LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
Práctica I: Espectrofotometría y curvas de calibración
Ayeisa Giseth López Mena
Wendy Vanessa Rojas Cortés
Isabella Palacio Gaviria
Lina María Osorio López
Carolina Velásquez Giraldo
Espectrofotometría y curvas de calibración
Introducción En esta técnica se mide la cantidad de luz absorbida
La espectrofotometría es una técnica de como función de la longitud de onda utilizada [1].
análisis muy utilizada cuyo fundamento se basa La absorción de las radiaciones ultravioletas,
en las proporciones resultantes entre la visibles e infrarrojas depende de la estructura de las
absorción de luz de un compuesto en moléculas, y es característica de cada sustancia
específico y su concentración. química.
Lo dicho anteriormente da preámbulo al La teoría ondulatoria de la luz propone la idea de
presente informe que tiene como objetivo que un haz de luz es un flujo de cuantos de energía
exponer y analizar el desarrollo experimental llamados fotones; la luz de una cierta longitud de
realizado en la práctica de espectrofotometría onda está asociada con los fotones, cada uno de los
y curvas de calibración, con el fin de generar cuales posee una cantidad definida de energía. El
mayor familiarización con ésta técnica la cual color que vemos en una muestra de solución se
es de gran importancia en el campo de la debe a la absorción selectiva de ciertas longitudes
microbiología y la ciencia. de onda de luz visible y transmitancia del resto
longitudes de onda. Si una muestra absorbe todas
Marco teórico. las longitudes de onda en la región visible del
La espectrofotometría es uno de los métodos espectro, aparecerá negro; si no absorbe ninguno
de análisis más utilizado que consiste en medir de ellos, aparecerá blanco o incoloro.
cuanta luz absorbe una sustancia química, Las longitudes de onda utilizadas en el laboratorio
midiendo la intensidad de la luz cuando un haz comprenden a la luz visible y ultravioleta.
luminoso pasa a través de la solución muestra,
basándose en la Ley de Beer-Lambert. Este Ley de Beer-Lambert
método aprovecha la absorción de radiación Esta ley propone que la absorbancia de una muestra
electromagnética en la zona del ultravioleta y a determinada longitud de onda depende de la
visible del espectro. La muestra absorbe parte cantidad de especie absorbente con la que se
de la radiación incidente en este espectro y encuentra la luz al pasar por la muestra.
promueve la transición del analito hacia un
estado excitado, transmitiendo un haz de
menor energía radiante.
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2. Espectro de absorción del sulfato Resultados
de cobre: Se prepararon tres cubetas,
cada una con 1.5 mL de solución de Espectro de absorción del sulfato de cobre:
sulfato de cobre al 1%; estas fueron
leídas por el equipo en las siguientes
REP. #1 REP. #2 REP. #3 PROMEDIO
longitudes de onda: 525, 560, 600, 635 y
( DO ) ( DO ) ( DO )
670 nm [Gráfica 1] [Tabla 2].
535 0,006 0,004 0,010 0,006
3. Construcción de la curva de
calibración: Se prepararon cinco tubos 560 0,0013 0,012 0,013 0,013
de ensayo con diferentes cantidades de
solución de sulfato de cobre al 1%, 600 0,040 0,039 0,045 0,041
algunos complementados con agua, para
que finalmente todos tuvieran un 635 0,089 0,088 0,096 0,091
volumen de 5mL y un tubo de ensayo 670 0,182 0,182 0,177 0,180
con 5mL de una muestra problema de
Tabla 1: Datos utilizados para realizar espectro de absorción
sulfato de cobre, con concentración
del sulfato de cobre al 1%.
desconocida que pasó a ser determinada
mediante una interpolación que es una
comparación en la gráfica a partir de la Espectro de absorción del sulfato de cobre:
curva de calibración. [Tabla 3]
A continuación se realizaron los cálculos
pertinentes para conocer la nueva
concentración de las muestras tras ser
diluidas algunas de ellas con agua
destilada, utilizando la fórmula
C1*V1=C2*V2. El siguiente paso fue
agregar 1.5 mL de solución de cada uno
de los tubos a una cubeta
correspondiente y realizar tres lecturas
de absorbancia con longitud de onda de
670 nm en forma ordenada para cada
cubeta. Finalmente se obtuvo el Gráfica 1
promedio de las mediciones, utilizado
para elaborar la curva de calibración.
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Conclusiones.
3. Henao Luis Eduardo. (2014). LEY DE
Fue posible evidenciar la capacidad BOURGUER-LAMBERT-BEER,
que tienen ciertas sustancias de DESVIACIONES A LA LEY DE BEER Y
absorber la luz y a su vez, se logró ERRORES EN ESPECTROFOTOMETRÍA.
observar cómo se comporta la curva Dirección Nacional de innovación.
espectral a medida que las longitudes Universidad Nacional de Colombia Sede
de onda cambian en una Bogotá.
concentración constante.
4. REAL ACADEMIA ESPAÑOLA:
Con la espectrofotometría es posible Diccionario de la lengua española, 23.ª ed.,
cuantificar una sustancia de interés [versión 23.2 en línea].
teniendo un estándar de referencia. <https://dle.rae.es> [Consultado 23 de
julio de 2019].
Es necesario encontrar la longitud de
onda de máxima absorción del analito 5. Yuhao Xiong, Linjing Su, Xingcun He, et
de interés, para poder cuantificar all. (2017). Colorimetric determination of
correctamente. copper ions based on regulation of the
enzyme-mimicking activity of covalent
Para cuantificar una muestra triazine frameworks. China: Hezhou
problema, la concentración debe estar University.
en el rango de la curva de calibración,
si está por debajo se debe aumentar el 6. J. Antonio, B. Emilio, F, Aurora, G. Jesús,
número de puntos de la curva, si está J. José, P. Fermín, T. Isaac, T.
por encima, se debe diluir la muestra. Espectrofotometría: Espectros de
absorción y cuantificación colorimétrica
Referencias: de biomolécu
en: https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-
mol/pdfs/08_ESPECTROFOTOMETRIA.pdf
1. Arenas Sosa Iván., López Sánchez Jose [Consultado 22 Julio 2019] Departamento
Luis. (2004) de Bioquímica y Biología Molecular.
ESPECTROFOTOMETRÍA DE Universidad de Córdoba, España.
ABSORCIÓN. Instituto de
Biotecnología. Universidad Nacional
Bibliografía:
Autónoma de México. Cuernavaca,
México.
J. Antonio, B. Emilio, F, Aurora, G. Jesús, J.
José, P. Fermín, T. Isaac, T.
2. Brunatti, C; Martín, A. Introducción a
Espectrofotometría: Espectros de
la Espectroscopía de Absorción
Molecular Ultravioleta, Visible e absorción y cuantificación colorimétrica de
Infrarrojo Cercano. Tomado de: biomolécu
https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-
http://materias.fi.uba.ar/6305/downloa
mol/pdfs/08_ESPECTROFOTOMETRIA.pdf
d/Espectrofotometria.pdf [Consultado
[Consultado 22 Julio 2019] Departamento
21 julio 2019]
de Bioquímica y Biología Molecular.
Universidad de Córdoba, España.
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