AUTOFAGOCITOSIS
O
AUTOFAGIA
Dra. María Isabel Colombo
Profesora Titular de Biología Celular y Molecular
FCM-U.N. CUYO
CRECIMIENTO CELULAR
SÍNTESIS DEGRADACIÓN
1
DEGRADACIÓN DE PROTEÍNAS
INTRACELULARES
• Impide la acumulación de proteínas mal
sintetizadas o mal plegadas
• Participa en el control metabólico de la célula,
eliminando proteínas no necesarias o que ya
cumplieron su función (ej. ciclinas)
• Es la principal fuente de aminoácidos cuando
aumentan las necesidades metabólicas o
disminuye el aporte de nutrientes.
DEGRADACIÓN INTRACELULAR
NO LISOSOMAL LISOSOMAL
• Es llevada a cabo por el • Es llevada a cabo en el
proteosoma lisosoma
• Degradación de proteínas • Degradación de proteínas
de vida media larga
de vida media corta
• Involucra procesos como
• Involucra el sistema de
la endocitosis, fagocitosis
ubiquitinación y autofagocitosis
2
AUTOFAGOCITOSIS
AUTOFAGOCITOSIS
• Permite la degradación de macromoléculas
citosólicas (ribosomas, RNA) y de comparti-
mientos membranosos: organelas envejecidas,
hipertrofiadas
• Participa en la remodelación celular durante la
diferenciación, metamorfosis, envejecimiento,
cáncer, enfermedades neurodegenerativas
(Alzheimer).
• Mantiene el suministro de aminoácidos en
ayunos prolongados mediante el secuestro
inespecífico de proteínas citosólicas.
3
MADURACIÓN DE LA VACUOLA AUTOFÁGICA
FAGOFORO
ENDOSOMAS LISOSOMAS
AUTOFAGOSOMA ANFISOMA AUTOFAGOLISOSOMA
Autofagosomas: microscopía electrónica
4
Autofagosomas: microscopía electrónica
REGULACIÓN DE LA AUTOFAGIA
• HORMONAS:
- Insulina: inhibe la autofagocitosis
- Glucagón: estimula la autofagocitosis
• AMINOÁCIDOS: la autofagia aumenta
cuando disminuye la concentración de AA
en el líquido extracelular. Leu, Tyr, Phe, Gln,
Pro, Met, His y Trp
5
REGULACION DE LA AUTOFAGIA
• La autofagia es estimulada por el ayuno
(falta de aminoácidos y suero) y es inhibida
en condiciones ricas en nutrientes.
• Una quinasa llamada Tor (Target of
rapamycin) es parte de la cascada de
traducción de señales involucrada en
sensar el ambiente nutricional.
+ aminoácidos - aminoácidos
TOR Wortmanina
3-metiladenina
Rapamicina
PI3K
Autofagia
6
MATURATION OF THE AUTOPHAGIC VACUOLE
FAGOFORO
Ayuno ↑
Rapamicina ↑↑
ENDOSOMAS LISOSOMAS
LC3
AUTOFAGOSOMA ANFISOMA AUTOLISOSOMA
LC3 localiza en autofagosomas
después de ser procesada
AUTOFAGIA
LC3-I LC3-II
Citosol Asociada a membranas
7
Visualización de autofagosomas
marcados con la proteína GFP-LC3
GFP LC3
Células CHO
GFP-
GFP-LC3
+ aminoácidos - aminoácidos
(ayuno)
Fusión de MVBs con autofagosomas
EGFP-Rab11wt (MVBs)
RFP-LC3 (autophagosomes)
8
Monodansilcadaverina (MDC)
• compuesto autofluorescente
• marcador de autofagosomas
Vacuolas marcadas con MDC
Control Ayuno (- AA)
9
+ aminoácidos - aminoácidos
TOR Wortmanina
3-metiladenina
Rapamicina
PI3K
Autofagia
INHIBIDORES DE LA VÍA AUTOFÁGICA
FAGOFORO
WORTMANINA LISOSOMAS
3-METIL-ADENINA
AUTOFAGOSOMA ANFISOMA AUTOFAGOLISOSOMA
10
Wortmanina inhibe el procesamiento de LC3
y la formación de autofagosomas
Ayuno Ayuno + Wortmanina
Wortmanina: inhibidor de PI3K
INHIBIDORES DE LA VÍA AUTOFÁGICA
FAGOFORO
LISOSOMAS
VINBLASTINA
AUTOFAGOSOMA ANFISOMA AUTOFAGOLISOSOMA
11
Vinblastina genera grandes vacuolas
autofágicas que se marcan con MDC
- Vbl
+ Vbl
AUTOFAGOCITOSIS o AUTOFAGIA
• Permite la degradación de macromoléculas
citosólicas (ribosomas, RNA) y de compartimientos
membranosos (organelas envejecidas,hipertrofiadas
• Participa en la remodelación celular durante la
diferenciación, envejecimiento, enfermedades
neurodegenerativas, cáncer.
• Mantiene el suministro de aminoácidos en ayunos
prolongados mediante el secuestro inespecífico
de proteínas citosólicas. Supervivencia celular.
12
La autofagia es un mecanismo de
supervivencia celular
pero el exceso puede llevar a la
muerte celular
(Muerte celular programada Tipo II)
Papel de la autofagia en la salud y la enfermedad
Enfermedad Efectos beneficiosos Efectos dañinos
Supresor de tumores Supervivencia de células cancerosas
Cáncer MCP Tipo II en células cancerosas en el ambiente pobre en nutrientes
remoción de organelas dañadas del tumor evitando la muerte celular
Enfermedades Permitiría le remoción de Puede inducir MCP en las neuronas
neuronales agregados proteicos que acumulan agregados proteicos:
Huntington, Parkinson, Alzheimer
Infección con Defensa contra la invasión Utilización de la vía autofágica por
patógenos de bacterias y virus ciertos patógenos para establecer
la vacuola replicativa
Enfermedades Aumento de la autofagia Aumento de la autofagia llevaría a MCP
lisosomales compensaría ciertos defectos o defectos en esta vía causarían la
lisosomales acumulación de autofagosomas
no funcionales.
13
AUTOFAGIA Y CANCER
• La proteína Beclina 1 forma parte del complejo con PI3kinasa
tipo III y es requerida para la formación de autofagosomas.
• Beclina 1 está ausente en uno de los alelos en varios tipos de
carcinomas de mama, ovario y próstata.
• Ratones deficientes para Beclina 1 sufren de una alta incidencia
de tumores espontáneos.
La autofagia favorece la supresión de tumores induciendo la
muerte de la célula tumoral o limitando su proliferación.
AUTOFAGIA Y CANCER
Ciertos productos farmaceuticos usados para tratar
el cáncer actuarían a través de la autofagia.
Por ejemplo Tamoxifeno, droga usada para tratar
ciertos tipos de cáncer de mama funcionaría
aumentando los niveles endógenos de la proteína
Beclina 1, activando la autofagia.
Otros compuestos que estimulan la autofagia como
la rapamicina están siendo probados actualmente en
pacientes con tumores malignos.
14
Papel de la autofagia en la salud y la enfermedad
Enfermedad Efectos beneficiosos Efectos dañinos
Supresor de tumores Supervivencia de células cancerosas
Cáncer MCP Tipo II en células cancerosas en el ambiente pobre en nutrientes
remoción de organelas dañadas del tumor evitando la muerte celular
Enfermedades Permitiría le remoción de Puede inducir MCP en las neuronas
neuronales agregados proteicos que acumulan agregados proteicos:
Huntington, Parkinson, Alzheimer
Infección con Defensa contra la invasión Utilización de la vía autofágica por
patógenos de bacterias y virus ciertos patógenos para establecer
la vacuola replicativa
Enfermedades Aumento de la autofagia Aumento de la autofagia llevaría a MCP
lisosomales compensaría ciertos defectos o defectos en esta vía causarían la
lisosomales acumulación de autofagosomas
no funcionales.
ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS
PRINCIPALES ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS:
• Enfermedad de Parkinson
• Enfermedad de Huntington
• Enfermedad de Alzheimer
• Enfermedad de los Priones
Se caracterizan por la acumulación de agregados proteicos
que causan muerte neuronal
ENFERMEDAD PROTEÍNA MUTADA o alterada
• Parkinson α-sinucleína (Cuerpos de Lewy)
• Huntington huntintina con extra Poli Q en el amino
• Alzheimer β-amieloide
• Priones priones
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DEGRADACIÓN INTRACELULAR
NO LISOSOMAL LISOSOMAL
• Es llevada a cabo por el • Es llevada a cabo en el
proteosoma lisosoma
• Degradación de proteínas • Degradación de proteínas
de vida media larga
de vida media corta
• Involucra procesos como
• Involucra el sistema de
la endocitosis, fagocitosis
ubiquitinación y autofagocitosis
AUTOFAGIA Y ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS
En estadios iniciales el sistema ubiquitina-proteosoma intenta
remover las proteínas mal plegadas.
En muchas enfermedades neurodegenerativas se ha visto la
acumulación masiva de vacuolas autofágicas.
El tratamiento de las células con el inductor de la autofagia
rapamicina (inhibidor de TOR) promueve la degradación de
las proteínas agregadas.
La autofagia puede proteger a las células en contra de los
efectos tóxicos de los agregados proteicos, pero exceso de
autofagia podrtía causar muerte neuronal .
16
AUTOFAGIA Y NEURODEGENERACIÓN
Neurodegeneración
Inducción de la
autofagia por Agregados
drogas (Rapa) proteicos
Degradación de
proteínas
agregadas
Reducción de agregados
proteicos y de la toxicidad
celular
Protección en varios modelos de
enfermedades neurodegenerativas
Papel de la autofagia en la salud y la enfermedad
Enfermedad Efectos beneficiosos Efectos dañinos
Supresor de tumores Supervivencia de células cancerosas
Cáncer MCP Tipo II en células cancerosas en el ambiente pobre en nutrientes
remoción de organelas dañadas del tumor evitando la muerte celular
Enfermedades Permitiría le remoción de Puede inducir MCP en las neuronas
neuronales agregados proteicos que acumulan agregados proteicos:
Huntington, Parkinson, Alzheimer
Utilización de la vía autofágica por
Infección con Defensa contra la invasión
ciertos patógenos para establecer
patógenos de bacterias y virus la vacuola replicativa
Enfermedades Aumento de la autofagia Aumento de la autofagia llevaría a MCP
lisosomales compensaría ciertos defectos o defectos en esta vía causarían la
lisosomales acumulación de autofagosomas
no funcionales.
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Microorganismos y la vía autofágica
Se benefician Son destruidos
Porphyromonas gingivalis Listeria monocytogenes
Brucella abortus ( cell type?) Mycobacterium tuberculosis
Legionella pneumophila Group A Streptococcus
Chlamydia trachomatis Shigella flexneri
Coxiella burnetii Salmonella entérica (20%)
Staphylococcus aureus
Trypanosoma cruzi
Herpes virus
Poliovirus
MHV
Las vacuolas replicativas de Coxiella
son decoradas por GFP-LC3
CRV
CV CRV
CV CRV
CV
N N N
Berón et al; Infect. Imm. 70: 5816-5821(2002)
Gutierrez et al., Cell. Microb. 7: 981-993 (2005)
18
La inducción de la autofagia favorece
el desarrollo de la vacuola con Coxiella
** **
**
70 70
% ce lls with v acuole s
% ce lls with v acuole s
60 60
50
40
** 50
40
30 30
20 20
10 10
0 0
Ctrl 2h 6h 24h Ctrl Rap Wm 3-MA
Full Starvation Full Starvation
Gutierrez et al., Cell. Microb. 7: 981-993 (2005)
Conclusiones
• La inducción de la autofagia aumenta el % de
células infectadas y favorece la generación y
maduración de las vacuolas con Coxiella.
• La vacuola con Coxiella colocaliza con
proteínas de la vía autofágica.
•Sobreexpresión de proteínas autofágicas
favorece el desarrollo de la vacuola
replicativa.
19
Mycobacterium tuberculosis inhibe la
maduración del fagosoma
• Reside en compartimientos que son
modificados para evitar la fusión con los
lisosomas y la adquisición de enzimas
hidrolíticas.
• Bloquea la maduración del fagosoma en un
punto entre el endosoma temprano y el tardío.
• Los fagosomas que contienen Mycobacterium
restringen la adquisición de la bomba de
protones previniendo la acidificación.
La inducción de la autofagia favorece la
maduración de los fagosomas con Mtb
Cath D Mycobac
Control 60
50 ***
% colocalization
***
40
30
***
20
10
Ayuno
0
tion
tion
tion
n
ol
ol
ol
ol
tio
ntr
n tr
nt r
n tr
rv a
rv a
rv a
rv a
Co
Co
Co
Co
S ta
Sta
S ta
S ta
CathD LBPA LAMP-1 VoATPase
Gutierrez et al., Cell 119:753-766 (2004)
20
La inducción de la autofagia disminuye
la supervivencia de Micobacterium
100 † †
80
***
% survival
60
40 ***
20
m
50
l
tion
ntro
v+3M
v+W
ycin
rva
Co
Star
Star
pam
Sta
Ra
Gutierrez et al., Cell 119:753-766 (2004)
Autofagia y microorganismos
Coxiella burnetii M. tuberculosis
Mycobacterium
Coxiella
phagosome
lysosome lysosome
autophagosome
Mycobacterium degradation
Coxiella replication ER
21
LA AUTOFAGIA COMO MECANISMO DE DEFENSA
Levine, Cell 2005
LA AUTOFAGIA COMO MECANISMO DE DEFENSA
CONTRA PATÓGENOS QUE ESCAPAN
AL CITOPLASMA
Shigella- GAS
Shigella- GAS
Vázquez, Lerena and Colombo, Cell Micro 2009
22
Camuflage de Shigella para evitar ser
reconocida por la autofagia
Ogawa and Sasakawa, Cellular Micro. 2006
CONCLUSION
LA MODIFICACIÓN FARMACOLÓGICA DE LA AUTOFAGIA
PERMITIRÁ LA ELIMINACIÓN DE CIERTOS PATÓGENOS
INTRACELULARES PERO PUEDE RESULTAR BENEFICIOSA
PARA OTROS.
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Papel de la autofagia en la salud y la enfermedad
Enfermedad Efectos beneficiosos Efectos dañinos
Supresor de tumores Supervivencia de células cancerosas
Cáncer MCP Tipo II en células cancerosas en el ambiente pobre en nutrientes
remoción de organelas dañadas del tumor evitando la muerte celular
Enfermedades Permitiría le remoción de Puede inducir MCP en las neuronas
neuronales agregados proteicos que acumulan agregados proteicos:
Huntington, Parkinson, Alzheimer
Infección con Defensa contra la invasión Utilización de la vía autofágica por
patógenos de bacterias y virus ciertos patógenos para establecer
la vacuola replicativa
Enfermedades Aumento de la autofagia Aumento de la autofagia llevaría a MCP
compensaría ciertos defectos o defectos en esta vía causarían la
lisosomales acumulación de autofagosomas
lisosomales
no funcionales.
Papel de la autofagia en la patogénesis
de enfermedades lisosomales
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MIOPATÍAS LISOSOMALES
Enfermedad de Danon Enfermedad de Pompe
Acumulación de glucógeno
ENFERMEDAD DE DANON
Enfermedad poco frecuente ligada al cromosoma X
caracterizada por:
• cardiomiopatía hipertrófica
• Miopatía de músculos esqueléticos
• retardo mental variable
Tratamiento
• Trasplante cardíaco
25
ENFERMEDAD DE DANON
Causada por mutaciones en el gen que codifica a la proteína
LAMP-2 (Lysosomal Associated Membrane Protein-2)
Proteína mayoritaria de la membrana lisosomal con un único
dominio transmembrana, un gran dominio intraluminal
(altamente glicosilado) y una cola citosólica corta.
Principales alteraciones celulares
en la Enfermedad de Danon
Diagnóstico
Carencia de proteínas LAMP-2 en músculo,
leucocitos, y fibroblastos esqueléticos y del
miocardio
• Acumulación de vacuolas autofágicas con
características de sarcolema en varios tejidos:
hígado, riñón, músculo cardíaco y esquelético
• Estas vacuolas contienen enzimas lisosomales,
marcadores autofágicos (LC3) y además proteínas
del sarcolema como distrofina y acetilcolinesterasa
26
Acumulación de vacuolas autofágicas
con características de sarcolema
Malicdan et al., 2008
Por qué se acumulan los autofagosomas?
• Se debe a fallas en la maduración de los
autofagosomas (bloqueo en la fusión con lisosomas)
y no a un aumento en la producción de dichos
autofagosomas.
• Estudios demostraron que la proteína LAMP es
requerida para la fusión de fagosomas y
autofagosomas con los lisosomas y para el
transporte vía microtúbulos.
√ La Enfermedad de Danon es un trastorno de la
autofagia debido a alteraciones en la fusión y/o
motilidad de organelas
27
ENFERMEDADES LISOSOMALES CON AUTOFAGIA DISFUNCIONAL
Resaltar la importancia de la AUTOFAGIA
como un nuevo blanco para el desarrollo de
nuevos medicamentos para el tratamiento
de distintas enfermedades
28
