PRUEBAS BIOQUIMICAS

Microbiología II
Tecnicatura en Alimentos
GD
 Pruebas metabolicas
• El metabolismo se define como una serie de reacciones
químicas que se llevan acabo en el microorganismo de tipo
fisiológico para que se adapte al medio. Las funciones
específicas del metabolismo son cuatro:
1. Obtención de energía química de las moléculas
combustibles.
2. La conversión de principios nutritivos exógenos en
precursores de los componentes macromoleculares de la
célula.
3. El ensamblaje de estos materiales para formar, proteínas,
ácidos nucleicos, lípidos y otros componentes celulares.
4. La formación y degradación de las biomoléculas necesarias
para las funciones especializadas de las células.
 METABOLISMO
• Anabolismo: Síntesis de macromoléculas
(cápsulas, membranas, proteínas, etc).
• Catabolismo: Degradación o rompimiento de
moléculas grandes (glúcidos, lípidos y
proteínas), se degradan para producir
moléculas más sencillas.
 PARA QUE SIRVEN!?
• Se entiende por identificación microbiana al
conjunto de técnicas y procedimientos que se
aplican para establecer la identidad de un
microorganismo.
 Métodos de identificación bacteriana
1. Métodos basados en criterios morfológicos
2. Métodos basados en tinción diferencial
3. Métodos basados en pruebas bioquímicas
4. Métodos basados en tipificación con fagos
5. Métodos basados en pruebas serológicas
6. Métodos basados en detección molecular
• En la mayoría de los casos la identificación no
se realiza con base a un solo método, sino a la
combinación de más de uno.
 Clasificación de pruebas by Gusti
• si el microorganismo es capaz de fermentar
azúcares
• la presencia de enzimas
• la presencia de estructuras (flagelos,
plasmidos)
 USO DE AZUCARES
Durante el proceso del metabolismo algunas
bacterias son capaces de reducir a los
carbohidratos a compuestos menos
complejos que pueden penetrar en el
interior de las células.
• Citrato
• Voges-Proskauer
• Rojo de metilo
• Movilida, Indol, Ornitina (MIO)
• Triple azúcar Herro (TSI)
• Agar Lisina Hierro (LIA)
• El más importante ciclo fermentativo de la
degradación de la glucosa es el ciclo de
Embden - Meyerhof aun cuando éste también
puede producirse por la derivación de
pentosa o el ciclo de Entner - Duodoroff
 CITRATO
• Es una sal del acido cítrico.
• Se detecta en el medio de citrato por la producción de
subproductos alcalinos.
• El medio contiene citrato de sodio, que es un anión,
como única fuente de carbono, y fosfato de amonio
como única fuente de nitrógeno. Las bacterias que
pueden utilizar el citrato también pueden extraer
nitrógeno de la sal de amonio, con producción de
amoniaco (NH+), lo que produce la alcalinización del
medio por conversión del NH a hidróxido de amonio
(NH4OH)
 VOGES- PROSKAUER
• El acido pirúvico, se metaboliza y da como
resultado la producción de acetoina y
cantidades pequeñas de ácidos mixtos.
• En presencia de oxigeno atmosférico e
hidróxido de potasio al 40%, la acetoina se
convierte a diacetilo. Y el a-naftol sirve de
catalizador para producir un complejo de color
rojo
 VOGES- PROSKAUER
• Medio de cultivo y reactivos:
• sc-naftol al 5%:. (intensificador de color)
a-naftol 5 g
Alcohol etilico absoluto 100 mL
• Hidroxido de potasio al 40%(agente oxidante)
 Procedimiento
Finalizada la incubación, transferir 1 ml del caldo
a un tubo de ensayo limpio. Agregar 0,6 ml de a-
naftol al 5%, seguidos de 0,2 ml de KOH al 40%.

Es esencial que los reactivos sean agregados en

ese orden. Agitar suavemente el tubo para
exponer el medio al oxigeno atmosférico y dejar
el tubo en reposo durante 10 a 15 minutos.
 Resultados
Positivo: desarrollo de color rojo 15 minutos o mas
después del agregado de los reactivos, que indica la
presencia de diacetilo, el producto de oxidación de
la acetoina.
La prueba no debe leerse mas allá de una hora
después de dejar los tubos en reposo, porque los
cultivos Voges-Proskauer negativos pueden
producir un color cobrizo, que se puede interpretar
como un positivo falso.
 ROJO DE METILO
El rojo de metilo es un indicador de pH con un
rango entre 6 (amarillo) y 4,4 (rojo). El pH al cual
el rojo de metilo detecta los ácidos es mucho
mas bajo que el pH correspondiente a otros
indicadores utilizados en medios de cultivo
bacteriológicos. Por lo tanto, para provocar un
cambio de color, el microorganismo en estudio
debe producir grandes cantidades de acido del
sustrato de hidratos de carbono que se utilice.
 Procedimiento
1. Sembrar el caldo MR/VP con un cultivo puro
del microorganismo en estudio. Incubar el caldo
a 35 °C durante 48 a 72 horas (no menos de 48
horas).
2. Finalizada la incubación, agregar 5 gotas del
reactivo de rojo de metilo directamente al caldo.
 Resultados
• Positivo: El desarrollo de color rojo estable en
la superficie del medio indica la suficiente
producción de acido como para disminuir el
pH a 4,4
• Negativo: Como otros microorganismos
pueden producir pequeñas cantidades de
acido del sustrato probado, puede observarse
un color naranja, intermedio entre amarillo y
rojo. Esto no indica una prueba positiva.
 INDOL
• La degradación del triptófano libera indol, ácido pirúvico,
amoniaco y energía. El ácido pirúvico puede ser
nuevamente metabolizado por medio del ciclo glucolítico o
entrar en el ciclo de Krebs para liberar CO2 y H2O y una
gran producción de energía.
• El NH3 puede ser utilizado para sintetizar nuevos
amioácidos.
• La prueba de indol se basa en la formación de un complejo
de color rojo cuando el indol reacciona con el grupo
aldehído de p-dimetilaminobenzaldehído (sustancia activa
del reactivo de Kovacs).
• La formación de indol se produce solamente en aquellos
organismos capaces de fermentar los hidratos de carbono
 Medios y reactivos
Caldo triptofano (triptofano al 1%)
• Peptona o digerido pancreatico de caseina (tripticasa) 2 g
• Cloruro de sodio 0,5 g
• Agua destila da 100 ml
Reactivo de Kovac
• Alcohol amilico o isoamilico puro 150 ml
• p-dimetilaminobenzaldehido 10 g
• HCI concentrado 50 ml
Reactivo de Ehrlich
• p-dimetilaminobenzaldehido 2 g
• Alcohol etílico 190 ml
• HCI concentrado 40 ml
 Procedimiento
Una vez transcurrido este tiempo, agregar 15
gotas del reactivo haciendo que se deslicen por
la pared del tubo.

Si se utiliza el reactivo de Ehrlich, este paso debe

ser precedido por el agregado de 1 mL de xilol.
Esto no es necesario con el reactivo de Kovac.
 Resultados
Positivo: Anillo rojo en la superficie del medio
Negativo: No se produce color /Color naranja en
la superficie del medio indica desarrollo de
escatol, un compuesto metilado que puede ser
precursor de la formación de indol.
 UTILIZACION DE ENZIMAS

• GELATINASA
• SIM/MIO
• HEMOLISIS
• UREASA
• OXIDASA
• CATALASA
 GELATINASA
Determina la capacidad de un organismo de producir enzimas
de tipo proteolítico (gelatinasas) que licuan la
gelatina.

Las proteínas que se producen naturalmente son demasiado

grandes para entrar en una célula bacteriana; por lo tanto,
para que una célula utilice las proteínas, primero deben ser
catabolizadas en componentes más pequeños. Las enzimas
exonucleares de tipo protelítico, gelatinasas, son
secretadas por ciertas bacterias para desdoblar a las
proteínas y esta capacidad ayuda a la identificación
bacteriana.
 PROCEDIMIENTO
• Consistencia del medio: Semisólido
• Inoculación: Picadura en posición vertical hasta
una profundidad.
• Condiciones de incubación:
Tiempo: 18 - 24 horas Temperatura: 35 - 37 ° C
• Al término de la incubación se coloca el tubo en
un refrigerador o baño de hielo durante dos
horas para determinar si se ha producido o no la
digestión de la gelatina (licuefacción).
 RESULTADOS
s/inoculo
POSITIVO
 SIM/ MIO
• SIM= sulfuro indol movilidad
• MIO= movilidad indol ornitina
La bacteria reacciona con el tiosulfato de sodio
del medio que da un sulfito y un sulfato, SH2.
El gas incoloro SH2 reacciona con una sal
(citrato férrico de amonio) para producir un
precipitado negro insoluble, sulfato ferroso.
 MIO
• Descarboxilación de ornitina: mide la
capacidad enzimática de un organismo para
descarboxilar un aminoácido para formar una
amina, con la consiguiente alcalinidad.
UREASA
 PROCEDIMIENTO
El medio es el urea.
La superficie inclinada del agar (pico de flauta)
se siembra en estría con el microorganismo. Se
incuba a 35 °C durante 18 a 24 horas.
 HEMOLISIS
• El agar sangre es una combinación de un agar
base (agar nutritivo) con fuente proteica, el
cual tiene un agregado de 5 % de sangre
ovina, (también puede usarse sangre humana,
para cultivos en una placa de Agar) con una
pequeña cantidad de hidratos de carbono
naturales.
 FUNDAMENTO
Se usa para ver la capacidad hemolítica de los
microorganismos patógenos (que es un factor
de virulencia). Observando los halos hemolíticos
alrededor de las colonias se determina el tipo de
hemólisis que posee:
• Alfa: halos verdosos
• Beta: halos incoloros
• Gamma: inexistencia de halos.
HEMOLISIS
 OXIDASA

• Los microorganismos que contienen la enzima

citocromo-c-oxidasa en su cadena
respiratoria, se evidencian porque en
presencia de oxígeno atmosférico y citocromo
c, se oxida el sustrato presente en los discos
(dimetil para fenilendiamina) a un compuesto
de color rosado a fucsia.
 Procedimiento
• Siembra
Puede realizarse cualquiera de estas 2 metodologías:
- Prueba en tubo: a partir de un cultivo puro del
microorganismo en estudio, hacer una suspensión densa en
0.2 ml de agua destilada estéril(aproximadamente Nº 2 de la
escala de Mac Farland), y agregar un disco de Oxidasa.
- Prueba en portaobjetos: humedecer el disco de Oxidasa con
una gota de agua y luego colocar sobre este una colonia del
microorganismo en estudio.
• Incubación
A temperatura ambiente, durante 1 minuto.
SIEMPRE PARTIR DE CULTIVOS DE AGAR NUTRITIVO! El resto
contiene azucares que modifican el ensayo
 METODOS DG RAPIDO
• API® 20 E fue el primer sistema de identificación
desarrollado que asociaba una galería de pruebas
bioquímicas y una base de datos
• Este sistema presenta las ventajas de ser rápido,
eficaz y de permitir realizar numerosas pruebas
a la vez. Cada tira de API 20E contiene 20
microtubos o pocillos con distintos sustratos
deshidratados. Cada tubo es una prueba
bioquímica distinta. La prueba número 21, la
oxidasa, se hace de forma independiente a la
tira.
Prueba Reacción / Enzimas Negativo Positivo
ONPG Beta-galactosidasa sin color amarillo
ADH Arginina deshidrolasa (parafina) amarillo rojo o naranja
LDC Lisina descarboxilasa (parafina) amarillo rojo o naranja
ODC Ornitina descarboxilasa (parafina) amarillo rojo o naranja
CIT Utilización del citrato verde azul oscuro o turquesa
sin precipitado
H2S Producción de H 2 S (parafina) precipitado negro
negro
URE Ureasa amarillo rojo o naranja
TDA Triptófano desaminasa amarillo marrón-rojo
color rosa o anillo rosa-
IND Producción de indol amarillo
rojo
Producción de acetoína (Voges-
VP sin color rosa-rojo
Proskauer)
GEL Gelatinasa sin difusión difusión de pigmento
GLU Fermentación/oxidación de glucosa azul o verde amarillo

MAN Fermentación/oxidación de manitol azul o verde amarillo

INO Fermentación/oxidación de inositol azul o verde amarillo

SOR Fermentación/oxidación de sorbitol azul o verde amarillo

RHA Fermentación/oxidación de ramnosa azul o verde amarillo

SAC Fermentación/oxidación de sacarosa azul o verde amarillo

MEL Fermentación/oxidación de melobiosa azul o verde amarillo

AMY Fermentación/oxidación de amigdalina azul o verde amarillo

ARA Fermentación/oxidación de arabinosa azul o verde amarillo

• A patir de una colonia bien aislada del microorganismo, hacer una
suspensión en 5 mL de solución salina (1% de NaCl) o 5 mL de agua
estéril.
• Llenar con la suspensión de bacterias los tubos, no la cúpula (cada
pocillo tiene un tubo y una cúpula, parte aerobia), de todos los pocillos.
• Llenar la cúpula de los pocillos CIT , VP, GEL con la suspensión de
bacterias.
• Cubrir con parafina las cúpulas de los pocillos ADH, LDC, ODC, URE, H2S
para obtener anaerobiosis.
• Poner la tira en su propia cámara húmeda de incubación. Previamente
poner agua en los alvéolos de la cámara para proporcionar una
atmósfera húmeda durante la incubación.
• Incubar a 37 °C durante 18-24 h.
• Tras la incubación se anotan los resultados inmediatos, es decir, los que
no requieren ser revelados.
•
• TDA
Añadir una gota de FeCl3 10 %.

• VP

Añadir una gota del reactivo 1 (KOH al 40%) y una gota del reactivo 2 (C2 H5 OH).

• IND

Añadir una gota de reactivo de Kovacs o de Dimetilamino-cinamaldehido.

• Oxidasa

Añadir una gota del reactivo (tetrafenilendiamina) recién preparado.

RESULTADOS
0104140 Shigella flexneri
0104452 Salmonella paratyphi A
0104504 Pasteurella multocida
0104521 Yersinia enterocolitica
0140004 Pasteurella multocida
0144042 Shigella boydii
0206042 Acinetobacter calcoaceticus
0210004 Achromobacter sp.
0210004 Alcaligenes faecalis
0210004 Alcaligenes sp.
0314000 Proteus mirabilis
0504512 Salmonella paratyphi A
0676001 Proteus vulgaris
0776000 Proteus mirabilis
1000004 Pasteurella sp.
1014743 Klebsiella ozaenae
1104112 Shigella sonnei
1214012 Yersinia pseudotuberculosis
1214773 Klebsiella pneumoniae
2206004 Pseudomonas aeruginosa
2504752 Salmonella spp.