UNIVERSIDAD DE SUCRE
ASIGNATURA: INMUNOLOGÍA
PRÁCTICA Nª 4
Por: Anais Castellar Bsc.
GUÍA 4. DIFERENCIACIÓN DE POBLACIONES CELULARES MEDIANTE
CITOMETRÍA DE FLUJO
INTRODUCCIÓN
En los últimos años, el diagnóstico clínico ha experimentado profundas
modificaciones debidas, en gran medida, a los avances producidos por los
nuevos métodos cuantitativos de análisis celular. De entre ellos destaca la
citometría de flujo, que ha alcanzado gran relevancia, además de la que ya tenía
en la investigación básica. La citometría constituye un complemento valioso de
las técnicas clásicas utilizadas para el estudio de la morfología, biología y
bioquímica celular. Aunque, desde el punto de vista cronológico, la citometría de
flujo es una tecnología relativamente reciente, sus características especiales
como técnica de análisis celular han hecho que en la última década su uso se
haya extendido de forma rápida, desde los laboratorios de investigación básica
hasta los laboratorios clínicos1. La citometría de flujo ha encontrado amplia
utilidad en ciencias como la inmunología, hematología, oncología, anatomía
patológica y biología celular2. La conjugación de marcadores fluorescentes con
anticuerpos monoclonales o policlonales ha hecho posible los estudios de la
densidad y la distribución de determinantes y receptores de la superficie y del
citoplasma celular, permitiendo identificar subpoblaciones celulares 3. Por otra
parte, en comparación con los métodos bioquímicos de análisis celular, en los
que se obtiene un resultado promedio para toda la muestra, la citometría de flujo
es capaz de proporcionar una información cuantitativa sobre cada célula en
particular y permite identificar en una muestra subpoblaciones de células
diferentes, incluso cuando están escasamente representadas.
La citometría de flujo representa un método rápido objetivo y cuantitativo de
análisis de células, núcleos, cromosomas, mitocondrias u otras partículas en
suspensión. El principio en el que se basa esta tecnología es simple: hacer pasar
células u otras partículas en suspensión alineadas y de una en una por delante
de un haz luminoso. La información producida puede agruparse en dos tipos
fundamentales: la generada por la dispersión de la luz y la relacionada con la
emisión de luz por los fluorocromos presentes en la célula o partícula al ser
excitados por el rayo luminoso. Las señales luminosas detectadas se
transforman en impulsos eléctricos que se amplifican y se convierten en señales
digitales que son procesadas por una computadora4
La citometría de flujo permite medir diferentes parámetros de una célula. Éstos
se dividen en:
• Parámetros nucleares
• Parámetros citoplásmicos
• Parámetros de superficie
• Parámetros extracelulares
Un aspecto importante y que representa una ventaja de ella, es la posibilidad de
medir tantos parámetros como anticuerpos se dispongan para ello, marcados
con distintos fluorocromos. Así, es posible caracterizar una célula por su fenotipo
de superficie y, al mismo tiempo, conocer el estado intracelular que guarda la
célula como su patrón de secreción de citocinas, o bien, la etapa del ciclo celular
en la que se encuentra5.
MATERIALES Y REACTIVOS
1. Clitómetro de flujo
2. Micropipetas
3. Puntas para micropipeta
4. Cloruro de Amonio 0.17M (Solución de lisis de células rojas)
5. PBS 1X
6. Tubos Falcón 50ml
7. Centrifuga
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
Se debe usar sangre fresca para asegurar una alta viabilidad de los leucocitos
aislados. Preparar la muestra a una temperatura entre 18 y 20 °C.
1. En un tubo de ensayo adicionar 5 ml de sangre tratada con anticoagulante con
45 ml de solución de lisis de células rojas conservada a temperatura ambiente.
2. Incubar por 5 minutos en agitación. No exceder este tiempo porque las células
blancas empiezan a lisarse.
3. Centrifugar por 5 minutos a 2000 RPM.
4. Aspirar el sobrenadante, resuspender el pellet in ~50 ml de PBS 1X frío.
5. Centrifugar por 5 minutos a 2000 RPM
6. Aspirar el sobrenadante y el pellet resupenderlo en 1 ml de PBS 1X
CITOMETRÍA DE FLUJO
Inicialmente, es necesario lavar la celda del flujo y el sistema de toma de muestras del
equipo, utilizando una solución detergente y agua ultrapura. Una vez se hace el lavado,
se procede a leer las muestras. Previo a esto, se realiza un ajuste en el sistema del equipo,
colocando 400 μl de muestra en un tubo eppendor, se ajusta el sistema y se procede a leer
las muestras, las cuales deben diluirse 1/5, en un volumen total de 400 µl y se procede a
realizar la lectura en el equipo.
BIBLIOGRAFÍA
Orfao A, Ciudad J, López A, López-Berges MC, Vidriales B, Macedo A, et al.
La citometría de flujo en el diagnóstico clínico. Servicio General de Citometría.
Universidad de Salamanca, 1993.
Orfao A, González M, Ciudad J, López-Berges MC, López A, San Miguel JF, et
al. Aplicaciones de la citometría de flujo en el diagnóstico hematológico. Biol Clin
Hematol 1992; 13:456-523.
Goding JS. Conjugation of Antinodies with Fluorochromes Modifications to the
Standard Methods. J Immunol Meths 1976; 13:215-223.
Shapiro HM. Practical Flow Cytometry. 4th ed. New Jersey: Wiley-Liss, Hoboken,
2003.
Barrera Ramírez, LM et al. Citometría de flujo: vínculo entre la investigación básica
y la aplicación clínica. Rev. Inst. Nal. Enf. Resp. Mex. [online]. 2004, vol.17, n.1
[citado 2016-09-25], pp.42-55. Disponible en:
<[Link]
75852004000100007&lng=es&nrm=iso>. ISSN 0187-7585.
