CENTRIFUGA
La centrifugación se puede llevar a cabo a escala preparativa o escala analítica. La primera se
utiliza para aislar partículas para su aprovechamiento posterior y la segunda permite determinar
propiedades físicas como la velocidad de sedimentación o el peso molecular.
La centrifugación preparativa se utiliza para separar partículas según la velocidad de
sedimentación (centrifugación diferencial), la masa (centrifugación zonal) o la densidad
(centrifugación isopícnica). En el primer caso se obtiene un líquido sobrenadante y un materioal
sedimentado. En los otros dos casos las patículas se distribuyen en fracciones de diferentes
densidades de un fluido líquido (centrifugación mediante un gradiente de densidades).
Las partículas se pueden separar en función de la velocidad de sedimentación (centrifugación
diferencial), la masa (centrifugación zonal) o la densidad (centrifugación isopícnica). La
centrifugación zonal y la centrifugación isopícnica constituyen ejemplos de centrifugación
mediante un gradiente de densidades.
Hay diferentes tipos de centrífugas según el rango de velocidades de giro:
A. Centrífugas de baja velocidad, de sobremesa o clínicas. De pequeño tamaño y sin
refrigeración. Alcanzan una velocidad máxima de 5000 rpm. Son Útiles para la separación de
partículas grandes como células o precipitados de sales insolubles.
Las centrífugas micrófugas son una variante de las anteriores que permiten llegar a velocidades
de más de 10.000 rpm, Los volúmenes de trabajo son muy pequeños. Son útiles en el campo de
la biología molecular.
B. Centrífugas de alta velocidad. Alcanzan velocidades de entre 18.000 y 25.000 rpm. Son
refrigeradas y algunas tienen sistema de vacío para evitar el calentamiento del rotor a causa del
rozamiento con el aire. Son útiles en la separación de fracciones celulares, pero insuficientes para
la separación de ribosomas, virus o macromoléculas en general.
C. Ultracentrífugas. Superan las 50.000 rpm, por lo que tienen sistemas auxiliares de
refrigeración i de alto vacío. Hay ultracentrífugas analíticas que permiten la obtención de datos
precisos de propiedades de sedimentación (coeficientes de sedimentación, pesos moleculares), y
preparativas, útiles para aislar partículas de bajo coeficiente de sedimentación (microsomas, virus,
macromoléculas).
11.2.1 Centrifugación diferencial
Es el proceso que tiene como resultado la obtención de un sobrenadante y un material
sedimentado.
11.2.2 Centrifugación mediante un gradiente de densidades:
Este tipo de centrifugación es un proceso mediante el cual las partículas se distribuyen en
fracciones de diferentes densidades de un fluido líquido. El método es un poco más elaborado que
la centrifugación diferencial, no obstante presenta ventajas que compensan el trabajo añadido. La
técnica permite la separación de varios o todos los componentes de la muestra y la realización de
medidas analíticas. El método de gradiente de densidades implica la utilización de un soporte
fluido cuya densidad aumenta desde la zona superior a la inferior. El gradiente se consigue con
un soluto preferiblemente de baja masa molecular, de tal manera que la muestra a analizar pueda
ser suspendida en la solución resultante. Como solutos se utilizan la sacarosa, polisacáridos
sintéticos, derivados yodados del ácido benzoico, o sales de metales alcalinos pesados como el
rubidio o el cesio, entre otros. La muestra se deposita en la parte superior del gradiente como una
fina banda y, tras centrifugar, la separación de los componentes de la muestra se presenta como
diferentes bandas o zonas que pueden ser separadas (o fraccionadas).
Hay dos variantes de este método, la centrifugación zonal y la centrifugación isopícnica:
11.2.2.1 Centrifugación zonal
En la centrifugación zonal la muestra a analizar se deposita en la parte superior de un gradiente
de densidades previamente formado. A causa de la fuerza centrífuga las partículas se mueven a
velocidades que dependen de la masa y sedimentan en diferentes zonas del gradiente. La
densidad máxima del gradiente no ha de exceder a la de las partículas a separar.
11.2.2.2 Centrifugación isopícnica
La centrifugación isopícnica separa les partículas en un gradiente de densidades en función de la
densidad de las mismas. Las partículas se mueven en el gradiente hasta que llegan a un punto
donde la densidad de éstas i la del gradiente son idénticas (de aquí el nombre de ‘isopícnico’). En
este caso, es condición fundamental que la densidad máxima del gradiente final ha de exceder
siempre a la densidad de las partículas. Por este motivo la sedimentación final no se produce si
se controlan las condiciones de centrifugación, ya que las partículas flotan sobre un "colchón" de
material que posee una densidad superior a la de éstas. Esta técnica se utiliza, por ejemplo, para
separar partículas similares en tamaño pero de diferente densidad. En este sentido, la
centrifugación isopícnica es un método adecuado para separar ácidos nucleicos o diferentes
orgánulos celulares.
Aplicación
La centrifugación se utiliza para separar partículas en suspensión en el seno de un líquido o
partículas en disolución, siendo éste el caso donde se encuentran más aplicaciones. Así, se utiliza
habitualmente en biología ya que permite separar células, orgánulos subcelulares o
macromoléculas
Utillaje/Material
Independientemente del tipo de centrifugación que se vaya a utilizar, el elemento básico necesario
es la centrífuga. Una centrífuga consta de un motor, un rotor adaptado especialmente para
poner tubos de muestra y un compartimento donde está alojado el motor para aislarlo del exterior.
Cuando la velocidad de giro es muy elevada, este compartimento es totalmente estanco y se
refrigera para poder trabajar al vacío y evitar el calentamiento del rotor. Por otro lado, este recinto
suele estar blindado para evitar accidentes en caso de rotura del rotor
Montaje
Sólo se requiere que la centrífuga esté sobre una base sólida exenta de vibraciones y en un
espacio suficientemente amplio para que pueda ser manipulada sin problemas.
Procedimiento
a) Colocar el tubo de muestra (suspensión o disolución) en uno de los receptáculos del rotor.
b) Compensar el tubo de muestra colocando en el receptáculo diametralmente opuesto otro tubo
con un volumen de líquido de peso idéntico al de la muestra.
c) Cerrar herméticamente el compartimento del rotor y poner en funcionamiento la centrífuga. Una
vez acabada la centrifugación (normalmente las centrífugas tienen un temporizador que
desconecta automáticamente el motor una vez transcurrido el tiempo programado), esperar a que
se detenga el rotor para abrir la tapa del compartimento donde está alojado y sacar el tubo de
muestra y el de compensación.
La centrífuga ha de estar sobre una base sólida y fija.
El rotor ha de ser compatible con la centrífuga que se quiere utilizar y ha de estar perfectamente
fijado al motor.
La distribución de los tubos en el rotor ha de ser tal que éste esté perfectamente equilibrado
(compensado) para evitar vibraciones durante el giro y, por lo tanto, su rotura. Si es necesario, se
utilizan tubos adicionales con volúmenes de líquido de pesos idénticos a los de las muestras.
Los tubos han de ser compatibles con la centrífuga para evitar roturas durante el funcionamiento
de la misma.
La tapa que aísla el rotor del exterior ha de estar bien cerrada y asegurada.
Nunca se ha de dejar la centrífuga sin atención hasta llegar a la velocidad máxima de giro.
