Los microorganismos están ampliamente distribuidos en la naturaleza, por lo que siempre se encuentran presentes en
diversos productos, especialmente en aquellos que favorecen de algún modo su sobrevivencia o desarrollo. Los alimentos
por su producción primaria, generalmente tienen una importante microbiota “normal”, según la región y condiciones en
que se producen; además, su composición tiende a conservar dicha flora y, por supuesto, le proporciona nutrientes de
manera que, si las condiciones lo permiten, los microorganismos pueden multiplicarse en los alimentos. Como
consecuencia de este desarrollo microbiano, los alimentos pueden deteriorarse y perder sus atributos. Además de la
microbiota normal, los alimentos son susceptibles de contaminación durante su manejo, ya sea por operadores, equipo,
fauna nociva, o por contaminación cruzada; algunos de los microorganismos contaminantes pueden ser patógenos y en
tal caso, su desarrollo e incluso su mera sobrevivencia, pueden ocasionar desde el incumplimiento de normas de higiene
y seguridad, hasta la aparición de enfermedades transmitidas por alimentos (ETA’s). Posteriormente a la toma de muestra
y como parte del análisis, se hace una dilución primaria cuya finalidad es lograr obtener una muestra representativa del
alimento, esto es, tanto en el aspecto cualitativo (diferentes tipos de bacterias) como en el cuantitativo, y así lograr una
distribución lo más uniforme posible, de los microorganismos contenidos en la muestra destinada al análisis. Con este fin,
se utiliza un diluyente que favorezca la recuperación de los microorganismos presentes, para ponerlos de manifiesto
cuando se cultiven; para lograrlo, el diluyente debe tener la osmolaridad y los pH favorables para iniciar la recuperación y
actividad de las células microbianas presentes, así como para favorecer aquellas que se buscan entre una población mixta.
Se pretende encontrar el número de microorganismos por unidad de volumen, hasta asegurar que después de la
incubación se obtenga un resultado cuantificable, esto se logra después de realizar tantas diluciones decimales seriadas
como sea necesario, en el mismo diluyente. Este resultado puede ser la cuenta de colonias en placas o la observación de
resultados proporcionales al tamaño de la población, en el caso de tubos o matraces. NOTAS
• Esta técnica es la primera etapa en el análisis de la mayoría de las prácticas en las que se determina cuantitativamente
algún microorganismo o grupo microbiano; por lo tanto, continúa con la determinación específica.
• Cuando se trabaja con alimentos líquidos, fácilmente homogenizables, que pueden distribuirse con pipetas de 1 mL, y
con bajo contenido microbiano, puede omitirse la preparación de diluciones, pero este caso es una excepción, no la regla.
• Los diluyentes más utilizados son la solución amortiguadora de fosfatos, el agua peptonada y la solución salina isotónica,
pero pueden utilizarse otros diluyentes que cumplan con las funciones de dispersar y homogenizar la carga microbiana y
de facilitar la recuperación de los microorganismos en estudio, mediante condiciones de osmolaridad, pH, etc., adecuadas
para ellos; por ejemplo, para la determinación de Vibrio cholerae, que es alcalófilo, se utiliza agua peptonada a pH 8.5.
• El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se inoculan
las diluciones en los medios de cultivo, no debe exceder de 20 minutos.
Secretaría de Salud. NOM-110-SSA1-1994. Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis
Microbiológico. Norma Oficial Mexicana. México.
Food and Drug Administration (2003) “Bacteriological Analytical Manual”. 9th ed. Arlington, VA: AOAC.
Camacho, A., M.Giles, A.Ortegón, M.Palao, B.Serrano y O.Velázquez. 2009. Técnicas para el Análisis Microbiológico de
Alimentos. 2ª ed. Facultad de Química, UNAM. México.
Cuenta en placa de bacterias
Cuando se requiere investigar el contenido de microorganismos viables en un alimento, la técnica comúnmente utilizada
es la cuenta en placa. Esta técnica no pretende detectar a todos los microorganismos presentes, pero el medio de cultivo,
las condiciones de temperatura y la presencia de oxígeno, permiten seleccionar grupos de bacterias cuya presencia es
importante en diferentes alimentos; por ejemplo, las bacterias mesofílicas aerobias, o mesófilos aerobios son un indicador
general de la población que pueden estar presente en una muestra y, por lo tanto, de la higiene con que ha sido manejado
el producto.
La técnica se basa en contar las “unidades formadoras de colonias” o UFC presentes en un gramo o mililitro de muestra.
Se considera que cada colonia que desarrolla en el medio de cultivo de elección después de un cierto tiempo de incubación
a la temperatura adecuada, proviene de un microorganismo o de un agregado de ellos, de la muestra bajo estudio; ese
microorganismo o microorganismos son capaces de formar la colonia, es decir una UFC. Para que las colonias puedan
contarse de manera confiable, se hacen las diluciones decimales necesarias de la muestra, antes de ponerla en el medio
de cultivo; la técnica para realizar este procedimiento se describe en “Preparación y dilución de muestras de alimentos
para su análisis microbiológico”.
Secretaría de Salud. NOM-110-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su
Análisis Microbiológico. Norma Oficial Mexicana. México.
CUESTIONARIO
Tipos de conteo bacteriano[editar]
Conteo en caja de petri[editar]
Método más usado para contar bacterias. Se prepara un caldo de cultivo, el cual posteriormente se vierte en las
placas de petri. Dependiendo del tipo de sembrado, puede que la muestra se encuentre incorporada en el agar
(Pour method) o puede que la muestra se disperse sobre el agar gelificado (Spread method). Es de suponerse que
cada célula o grupo de células presentes en la muestra se reproducirá en sus múltiples alrededores para producir
"colonias de células" separadas en el agar. Cada colonia es llamada unidad formadora de colonias (UFC).. Este
método es deseable porque arroja el total de células viables (sólo células vivas); en contraste con el conteo
microscópico y el conteo de peso seco. Una desventaja radica en el tiempo que requiere para producir las colonias,
ya que se necesitan como mínimo 24 horas o más
Conteo por filtración[editar]
Es realizado cuando la cantidad de bacterias es muy pequeña, como en casos de lagos y arroyos relativamente
puros. En esta técnica se necesitan al menos 100 mL de agua que atraviesen una membrana delgada de un filtro,
con poros tan pequeños que no permitan el paso de bacterias, de esta forma éstas son retenidas en la superficie
del filtro.
Posteriormente el filtro es transferido a una caja de petri que cuenta con un caldo nutritivo, en la cual las colonias
surgen de las bacterias en la superficie del filtro. Las colonias bacterianas formadas por este método son distintivas
cuando ocupan un medio diferencial.
Este método es aplicado frecuentemente en la detección y enumeración de bacterias coliformes, las cuales son
indicadores de contaminación fecal en la comida o en el agua.
Método del número más probable (NMP)[editar]
Es una técnica de estimación estadística basada en el hecho que a mayor número de bacterias en una muestra,
mayor será la dilución necesitada para reducir la densidad hasta el punto en que ninguna bacteria se le permita
crecer en la serie de tubos de dilución. Muestras microbianas son añadidas a tubos con caldos de lactosa y la
presencia o ausencia de gas formado en la fermentación y da un estimado de número de células. Este método es
más útil cuando las bacterias que están siendo contados no crecerán en medios sólidos, como en el caso de las
bacterias nitrificantes quimioautótrofas. También es útil cuando el crecimiento de la bacteria es en un medio líquido
diferencial, usado para identificar microbios, como en bacterias coliformes. El NMP es la única afirmación en la cual
existe 95% de probabilidad que la población bacteriana sea de rango correcto, siendo el número estadístico más
probable.
Determinación directa por microscopio[editar]
Las células se pueden contar en un frote teñido, como es el caso del Método de Breed, colocando en la
preparación un volumen conocido de la suspensión de células sobre un área conocida del portaobjetos. Después
de haber fijado y teñido el frote, es posible contar con un microscopio las bacterias.
Como no es práctico recorrer toda el área, se cuenta el número de células en unos cuantos campos microscópicos
seleccionados al azar. Si el diámetro del campo microscópico se mide con micrómetro objetivo, se puede calcular
fácilmente el área, entonces el número de campos en 1 cm2 se multiplicará por el promedio del número de células
por campo y después por 100 (si se vierte 0.01 mL) el resultado será igual al número de células por mililitro. Este
método es susceptible a muchas críticas debido a su falta de uniformidad al momento de hacer el frote.
Método de turbidez[editar]
Para algunos experimentos, es necesario estimar turbidez, ya que es una forma práctica de monitorizar el
crecimiento bacteriano. Como una bacteria se multiplica en un medio líquido, éste se torna turbio o de aspecto
nublado por las células. El instrumento usado para medir la turbiedad es un espectrofotómetro (colorímetro). En el
espectrofotómetro, un haz de luz es transmitido a través de la suspensión bacteriana a un detector sensible a la luz.
Mientras incremente el número de bacterias, menor será la luz captada por el detector. Este cambio en la luz se
registrará en la escala del instrumento como el porcentaje de transmisión. También se registra una expresión
logarítmica llamada absorbancia (algunas veces nombrada densidad óptica), un valor derivado del porcentaje de
transmisión que puede ser reportado. Más de un millón de células por mililitro deben estar presentes para que la
primera señal de turbidez sea visible. Aproximadamente de 10 millones a 100 millones de células por mililitro son
necesitadas para hacer una suspensión suficientemente turbia para leer en el espectrofotómetro. La turbidez no es
útil para medir contaminación en líquidos por la pequeña cantidad relativa de bacterias.
Determinación del peso seco en las células[editar]
Es el método más directo para las mediciones cuantitativas de la masa celular y probablemente el más fácilmente
realizable y reproducible, aunque se debe aplicar sólo en suspensiones celulares muy densas y las células deben
ser lavadas muy bien para removerles todo material extra. Se utiliza para bacterias filamentosas y mohos. En este
proceso, el fungus es removido del medio de crecimiento, filtrado para remover material extraño, drenado en un
secador y después es pesado.
2. Psicrófilas: criófilas crecen a temperaturas bajas, alrededor de 0ºC, pero el desarrollo óptimo es entre 10 y 15ºC, existen
especies que tienen desarrollo hasta - 15ºC. Su temperatura máxima es de 18-20ºC.
6 Para obtener resultados estadísticamente significativos es necesario contar placas quecontengan entre 30 y 300
colonias. Para que ello sea posible, en el momento de la siembradebe tenerse una idea aproximada del número de
bacterias presentes en la muestra a fin derealizar las diluciones adecuadas.Cuando se desconoce totalmente la
muestra problema es conveniente realizar la máximacantidad de diluciones posibles
7. En general se parte de una solución concentrada y se preparan series de diluciones al décimo (1:10) o al medio
(1:2). De esta manera se obtiene una serie de soluciones relacionadas por ejemplo por un factor de dilución 10 es
decir 1/10; 1/100; 1/1000 y así sucesivamente. O la otra serie es 1/2; 1/4; 1/8; 1/16; 1/32 etc. Por ejemplo: si partimos
de una solución de 50mg/ml de una sustancia (Solución A)
a. Dilución 1/10: 1ml de la solución A + 9 ml de agua= una solución de 5 mg/ml (dilución 1:10)
b. Dilución 1/2: 5 ml de la solución A + 5 ml de agua= una solución de 25 mg /ml (dilución 1:2)
8. Ponen de manifiesto deficiencias en la calidad HIGIENE ALIMENTARIA 2 •2. Indicadores Ponen de manifiesto
deficiencias en la calidad microbiológica de un determinado alimento en términos más generales. Por ejemplo,
presencia de bacterias del grupo coliformes en la leche pasteurizada, en número que exceda a un valor de referencia
experimentalmente establecido, puede advertir diversas deficiencias de este producto: •a) un tratamiento térmico
insuficiente, •b) una contaminación posterior al tratamiento, •c) un almacenamiento del producto final a una
temperatura demasiado elevada.(Microorganismos marcadores, Universidad de Murcia, 2002)
9. PRINCIPIO El Plate Count Agar fue desarrollado por Buchbinder,Baris y Goldstein en 1953.Esta formulación está
especificada en Standard Methods para el examen del agua y las aguas residuales. En el PCA ( Plate Count Agar), la Triptona
y el Extracto de Levadura suministran las fuentes de nitrógeno y de vitaminas, que requieren para el crecimiento una basta
variedad de microorganismos, la glucosa actúa como fuente de energía. Se prepara según la fórmula de la USP y
recomendaciones de la APHA (American Public Health Association) La transparencia del medio y el buen tamaño de las
colonias al crecer facilitan los recuentos bacterianos.
COMPOSICION POR LITRO DE MEDIO EN AGUA PURIFICADA pH : 7,0+/- 0,2
Hidrolizado pancreático de caseína (Triptona) 5.0 g / Extracto de levadura 2.5 g / Glucosa 1.0 g / Agar 15.0
INFORMES 2
El control de los parámetros físico-químicos y microbiológicos es muy importante tanto en los sistemas de potabilización
como de depuración del agua. Sin embargo, en los lugares donde el agua es consumida por el hombre o es reutilizada, el
factor de riesgo más importante está asociado con la exposición a agentes biológicos que incluyen bacterias patógenas,
helmintos, protozoos y virus entéricos (Asano y Levine, 1998). Desde el punto de vista de la salud pública, los virus
entéricos son el grupo de organismos patógenos más críticos, debido a que la dosis mínima infecciosa es muy baja, son
muy resistentes a los sistemas de desinfección y el control a nivel de laboratorio es costoso (Ayres y Wescot, 1987; Wescot
y Ayres, 1990)
ASANO, T. AND LEVINE, D. (1998). “Wastewater reclamation, recycling and reuse: an introduction. In wastewater
reclamation and reuse”. Takashi Asano (editor),. Technomic Publishing. Lancaster. 1528 pags. AYRES, R. Y WESCOT, D.
(1987). “La calidad del agua en la agricultura. Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación”.
Estudio FAO Riego y Drenaje, Nº 29. Roma. p 8-101
La calidad microbiológica de los alimentos es fundamental porque influye en su conservación y vida de anaquel y, sobre
todo, porque los microorganismos presentes en ellos, pueden ser causantes de enfermedades transmitidas por alimentos
ó ETA’s (en inglés se denominan “foodborne illness” ó FBI). La detección en el laboratorio de los microorganismos
patógenos puede ser muy complicada, muy lenta y/o muy costosa para determinaciones rutinarias. Además, es
concluyente cuando se encuentra un microorganismo patógeno pero puede haber casos en que no se detecte por razones
circunstanciales como el clima o la cantidad de individuos infectados que están contaminando, a pesar de que el manejo
del alimento implique el riesgo de que el patógeno aparezca en cualquier momento. En todo caso, la investigación de
microorganismos patógenos en alimentos no facilita un enfoque preventivo. Por esas razones, las normas en materia de
alimentos, generalmente establecen la calidad microbiológica en términos de microorganismos indicadores. Éstos son
organismos (o grupos) que advierten oportunamente de un manejo inadecuado o contaminación que incrementan el
riesgo de presencia de microorganismos patógenos en alimentos. Además de que su detección en el laboratorio es más
sencilla, rápida y/o económica, los microorganismos indicadores permiten un enfoque de prevención de riesgos, puesto
que advierten manejo inadecuado y/o contaminación.
Los principales microorganismos indicadores en alimentos son:
− Indicadores de condiciones de manejo o de eficiencia de proceso: mesófilos aerobios (o cuenta total) cuenta de hongos
y levaduras cuenta de coliformes totales
− Indicadores de contaminación fecal: coliformes fecales, E. coli enterococos. Cl. perfringens La selección de indicadores
en un alimento depende fundamentalmente de los riesgos implicados y de lo que se requiera saber para liberar, controlar
o mejorar el alimento, manteniendo el enfoque preventivo.
Cuenta de coliformes totales Las bacterias del grupo coliforme se definen como: bacilos cortos, Gramnegativos,
anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa a 35 °C, en menos de 48 h, con producción de ácido y
gas. Incluye los géneros: Escherichia, Enterobacter, Klebsiella y Citrobacter. Durante mucho tiempo se consideraron
evidencia de contaminación fecal, pero se ha demostrado que muchos de ellos pueden vivir e incluso crecer en el suelo,
el agua y otros ambientes. Actualmente se consideran un excelente indicador de la eficiencia de los procesos de
sanitización y desinfección, así como de calidad sanitaria en agua, vegetales y diversos productos procesados. 17 Su
determinación se basa generalmente en la capacidad de fermentar lactosa. Se pueden utilizar los métodos del número
más probable (NMP ó MPN por sus siglas en inglés) que es un método estadístico en tres etapas y permite el hallazgo de
cantidades muy bajas de coliformes. También se pueden detectar por cuenta en placa utilizando agar bilis-rojo violeta
(ABRV ó RVBA por sus siglas en inglés) en el cual las colonias fermentadoras de lactosa causan el vire del indicador; pueden
detectarse por filtración en membrana (Millipore) e incubación en medios adecuados, por métodos rápidos como Petrifilm
y reacciones cromogénicas o fluorogénicas. Coliformes fecales Dentro del grupo coliforme, los de origen fecal son capaces
de fermentar la lactosa también a 44.5 °C; se consideran el indicador más adecuado de contaminación con heces de
animales y humanos, por ejemplo en pescados y mariscos, carnes, leche, alimentos RTE, entre otros. La determinación se
hace a partir de la segunda etapa (confirmativa) del método de NMP, cultivando en caldo lactosado con incubación a 44.5
°C. Generalmente se combinan las determinaciones, según se requiere. E. coli Se considera indicador de contaminación
fecal reciente, humana o animal en productos como agua embotellada, leche y jugos, alimentos infantiles, y alimentos
procesados, en general. Se caracteriza por ser coliforme termotolerante (fermenta lactosa a 44.5°C) que produce indol a
partir de triptofano y produce β-glucuronidasa, características que se usan para su identificación en laboratorio,
generalmente en la etapa final del NMP o de alguno de los otros métodos, incluyendo Petrifilm. Enterococos Los
estreptococos de origen fecal o enterococos también son un indicador de contaminación fecal, debido a su abundancia
en el tracto digestivo de animales y humanos; aunque se encuentran en cantidades menores por un orden de magnitud,
en comparación con E. coli, tienen algunas ventajas como su mayor supervivencia. Se consideran indicadores en alimentos
procesados, como lácteos y cárnicos, en los cuales E. coli puede no sobrevivir. Se determinan mediante métodos sencillos
generalmente con tecnologías de sustratos específicos. Cl. perfringens Esta bacteria Grampositiva, esporulada, anerobia,
reudtora de sulfitos también se encuentra ampliamente distribuida en la naturaleza y es habitante usual del tracto
intestinal de muchos animales. Las esporas de Cl. perfringens son muy resistentes a los desifectantes, siempre están
presentes en aguas negras pero 18 no se multiplican en el sedimento por lo que se le considera un buen indicador cuando
se sospecha de contaminación con protozoarios o virus, que generalmente no tienen relación con el hallazgo de coliformes
o enterococos. Son buenos indicadores en trabajos de seguimiento o para relacionarlos con contaminación fecal en
peritajes; también se considera un indicador útil en aguas tropicales, donde la supervivencia de otros como E. coli y
Enterococcus puede disminuir. La determinación de Clostridium pefringens como indicador, se hace por cuenta en placas
vertidas de agar triptona-sulfito-cicloserina (TSC) con yema de huevo, incubadas en anaerobiosis (Gas-Pack o similar).
CSTNAI
