ESPECTROMETRÍA DE MASAS - FUENTES

La fundamentación conceptual se deberá consultar de los libros:

a. Organic Chemistry - Jonathan Clayden & Al.
i. Ya solicite el documento a la biblioteca
b. Structure Determination of Organic Compounds (3rd) - Pretsch
c. Spectrometric identification of Organic Compounds - Silverstein
i. [Link]
Silverstein%20-
%20Spectrometric%20Identification%20of%20Organic%20Compounds%207t
h%[Link]
ii. Ya solicite el documento a la biblioteca

[Link]
metria_de_masas.pdf
[Link]
[Link]
[Link]
[Link] 941
[Link]
[Link]
ESPECTROMETRÍA DE MASAS - INVESTIGACIÓN
1. Generalidades
a. Definición
➔ La Espectrometría de Masas es una poderosa té cnica microanalítica usada para
identificar compuestos desconocidos, para cuantificar compuestos conocidos, y para
elucidar la estructura y propiedades químicas de molé culas. La detecció n de
compuestos puede ser llevada a cabo con cantidades realmente pequeñ as (algunos
pmoles) de muestra y obtener informació n característica como el peso y algunas veces
la estructura del analito.
En otras palabras, lo que ocurre en la espectrometría de masas es que un compuesto
se ioniza, por alguno de los diversos métodos de ionización, los iones se separan en
relación masa/carga (método de separación de iones), y el número de iones que
representan cada “unidad” de masa/carga se registra como un espectro.
➔ Ionización: Procedimiento a través del cual se generan iones, estos se definen como un
átomo o una molécula que dispone de carga eléctrica a partir de ganar o de perder una
cierta cantidad de electrones.
➔ La espectrometría de masas está basada en la obtención de iones a partir de moléculas
orgánicas en fase gaseosa; una vez obtenidos estos iones, se separan de acuerdo con su
masa y su carga, y finalmente se detectan por medio de un dispositivo adecuado
(espectrómetro de masas). Un espectro de masas será, en consecuencia, una
información bidimensional que representa un parámetro relacionado con la
abundancia de los diferentes tipos de iones en función de la relación masa/carga de
cada uno de ellos.

b. Generalidades del proceso

i. Qué es un espectrómetro de masas: En su forma más simple, el espectrómetro de masas
realiza tres funciones esenciales. Primero, las moléculas son bombardeadas por una
corriente de electrones de alta energía, convirtiendo algunas de las moléculas en iones
positivos. Debido a su alta energía, algunos de estos iones se fragmentan o se rompen
en iones más pequeños. Todos estos iones se aceleran en un campo eléctrico. En
segundo lugar, los iones acelerados se separan según su relación masa-carga en un
campo magnético o eléctrico. Finalmente, los iones con una relación de masa a carga
particular son detectados por un dispositivo que puede contar la cantidad de iones que
lo golpean.
Un espectrómetro de masas tiene tres componentes básicos: algo para volatilizar e
ionizar la molécula en un haz de partículas cargadas; algo para enfocar el haz de modo
que las partículas de la misma relación masa: carga se separen de todas las demás; y
algo para detectar las partículas. Todos los espectrómetros de uso común operan en
un alto vacío y usualmente usan iones positivos.

c. Interpretación de resultados
El ion más abundante formado en la cámara de ionización da lugar al pico más alto en
el espectro de masas, llamado pico base. Las abundancias relativas de todos los otros
picos en el espectro se informan como porcentajes de la abundancia del pico base.
El haz de electrones en la cámara de ionización convierte algunas de las moléculas de
muestra en iones positivos. La eliminación de un solo electrón de una molécula
produce un ion cuyo peso es el peso molecular real de la molécula original. Este ion es
el ion molecular, frecuentemente simbolizado como M +. El valor de m/z en el que el
ion molecular aparece en el espectro de masas, suponiendo que el ion tiene solo un
electrón eliminado, da el peso molecular de la molécula original.

Si puede identificar el pico de iones moleculares en el espectro de masas, puede usar

el espectro para determinar el peso molecular de una sustancia desconocida. Si la
presencia de isótopos pesados se ignora por el momento, el pico de iones moleculares
corresponde a la partícula más pesada observada en el espectro de masas.

Las moléculas no ocurren en la naturaleza como especies isotópicamente puras.

Prácticamente todos los átomos tienen isótopos más pesados que se producen en
variadas abundancias naturales. El hidrógeno se produce principalmente como 1H,
pero un pequeño porcentaje de átomos de hidrógeno se produce como el isótopo 2H.
Además, el carbono normalmente se presenta como 12C, pero un pequeño porcentaje
de átomos de carbono es el isótopo más pesado, 13C. Con la excepción del flúor, la
mayoría de los otros elementos tienen un cierto porcentaje de isótopos más pesados
que ocurren naturalmente. Los picos causados por los iones que llevan estos isótopos
más pesados también se encuentran en el espectro de masas. Las abundancias relativas
de estos picos isotópicos son proporcionales a las abundancias de los isótopos en la
naturaleza. Muy a menudo, los isótopos ocurren en una o dos unidades de masa por
encima de la masa del átomo "normal".

El haz de electrones en la cámara de ionización puede producir el ion molecular. Este

haz también tiene suficiente energía para romper algunos de los enlaces en la molécula,
produciendo una serie de fragmentos moleculares. Los fragmentos que se cargan
positivamente también se aceleran en la cámara de ionización, se envían a través del
analizador, se detectan y se registran en el espectro de masas. Estos picos de iones
fragmentarios aparecen en valores m / e correspondientes a sus masas individuales.
Muy a menudo, un ión fragmento en lugar del ión molecular será el ión más abundante
producido en el espectro de masas (el pico base). Un segundo medio para producir
fragmentos de iones ocurre con el ion molecular, que, una vez que se forma, es tan
inestable que se desintegra antes de que pueda pasar a la región de aceleración de la
cámara de ionización.

Al pico más fuerte, con 43 unidades de masa en este caso, se le asigna una "abundancia"
del 100% y se llama pico base. La abundancia de los otros picos se muestra en relación
con el pico base. En este espectro, solo hay otro pico fuerte (58 al 50%) y el pico de la
masa más alta a 114 (al 5%) es el ion molecular.
2. Tipos de ionización (Libro 3)
a. En fase gaseosa: son los métodos más antiguos y populares; son aplicables a compuestos
que tienen una presión de vapor mínima de 1 × 10−6Torr a una temperatura a la que el
compuesto es estable.
i. Ionización por impacto de electrones (EI): es el método más utilizado para generar
iones para la espectrometría de masas. Las moléculas de muestra en fase vapor son
bombardeadas con electrones de alta energía (generalmente 70 eV), que expulsa un Commented [1]: Electronvoltio
electrón de la molécula de muestra para producir un catión radical, conocido como un
ión molecular. Debido a que el potencial de ionización de los compuestos orgánicos
típicos es generalmente inferior a 15 eV, los electrones bombardeados imparten 50 eV,
o más, de exceso de energía al ión molecular recién creado, que se disipa en parte por
la ruptura de enlaces covalentes, que contienen fuerzas de enlace entre 3 y 10 eV. La
ruptura de enlaces suele ser muy extensa, altamente reproducible y característica del
compuesto estudiado. Además, este proceso de fragmentación también es predecible
y es la fuente del poderosos potencial de elucidación de la estructura de la
espectrometría de masas. A menudo, el exceso de energía impartido al ion molecular
es demasiado grande, lo que conduce a un espectro de masas sin ion molecular
discernible. La reducción del voltaje de ionización es una estrategia comúnmente
utilizada para obtener un ion molecular: la estrategia a menudo es exitosa porque hay
una fragmentación muy reducida. La desventaja de esta estrategia es que el espectro
cambia y no se puede comparar con los espectros de literatura estándar.

La singularidad del espectro de masas de EI para un compuesto orgánico, incluso para

los estereoisómeros, es casi una certeza. Esta singularidad, junto con la gran
sensibilidad del método, es lo que hace que la espectrometría de masas sea una
herramienta analítica tan poderosa y popular.

El analito es introducido dentro de la fuente de ionizació n que esta al vacío (<10-6

mbar) y sebsecuentemente ionizado por colisiones con un flujo de electrones (a 70 eV).
 Los electrones para este proceso son generados por emisió n té rmica de un filamento
caliente. El filamento esta típicamente hecho de tungsteno o de renio. Los electrones
son subsecuentemente acelerados al aplicar un potencial entre el filamento y la
muestra. El rayo de electrones cruza la fuente de iones, afectando las molé culas neutras
que provienen de la muestra.

Esquemáticamente, una molécula desconocida primero forma el catión radical M + •

que luego se rompe (fragmentos) para dar un radical X • y un catión Y +. Solo los
campos magnéticos y electrostáticos pueden acelerar y enfocar las partículas cargadas
(cationes en la mayoría de las máquinas), por lo que el detector registra solo el ion
molecular M + • y los fragmentos cargados positivamente Y +. Los radicales sin carga X
• no se registran.

ii. Ionización química: La ionización por impacto de electrones a menudo conduce a una
fragmentación tan extensa que no se observa ion molecular. Una forma de evitar este
problema es utilizar técnicas de “ionización suave”, de las cuales la ionización química
es la más importante. La ionizació n química es el primer mé todo de ionizació n suave
introducido a la espectrometría de masas. La ionizació n es afectada por reacciones
sobre la molé cula con iones de un reactivo gaseoso generados por medio de ionizació n
de impacto electró nico con molé culas del analito neutras. El gas reactivo, generalmente
metano, isobutano o amoníaco, se introduce en la fuente y se ioniza. Las moléculas de
muestra colisionan con las moléculas de gas reactivo ionizado (𝐶𝐶5 + , 𝐶4 𝐶9 + ,etc.)
en la fuente de la ionización química a presión relativamente alta y se someten a
ionización secundaria por ion protón obteniendo un ion [𝐶 + 1] + , por adición
electrofílica obteniendo iones [𝐶 + 15] + , [𝐶 + 24] + , [𝐶 + 43] + 𝐶 [𝐶 +
18] (con 𝐶𝐶4
+ +
), o por intercambio de carga (poco usual) produciendo un ion
[𝐶] + . El exceso de energía transferido a las moléculas de la muestra durante la fase
de ionización es pequeño, generalmente menos de 5 eV, por lo que produce mucha
menos fragmentación. Existen varias consecuencias relevantes, por ejemplo, esta
técnica brinda menos información acerca de la estructura del analito.

El contenido energético de los iones secundarios de metano, isobutano y amoníaco

disminuye de la siguiente manera: 𝐶𝐶5 + > 𝐶 − 𝐶4 𝐶9 + > 𝐶𝐶4 + .
La ionización química en espectrometría de masas no es útil para igualar picos (ya sea
de forma manual o en computador), y tampoco es particularmente útil para determinar
 la estructura de una sustancia; su mayor uso radica en la detención de iones
moleculares y por tanto sus pesos moleculares.

b. Por desorción: son aquellas técnicas en las que las moléculas de muestra se emiten
directamente de una fase condensada a la fase de vapor como iones, el uso principal es
para compuestos grandes, no volátiles o iónicos. Para compuestos desconocidos, los
métodos se usan principalmente para proporcionar peso molecular y, en algunos casos,
para obtener una masa exacta.
i. Por desorción de campo: En el método de desorción de campo (FD), la muestra se
aplica a un emisor de metal en cuya superficie se encuentran microagujas de carbono.
Las microagujas activan la superficie, que se mantiene en el voltaje de aceleración y
funciona como el ánodo. Los gradientes de voltaje muy alto en las puntas de las agujas
eliminan un electrón de la muestra, y el catión resultante se repele lejos del emisor.
Los iones generados tienen poco exceso de energía, por lo que existe una
fragmentación mínima, es decir, el ión molecular suele ser el único ión significativo
visto colesten-5-eno-[Link]-tetrol que el El y el Cl no tienen. Sin embargo, para
este esteroide, el espectro de masa FD muestra predominantemente el ion molecular
prácticamente sin fragmentación. La desorción de campo fue eclipsada por el
advenimiento de FAB. A pesar de que el método a menudo es más útil que el FAB para
compuestos no polares y no sufre el alto nivel de iones de fondo que se encuentran en
los métodos de desorción asistida por matriz, no se ha vuelto tan popular como el FAB
probablemente porque los fabricantes comerciales han apoyado firmemente.

ii. Por bombardeo de átomos rápidos: El bombardeo de átomos rápidos (FAB) utiliza
átomos de xenón o argón de alta energía (6-10 keV) para bombardear muestras
disueltas en un líquido de baja presión de vapor (por ejemplo, glicerol). La matriz
protege la muestra del daño excesivo por radiación, FAB se usa principalmente con
moléculas no volátiles grandes, particularmente para determinar el peso [Link]
límite de masa superior para la ionización de FAB está entre 10 y 20 kDa, es realmente
más útil hasta aproximadamente 6 kDa. FAB se ve con mayor frecuencia con
instrumentos de sector magnético de doble enfoque donde tiene una resolución de
aproximadamente 0.3 m / z en todo el rango de masa; Sin embargo, FAB puede usarse
con la mayoría de los tipos de analizadores de masas, el mayor inconveniente de usar
FAB es que el espectro siempre muestra un alto nivel de iones generados por la matriz,
lo que limita la sensibilidad y puede oscurecer los iones de fragmentos importantes.
Un método relacionado, la espectrometría de masas de ionización secundaria líquida
(LSIMS) es similar, excepto que utiliza iones de cesio algo más enérgicos (10-30 keV).
En ambos métodos, se forman iones positivos (por unión de cationes ((𝐶 +
1)+ 𝐶𝐶 (𝐶 + 23, 𝐶𝐶)+) e iones negativos (por desprotonación ((𝐶 − 1)+ ); ambos tipos
de iones generalmente están cargados individualmente y, dependiendo en el
instrumento, FAB puede usarse en modo de alta resolución.

iii. Por desorción de plasma: Es una técnica altamente especializada que se utiliza casi
exclusivamente con un analizador de masa de tiempo de vuelo, Los productos de fisión
de Californium 252 (C, con energías en el rango de 80-100 MeV, se utilizan para
bombardear e ionizar la muestra. Cada vez que un Cf se separa, dos partículas se
mueven en direcciones opuestas, Una de las partículas golpea un detector de activación
 y señala una hora de inicio. La otra partícula golpea la matriz de muestra y expulsa
algunos iones de muestra en un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo (TOF-MS).
Los iones de muestra se liberan con mayor frecuencia como restos protonados de
forma individual, doble o triple. baja energía, de modo que rara vez se observa una
fragmentación estructuralmente útil y, para los polisacáridos y los polipéptidos, la
información de secuenciación no está disponible. La precisión de la masa del método
está limitada por el tiempo de vuelo del espectrómetro de masas.
.

iv. Por desorción con láser: Debido a que este método de ionización es pulsado, debe
usarse con un tiempo de vuelo o con un espectrómetro de masas con transformada de
Fourier. Dos tipos de láseres han encontrado un uso generalizado: un láser CO2, que
emite radiación en la región del infrarrojo lejano, y un láser de neodimio / itrio-
aluminio-granate cuadruplicado en frecuencia, que emite radiación en la región UV a
266 nm. Sin asistencia matricial, el método se limita a moléculas de bajo peso
molecular de 2 kDa. El poder del método se mejora considerablemente mediante el uso
de asistencia matricial (ionización por desorción láser asistida por matriz, o MALDI).
Dos matrices de ácido nicotínico y ácido sinapínico, que tienen bandas de absorción
que coinciden con el láser empleado. han encontrado un uso generalizado y se han
analizado con éxito pesos moleculares de muestra de hasta doscientos o trescientos
mil Da. Se confunden algunos picomoles de muestra con el compuesto de matriz
seguido de irradiación pulsada, lo que hace que los iones de muestra (generalmente
monómeros con carga simple pero ocasionalmente se hayan observado iones y
dímeros con carga múltiple) sean expulsados de la matriz al espectrómetro de masas.
Los iones tienen poca energía en exceso y muestran poca propensión a fragmentarse.
Por esta razón, el método es bastante útil para mezclas. La precisión de la masa es baja
cuando se usa con un TOF-MS. pero se puede obtener una resolución muy alta con un
FT-MS Al igual que con otros métodos asistidos por matriz, MALDI sufre interferencia
de fondo del material de la matriz, que se agrava aún más por la aducción de la matriz.
Por lo tanto, la asignación de un ion molecular de un compuesto desconocido puede
ser incierta.

c. Por evaporación: Hay dos métodos importantes en los que los iones, o con menos
frecuencia, compuestos neutros en solución (usualmente contienen ácido fórmico) sus
moléculas de disolvente son eliminadas mediante evaporación, y simultáneamente con
ionización dejando únicamente los iones para el análisis de masas. Junto con la
instrumentación de cromatografía líquida, estos métodos se han vuelto inmensamente
populares.
i. Espectrometría de masas por termo-aspersión: En el método de termo-aspersión, se
introduce una solución de la muestra en el espectrómetro de masas mediante un tubo
capilar calentado. El tubo nebuliza y vaporiza parcialmente el disolvente formando una
corriente de finas gotas que entran en la fuente de iones. Cuando el disolvente se
evapora por completo, los iones de muestra pueden analizarse. Este método puede
manejar altas tasas de flujo y amortiguadores; fue una solución temprana para la
interfaz de espectrómetros de masas con cromatografía líquida acuosa. Este método
ha sido suplantado en gran parte por la electropulverización.
ii. Espectrometría de masas por electrospray: La fuente de iones de electrospray se
opera a presión atmosférica o cerca de ella, por lo tanto también se conoce como
ionización a presión atmosférica. La muestra en solución (usualmente un solvente
volátil polar) entra a la fuente de iones a través de un capilar de acero inoxidable que
está rodeado por un flujo coaxial de nitrógeno llamado gas nebulizador. La punta del
capilar se mantiene a un alto potencial con respecto a un contraelectrodo. La diferencia
del potencial produce un gradiente de campo de hasta 5 kV/cm. A medida que la
solución sale del capilar, el flujo de gas nebulizador dirige el efluente hacia el
espectrómetro de masas. Las gotas en el aerosol se contraen a medida que el disolvente
se evapora, concentrando así los iones de muestra cargados. Cuando la repulsión
electrostática entre los iones de muestra cargados alcanza un punto crítico, la gota
experimenta una llamada “explosión de Coulombic”, que libera los iones de la muestra
en fase vapor. Los iones en fase vapor son concentrados en varios orificios de
muestreo en el analizador de masas.

La determinación de la masa real del ion requiere que se conozca la carga del ion. Si se
pueden identificar dos picos, que difieren en una sola carga, el cálculo se reduce a
álgebra simple. Recuerde que cada ion de la molécula de muestra (M) tiene la forma
general (M + zH)z+ donde H es la masa de un protón (1.0079 Da). Para dos iones que
difieren en una carga, m1 = [M, + zH) / z] y m2 = [M, + zH) / z]. Al resolver las dos
ecuaciones simultáneas para la carga z, se obtiene 𝐶 = (𝐶1 − 𝐶) / (𝐶2 − 𝐶1 ). Un
programa de computadora de rendimientos z automatiza este cálculo para cada pico
en el espectro y calcula la masa directamente. Muchos fabricantes han introducido
espectrómetros de masas de bajo costo dedicados a la electroaspersión por dos
razones. Primero, el método ha sido muy exitoso sin dejar de ser un método bastante
simple de emplear. En segundo lugar, el análisis de proteínas y péptidos más pequeños
ha crecido en importancia, y probablemente se analizan mejor por el método de
electrospray.

Es ampliamente utilizado en aplicaciones de ciencias bioquímicas y biomé dicas debido

a su capacidad de analizar molé culas altamente polares tales como pé ptidos,
oligonucleó tidos y oligosacá ridos. Una característica de ESI es que debido a las
condiciones á cidas usadas para producir las gotas cargadas positivamente se tienden
a protonar todos los sitios bá sicos en las molé culas de analito. Una segunda
característica de ESI es la eficiencia del proceso de ionizació n y, como resultado, la
sensibilidad de los experimentos basados en esta forma de ionizació n, la eficiencia en
la protonació n de estos sitios bá sicos en ambientes á cidos parece contribuir a la
sensibilidad. Una tercera característica es su compatibilidad con los solventes de HPLC
de fase reversa (reverse-phase high-performance liquid chromatography), ya que las
mezclas agua/solvente tienen excelentes propiedades compatibles con ESI.

3. Espectros MS de alta y baja resolución:

[Link]
spectrometria_de_masas.pdf
 Alta resolución guía [Link]
Cientificotecnics/Area-de-espectrometria-de-masses/Espectrometria-de-masas-
de-alta-resolucion.cid108102

𝑅
𝑅 =
𝑅𝑅
● R=m/∆m, donde ∆m es la diferencia de masas entre los dos iones y m la masa nominal
del ion. Se considera que los dos picos están suficientemente separados cuando el valle
existente entre ambos sea el 10% de la altura de los picos.

4. Ejemplos prácticos

a. Determinación de la fórmula molecular de un compuesto

La espectrometría de masas se puede utilizar para determinar las fórmulas
moleculares de las moléculas que proporcionan iones moleculares razonablemente
abundantes. La fórmula molecular de una sustancia se puede determinar mediante el
uso de masas atómicas precisas. Se requieren espectrómetros de masas de alta
resolución para este método. Normalmente se piensa que los átomos tienen masas
atómicas integrales; por ejemplo, H = 1, C = 12 y O = 16. Sin embargo, si puede
determinar las masas atómicas con suficiente precisión, encontrará que las masas no
tienen valores que sean exactamente integrales. La masa de cada átomo en realidad
difiere de un número de masa completo por una pequeña fracción de una unidad de
masa.
Dependiendo de los átomos que están contenidos dentro de una molécula, es posible
que las partículas de la misma masa nominal tengan masas medidas ligeramente
diferentes cuando se pueden hacer determinaciones de masa precisas. Para ilustrar,
una molécula cuyo peso molecular es 60 podría ser C3H8O, C2H8N2, C2H4O2 o
CH4N2O. Las especies tienen las siguientes masas precisas:

La observación de un ion molecular con una masa de 60.058 establecería que la

molécula desconocida era C3H8O. Distinguir entre estas posibilidades está dentro de
la capacidad de un instrumento moderno de alta resolución.

b. Ejemplo del butano (pg. 949 [Link] )

kjn