PROCEDIMIENTO
EXTRACCION cDNA
1. Primero de nuestra muestra de ADN extraimos 1 microlitro
2. Luego lo mantuvimos en hielo
3. De este tubo extraer 1 ml de muestra de sangre
4. En un tubo Falcon añadir 10 ml de ELB y llevarlo al vortex por un tiempo de 10
segundos
5. Incubar en hielo cada 5 minutos y llevarlo nuevamente a vortex durante 15 minutos
6. Llevarlo a la centrifugadora a 3000 rpm por 5 min y hacer una resuspension
7. Nuevamente llevarlo a centrifugar a 3000 rpm por 4 minutos
8. Descartar el sobrenadante teniendo cuidado de desechar el pellet
9. Sobre el pellet añadir 600 microlitros de RL
10. Incubar por 2 minutos a RT (temperatura ambiente)
11. Hacer una resuspension celular del pellet
REMOCION DE gDNA
12. Colocar el tubo Spin Filter D a un Receiver Tube
13. Añadir el sobrenadante a este tubo de Spin Filter D y llevarlo a acentrifugar a
12000 rpm por 2 minutos
14. Descartar el tubo Spin Filter D
15. Añadir 600 microlitros de etanol al 70%
UNION SELECTIVA DE RNA
16. Colocar un nuevo tubo Spin Filter R a un nuevo Receiver Tube
17. Agregar 600 microlitros de nuestra anterior muestra al Spin Filter Tube R
18. Centrifugar a 12000 rpm por 1 minuto
19. Añadir la muestra restante de nuestra muestra anterior y volver a centrifugar a
12000 rpm por 1 minuto
LAVADO
20. Descartar el tubo de eppendford y añadir 500 microlitos de HS al Spin Filter Tube
R, llevarlo a centrifugar a 120000 rpm por 1 minuto
21. Añadir 700 microlitros de LS y nuevamente centrifugar a 12000 rpm por 1 minuto
REMOVIENDO EL ETANOL
22. Descartar nuevamente el tubo de eppendford y colocar el Spin Filter Tube R
anterior a un Receiver Tube para centrifugarlo a máxima velocidad por 3 minutos
ELUCION
23. Colocar el Spin Filter R al Tubo de elución
24. Añadir de 30 a 50 microlitros de RNA-asa
25. Incubar por 1 minutos a temperatura ambiente
26. Centrifugar a 10000 rpm por 1 minuto
