UNIVERSIDAD PRIVADA NORBERT WIENER

ESCUELA ACADÉMICA DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

PRÁCTICA N º2

TEMA: “EXTRACCIÓN DE LA CASEÍNA Y

DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELÉCTRICO”

INTEGRANTES:
 Huashuayo Cusi, Medalyt Angela
 Oyola Gonzales, Christian
 Paredes Sánchez, Violeta
 Rafael Portuguez, Deyni
DOCENTE: Q.F. LEÓN MEJÍA, ENRIQUE
CICLO: VI
SECCIÓN: FB6M1
TURNO: MAÑANA
FECHA DE LA PRÁCTICA: 31/08/2019
FECHA DE ENTREGA: 07/09/2019

2019- II

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 Pág.

1- Introducción--------------------------------------------------------------------------------------------- 3
2- Marco teórico-----------------------------------------------------------------------------------4, 5, 6,7
3- Parte experimental---------------------------------------------------------------8, 9, 10, 11, 12,13
4- Resultados----------------------------------------------------------------------------------------------14
5- Conclusiones-------------------------------------------------------------------------------------------15
6- Cuestionario--------------------------------------------------------------------------------------------16
7- Referencias bibliográficas--------------------------------------------------------------------------17

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La leche es un líquido secretado por las glándulas mamarias de las hembras de los mamíferos, tras el
nacimiento de la cría, de composición compleja blanco y opaco, de sabor dulce y reacción iónica (pH)
próxima a la neutralidad. Contiene cuatro tipos de componentes importantes lípidos (triglicéridos),
Proteínas (caseína, albúminas y globulinas), glúcidos (lactosa) y sales minerales 1.

La leche contiene 30-36 g/l de proteína y alcanza cantidades nutritivas de muy alto valor biológico. Las
proteínas de la leche se clasifican bien como caseínas o bien como proteínas del suero.

La caseína es una proteína conjugada de la leche del tipo fosfoproteína que se separa de la leche por
acidificación y con formación de masa blanca. Las fosfoproteínas son grupos de proteínas unidas a una
sustancia con ácido fosfórico. Unidos a Serina y treonina por grupo hidroxilo.

En la leche representa cerca del 77 al 82 por ciento de las proteínas presentes en leche y 2.7 en
composición liquida. Formada por Alpha (s1), Alpha (s2)-caseína, beta-caseína y kappa-caseína formando
una micela o unidad soluble. Las caseínas precipitan a pH 4,6, que es su punto isoeléctrico 2 (a temperatura
ambiente).
De entre las especies más comunes, las mayores diferencias se encuentran en el contenido de caseína κ
que representa el 3% de las caseínas de leche de búfala, el 13% de las de la leche de vaca y el 26% de
las de la leche humana.

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 CASEÍNA

La leche contiene vitaminas (principalmente tiamina, riboflavina, ácido pantoténico y vitaminas A, D y

K), minerales (calcio, potasio, sodio, fósforo y metales en pequeñas cantidades), proteínas (incluyendo
todos los aminoácidos esenciales), carbohidratos (lactosa) y lípidos. Los únicos elementos importantes
de los que carece la leche son el hierro y la vitamina C.

Las proteínas se pueden clasificar de manera general en proteínas globulares y fibrosas. Las proteínas
globulares son aquellas que tienden a agregarse en formas esferoidales y no establecen interacciones
intermoleculares como son los puentes de hidrógeno (característicos de las proteínas fibrosas) siendo
solubilizadas en suspensiones coloidales.

En la leche hay tres clases de proteínas: caseína, lacto albúminas y lacto globulinas (todas globulares).

La caseína es una proteína conjugada de la leche del tipo fosfoproteína que se separa de la leche por
acidificación y forma una masa blanca. Las fosfoproteínas son un grupo de proteínas que están
químicamente unidas a una sustancia que contiene ácido fosfórico. En la caseína la mayoría de los
grupos fosfato están unidos por los grupos hidroxilo de los aminoácidos serina y treonina. La caseína
en la leche se encuentra en forma de sal cálcica (caseinato cálcico). La caseína representa cerca del
77% al 82% de las proteínas presentes en la leche y el 2,7% en composición de la leche líquida.
La caseína está formada por alpha (s1), alpha (s2)-caseína, ß-caseína, y kappa-caseína formando una
micela o unidad soluble. Ni la alfa ni la beta caseína son solubles en la leche, solas o combinadas. Si
se añade la kappa caseína a las dos anteriores o a cada una de ellas por separado se forma un complejo
de caseína que es solubilizado en forma de micela. Esta micela está estabilizada por la kappa caseína
mientras que el alfa y la beta son fosfoproteínas que precipitan en presencia de iones calcio.

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La kappa caseína, sin embargo, tiene pocos grupos fosfato y un alto contenido de carbohidratos unidos
a ella. También tiene todos sus residuos de serina y treonina con sus correspondientes grupos hidroxilo,
así como los carbohidratos dispuestos en una sola cara de su superficie por lo que esta parte exterior es
fácilmente soluble en agua gracias a los grupos polares que posee. La otra parte de su superficie se une
fácilmente al alfa y la beta caseínas insolubles, lo que da lugar a la formación de la micela.

La propiedad característica de la caseína es su baja solubilidad a pH 4,6. El pH de la leche es 6,6

aproximadamente, estando a ese pH la caseína cargada negativamente y solubilizada como sal cálcica.
Si se añade ácido a la leche, la carga negativa de la superficie de la micela se neutraliza (los grupos
fosfato se protonan) y la proteína neutra precipita.

Ca2+ Caseinato + 2HCl Caseína + CaCl2

La conformación de la caseína es similar a las proteínas desnaturalizadas globulares. El alto número de

residuos de prolina en la caseína causa un especial plegamiento en la cadena de proteína e inhibe la
formación de una fuerte y ordenada estructura secundaria. La caseína no contiene puentes di sulfuro. De
igual manera la falta de estructura secundaria es importante para la estabilidad de la caseína frente a la
desnaturalización por calor. La carencia de estructura terciaria facilita la situación al exterior de los
residuos hidrofóbicos lo que facilita la unión entre unidades proteicas y la convierte en prácticamente
insoluble en agua. En cambio, es fácilmente dispersarle en álcalis diluidas y en soluciones salinas tales
como oxalato sódico y acetato sódico.

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La función biológica de las micelas de caseína es transportar grandes cantidades de Ca y P altamente
insoluble en forma líquida a los lactantes y formar un coagulo en el estómago para favorecer una nutrición
eficiente. Además de caseína, Ca y P la micela formada también contiene citrato, iones, lipasa, enzimas
plasmáticos y suero. Estas micelas ocupan del 6-12% del volumen total de la leche.

Las proteínas que aparecerán en el sobrenadante cuando precipitemos la caseína en medio ácido son
proteínas globulares, hidrofilias y fácilmente solubles en agua, así como susceptibles de
desnaturalización por calor. Las principales son ß -lacto globulina, alpha- lactalbumina, bovine serum
albumin (BSA), e inmunoglobulinas (Ig).

La caseína se emplea en la industria para la fabricación de pinturas especiales y en el apresto de tejidos,

la clarificación de vinos, la elaboración de preparados farmacéuticos y la fabricación de plásticos. La
pintura de caseína ha sido usada desde la antigüedad por los egipcios.

PUNTO ISOELÉCTRICO
Todas las macromoléculas de la naturaleza adquieren una carga cuando se dispersan en agua. Una
característica de las proteínas y otros biopolímeros es que la carga total que adquieren depende del pH
del medio.

Así, todas las proteínas tienen una carga neta dependiendo del pH del medio en el que se encuentren y
de los aminoácidos que la componen, así como de las cargas de cualquier ligando que se encuentre
unido a la proteína de forma covalente (irreversible).

Debido a la composición en aminoácidos de la proteína, los radicales libres pueden existir en tres formas
dependiendo del pH del medio: catiónicos, neutros y aniónicos.
Cualquier proteína tendría una carga neta positiva si se encuentra en un medio lo suficientemente ácido
debido a que los grupos COOH de los aminoácidos aspártico y glutámico estarían en su forma neutra
pero los grupos amino de Arginina y lisina estarían protonados (-NH3+).

De igual forma si la proteína se encuentra en un medio con un pH muy alto estaría cargada negativamente
ya que en este caso los grupos carboxilo estarían desprotonados (COO -) y los grupos amino estarían en
su forma neutra (NH2).

De lo anterior se deduce que las proteínas tienen un pH característico al cual su carga neta es cero. A
este pH se le denomina punto isoeléctrico (pI).

En el punto isoeléctrico (pI), se encuentran en el equilibrio las cargas positivas y negativas por lo que la
proteína presenta su máxima posibilidad para ser precipitada al disminuir su solubilidad y facilitar su
agregación.

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Si suponemos una proteína formada únicamente por aminoácidos sin grupos laterales ionizables la
carga neta de la proteína dependería exclusivamente de la protonación / desprotonación de los grupos
amino y carboxilo terminal. En la realidad las proteínas están formadas por multitud de aminoácidos
unidos mediante enlaces peptídicos y la carga va a depender de los grupos ionizables que poseen los
aminoácidos que la componen y del pH del medio.

ENLACE PEPTÍDICO

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3.1 Materiales y Equipos a usar:

a) Tubos de ensayo 13 x 100mm.

b) Gradilla de metal
c) Pipetas de 5.0ml, 10ml
d) Matraz aforado de 50ml
e) Beacker de 100ml y 250 ml
f) Propipeta
g) Bagueta
h) Espectrofotómetro
i) Luna de reloj
j) Espátula cuchara de laboratorio
k) Balanza analítica
l) pHmetro digital
m) Goteros Pasteur

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3.2 Reactivos:
a) Agua destilada.

b) Acetato sódico 0.1 N

c) Ácido acético 0.01N

d) Ácido acético 0.1N

e) NaOH 1N

f) Soluciones buffer pH 4,0 y 7,0 para calibrar el potenciómetro

g) Caseína

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3.3 Procedimiento:

B. PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN DE CASEÍNA

Colocamos 250 mg de
caseína en una beacker
de 50 ml.

Agregamos 20 ml de H2O
destilada y 5 ml de hidróxido
de sodio (NaOH 1N).

Agitamos hasta lograr

una solución total de
la caseína.

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 Luego vertimos en
un matraz aforado
de 50 ml.

Adicionamos 5ml de
ácido acético 1N y
diluimos con agua
destilada hasta 50 ml y
mezcle bien.

OBSERVACIÓN: La
solución debe ser clara y
limpia.

C. DETERMINACION DEL pI DE LA CASEÍNA:

Se cogieron 10 tubos de 25
mL limpios y secos.

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Se adiciona los siguientes reactivos según indica:

pH
ACETATO ACÉTICO ACÉTICO
TUBO RESULTANTE
0.1N 0.1N 0.01N
(APROX.)
1 0.5ml 9.5ml - 3.2l
2 1ml 9ml - 3.6l
3 1.5ml 8.5ml - 3.8l
4 2ml 8ml - 4.0l
5 3ml 7ml - 4.2l
6 4ml 6ml - 4.5l
7 6ml 4ml - 4.7
8 8ml 2ml - 5.1
9 6ml - 4ml 5.5
10 8ml - 2ml 6.1

Se procede a medir el pH de cada

tubo con el pHmetro digital y debe
cubrir un rango aproximado
semejante al teórico (3 a 6.5).

Añadir 1ml de la disolución

de caseína a cada tubo

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Medir la absorbancia de
cada muestra a 640 nm.

OBSERVACION: Agitar bien cada

tubo para obtener una solución
homogénea antes de verter una
parte en la cubeta.

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  TABLA DE RESULTADOS:

TUBO N°: pH ABSORVANCIA

1 3 0.357 A

2 3 0.392 A

3 3 0.450 A

4 4 0.391A

5 4 0.520 A

6 4 0.482 A

7 4 0.066 A

8 5 0.056 A

9 5 0.021 A

10 6 0.024 A
Punto
isoeléctrico
EL P.I es: 6 ya que es el punto más alto.

6
5 5
4 4 4 4
pH

3 3 3

ABSORBANCIA

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 Hemos concluido que para realizar esta práctica como paso inicial es necesario cortar lo
suficientemente la leche con el uso de un ácido lo cual fue el ácido acético 1M en este
caso, ya que esto nos ayudará a determinar la presencia de grumos blancos un
precipitado que es un indicativo para poder seguir trabajando y obtener resultados
correctos.

 La presencia de precipitado en la solución de caseína, al añadir ácido acético 1 Molar,

es la evidencia en la práctica, de haber encontrado el punto isoeléctrico. El precipitado
formado, se puede volver a disolver adicionando poco a poco, NaOH 1N.

 Debido a las propiedades de precipitación que presenta la caseína, es posible realizar

una medición de su punto isoeléctrico a partir de una desestabilización por
acidificación ya que hemos obtenidos del ph y la absorbancia se presenta en el grafico
la relación de la absorbancia frente al pH y se determinó el punto isoeléctrico de la
caseína.
 La pI experimental, obtenido fue de 6 la cual su absorbancia fue 0.024 A Mediante
la comparación con la pI reportado en la literatura, se obtuvo un % de error de
1,52%.

 Se infiere que la práctica se realiza con un 98,49% de exactitud, este se debe a errores
comprendidos en el procedimiento de extracción de la caseína.

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1. ¿CUÁL ES EL PUNTO ISOELÉCTRICO DE LA CASEÍNA?

Según Brito en el artículo sobre “QUESO COTTAGE ELABORADO CON CULTIVO

LÁCTICO REDI-SET Y DVS, USANDO CREMA LACTEA HOMOGENEIZADA Y SIN
HOMOGENEIZAR” en el cual se afirma que la caseína posee un punto isoeléctrico de 4,6 a 4,7
ya que compara el proceso de coagulación acida del queso Cotttage sin grasa en el cual la
leche es coagulada al punto isoeléctrico de la caseína.

2. ¿POR QUÉ LAS PROTEÍNAS TIENEN SOLUBILIDAD MÍNIMA EN EL

PI?

En general el punto isoeléctrico de una proteína es también el pH en el cual es

menos soluble y más fácilmente precipita, esto se atribuye a que probable atracción entre
grupos de carga opuesta de moléculas vecinas, ya que el número de cargas opuestas será el
máximo en el punto isoeléctrico
Las proteínas al tienen un pH característico del que su carga neta es “0” el PI tiene en equilibrio
las cargas positivas y negativas por lo que la proteína presenta su máxima posibilidad para ser
precipitada al disminuir su solubilidad.

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1. López Camacho Y. Bioquímica. Sinaloa, México. Edit. Circuito interior
oriente. 1era Edición. 2011.

2. Devlin Thomás M. Bioquímica con Aplicaciones Clínicas. Tomo I y II.

Barcelona. Edit. Reverté Colombiana. S. 2000.

3. Miller D.D. 2001. Química de Alimentos, Manual de Laboratorio. Limusa

Wiley, México.

4. Gil Hernández, Á. (2010). Tratado de Nutrición: Composición y calidad

nutritiva de los alimentos. Madrid: Editorial Médica Panamericana, D.L.

5. Lacad Godina, A. (1985). Ciencia de la leche. Principios de técnica lechera.

Barcelona: Editorial Reverté, S.A.

6. Brito C Carmen, Pino F Marianella, Molina C Luz H, Molina V Irma, Horzella R Mariela,
Schöbitz T Renate. QUESO COTTAGE ELABORADO CON CULTIVO LÁCTICO REDI-SET Y
DVS, USANDO CREMA LACTEA HOMOGENEIZADA Y SIN HOMOGENEIZAR. Rev. chil.
nutr. [Internet]. 2006 Abr [citado 2019 Sep. 04]; 33(1 ): 74-85. Disponible en:
[Link]
75182006000100008&lng=es. [Link]

7. Depósito de documentos de la fao, depto de agricultura. Recuperado el 28 de

agoto de: [Link]

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