UNIVERSIDAD NACIONAL HERMILIO VALDIZÁN
Código: BQA-002
C.P. INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL
BIOQUÍMICA AGROINDUSTRIAL
Mg. Sc. Ruth Esther Chamorro Gómez/Ing. Janet Beraun Bedoya
PRÁCTICA N°2
Página: 2
EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS Y EVALUACIÓN DE LAS
PROTEINAS EXTRAIDAS
I. INTRODUCCION
El método de extracción se fundamenta en la relación estructura-solubilidad de las proteínas. Por ejemplo, se
sabe que la zeína que es soluble en un alcohol fuerte o en disoluciones alcalinas diluidas, pero es insoluble en
agua o en soluciones neutras inorgánicas. Las glutelinas por ejemplo son insolubles en agua, en soluciones
salinas y en alcohol, y bastante soluble en sosa y potasa. Es importante notar que la mayor parte de nitrógeno
proveniente de proteínas es soluble en alcohol y en disoluciones alcalinas. Las globulinas, albúminas y prolinas
son solubles en disoluciones alcalinas diluidas.
Las espumas son sistemas coloidales en el cual pequeñas burbujas de aire son dispersas en una fase acuosa.
Muchos alimentos procesados tales como crema batida, helado, pastel, merengues y malvaviscos son productos
obtenidos aplicando la propiedad funcional de formación de espuma. En esos productos las proteínas son los
agentes principalmente estabilizadores de la fase gaseosa dispersa. Generalmente, las espumas se forman por
burbujeo, agitación o batido de la solución de proteína. Las propiedades de espumado consideran 2 aspectos.
a) la habilidad de producir un área en la interfase tal que una gran cantidad de gas puede incorporarse en el
líquido (comúnmente referido como espumado o capacidad de espumado) y b) la habilidad de formar una
película determinada que pueda contrarrestar las fuerzas internas y externas.
La capacidad de las proteínas para actuar como surfactantes y emulsificantes depende de su habilidad para
adsorberse en una interfase agua-aceite. Las emulsiones son dispersiones de dos líquidos inmiscibles, uno de
los cuales se encuentra bajo la forma de pequeñas gotitas dispersas en el otro líquido que constituye la fase
continua dispersante. Las proteínas se adsorben en la interfase entre las gotitas de aceite disperso y la fase
acuosa continua, y aportan propiedades físicas y reológicas (viscosidad, elasticidad, rigidez, etc) que
determinan la resistencia de las gotitas a la coalescencia. Así mismo, según el pH, se puede producir la
ionización de las cadenas laterales de los aminoácidos y esto aporta fuerzas de repulsión electrostática que
favorece la estabilidad de la emulsión.
La capacidad de retención del agua puede definirse como la cantidad de agua que se mantiene unida a la
proteína hidratada aun después de la aplicación de una fuerza externa como presión o más comúnmente
centrifugación. En este método se mide tanto el agua ligada (agua de hidratación, no congelable) como el agua
capilar, retenida físicamente entre las moléculas proteicas. La concentración proteica, el pH, la temperatura, el
tiempo, la fuerza iónica y la presencia de otros componentes afectan a las fuerzas que toman parte en las
interacciones proteínaproteína y proteí[Link] fijación de agua por las proteínas desciende generalmente a
medida que se eleva la temperatura, debido a la disminución de los puentes de hidrógeno. El calentamiento
provoca la desnaturalización y la agregación, pudiendo esta última reducir el área superficial y el número de
grupos amino polares disponibles para fijar agua. Por otro lado, cuando se calientan proteínas con una
estructura muy compacta, la disociación y el desplegamiento ocasionados pueden exponer enlaces peptídicos
y cadenas laterales polares previamente ocultas, lo que aumenta la fijación. El tipo y la concentración de iones
ejercen un considerable efecto sobre la absorción de agua. Generalmente, se establece una competencia en la
interacción entre el agua, la sal y las cadenas laterales de los aminoácidos.
Cuando las proteínas desnaturalizadas se agregan para formar una red proteica ordenada, al proceso se le
denomina gelificación. La gelificación es una propiedad funcional muy importante de algunas proteínas, se
utiliza, no sólo para formar geles sólidos viscoelásticos, sino también para mejorar la absorción de agua, los
efectos espesantes, la fijación de partículas (adhesión) y para estabilizar emulsiones y [Link] capacidad
de una proteína a gelificar depende de factores intrínsecos relacionados con las propiedades químicas, de las
condiciones que afectan la velocidad de desnaturalización y de las interacciones subsecuentes de las cadenas
desdobladas. Las proteínas grandes que tienen PM arriba de 60kDa y contienen mas de 30 de residuos
hidrofóbicos tienden a formas geles irreversibles tipo coagulo debido a que pueden interaccionar fácilmente
con sus fragmentos hidrofóbicos; por ejemplo hemoglobina y albúmina de huevo. Las proteínas que gelifican
contienen grupos hidrofóbicos por ejemplo proteínas de la soya y gelatina. El mecanismo de gelificación se da
en 2 etapas. En la primera ocurre una disociación de la estructura cuaternaria y despliegamiento de la molécula
de proteína (va depender de la estabilidad térmica, la desnaturalización generalmente ocurre a temperaturas
cercanas a 40°C). En la segunda etapa, usualmente a mayores temperaturas, las moléculas desnaturalizadas se
reacomodan y forman una red tridimensional debido a interacciones de los grupos reactivos de las cadenas.
II. OBJETIVOS
Extraer las proteínas de algunos alimentos y evaluar su rendimiento.
Determinar las propiedades funcionales de las proteínas extraídas, capacidad de gelificación, emulsificación,
de espumado y de retención de agua.
III. MATERIALES Y MÉTODOS Centrifugar a 10,000 rpm por 20 min, separar el
sobrenadante y lavar el residuo siguiendo el mismo
Muestras: leguminosas, cereales, tubérculos, etc. procedimiento. Unir los sobrenadantes y dializar
contra agua, finalmente las proteínas son
Materiales liofilizadas. El residuo se utiliza para la extracción
Probetas de 100 mL
de prolaminas.
Vaso precipitado de 250, 500, 1000 mL
Tubos Falcon de 15 y 50 mL Prolaminas
Licuadora
Tubos de ensayo con tapas Agregar 100 mL de la solución alcohólica (etanol
al 70%-acetato de sodio 0.5%) al residuo anterior
y agitar por 1 h. en refrigeración. Centrifugar a
Reactivos 10,000 rpm por 20 min. Colectar el sobrenadante
Solución de HCL 1N y, lavar 2 veces más el residuo siguiendo el mismo
Solución de NaOH 1N procedimiento. Unir los sobrenadantes y dializar
Solución de NaCl 1M contra agua por 24 hrs. cambiando por lo menos
tres veces el agua, finalmente las proteínas se
liofilizan. El residuo de utiliza para la extracción
Equipos de glutelinas.
Balanza analítica
Potenciómetro Glutelinas
Centrifuga
Agitador magnético con temperatura Agregar 100 mL de solución de etanol al 70%-
Termómetro acetato de sodio 0.5%-mercaptoetanol 0.1M al
Viscosímetro residuo anterior y agitar por 30 min. Separar el
sobrenadante y lavar el residuo 2 veces más con la
solución de etanol-acetato de sodio-
Metodología mercaptoetanol. Se juntan los sobrenadantes y
dializar contra agua.
Extracción de proteínas
Capacidad de formación de espuma
Albúminas
- Preparar unas soluciones proteínas en un
Pesar 100 g de harina desengrasada en un vaso de volumen de 100 mL de 0.5, 1.0 y 1.5% con agua
precipitados de 500 mL, agitar con 250 mL de agua
destilada, ajustando el pH a 4, 6 y 8.
desionizada por 1 h en refrigeración. Centrifugar a
10,000 rpm por 20 min. Recolectar el sobrenadante - Una vez realizada la dispersión licuar por 2
y lavar con 200 mL de agua el residuo siguiendo el minutos a una velocidad media.
mismo procedimiento. Unir los sobrenadantes y
dializar contra agua por 24 hrs. cambiando por lo - El batido o agitado será transferido a una probeta
menos tres veces el agua, finalmente las proteínas graduada y calcular el porcentaje de volumen
se liofilizan. El residuo se utiliza para la extracción incrementado a los 30 segundos, según la siguiente
de globulinas. fórmula:
Globulinas CFE = Vol. Espuma – Vol líquido inicial X 100
Vol líquido inicial
Agregar al residuo 250 mL de solución salina
(NaCl 0.5M) y agitar por 1 h en refrigeración.
Capacidad de estabilidad de la espuma 25ºC) por aproximadamente 15 minutos, luego
centrifugar a 4 000 rpm por 10 min. Medir la
- Después de medir el volumen total del batido, cantidad de agua separada.
medir el volumen de espuma en la probeta a un
tiempo de 1, 5, 10, 15 y 20 min, determinándose en - Reportar la EE según la siguiente fórmula:
función del pH (4, 6 y 8) y de la concentración
proteica (0.5, 1.0 y 1.5%). EE = mL H2O formulación – mL H2O separada X 100
mL H2O formulación
- Calcular los resultados según la siguiente
fórmula: Capacidad de retención de agua
EES = Vol. Espuma a un tiempo dado X 100 - Preparar una solución proteica al 1% (p/v) en
Vol. total espuma. agua destilada (500 ml). Agitar la solución por
unos minutos hasta la disolución total del aislado
Capacidad emulsificante proteico.
- Preparar soluciones proteicas a las - Añadir 40 ml de la solución anteriormente
concentraciones de 0.2, 0.4 y 0.6% con una preparada en vasos precipitados y ajustar a pH 2,
solución de NaCl 1M (50 ml de cada solución a 4, 6 y 8 utilizando las soluciones de HCl o NaOH
preparar). 1N. Incubar cada solución a temperatura ambiente
(~ 25ºC) por 15 minutos.
- Ajustar el pH de cada solución a 4, 6 y 8 con una
solución de HCl o NaOH 1N. - Transferir las soluciones a tubos de centrífuga de
50 ml (previamente tarados) y centrifugars a 4 000
- Incubar cada solución a temperatura ambiente (~ o 5 000 rpm por 10 minutos.
25ºC) por 15 minutos. Agitar las dispersiones a
velocidad media-alta por 30 seg en una licuadora. - Pesar el precipitado y retirar el sobrenadante. La
CRA será calculada como la diferencia entre el
- Posteriormente añaadir a la mezcla a una peso hidratado y el peso original en un gramo de
velocidad de 1 ml/segundo el aceite de maíz hasta proteína, según la siguiente fórmula:
quebrar la emulsión.
CRA = Peso hidratado – peso original X 100
- Realizar el mismo procedimiento en una solución
Peso proteína
sin proteína (blanco).
- Reportar la CE según la siguiente fórmula: Donde:
CRA: g de agua/g de proteína
CE = mL aceite añadido – mL aceite añadido blanco X 100
100 mL de solución
Capacidad de gelificación
Donde:
CE: son los mL de aceite/100mL de solución - Preparar unas soluciones proteínas en un
volumen de 100 mL de 6, 8 y 12% con agua
destilada.
Estabilidad de la emulsión
- Para realizar esta determinación, sellar en ambos
- Preparar soluciones proteicas a las extremos con tapones de goma tubos de vidrio de
concentraciones de 0.2, 0.4 y 0.6% con una 5 cm de largo y 8 mm de diámetro. Introducir un
solución de NaCl 1M (50 ml de cada solución a volumen de suspensión de 0.5 mL
preparar). aproximadamente.
- Ajustar el pH de cada solución a 4, 6 y 8 con una - Observar el color viscosidad y textura.
solución de HCl o NaOH 1N.
- Añadir 20 ml de aceite de maíz a la mezcla IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES
proteica en una licuadora y proceder a V. CONCLUSIONES
emulsificarla a velocidad media-alta por 1-2 min. VI. RECOMENDACIONES
- Verter las soluciones a dos tubos de centrífuga de
50 mL c/u e incubar a temperatura ambiente (~
VII. BIBLIOGRAFIA
Ahmedna, M., Prinyawiwatkul, W. & Rao R.M. (1999) Solubilized wheat protein isolate:functional
properties and potential food applications. Journal of Agricultural and FoodChemistry, 47:1340-1345.,
Pearson. D; (1993) Técnicas de laboratorio para el análisis de alimentos; Acribia, S.A Zaragoza
(España).
Nielsen S. (Ed); (2003) Food Analysis Laboratory Manual; Kluwer Academic/Plenum Publishers, New
York, USA.
