Manual de Prácticas Ecotoxicología- J.
Iannacone
UNIVERSIDAD CIENTIFICA DEL SUR
Facultad de Ciencias Ambientales
Carrera de Ingeniería Ambiental
Manual de Prácticas
Ecotoxicología
(IGA 810)
Autor:
Dr. José Alberto Iannacone Oliver
Profesor Responsable
Año Académico 2019-2
Lima -Perú
Perteneciente a:
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Manual de Prácticas Ecotoxicología- J. Iannacone
Presentación
La presente Guía de Prácticas de Ecotoxicología pretende ayudar al
educando a conozcan sobre la toxicología y la química ambiental con
énfasis en salud ambiental y servicios de ecosistemas, las sustancias
químicas en el ambiente incluyendo aspectos de su transporte y
destino final, métodos para estimar el peligro y el riesgo debido a las
sustancias químicas. En cada sección se presentará una pequeña
introducción de los temas tratados. La parta práctica de la asignatura
contribuye a desarrollar y proponer soluciones alternativas a los
problemas derivados del manejo de recursos biológicos, el deterioro
ambiental y la incorporación de nuevas tecnologías y sus derivados al
mundo biológico. También realiza investigación básica y aplicada en
cualquier área de las ciencias biológicas y difunde los resultados de
sus investigaciones y el estado del arte a diferentes de la sociedad.
El Autor
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Manual de Prácticas Ecotoxicología- J. Iannacone
Guía 1
Taller de Ecotoxicología I
Introducción y conceptos
OBJETIVO:
Entender los conceptos básicos, introductorios, históricos de la
ecotoxicología en Latinoamérica y en el Perú.
MATERIAL:
Material electrónico especializado en ecotoxicología:
Zagatto, P.A. 2006. Ecotoxicología. Capítulo 1. En:
Ecotoxicología Aquática. Principios e Aplicaciones. Zagato,
P.A. & Bertoletti, E. (eds.). Sao Carlos. RiMa. pp. 1-13.
TAREA ACADÉMICA:
En base a la lectura especializada y seleccionada por el docente
facilitador se completará el siguiente cuestionario:
1. Realizar una línea de tiempo sobre la evolución de los estudios
ecotoxicológicos.
2. Mencione cinco diferencias entre la Toxicología clásica y la
Ecotoxicología. Sustente.
3. Indique los parámetros que se utilizan para un estudio
ecotoxicológico. Sustente.
4. De 2 ejemplos de estudios relevantes en Brasil en la ecotoxicología.
5. Como influyen las características intrínsecas de las sustancias
químicas en su toxicidad.
6. Defina las siguientes siglas y su relación con el curso de
Ecotoxicología:
- DDT
- CETESB
- PCBs
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Manual de Prácticas Ecotoxicología- J. Iannacone
- ISO
- LTM
- SETAC
- ECOTOX
7. Como Define Blaise la ecotoxicología.
8. Como define Ramade la ecotoxicologia.
Los estudiantes finalmente realizarán un organizador visual, el cual
será discutido con los alumnos y evaluado por el docente especialista.
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Manual de Prácticas Ecotoxicología- J. Iannacone
Guía 2
Taller de Ecotoxicología II
Aportes de la Ecotoxicología en la las
regulaciones ambientales
OBJETIVO:
Se desarrollará una revisión de los aportes de la ecotoxicología a las
diferentes regulaciones, tanto a nivel internacional como nacional.
MATERIAL:
Material electrónico especializado en ecotoxicología:
Planes, E. & Fuchs, J. 2015. Cuáles son los aportes de la
ecotoxicología a las regulaciones ambientales?. Ciencia e
Investigación, 65: 45-62.
La ecotoxicologia es la disciplina científica que estudia el efecto de las
sustancias y compuestos químicos sobre los ecosistemas. Una
característica de esta disciplina es que los conocimientos científicos y
las tecnologías que desarrolla se utilizan para resolver problemas
ambientales concretos. En todos los países existen normativas que
regulan la presencia de compuestos químicos en el ambiente debido a
sus posibles efectos tanto sobre la salud humana como sobre los
ecosistemas.
Actualmente las normativas se fijan tomando en cuenta las
principales características de los compuestos químicos que las hacen
peligrosas para el ambiente, su toxicidad, su persistencia en el
ambiente y su potencial de bioacumulación. Estas características
ecotoxicológicas se estudian generalmente en el laboratorio. Las
investigaciones realizadas directamente en el campo, que permiten
detectar situaciones nuevas que no pueden predecirse a partir de
estudios en laboratorio, también se consideran. Los estudios
ecotoxicológicos son los que proporcionan la información científica
que luego va a traducirse en legislaciones con distinto alcance:
convenios internacionales que prohíben el uso de ciertos compuestos
químicos a nivel mundial; regulaciones para las descargas de
efluentes; autorizaciones para la aplicación deliberada de compuestos
químicos (ej. pesticidas); evaluación y remediación sitios
contaminados y clasificación de productos químicos. En este trabajo
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Manual de Prácticas Ecotoxicología- J. Iannacone
se desarrolla una revisión de los aportes de la ecotoxicología a las
diferentes regulaciones, tanto a nivel internacional como nacional.
TAREA ACADÉMICA:
En base a la lectura especializada y seleccionada por el docente
facilitador se completará el siguiente cuestionario:
1.- Conceptualice:
a) Enfermedad de Minamata
b) COPs
c) PNEC
d) NOEC
e) CI50
2.- Rachel Carson y la Ecotoxicología.
3.- Mecanismos de degradación de los tóxicos en el ambiente?
4.- Aplicación de los isótopos de N en ecotoxicología
5.- Métodos para determinar PNEC.
6.- Como se determinan las concentraciones que no causan efectos
adversos en:
a) salud humana
b) ecosistema
7.- Que normas se usan en Ensayos de Toxicidad?
8.- Importancia del biomonitoreo.
9.- Describa el fenómeno del Imposex.
10.- Efecto del monocrotofos en Aguiluchos.
11.- Qué relación existe entre los Sábalos los PCBS?
12.- Defina:
a) SGA
b) Libro púrpura
c) IRAM
13.- Como se fijan las concentraciones límites en los efluentes?
Los estudiantes finalmente realizarán un organizador visual, el cual
será discutido con los alumnos y evaluado por el docente especialista.
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Manual de Prácticas Ecotoxicología- J. Iannacone
Guías 3
ORGANIZACIÓN DE UN PROTOCOLO
ECOTOXICOLÓGICO: ANÁLISIS DE
DATOS
OBJETIVO:
Realizar un análisis de datos de un bioensayo ecotoxicológico.
MATERIAL:
Concentración letal y efectiva media (CL/CE50)
La CL/CE50 será calculada mediante el uso del programa Toxicity
Relationship Analysis Program (TRAP) versión 1.30a de la United
State Environmental Protection Agency (USEPA, 2015) y a través de
la función Probit contenida en una plantilla del programa Excel 2016
provista por Alpha (2017) para uso libre y disponible en la web.
Métodos para evaluar la diferencia entre las respuestas a
distintas concentraciones
Concentración de efecto no observado (NOEC) y concentración
mínima de efecto observado (LOEC)
La NOEC y LOEC serán determinadas a través del análisis de varianza
(ANDEVA), seguido de la prueba de Tukey, con el empleo del
programa de uso PAST.
Inicialmente se aplicará el ANDEVA de una vía, ya que solo se
evaluará la variable concentración, para verificar si existen
diferencias significativas entre las mortalidades medias de las
distintas empleadas, incluyendo la muestra control. Si los resultados
confirman lo planteado, se proseguirá con la prueba de Tukey para
identificar las concentraciones con mortalidades medias que no
fueron significativamente distintas a las de la muestra control.
Finalmente, en base a esos resultados, se identificarán el NOEC y
LOEC.
TAREA ACADÉMICA:
Los estudiantes realizarán cálculos de la Concentración letal y efectiva
media (CL/CE50), Concentración de efecto no observado (NOEC) y
concentración mínima de efecto observado (LOEC).
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Manual de Prácticas Ecotoxicología- J. Iannacone
Guías 4-7
ORGANIZACIÓN DE UN PROTOCOLO
ECOTOXICOLÓGICO CON LEMNA
MINOR O LEMNA GIBBA
OBJETIVO:
Realizar un bioensayo ecotoxicológico con la lenteja de agua: Lemna
minor o Lemna gibba usando una muestra ambiental con
contaminación química.
INTRODUCCIÓN:
Lemna minor y Lemna gibba son ideales para el estudio de la
toxicidad acuática, porque tales plantas son de fácil recolección y
cultivo. Lemna ha resultado ser un buen organismo para utilizar en
bioensayos, porque la prueba de inhibición del crecimiento es simple,
sensible y económica. Este tipo de análisis ha sido recomendado por
las agencias estatales de los Estados Unidos y por la Organización
Internacional para la Cooperación y el Desarrollo Económico, que han
afirmado que la lenteja de agua es más sensible a los herbicidas y a
los metales pesados que a los productos químicos industriales
MATERIAL:
Material electrónico especializado en ecotoxicología:
OECD. 2002. Guidelines for the testing of chemicals revised
proposal for a new guideline 221 Lemna sp. Growth Inhibition
Test. 22 pp.
Resumen del Protocolo
Muestra ambiental acuática
La recolección de la muestra ambiental acuática, se realizará de
cualquier zona del departamento de Lima donde se tenga
contaminación acuática por sustancias químicas por cualquier
actividad antrópica. La colecta se realizará mediante botellas de 3 L
siguiendo las pautas de la entidad reguladora nacional e internacional
para toma de muestras de agua continental. La muestra será
transportada en un cooler hasta el laboratorio. Los sitios colectados
serán caracterizados mediante un perfil ambiental y se tomarán los
parámetros básicos de pH, Conductividad eléctrica y Solidos totales
disueltos.
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Manual de Prácticas Ecotoxicología- J. Iannacone
Colecta de organismos prueba
Se procederá a la colección e identificación de la especie de Lemna
minor o L. gibba. Los ejemplares de L. gibba serán recolectados en
humedales del departamento de Lima, Perú de áreas con escasa
perturbación ambiental. La colecta se realizará de manera artesanal
empleando un balde de 7 litros de capacidad. Los ejemplares
colectados serán transportados con el agua de la zona de colecta
mediante un balde hasta el laboratorio
Caracterización del organismo
Los ejemplares de L. gibba se caracterizaron para la implementación
de los bioensayos de las cuales debería contar con algunos requisitos:
Contar con 2 frondas formadas de aproximadamente el mismo
tamaño y no tener ningún efecto subletal como necrosis y clorosis.
Esta selección se realizará con la ayuda de pinceles finos. Se utilizará
el estereoscopio y de placas petri esterilizadas para la selección.
Preparación de concentraciones
Con la muestra de agua dulceacuícola presuntamente contaminada
recolectada se prepararán 5 concentraciones sucesivas con un factor
de dilución de 0,5. Para realizar las disoluciones se utilizará agua
embotellada. Las cinco disoluciones serán 100% (C5), 50% (C4), 25%
(C3), 12,5% (C2) y 6,25% (C1). Se preparará una concentración
control (C0) la cual consistirá en agua embotellada sin ningún aditivo.
Aclimatación y pruebas ecotoxicológicas
Se realizará la aclimatación de la Lemna por una semana, previo al
ensayo, utilizando un aireador.
Los bioensayos se realizarán con 240 colonias de dos frondas u hojas
de Lemna seleccionada previamente. Se usarán 40 colonias
seleccionadas al azar por concentración y 10 por cada réplica, para
luego visualizar parámetros siete subletales, después de 168 h (siete
días).
Las condiciones y criterios de aceptabilidad del bioensayo con Lemna
son indicados en la tabla 1.
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Manual de Prácticas Ecotoxicología- J. Iannacone
Tabla 1. Esquema del protocolo de investigación con Lemna minor
ESQUEMA DEL PROTOCOLO DE INVESTIGACIÓN
Tipo de prueba Estática crónica
Duración 7 días (168 h)
Temperatura Ambiente 22 [± 2] °C
Calidad de luz Luz fría en ambiente de laboratorio
Fotoperiodo 12 h luz - 12 h oscuridad
Volumen de cada envase 250 mL
Número de colonias por envase 10
Número de colonias por concentración 40
Edad de los organismos Colonia de 2 frondas
DBCA 6x4
Concentraciones de la prueba 0%,6,25%, 12,5%, 25%, 50%, 100%
Agua de control y dilución Agua embotellada
Régimen de Alimentación No requiere alimentación
Parámetros medidos pH, T°, CE
Número total de frondas,
Formación de hojas u hojitas nuevas,
necrosis,
clorosis,
ruptura de colonias,
peso húmedo,
peso seco
Las pruebas de toxicidad estática crónica a las 168 h (7 días) para
Lemna se realizarán en cuatro repeticiones con cinco concentraciones
más el control. Los resultados obtenidos se clasificarán por el número
de frondas (desde una fronda hasta cuatro frondas) y por cada efecto
subletal (clorosis, necrosis y hojas nuevas). De igual manera, se
realizará el conteo final del número total de hojas. Para los resultados
de peso seco y húmedo, se pesarán tres veces el número total de
Lemna por cada repetición. Con cada resultado obtenido se realizará
promedios por fronda y concentración.
Análisis estadístico
Se utilizará el programa estadístico SPSS versión 22, así mismo, se
realizará el análisis de los resultados mediante la evaluación de los 7
parámetros observados. Se emplearán las pruebas de normalidad,
homogeneidad de varianza, comparaciones múltiples (prueba de
Dunnett), la prueba no paramétrica de Kruskal Wallis y la prueba de
ANOVA junto con Tukey, para poder identificar si los datos obtenidos
son estadísticamente iguales o diferentes. Se determinarán los
valores de CE50 (Concentración efectiva media), LOEC (Concentración
más baja de efectos observables) y NOEC (Concentración de efectos
no observables). Por otro lado, para calcular el CE50 (Concentración
Efectiva Media) se usará el análisis probit o el TRap.
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Manual de Prácticas Ecotoxicología- J. Iannacone
TAREA ACADÉMICA:
Como parte de la investigación formativa o semilleros de
investigación se elaborará un artículo científico de los efectos
ecotoxicológicos con Lemna en formato Word. Se adjuntará al artículo
científico toda la data original en bruto en Excel y la galería
fotográfica en power point. Los criterios y componentes del artículo
científico serán especificados por el docente.
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Manual de Prácticas Ecotoxicología- J. Iannacone
Guías 8-9
ORGANIZACIÓN DE UN PROTOCOLO
ECOTOXICOLÓGICO CON DAPHNIA
MAGNA
OBJETIVO:
Realizar un bioensayo ecotoxicológico con la pulga de agua: Daphnia
magna usando una muestra ambiental dulceacuícola con
contaminación química o un tóxico de referencia (metal pesado,
plaguicida, hidrocarburo u otra sustancia química relevante).
INTRODUCCIÓN
Daphnia magna es la especie más conocida y utilizada en
ecotoxicología acuática. Es uno de los organismos recomendados con
más frecuencia por la regulación federal para evaluar la toxicidad
aguda y crónica de efluentes, cuerpos de agua, muestras acuosas y
productos químicos. Daphnia magna presenta una serie de ventajas
que la hacen especialmente favorable como organismo bioindicador
en dichos ensayos, su sensibilidad a los tóxicos, su reproducción
partenogenética y sus ciclos vital y reproductivo relativamente cortos,
facilitan el desarrollo de experiencias de laboratorio presentándose,
además, raramente en combinación con otras especies.
La pulga de agua, como vulgarmente se le conoce a la D. magna, es
un crustáceo de agua dulce, de tamaño pequeño y de vida corta, que
se alimenta del fitoplancton y levaduras, el último especialmente en
condiciones de aclimatación en laboratorio. Los ensayos de toxicidad
con D. magna constituyen el único tipo de bioensayos con
invertebrados acuáticos reconocidos por organizaciones
internacionales como la U.S. Environmental Protection Agency (EPA),
la Comunidad Económica Europea (CEE) y la Organization for
Economic Cooperation and Development (OECD), siendo requeridos
regularmente en todos los países.
MATERIAL:
Material electrónico especializado en ecotoxicología:
American Public Health Association - APHA. 2005. Standard
Methods for the examination of water and wastewater. 21th
ed. Washington: M.A.H. Franson.
OECD. 1984. "Daphnia sp., Acute Immobilisation Test and
Reproduction Test. 202. 16 p.
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Manual de Prácticas Ecotoxicología- J. Iannacone
Recolección de las especies D. magna
La obtención de D. magna se hará a través de un acuario o
laboratorio de cultivo local. De esta forma se evitará cualquier sesgo
con la especie obtenida. Se recolectarán 1000 hembras que serán
aclimatadas, para luego separar a la Daphnia con neonatos en su
interior.
Bioensayo con D. magna
Se usarán baldes o acuarios para la aclimatación de la especie. Se
usarán aireadores para brindarles las condiciones respectivas, de esta
forma la especie estará en buenas condiciones para que pueda ser
usada en los bioensayos.
Para la alimentación del organismo acuático, se utilizará 1 stick de
espirulina por cada L. Con la ayuda de un mortero, esta será molida y
disuelta en 250 mL de agua embotellada. Esta cantidad será
agregada interdiariamente durante una semana a los baldes con la
especie mencionada. Se mantendrán en el laboratorio a temperatura
de ambiente.
Después de 5-7 días se separarán las hembras con una pipeta
Pasteur. Se colocarán en vasos de precipitado de 0,5 L, las cuales
serán previamente observadas en un estereoscopio para verificar la
presencia de neonatos en su interior. Después de 24 h, se separarán
a los neonatos menores a 24 h y se colocarán 10 por cada envase de
30, 40 o 50 mL, a los cuales se les expondrán a 5 tratamientos
diferentes, a base de una muestra ambiental con contaminación
química o un tóxico de referencia (metal pesado, plaguicida,
hidrocarburo u otra sustancia química relevante), y un control,
obteniendo de esta manera un modelo de 6x4 (6 concentraciones con
4 repeticiones).
Se medirá el pH y la conductividad eléctrica por cada concentración al
preparar los tratamientos y el control. A las 24h y a las 48h se
volverá a medir el pH y la conductividad eléctrica.
Se tomará en cuenta los siguientes parámetros con D. magna:
mortalidad e inmovilización (Tabla 2).
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Manual de Prácticas Ecotoxicología- J. Iannacone
Tabla 2. Esquema del protocolo de investigación con D. magna.
ESQUEMA DEL PROTOCOLO DE INVESTIGACIÓN
Tipo de prueba Estática aguda
Duración 24 y 48 h
Temperatura Ambiente 20 [± 2] °C
Calidad de luz Luz fría en ambiente de laboratorio
Fotoperiodo 12 h luz - 12 h oscuridad
Volumen de cada envase 30, 40 y 50 mL
Número de organismos por envase 10
Número de organismos por concentración 40
Edad de los organismos Neonatos de < 24 h
DBCA 6x4
Concentraciones de la prueba 0%,6,25%, 12,5%, 25%, 50%, 100%
Agua de control y dilución Agua embotellada
Régimen de Alimentación en el cultivo 250 mL/día de dilución de Spirulina y agua
embotellada.
Parámetros medidos pH, T°, CE
Muerte o letalidad,
Inmovilización
Muestra ambiental o tóxico de referencia
La muestra ambiental dulceacuícola con contaminación química o el
tóxico de referencia: metal pesado, plaguicida, hidrocarburo u otra
sustancia química relevante seleccionado para el bioensayo
ecotoxicológico requerirá conocer en los posible sobre todo con el
tóxico de referencia, su perfil físico-químico e información
ecotoxicológica previa con organismos acuáticos, y en especial con D.
magna.
Análisis estadístico
Se utilizará el programa estadístico SPSS versión 22, así mismo, se
realizará el análisis de los resultados mediante la evaluación de los 2
parámetros observados. Se emplearán las pruebas de normalidad,
homogeneidad de varianza, comparaciones múltiples (prueba de
Dunnett), la prueba no paramétrica de Kruskal Wallis y la prueba de
ANOVA junto con Tukey, para poder identificar si los datos obtenidos
son estadísticamente iguales o diferentes. Por otro lado, para hallar el
CL50 (Concentración letal media) y el CE50 (Concentración efectiva
media) se usará el análisis probit o el TRap. Se determinarán los
valores de NOEC y LOEC.
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Manual de Prácticas Ecotoxicología- J. Iannacone
TAREA ACADÉMICA:
Como parte de la investigación formativa o semilleros de
investigación se elaborará un artículo científico de los efectos
ecotoxicológicos con Daphnia magna en formato Word. Se adjuntará
al artículo científico toda la data original en bruto en Excel y la galería
fotográfica en power point. Los criterios y componentes del artículo
científico serán especificados por el docente.
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Manual de Prácticas Ecotoxicología- J. Iannacone
Guías 10-12
ORGANIZACIÓN DE UN PROTOCOLO
ECOTOXICOLÓGICO CON EISENIA
FOETIDA
OBJETIVO:
Realizar un bioensayo ecotoxicológico con la lombriz de tierra: Eisenia
foetida usando una muestra ambiental terrestre con contaminación
química o un tóxico de referencia (metal pesado, plaguicida,
hidrocarburo u otra sustancia química relevante).
INTRODUCCIÓN
Dentro de organismos usados como bioindicadores de contaminación
del suelo encontramos a la lombriz de tierra, Eisenia foetida (Savigny,
1826) (Annelida: Oligochaeta). Esta especie es importante para la
formación del suelo y para la descomposición de la materia orgánica.
La lombriz de tierra ha sido considerada un indicador apto para
evaluar la contaminación debido a su interacción con el suelo.
Además, la lombriz de tierra se expone a diferentes tóxicos por varias
vías de exposición. La primera vía es a través de la pared corporal,
dado que ésta es extremadamente permeable y al estar en continuo
contacto con los poros y el agua que hay en el suelo, hacen que esta
sea la principal ruta de exposición a los contaminantes tóxicos. Otra
de las rutas importantes es la ingestión, que la lombriz de tierra la
realiza durante el procesamiento del suelo a través de su sistema
digestivo, al descomponer la materia orgánica y los agregados del
suelo.
MATERIAL:
Material electrónico especializado en ecotoxicología:
EPA. 2012. Ecological Effects Test Guidelines OCSPP 850.3100:
Earthworm Subchronic Toxicity Test. EPA 712-C-016. January
2012. 19 p.
ISO (International Organization for Standardization). 1993.
Soil quality - Effects of pollutants on earthworms (Eisenia
fetida). Part 1: Determination of acute toxicity using artificial
soil Substrate. ISO 11268-1. First ed. 1993. pp. 12-15.
OECD (Organisation for Economic Co-operation and
Development). 1984. Earthworm, Acute Toxicity Tests.
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Manual de Prácticas Ecotoxicología- J. Iannacone
Guideline for Testing of Chemicals. 207. Adopted 4 april 1984.
9 p.
Selección de lombrices: Se seleccionarán individuos adultos
(clitelio visible) de E. foetida, por cada contenedor de cultivo, con un
peso fluctuante entre 200-500 mg. Las lombrices serán aclimatadas
en suelo agrícola durante 48 h. Posteriormente se lavarán con agua,
se medirán (longitud total) en cm y se pesarán (mg)
individualmente.
Se seleccionará a E. foetida por ser una especie sensible a cambios
en la calidad del suelo y por ende se le considera una buena
indicadora de calidad ambiental. La identificación taxonómica a nivel
específico se realizará usando los criterios especializados.
Para la selección de los individuos se verificará el tamaño y la
presencia del anillo clitelar desarrollado y visible, la cual es
indicativo de su capacidad reproductiva e indica que son individuos
adultos. Las lombrices adultas se seleccionarán de un mismo
sistema de cultivo, con el fin de evitar variaciones en los resultados
finales del bioensayo. Se realizarán ensayos con ácido bórico como
control positivo con el fin de asegurar el rango adecuado de
sensibilidad de las lombrices de tierra.
Aclimatación de lombrices: Para llevar a cabo la aclimatación de
las lombrices de tierra se realizarán las siguientes dos actividades:
(1) previo a la aclimatación de las lombrices, se les darán todas las
condiciones necesarias, y su alimentación consistirá en tomates
“cherry” descompuestos, (2) posteriormente, las lombrices
seleccionadas serán aclimatadas en suelo agrícola a lo largo de una
semana, su régimen de alimentación se mantendrá constante (OECD,
1984; ISO, 1993; EPA, 2012). Los ensayos de aclimatación serán
considerados válidos cuando la mortalidad de E. foetida no sobrepasa
el 10%. La cantidad de agua de riego suministrada permitirá
mantener la humedad en suelo para mantener en el rango óptimo
establecido de 40-80%.
Bioensayos ecotoxicológicos
Las pruebas ecotoxicológicas con los oligoquetos se realizarán con
cohortes de especímenes de E. foetida que se obtendrán del envase
de cultivo masivo, considerando solo a adultos. Al inicio del
bioensayo, las lombrices serán colocadas en envases de plástico de
un litro de capacidad y de 12 cm de alto. Los bioensayos se realizarán
bajo condiciones de oscuridad para evitar el efecto de fotólisis. Las
lombrices serán lavadas en agua destilada y luego secadas en papel
absorbente para eliminar el exceso de agua durante la lectura. Se
emplearán aproximadamente 250 g de suelo como sustrato en
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Manual de Prácticas Ecotoxicología- J. Iannacone
ensayos estáticos a 7 d de exposición. Para las diluciones se
empleará suelo artificial (10% musgo (materia orgánica), 20% arcilla
y 70% arena).
Efecto tóxico letal (OECD, 1984; ISO, 1993; EPA, 2012)
Se medirá la mortalidad a través de la CL50, la cual representa la
concentración del suelo problema que ocasiona la muerte (daño
máximo) en el 50 % de las lombrices de tierra que han sido
expuestas. Las lombrices moribundas se registrarán como muertas si
no responden a un toque mecánico suave con una pinza.
La toxicidad letal de los bioensayos será evaluada a los 7 días
contados a partir de la instalación del bioensayo.
Mortalidad: Se consideró efectiva la mortalidad cuando:
a) No se registran en el conteo de lombrices a los 7 días, debido a
que tienden a desintegrarse rápidamente.
b) Se observa una mancha delgada amarillenta, relacionadas con la
descomposición y la desintegración.
c) No hay respuesta ante los estímulos físicos en 15 seg de
observación como por ejemplo: escape a la luz, movimientos bruscos,
etc.
Efecto tóxico subletal (OECD, 1984; ISO, 1993; EPA, 2012)
Mide el comportamiento y la reacción del organismo vivo ante el
tóxico a través de la CE50, LOEC y NOEC, y hace referencia a la
fragmentación, oscurecimiento y adelgazamiento en las lombrices de
tierra. Las respuestas subletales seleccionadas serán:
Fragmentación: serán consideradas afectadas por fragmentación
aquellas lombrices que se encontraron divididas por la mitad cuando
se realizó la lectura de los bioensayos a las 7 días de exposición.
Oscurecimiento: se considerará significativo cuando se observaran
mancha marrón en la lombriz de tierra, así como un cambio de color
de rojo a guinda oscura.
Adelgazamiento: Los efectos serán representados por la pérdida del
grosor del cuerpo de la lombriz de tierra. En algunos casos serán tan
delgados que solo penderían de un hilo que los une, hasta llegar a
partirse en dos.
Biomasa promedio en g- se determinó con una aproximación de
0,01 mg en una balanza semianalítica.
Longitud total promedio.
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Manual de Prácticas Ecotoxicología- J. Iannacone
Las condiciones del bioensayo se mantendrán a 20°C durante 7 días,
y será registrada la mortalidad. El punto final considerado como
respuesta letal será la mortalidad, evaluada a través de la
concentración letal media (CL50), y los puntos finales de respuesta
sub letal serán cinco: fragmentación, oscurecimiento,
adelgazamiento, biomasa promedio y longitud total, evaluados a
través de CE50 (Concentración efectiva media), LOEC (Concentración
más baja de efectos observables) y NOEC (Concentración de efectos
no observables).
Las pruebas de toxicidad para cada tóxico o muestra de suelo se
evaluarán en cinco concentraciones, más un control o testigo con
cuatro repeticiones, en un diseño en bloque completamente aleatorio
(DBCA) de 6x4.
La eficacia de los tratamientos y las repeticiones se evaluará a través
de un análisis de varianza (ANDEVA) de dos vías, previa
transformación de los datos a raíz cuadrada del arcoseno, con el fin
de ajustar los datos letales y subletales a la normalidad. En el caso de
existir diferencias significativas entre los tratamientos y entre las
repeticiones se realizará la prueba de Tukey. Los cálculos de la
mortalidad corregida se realizarán mediante la fórmula de Abbott en
caso de muerte natural en el grupo testigo cuando sea menor al
20%. Las CL(E)s50 se calcularán usando el programa Excel con
plantilla de uso libre generada por Alpha-Raj (2018) disponible en la
web, la cual contiene las fórmulas requeridas para el cálculo de la
CL50 y CE50 y de sus respectivos límites de confianza (CL(E) 50 inf y CL
(E)50 sup) al 95%, junto a otros estimadores, mediante el uso de la
función Probit. El modelo de regresión será verificado usando el
estadístico Chi-cuadrado. Los resultados para los estadísticos
descriptivos e inferenciales se analizarán mediante el paquete
estadístico SPSS o PAST.
TAREA ACADÉMICA:
Como parte de la investigación formativa o semilleros de
investigación se elaborará un artículo científico de los efectos
ecotoxicológicos con E. foetida en formato Word. Se adjuntará al
artículo científico toda la data original en bruto en Excel y la galería
fotográfica en power point. Los criterios y componentes del artículo
científico serán especificados por el docente.
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Manual de Prácticas Ecotoxicología- J. Iannacone
Guía 13-14
ÍNDICES DE CALIDAD DE AGUA
OBJETIVO:
Calcular los ICA (Índices de calidad de agua) y su relación con la
ecotoxicología.
INTRODUCCIÓN:
El deterioro de las fuentes de abastecimiento de agua incide
directamente en el nivel de riesgo sanitario presente y en el tipo de
tratamiento requerido para su reducción; la evaluación de la calidad
del agua permite tomar acciones de control y mitigación del mismo,
garantizando el suministro de agua segura. Una herramienta son los
índices de calidad de agua –ICA–; los de tipo multiplicativo son más
sensibles a las variaciones en la calidad del agua que los de tipo
aditivo. Aquellos que consideran las variaciones en el tiempo y en el
espacio y además permiten una comparación con la normativa
vigente en la zona de estudio. Para el uso de estas fuentes para
abastecimiento humano, valores entre 90 y 100 de la generalidad de
los ICA implican tratamientos menores como sólo desinfección,
mientras que entre 50 y 90 requieren tratamiento convencional y en
algunos casos tratamientos especiales que están asociados a mayores
costos y complejidad.
MATERIAL:
Material electrónico especializado en ecotoxicología:
Cruz, C.H. & Patiño, P.J. 2009. Índices de calidad de agua en
fuentes superficiales utilizadas en la producción de agua para
consumo humano. una revisión crítica. Revista Ingenierías
Universidad de Medellín, 8: 79-94.
ANA (Autoridad Nacional del Agua). 2018. Metodología para
la determinación del índice de calidad de agua ICA-PE,
aplicado a los cuerpos de agua continentales superficiales.
Autoridad Nacional del Agua. Lima, Perú.
En base al denominado “Water Quality Index Calculator”- EXCEL se
introducirá cada parámetro del ICA multiplicativo de Oregon
estandarizado presentado. Se observará que el oxígeno disuelto
(OD), los coliformes, y el pH son los parámetros de mayor uso.
Seguidos en por la DBO, los nitratos, la temperatura, la turbiedad y el
fosforo.
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Manual de Prácticas Ecotoxicología- J. Iannacone
TAREA ACADÉMICA:
Como parte de la investigación formativa o semilleros de
investigación se elaborará un reporte Técnico en formato power point.
Los alumnos seleccionarán una cuenca entre las diversas áreas
geográficas del Perú, y calcularán los ICA en diferentes puntos con
visión espacial y temporal, en base a un Excel-Calculadora según el
“Oregon standards”, y se catalogará e interpretará la calidad del agua
para su uso como fuente de abastecimiento humano. Realizarán una
pequeña exposición y discusión de los hallazgos encontrados.
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Manual de Prácticas Ecotoxicología- J. Iannacone
Guía 15
ASPECTOS ÉTICOS EN
ECOTOXICOLOGÍA
OBJETIVO:
Entender los aspectos éticos en ecotoxicología acuática y terrestre.
MATERIAL:
Material electrónico especializado en ecotoxicología:
Dos Santos, J.; Dos Santos, I. K.; Carvalho de Freitas, L. &
Carvalho Neta, R. (2015). Princípios bioéticos aplicados a los
estudos ecotoxicológicos aquáticos. Revista bioética, 23: 416-
426.
Costello, M.; Beard, K.H.; Corlett, R.T.; Cumming, G.; Devictor,
V.; Loyola, R.; Maas, B.; Miller-Rushing, A.J.; Pakeman, R. &
Primack, R.B. 2016. Field work ethics in biological research.
Biological Conservation, 203: 268-271.
ASPECTOS ÉTICOS
Para los presentes estudios se considerarán los principios de las 3R
(refinamiento, reducción y sustitución) (Dos Santos et al., 2015). El
refinamiento abarca temas de aclimatación a la especie,
disminuyendo el sufrimiento y dolor que se le podría brindar. En los
bioensayos realizados se hará una aclimatación de las especies,
previa al bioensayo, generando de esta manera un menor sufrimiento
a las especies. La reducción busca disminuir el número de individuos
utilizados en un bioensayo. En los bioensayos se utilizarán los
individuos necesarios para tener un valor estadístico significativo. Se
emplearán la menor cantidad de individuos de las especies en los
bioensayos realizados. La sustitución busca el uso de organismos
inferiores en la escala biológica. En los bioensayos se usaron tres
especies (Lemna spp., D. magna y E. fetida) muy utilizadas para
bioensayos ecotoxicológicos, y las cuales no pertenecen al subfilo
Vertebrata.
TAREA ACADÉMICA
Los estudiantes finalmente realizarán en base al artículo seleccionado
un organizador visual, el cual será discutido con los alumnos y
evaluado por el docente especialista.
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