 – 1 establecido en el instructivo para verificación
de los métodos de ensayo (123 – LAA – INT – 17).

Para las curvas de calibración se determinó un rango de concentraciones que fueron de

9 𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝐻𝑀𝐹 90 𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝐻𝑀𝐹
aproximadamente a debido a que las normativas
𝐾𝑔 𝑚𝑖𝑒𝑙 𝑑𝑒 𝑎𝑏𝑒𝑗𝑎𝑠 𝐾𝑔 𝑚𝑖𝑒𝑙 𝑑𝑒 𝑎𝑏𝑒𝑗𝑎𝑠
actuales como lo son la Resolución 1057 del 23 de marzo de 2010 (Palacio Betancourt,
2010) y la NTC 1273 (Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación.(
ICONTEC), 2007) determinan que las mieles deben tener una concentración máxima de
60 𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝐻𝑀𝐹
.
𝐾𝑔 𝑚𝑖𝑒𝑙 𝑑𝑒 𝑎𝑏𝑒𝑗𝑎𝑠

8.2. SELECTIVIDAD/ESPECIFICIDAD

Los resultados expresados en .la tabla 61. del presente trabajo, señalan que el método
presenta una selectividad/ especificidad expresada cuantitativamente en porcentaje de
recuperación de 108,92%; lo cual indica que se encuentra en el rango establecido en el
instructivo para verificación de los métodos de ensayo (123 – LAA – INT – 17) del
Laboratorio de Análisis de Aguas y Alimentos de la Universidad Tecnológica de Pereira
es de 80% < %R < 120% (TABLA 61.).

8.3. LÍMITE DE DETECCIÓN Y LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN

Para establecer los valores del límite de detección (LD) y el límite de cuantificación (LC)
se aplicó la metodología descrita en la TABLA 9; obteniéndose que el LD = 9,8582 mg/Kg
y el LC = 13,8893 mg/Kg con un coeficiente de variación de 8,32% que está dentro de los
límites aceptados por el criterio del laboratorio, el cual establece que el coeficiente de
variación debe ser menor o igual al 10% (TABLA 61.). Pero en cuanto al porcentaje de
error este método no presenta buena exactitud para los estándares de baja concentración
ya que el error fue de 20,67% y el porcentaje de error de aceptación en el laboratorio es
menor o igual al 5%.

Además el límite de detección es cuatro veces menor a lo establecido por las normas, las
cuales hacen referencia a que el límite máximo permitido de HMF en miel de abejas es de
60 mg/Kg, por lo que indica que sirve para verificar que la concentración de HMF es
reglamentaria o no lo es para cada tipo de miel a analizar en el Laboratorio de Aguas y
Alimentos de la Universidad Tecnológica de Pereira.

111
8.4. REPETIBILIDAD Y REPRODUCIBILIDAD

8.4.1. REPETIBILIDAD

Como se explica en la tabla 7., la repetibilidad fue llevada a cabo por el analista A durante
5 días y el análisis se realizó a tres soluciones las cuales representaban respectivamente
concentración baja (aproximadamente 5 mg/Kg), media ( aproximadamente 41 mg/Kg) y
alta (aproximadamente 70 mg/Kg). A continuación se tabulan los promedios de
porcentajes de coeficiente de variación y porcentajes de error de los resultados obtenidos
en cada una de las soluciones como producto de los 5 días de la determinación por el
analista A (ver tablas 18, 22, 26, 30 y 34).

Tabla 62. Resultados promedio obtenidos por el analista A durante los 5 días; %CV y %E para tres
soluciones.

SOLUCIONES % CV %E
MADRE 1 4,982 % 4,272 %
MADRE 2 1,156 % 3,294 %
MADRE 3 1,0822 % 4,123 %

En la TABLA 62. Se observa unos porcentajes de coeficiente de variación (≤10 %) bajos,

lo que indica buena precisión y que existe un grado de concordancia entre las
concentraciones y las mediciones de absorbancia del HMF; bajo las mismas condiciones
de medición. El porcentaje de error está dentro de los criterios de aceptación (≤ 5%) lo
que demuestra que el método es exacto dentro de las condiciones de repetibilidad.

8.4.2. REPRODUCIBILIDAD

Como se explica en la tabla 7, la reproducibilidad se ejecutó durante un lapso de 5 días,

para tres soluciones las cuales representaban respectivamente concentración baja
(aproximadamente 5 ppm), media ( aproximadamente 41 ppm) y alta (aproximadamente
70 ppm) y por dos analistas A y B; modificando las condiciones de medición de las
concentraciones de HMF y obteniéndose los siguientes resultados de los promedios de
porcentajes de coeficiente de variación y porcentajes de error de cada una de las
soluciones organizados en la TABLA 62. Y TABLA 63.

112
 Tabla 63. Resultados promedio obtenidos por el analista B durante los 5 días; %CV y %E para tres
soluciones.

SOLUCIONES % CV %E

MADRE 1 5,6708 % 4,750 %

MADRE 2 1,5802 % 4,958 %

MADRE 3 1,2241 % 4,536 %

Tanto en la TABLA 62. Como en la TABLA 63. Todos los porcentajes de coeficiente de
variación están por debajo del límite de aceptación que es ≤ 10 %, y todos los porcentajes
de error se encuentra bajo el límite de porcentaje de error que es ≤ 5 %, según los
requerimientos estipulados en el instructivo para verificación de los métodos de ensayo
del Laboratorio de Análisis de Aguas y Alimentos de la Universidad Tecnológica de
Pereira, lo que señala que el método 980.23 de la AOAC es exacto y preciso en cuanto a
su reproducibilidad.

8.5. ROBUSTEZ

8.5.1. Aumento del contenido de HMF por elevación de temperatura en una muestra
de miel de abejas.

Al someter la miel a las siete diferentes temperaturas se observó que hubo

aumento en la concentración de HMF a medida que aumentaban estas; pero para
saber si realmente este factor influía en el desempeño del método se realizó un
análisis de varianza mediante la herramienta ANOVA en la cual se obtuvo la
TABLA 38., con un valor de alfa 0,05 y proponiéndose las siguientes hipótesis.
Ho (Hipótesis nula) = la concentración de HMF no varía de acuerdo al aumento
de la temperatura.
Ha (Hipótesis alterna) = la concentración de HMF varía de acuerdo al aumento
de la temperatura.
En la cual se concluía que si p (probabilidad) es menor que alfa se rechaza la
hipótesis nula pero si p es mayor que alfa se acepta la hipótesis nula.

Teniendo como resultado que el valor p es igual a 1,23 𝑥 10−06 se concluye que la
hipótesis nula es rechazada ya que el valor p es menor a alfa (0,05) o sea que la
temperatura influye en la concentración de HMF a medir.

113
Lo anterior indica que las muestras de miel se deben almacenar en un recipiente
y ambiente adecuado en el laboratorio mientras se analiza la concentración de
HMF; donde la temperatura no se eleve, ya que podría alterar la concentración de
esta en la miel de abejas y dar un resultado erróneo para este análisis.

8.5.2. Aumento del contenido de HMF por aumento en la humedad en una

muestra de miel de abejas.

Para medir este factor se adicionó agua a tres muestras de miel y se observó que
la concentración de HMF encontrada disminuyó con respecto a la concentración
medida a la miel sin variaciones inicial como se muestra en la TABLA 40. Pero
para saber si realmente este factor influía en el desempeño del método se realizó
un análisis de varianza mediante la herramienta ANOVA en la cual se obtuvo la
TABLA 40., con un valor de alfa 0,05 y proponiéndose las siguientes hipótesis.
Ho (Hipótesis nula) = la concentración de HMF no varía de acuerdo al aumento
de la humedad.
Ha (Hipótesis alterna) = la concentración de HMF varía de acuerdo al aumento
de la humedad.
En la cual se concluía que si p (probabilidad) es menor que alfa se rechaza la
hipótesis nula pero si p es mayor que alfa se acepta la hipótesis nula.
Teniendo como resultado que el valor p es igual a 0,00017416 se concluye que la
hipótesis nula es rechazada o sea que se acepta la hipótesis alterna en la que se
propone que la concentración de HMF varía de acuerdo al aumento de la
humedad como se observa en las determinaciones tiende a disminuir como lo
indica los datos registrados en la TABLA 39.
Por lo tanto las muestras de miel de abejas deben mantenerse a unas condiciones
de almacenamiento óptimas para no alterar su composición.
8.5.3. Acidez

En el procedimiento realizado para medir la variable acidez que inducía el

aumento de HMF, no se obtuvo resultados relevantes para afirmar esta hipótesis;
ya que después de aumentar la acidez con un ácido débil como lo es el ácido
acético, se aplicó la metodología 980.23 de la AOAC para la determinación de
HMF y no se produjo lectura de absorbancia por parte del espectrofotómetro,
como se expone en las tablas 41 y 42; por lo que el ácido adicionado se pudo
haber convertido en un interferente para la determinación por este método en
estudio.

114
La acidez es un factor importante en la formación de HMF pero sólo en conjunto
con la elevación de la temperatura, actuando así la acidez como un catalizador en
el aumento de HMF. Además, quizás la proporción entre los mismos tipos de
ácidos propios de la composición de la miel, dan las características de la acidez
requerida para que el HMF aumente.

Muchos autores reportan que la acidez libre se incrementa con el tiempo, y como
resultado de procesos de fermentación, ya que los azúcares de la miel y los
compuestos alcohólicos se transforman en ácidos por la presencia de levaduras
(Bath & Singh, 2000).

Algunos estudios como: “Formación y reducción de 5-hidroximetilfurfural al elevar

la temperatura en un sistema de modelo en función de aminoácidos y azúcares
de composición”; muestra que la formación de HMF se incrementa por la
reducción del pH, o sea por un aumento de acidez, altas temperaturas y en
presencia de azucares y aminoácidos en el sistema, en particular la presencia de
glutamina, ácido glutámico y ácido aspártico (Kavousi, Mirhosseini, Ghazali, &
Ariffin, 2015).

8.6. ANÁLISIS BROMATOLÓGICOS

A continuación se discuten los resultados obtenidos para los parámetros de la

Resolución 1057, aplicados a una muestra de miel de abeja con elevada
concentración de Hidroximetilfurfural.

8.6.1. CONTENIDO APARENTE DE SACAROSA

El resultado de contenido aparente de sacarosa para una muestra de miel de

abejas fue 1,46% revisando el límite de permisibilidad para este factor, muestra
que debe ser menor o igual a 5 % (Palacio Betancourt, 2010), lo que indica que
esta cumple con este parámetro.

8.6.2. CONTENIDO DE CENIZAS

El contenido de cenizas encontrado en la muestra de miel de abejas fue 0,0715 %

y según el límite aceptable es menor o igual a 0,6% (Palacio Betancourt, 2010)
por lo que cumple con este parámetro, el cuál mide el contenido total de minerales
presentes en el alimento.

8.6.3. ACIDÉZ LIBRE

En esta propiedad se registró un valor de 44,067 meq / Kg de acuerdo con los

límites de la normatividad, el límite aceptable es menor o igual a 50 meq /Kg
(Palacio Betancourt, 2010) por lo que la miel se encuentra dentro de este rango.

115
8.6.4. HUMEDAD

Para esta característica se encontró un valor de 19% y lo estipulado en la norma

es ≤ 20 % (Palacio Betancourt, 2010) por consiguiente se encuentra en este
rango.

8.6.5. SÓLIDOS INSOLUBLES EN AGUA

El contenido de sólidos insolubles en agua fue 0,1318 % pero la normativa exige

que debe ser menor o igual a 0,1 % (Palacio Betancourt, 2010) por lo que se
encontró que éste parámetro está un poco elevado.
8.6.6. CONDUCTIVIDAD

La conductividad registró un dato de 0,365 ms/cm, y la norma indica que debe ser
menor o igual a 0,8 ms/cm (Palacio Betancourt, 2010) por lo que la muestra de
miel en estudio está dentro del rango establecido.
8.6.7. PH

El pH de la muestra fue 3,95 pero la norma no registra límite alguno. La miel

contiene ácidos orgánicos que se encuentran parcialmente disociados en el agua, lo
cual ocasiona un aumento de los iones H+ y un consecuente descenso del pH (Owenn
R. Fennema, 1996).
8.6.8. SÓLIDOS SOLUBLES

La muestra de miel de abejas presenta 77,9 % de sólidos solubles. Pero las normas
no especifican límite para este parámetro, que evalúa la concentración de azúcar,
sales, ácidos y demás compuestos solubles en agua presentes en la miel.
8.6.9. HIDROXIMETILFURFURAL

La muestra de miel de abejas estudiada en los análisis fisicoquímicos reportó una

concentración de HMF de 105,91 mg/Kg para poder realizar la fundamentación del
análisis de una muestra real; lo que señala que esta miel no es fresca ya que el límite
establecido para HMF es menor o igual a 40 mg/Kg.
8.6.10. AZÚCARES REDUCTORES

La concentración de azucares reductores para esta muestra de miel de abejas fue

39,5976 %, y el límite de aceptación para este requisito es mayor o igual a 45 %
(Palacio Betancourt, 2010), por lo que se deduce que los azucares reductores (la
glucosa y la fructosa) están dando un indicador de que la miel está teniendo un
proceso de fermentación, o sea se está degradando, y va directamente relacionado
con la elevada concentración de HMF que presenta la miel de abejas.

116
8.6.11. METALES PESADOS
En productos apícolas como la miel, la proporción de sodio, potasio, calcio, magnesio,
hierro, cobre y zinc, son los elementos mayoritarios y son considerados parámetros
complementarios en la denominación de origen (Lachman, J., 2007). El contenido
mineral en la miel puede dar una indicación de su origen geográfico (Rodriguez-
Otero, J., 1992), actualmente no se incluyen valores del contenido de minerales en la
normatividad. La miel tiene un contenido promedio de minerales entre 0.1-0.2% en
mieles florales y 1% o más en mielatos; el elemento dominante es el potasio, seguido
por cloro, sodio, fósforo, magnesio, silicio, hierro y cobre (La Serna, I., 1999).
Tabla 64. Registro de concentración de minerales encontrados en la muestra de miel de abejas
analizada.

Promedio de
Mineral Concentraciones
ppm
Potasio 0,0412
Calcio 0,0075
Sodio 0,0058
Hierro 0
Zinc 0
Magnesio 0,0045
Manganeso 0
Cobre 0

117
 9. CONCLUSIONES

Se validó el método de la AOAC 980.23 para la determinación de

Hidroximetilfurfural en miel de abejas por espectrofotometría ultravioleta, a través
de la lectura del estándar de HMF (99%), patrones y muestras de miel; y con esto
se demostró que el método sirve para determinar Hidroximetilfurfural en miel de
abejas; ya que cumplió con todos los límites de aceptación de los parámetros
requeridos en el Laboratorio de Análisis de Aguas y Alimentos de la Universidad
Tecnológica de Pereira.

La validación del método de la AOAC 980.23 es muy importante para el

Laboratorio de Análisis de Aguas y Alimentos de la Universidad Tecnológica de
Pereira ya que se pretende que implantando este servicio dentro del portafolio del
laboratorio, se pueda suplir la necesidad de los apicultores de la región cafetera,
brindándoles ventajas importantes, tales como una reducción en los costos y
tiempo para el análisis previo a la comercialización de la miel exigido por los entes
reguladores.

Se elaboró el informe de validación del método de la AOAC 980.23 según los

instructivos del Laboratorio de Aguas y Alimentos de la Universidad Tecnológica
de Pereira. (ANEXO 2.).

Se desarrolló el plan de validación de la determinación de HMF en miel de

abejas de acuerdo al método 980.23 de la AOAC siguiendo como guía el
instructivo establecido en el Laboratorio de Análisis de Aguas y Alimentos.
(ANEXO 3.).

118
 10. RECOMENDACIONES

1. Se debe tener en cuenta que el lugar de almacenamiento de la miel debe

ser fresco y seco, puesto que someterla a un aumento de temperatura y/o
humedad, genera una alteración considerable en la concentración de HMF
en la miel de abejas.
2. Con este trabajo se abren temáticas para otros trabajos de grado, tales
como:
2.1. Determinación de diastasa por un método estandarizado.
2.2. Determinar a través de cual ruta de cálculo, resulta más confiable
aplicar, para la obtención de los valores de las concentraciones
de HMF en miel de abejas; si la ecuación de la curva de
calibración o la ecuación del método 980.23 de la AOAC.
2.3. Estudio para conocer la incidencia de las variables: temperatura,
humedad y acidez en la formación de hidroximetilfurfural en miel
de abejas.
2.4. Experimentar si la metodología utilizada para la determinación de
HMF en miel de abeja, puede ser aplicada de igual manera en la
determinación de HMF en otros alimentos ricos en carbohidratos
de los cuales se tenga sospecha que contenga esta sustancia.
3. Se propone revisar otras metodologías para medir la importancia de la
variable acidez en la formación de HMF.

119
 11. BIBLIOGRAFÍA

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123
 Normativa Conductividad Nivel de
Humedad Contenido de azucares Cenizas eléctrica Acidez
HMF
Contenido de fructosa y glucosa (suma de ambas)
En general: no menos de 60 g/100g
Mieles de mielada: no menos de 45 g/100g En
En general:
general:
En general: no máximo 40
Contenido de sacarosa máximo
más del 20% mg HMF/kg Máximo 50
En general: no más de 5 g/100g 0.8 mS/cm
Miel de brezo miel miliequivalent
Codex Alfalfa (Medicado sativa), Citrus spp., Falsa acacia No hace Miel de
"Calluna" y miel Mieles es de ácido
alimentarius (Robinia pseudoacacia), Madreselva francesa referencia mielada y
para uso tropicales: por 1000g de
(Hedysarum), MenziesBanksia miel de
industrial: no máximo 80 miel
(Banksiamenziesii),“Red castaño:
más del 23% mg HMF/kg
Gum”(Eucalyptuscamaldulensis), “Leatherwood” mínimo 0.8
miel
(Eucryphia lucida), Eucryphiamilligani: no más de mS/cm
10 g/100g Espliego (Lavandulaspp.), borraja
(Boragoofficinalis): no más de 15 g/100g
Contenido de fructosa y glucosa (suma de ambas)
En general:
En general: no Miel de flores: no menos de 60 g/100 g
máximo 50
más del 20% Miel de mielada, mezclas de miel de mielada con En
En general: miliequivalent
Miel de brezo miel de flores: no menos de 45 g/100 g general:
máximo 40 es de ácido
"Calluna" y miel máximo
Directiva mg HMF/kg por 1000g de
para uso Contenido de sacarosa 0.8 mS/cm
2001/110/CE miel miel
industrial: no En general: no más de 5 g/100 g No hace Miel de
Comunidad Mieles Miel para uso
más del 23% Falsa acacia (Robinia pseudoacacia), alfalfa referencia mielada y
Europea tropicales: industrial:
Miel de brezo (Medicago sativa), Banksia de Menzies miel de
máximo 80 máximo 80
"Callunavulgaris" (Banksiamenziesii), Sulla (Hedysarum), Eucalipto castaño:
mg HMF/kg miliequivalent
para uso rojo (Eucalyptuscamaldulensis), Eucryphia lucida, mínimo 0.8
miel es de ácido
industrial: no Eucryphiamilliganii, Citrus spp.: no más de 10 g/100 mS/cm
por 1000g de
más del 25% g Espliego (Lavandulaspp.), borraja
miel
(Boragoofficinalis): no más de 15 g/100 g

124
 Contenido aparente de azúcar reductor:
mínimo 60% miel floral, Máximo 50
Norma
mínimo 45% miel de mielada Máximo 40 miliequivalent
Técnica Máximo No hace
Máximo 20% mg HMF/kg es de ácido
Colombiana 0.6% referencia
Contenido aparente de sacarosa: miel por 1000g de
1273
máximo 5% miel

En general:
Contenido aparente de azúcar reductor: máximo 40
Resolución En general: mínimo 60% miel floral, mg HMF/kg Máximo 50
1057 de 2010 máximo 20% mínimo 45% miel de mielato miel miliequivalent
Máximo Máximo
Ministerio Mieles de Mieles es de ácido
0.6% 0.8 mS/cm
de Protección origen tropical: Contenido aparente de sacarosa: tropicales: por 1000g de
Social máximo 21% En general: máximo 5% máximo 60 miel
Mieles tropicales: máximo 10% mg HMF/kg
miel

ANEXO 1. Comparativo de los parámetros fisicoquímicos de la miel de abejas por las normatividades expuestas en
el presente documento.

125
126