Metabolismo del ARN

Dra. Ana Sotelo

31 de octubre de 2017
 Dogma central del ADN

Francis Crick, 1958

Durante la transcripción, la información génica de

una porción del ADN es copiada a ARN
La transcripción es más selectiva que la replicación

2
 Diferencias estructurales
entre el ADN y el ARN

ARN ADN

Composición Pentosa β-D-ribosa β-D-

química desoxirribosa

Base Adenina, guanina, Adenina,

citosina y uracilo. guanina,
Proporción variable citosina y
timina.
Proporción
constante de
A=T y de C=G
Estructura Cadena Una sola Dos cadenas
Por las funciones de cada
uno, el ADN es mucho Configuración Sin estructura Estructura
más estable que el ARN definida (excepto doble hélice,
ARNt) con
apareamientos
A=T y C=G
3
 Tipos de ARN

En la célula todos
los ácidos nucleicos
forman complejos
con proteínas

Funciones: almacenamiento y Los ARN especializados, con funciones

transmisión de la información génica regulatorias o catalíticas, son mayoritarios
Se denomina transcriptoma al conjunto de moléculas de ARN presentes en una
4 célula en determinado momento
Hebra codificante y hebra templado (o molde)

adenovirus

En general, solo una de las

dos hebras codifica proteínas
5
Síntesis de ARN
dependiente de ADN

 La transcripción (como la
replicación) usa un molde y tiene
polaridad (dirección de síntesis)

 No requiere cebador

Presenta fases:
• Iniciación  incluye unión al ADN
e inicio de la síntesis de ARN
• Elongación
• terminación

6
 Mecanismo de
transcripción

Además de molde, la
reacción requiere la
mezcla de
ribonucleótidos, Mg2+,
Zn2+

La ARN-polimerasa
agrega ribonucleótidos
en el extremo 3´-OH y
sintetiza ARN en
dirección 5´3´

ARN-polimerasa de E.coli

7
 Síntesis de ARN
dependiente de ADN

La ARN-polimerasa es más activa si

usa ADN bicatenario como molde
No requiere un cebador  el inicio
de la transcripción ocurre por unión
a secuencias específicas llamadas
promotores
El trifosfato en 5´ no se libera del
ARN naciente
Durante la síntesis se forma una
doble hélice híbrida (ADN-ARN)
temporal, de 8 pb  a medida que
la reacción procede, el ARN
naciente se separa del molde y el
ADN se reaparea ARN-polimerasa de E.coli 8
 Mecanismo de
transcripción

Para que comience la

transcripción, el ADN se tiene
que desenrollar
Durante la transcripción se
mantienen 17 pb desenrollados
= burbuja de transcripción
Se incorporan 50-90 nucleótidos
por segundo = elongación
El movimiento de la burbuja de
transcripción obliga al ADN a
ARN-polimerasa de E.coli superenrollarse por delante y
por detrás
9
 ARN-polimerasa procariota

subunida Mr Cantidad de Función

d subunidades en
la enzima
α 36 2 Iniciación de la cadena, interacción
000 con proteínas reguladoras y
elementos promotores

β 151 1 Iniciación y elongación de la cadena

000
β' 155 1 Unión al ADN
000
σ 70 1 Reconocimiento del promotor
000*
ω 11 1 desconocida
000

La subunidad σ se une transitoriamente al complejo

Holoenzima ARN-polimerasa de
núcleo
Thermus aquaticus 10
La subunidad σ de la ARN-
polimerasa procariota

Existen varias isoformas de la subunidad σ, dan la

especificidad de unión a distintos promotores

11
 Promotores:
secuencias de unión de la ARN-
polimerasa

Regiones variables de reconocimiento de la ARN-

polimerasa
ubicadas entre -70 a + 30 pb del inicio de
transcripción de un gen
Las más frecuentes: dos secuencias a -35 y -10 b
La subunidad σ se une al elemento UP El reconocimiento del promotor es el paso limitante
en la velocidad de transcripción
Cuanto más se parece un promotor a la secuencia
consenso, más eficiente es la transcripción
Las diferencias en las secuencias de los promotores
12 permiten regular la velocidad de transcripción
 Síntesis de ARN dependiente de ADN

La transcripción tiene
que estar regulada
 existen proteínas
que activan la
transcripción y
proteínas represoras
inhiben a la ARN-
polimerasa

La ARN-pol no tiene
actividad exonucleasa
3´5´ de corrección

La ARN-polimerasa
procariota no se disociaría
del ADN, sino que seguiría
buscando otro promotor
aguas abajo
13
 Inicio de la
transcripción:

La polimerasa (con el factor σ) se

une al promotor y forma un
complejo cerrado  el ADN se
desenrolla, se transforma en un
complejo abierto
Comienza la síntesis, la enzima
abandona el promotor, el factor σ se
disocia  etapa de elongación

ARN-polimerasa de E.coli
14
 Elongación de la transcripción:

La proteína NusA se une al

complejo, en reemplazo de la
subunidad σ
Cuando termina la
transcripción, NusA se separa
de la enzima, la enzima se
disocia del ADN y vuelve a
unir a la subunidad σ
La utilización de distintas
subunidades σ permite la
unión a distintos promotores
(distintos genes y distintos
procesos metabólicos en la
célula)

ARN-polimerasa de E.coli 15
Terminación de la transcripción:
mecanismo intrínseco o independiente de ρ

La ARN-polimerasa tiene alta procesividad  no se

disocia del templado hasta no terminar la síntesis
del ARN

La terminación de la
transcripción está indicada
por dos señales:
una secuencia
autocomplementaria que
permite al ARN naciente
formar una horquilla de 15-
20 pb, y, una secuencia de
tres residuos de A (que se
transcriben como U) cerca
del extremo de la horquilla

16
Terminación de la transcripción:
mecanismo intrínseco o independiente de ρ

17
Terminación de la transcripción:
mecanismo dependiente de ρ

- El ARN tienen una secuencia

rica en CA (elemento rut) de
unión a ρ

- ρ es una helicasa dependiente

de ATP que promueve la
traslocación de la proteína a
lo largo de la cadena de ARN
naciente

18
 ARN-polimerasa eucariota

La ARN-polimerasa bacteriana codifica para los tres tipos de

ARN (mensajero, ribosomal y de transferencia)
Es inhibida por el antibiótico rifampicina

rifampicina
Eucariotas tienen tres polimerasas, una para cada tipo de ARN
Son inhibidas diferencialmente por la α-amanitina
- ARN-polimerasa I (ARNt) resistente
- ARN-polimerasa II (ARNm) a bajas concentraciones
- ARN-polimerasa III (ARNr) a altas concentraciones
Amanita phalloides

19
 Diferencias entre la transcripción
en procariontes y eucariontes

Procariotas Eucariotas

El proceso es más simple El proceso es más complejo

Se puede transcribir todo el ADN en cualquier Solo se puede transcribir la eucromatina (cromatina
momento no condensada)
Se transcribe la mayor parte del ADN genómico No se transcribe todo el ADN genómico

Se transcriben regiones muy largas (exones e

intrones)
El transcripto primario es funcional El transcripto primario sufre un proceso de
maduración
Los ARNm se empiezan a traducir a medida que son Los ARNm deber ser transportados al citoplasma
sintetizados para participar en la traducción
Presentan un solo tipo de ARN-polimerasa Cada tipo de ARN tiene su propia polimerasa

La transcripción y la traducción son procesos La transcripción y la traducción no son procesos

simultáneos simultáneos
20
21
 ARN-polimerasa II

La ARN-polimerasa II reconoce múltiples sitios promotores

Uno de los más conocidos en eucariotas es la caja TATA  es

poco frecuente

22
 ARN-polimerasa II:
dominio carboxilo terminal (CTD)

Tiene 12 subunidades
La subunidad mayor, RBP1, tiene una
cola carboxilo terminal (CTD), que
tiene una secuencia de 7 aa –
YSPTSPS- repetidos muchas veces (27
en levaduras, 52 en humanos)

La ARN-pol II necesita, además,

varios factores de transcripción

23
 ARN-polimerasa II:
factores de transcripción adicionales (TFII)

24
Unión de la ARN-
polimerasa II y los
factores de transcripción
en el promotor
La proteína de unión a TATA (TBP)
se une al ADN  forman el
complejo cerrado
TFIIB y TFIIA se unen al complejo
TBP-ADN
Luego se unen TFIIE y TFIIH
TFIIH tiene actividad helicasa,
permite desenrollar al ADN se
forma el complejo abierto
Son más de 30 los factores (TF)
involucrados

25
ARN-polimerasa II:
etapas de la
transcripción

TFIIH también tiene actividad

quinasa y fosforila a los residuos S
del CTD
El grado de fosforilación del CTD
cambia a medida que progresa la
transcripción = elongación
Ahí se unen los factores de
elongación
Cuando se termina la transcripción
el CTD se defosforila

26
 ARN-polimerasa II:
etapa de la elongación

Cuando el complejo de
transcripción deja el sitio
de inicio, varios factores de
transcripción quedan
unidos al promotor

La actinomicina D inhibe la etapa

de elongación porque se intercala
entre las bases del ADN
27
 Maduración del ARN
Por corte y empalme (splicing) se
eliminan los intrones del ARN para
formar una secuencia continua que
codifique para un polipéptido
funcional

Los ARN mensajeros eucariotas también

se modifican en ambos extremos:
- 5’: se agrega un casquete
- 3’: se agrega una cola de poliA
El ARN se copia como un transcripto
primario, que contiene exones e intrones

28
Maduración del ARN

Los procesos de
maduración ocurren a
medida que el
transcripto primario se
sintetiza

El capping (agregado del

casquete en 5’) ocurre
durante la transcripción
El ensamblado (splicing)
puede ocurrir durante la
síntesis o después de la
liberación
29
 Adición del
casquete en 5’
(capping)

Un residuo de 7-metil-guanosina
se une al extremo 5’ del ARN, a
través de un enlace 5’,5’-trifosfato
El casquete protege de
ribonucleasas
Participa de la unión a ribosomas
para iniciar la síntesis proteica

Además, las dos primeras bases del ARNm

suelen ser metiladas
La metilación de bases está mediada por S-
adenosil-metionina
30
 Adición del casquete
en 5’ (capping)

El agregado del casquete ocurre luego

de que se genere un transcripto de 20-
30 residuos
El complejo de formación del casquete
se une al CTD de la ARN-pol II
Una vez agregado el casquete, este
complejo deja el CTD y se une una
proteína de unión del casquete (CBP)
que lo mantiene unido al CTD

31
 Exones e intrones

Los exones tienen una longitud de menos de 1000

nucleótidos (la mayor parte de 100 a 200), es decir, que
codifican para intervalos de 30-60 aminoácidos
El tamaño de los intrones varía entre 50 y 20.000
nucleótidos

Hay 4 tipos de intrones

Los tipo I y II realizan autocorte y empalme (self-splicing)

32
 Eliminación de intrones:
mecanismo del tipo I

Una molécula de guanosina actúa como

nucleófilo sobre el enlace fosfodiéster
El exón 3´habitualmente comienza con G
El intrón eliminado se degrada
Es un mecanismo presente en procariotas y
organelas
Catalizado por ribozimas 33
Eliminación de intrones:
mecanismo del tipo II

Una adenina en la secuencia intrónica

actúa como nucleófilo sobre la G
terminal (extremo 3´del exón 5´)
Luego el U ´terminal del exón 5´actúa
como nucleófilo, completando la
reacción

Mecanismo de procariotas y organelas

34
Eliminación de intrones:
mecanismo del tipo III
el espliceosoma

Los intrones de espliceosoma tienen secuencias

identificatorias de dos nucleótidos
El espliceosoma es un conjunto especializdo de
complejos ARN-proteínas, llamados pequeñas
ribonucleoproteínas nucleares (snRNP)
Cada snRNP tiene ARN de 100-200 nucleótidos,
los ARN nucleares pequeños (snRNA)

35
 Eliminación de intrones

El mecanismo de tipo III puede ocurrir asociado a

la transcripción: el espliceosoma puede unirse al
CTD de la ARN-polimerasa II

El mecanismo de tipo IV, para ARN de

transferencia, es por corte y unión directa de dos
segmentos de ARN, por acción de una
endonucleasa

Los mecanismos de tipo I y II se asocian a

organismos inferiores (procariotas) y organelas
derivadas de ellos

36
 Poliadenilación en 3’
Al final del transcripto se agrega una cola de
80-250 residuos de A
La cola de poliA protege al mensajero de la
degradación enzimática
La señal de corte está dada por la secuencia
AAUAAA, la ARN-pol II extiende la cadena más
allá de esa secuencia
Un complejo enzimático se asocial al CTD de la
ARN-polimerasa:
- Tiene actividad endonucleasa que reconoce la
secuencia AAUAAA y corta la cadena de ARN a
30 residuos
- La poliadenilato polimerasa agrega la cola de
poliA en el sitio de corte

37
Maduración del ARN mensajero:
proceso global

38
Maduración diferencial del ARN:
distinto patrón de poliadenilación

Mecanismo que permite la

diversidad de dominios variables
de las cadenas pesadas de las
inmunoglobulinas

39
Maduración diferencial del ARN:
ensamblado alternativo
(alternative splicing)

La mayor parte de los genes de los

mamíferos son pasibles de
ensamblado alternativo, por lo que
es mayor el número de proteínas
codificada por los genes

Ensamblado = empalme 40
Maduración diferencial del ARN:
ensamblado alternativo

41
Maduración diferencial del ARN:
ensamblado
alternativo

42
ARN ribosomal
en bacterias

El ARNr también se
genera a partir de un
precursor, el ARN
prerribosomal

43
 ARN ribosomal
eucariota

Un transcripto primario de 45S es

incorporado en el complejo
nucleolar 90
100 de los 14000 nucleótidos del
45S son metilados, y ocurren varias
otras modificaciones
Las reacciones de corte requieren
de ARN pequeños nucleolares
(snoRNA), que forman complejos
con proteínas snoRNPs

El ARN5S se sintetiza por la ARN-

polimerasa III
44
ARN pequeños nucleolares
(snoRNA)

Los snoRNAs asisten en

las modificaciones
postranscripcionales del
ARN ribosomal

El snoRNA de cajas C/D

guía la metilación
El snoRNA de caja H/ACA
guía la seudouridililación

46
 ARN de transferencia

La mayor parte de las

células tiene entre 40
y 50 ARNt distintos
Las células eucariotas
tienen varias copias
de los genes para
ARNt

Se procesan los extremos y se modifican algunas bases específicas

Los preARNt de eucariotas tienen un intrón que se elimina en el último paso

47
Micro ARN (miRNA)

ARN no codificante que interviene en

la regulación génica
Secuencias de 22 nucleótidos,
complementarios de determinadas
regiones de ARNm
Regulan la función del mensajero
cortándolo o inhibiendo su traducción
Existen miRNAs para 1/3 de los ARNm

48
 Ribozimas:
enzimas de ARN

 El sustrato habitual es el ARN

 Catalizan reacciones de hidrólisis (corte) y
de transesterificación (empalme)
 Están codificadas en secuencias intrónicas
 Tamaño entre 40 y 400 nucleótidos
 La estructura 3D es muy importante

49
 Degradación del
ARN mensajero
Uno de los niveles de control de
las expresión de genes es la
concentración celular de su ARNm
 importan la velocidad de síntesis
y la de degradación
La vida media del ARNm en
eucariotas es de 3h, en bacterias
de 1,5 min
En bacterias la degradación es por
endorribonucleasas seguidas por
exorribonucleasas 3´5´
En eucariotas inferiores primero se
acorta la cola de poliA, luego se
remueve el casquete en 5´, para
El exosoma es un complejo de 10 exorribonucleasas permitir la degradación desde 5´
implicado en la degradación desde 3´de ARNr, ARNt y
En eucariotas superiores es más
algunos ARN pequeños
importante la vía 3´ 5 50
 Polinucleótido fosforilasa

La PNP fue la primer polimerasa descubierta, en 1955

Es independiente de molde
Cataliza la síntesis de un polinucléotido a partir de
dinucleótidos fosfato (no NTPs)
La función probable de la enzima es la degradación de ARNm
51
 El dogma central revisado:
Síntesis de ADN y ARN a partir de ARN

52
Síntesis de ADN y ARN
dependiente de ARN

Característico de retrovirus, poseen una

enzima, la transcriptasa reversa

Propuestas en 1962 y halladas en 1970,

las RT son una prueba de que la
información genética puede ir “hacia atrás”

Las RT catalizan 3 reacciones:

- Síntesis de ADN dependiente de ARN
- Degradación de ARN
- Síntesis de ADN dependiente de ADN
Requieren un cebador = un ARNt
No tiene actividad correctora 3’  5’

53
Síntesis de ARN dependiente de ARN:
replicación del ARN
Algunos virus (fagos y virus
eucariotas) tienen genomas de
ARN monocatenario que también
funciona como ARN mensajero
Se replican en el huésped por
una ARN polimerasa
dependiente de ARN (ARN
replicasa)

54