MICROSCOPÍA
Campo claro
Campo oscuro
Microscopio Óptico Contraste de fase
Fluorescencia
Confocal
De transmisión (MET)
Microscopio Electrónico
De barrido (MEB)
Microscopio de Fuerza Atómica
2
3
1) Microscopio de campo claro
Ocular (X10)
Objetivo
(X20, X40, X60, X100)
Muestra
Condensador
Fuente
L
Luz
4
1) Microscopio de Campo Claro
La muestra debe ser delgada (casi transparente) Fijación Tinción
Para aumentar la diferencia de contraste entre los microorganismos
y el medio en las muestras es necesario realizar tinciones.
Levaduras sin teñir Bacterias Tinción Gram
5
2) Microscopio de campo oscuro
Objetivo - Se coloca una placa opaca en el
condensador.
d d
- Solo los rayos
y reflejados
j o
Muestra
difractados entran al objetivo.
- Se obtiene una imagen con fondo
oscuro y la muestra iluminada.
Condensador
Placa Opaca - No es necesario fijar las muestras
Fuente
Luz
(Buen contraste entre la muestra y el
fondo)
6
FUNDAMENTO
Rayos No
Lente del Objetivo
Desviados
Rayos Desviados
por la muestra
Muestra
Lente del
Condensador
Placa Opaca
Fuente de Luz
7
Campo Claro vs. Campo Oscuro
Levaduras Chlamydomonas
8
3) Microscopio de Contraste de fase
- Se basa en el retraso de las ondas de luz al Anillo de fase
atravesar objetos de distintos índices de refracción
(densidades), aprovechando y amplificando dichos
retrasos.
- Convierte
C i t pequeñas ñ difdiferencias
i en ííndices
di d
de
Muestra
refracción variables y detectables por el ojo.
- Permite observar estructuras sin necesidad de
fijar las muestras. Condensador
- Las partes oscuras de la imagen corresponden a
las porciones densas de la muestra; las partes Disco Anular
claras de la imagen corresponden a porciones Fuente
menos densas Luz
9
3) Microscopio de Contraste de Fase
La luz,, al atravesar objetos
j con distintos índices de refracción,, experimenta
p retrasos
(desfases), sin embargo, estos no son tan notorios como para poder percibirlos.
El MCF, mediante el diafragma anular y el anillo de fase, acentúa dichos retrasos,
haciendo que zonas con distintos índices de refracción se traduzcan en una variación
de contraste la cual puede ser observado.
Se observan imágenes
con el fondo claro
(rayos no desviados) y
las muestras oscuras
rayos con limites bien
en fase -1/4
/ definidos.
-1/4
ANILLO DE FASE Objetivo Los rayos desviados se
cancelan con los no desviados
Discos transparentes
con un diseño en relieve
10
3) Microscopio de Contraste de Fase
Cél l Vi
Células Vivas
Microscopio
p de Microscopio
p de
Campo Claro Contraste de Fase
• No hay buen contraste con el fondo • Buen contraste de células con el fondo
• No se observan hay límites claros • Límites celulares evidentes (oscuros)
• No se distinguen estructuras internas • Se distinguen estructuras internas
11
4) Microscopio de fluorescencia
Filtro de emisión
Muestra
Condensador de
Campo Oscuro
Lámpara
p
Filtro de
excitación
12
MUESTRAS
- Pueden presentar autofluorescencia ó estar teñidas con fluoróforos:
- Anticuerpos
A ti conjugados
j d
- Hoecht (tiñe DNA)
- Expresión de proteínas de fusión fluorescentes (GFP)
- Pueden estar vivas o fijadas Microscopio Invertido
- Son exitadas excitadas a una longitud de onda y fluorescen emitiendo a una longitud
de onda mayor.
13
5) Microscopio confocal
- Las muestras deben estar teñidas
con fluoróforos o presentar
autofluorescencia
- Las muestras pueden estar vivas o
fij d
fijadas
- Las muestras son excitadas a una
longitud de onda y fluorescen
emitiendo a una longitud de onda
mayor.
- Solo
S l llos haces
h d
de lluz que pasan por
el foco llegan al detector.
- Se observan planos
planos.
14
5) Microscopio confocal
- Un Rayo Láser se hace pasar a través
del pinhole, este haz de luz pasa a
través del espejo y luego a través del
l t objetivo
lente bj ti ell cuall llo enfoca
f sobre
b lla
muestra.
- La
L luz
l emitida
itid por lla muestra
t es
recibida por el lente objetivo y
reflejada por el espejo.
- Esta luz pasa a través de la apertura
pinhole que no permite el paso de la
fluorescencia originada por los planos
fuera de foco.
- Sólo la luz del plano focal llega al
detector.
15
Al
Algunas Aplicaciones
A li i
1) Análisis de colocalización.
2) Inmunofluorescencias y detección de sondas.
3) Series Z (Reconstrucciones 3-D).
4) Time Series (Series Temporales).
5) FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching).
16
5) Microscopio confocal
1- Observación de una imagen desde el eje z.
2- Se registran imágenes correspondientes a diferentes planos xy.
3- Se reconstruyen imágenes de la muestra observadas desde los ejes x ó y.
17
5) Microscopio Confocal
Microscopia de fluorescencia Microscopia Confocal
Escherichia coli
18
6) Microscopio Electrónico de Transmisión (TEM)
- Se
S utiliza
tili un haz
h ded electrones
l t e imanes
i como lentes.
l t Fuente emisora
de electrones
-Los electrones se transmiten a través de la muestra (poca
penetración: aprox. 10 - 100 nm) Condensador
- Muestra extremadamente fina y de baja densidad
Contraste con el fondo débil.
Muestra
TINCIÓN: absorbe electrones y produce una imagen
más oscura de la región teñida (osmio, tungsteno,
plomo o uranio)
- Se ggenera vacío p
para evitar q
que los electrones colisionen con
Objetivo
los átomos del aire y se desvíen.
- Tratamiento de las muestras: Lente
- Fijación proyectora
- Corte con micrótomo/criofractura
- Tinción con sales de metales pesados. Pantalla
- No explora superficies. El haz de electrones incidente atraviesa la muestra observada
y los detalles finos o ultra-estructuras son capturadas en una pantalla (fósforo).
19
20
CARACTERÍSTICAS del MET
• Objetos
Obj t < 0.2
0 2 um (virus,
( i estructuras
t t celulares
l l iinternas,
t etc.)
t ) deben
d b observarse
b
por ME (no pueden ser discriminadas con la resolución del MO)
• El poder de resolución del ME es mucho mayor que el de los MO debido a que la
longitud de onda de los electrones es 100.000 veces menor que la de la luz visible.
• El contraste es el resultado de la dispersión diferencial de electrones por la
muestra. El ggrado de dispersión
p es función del número y masa de átomos en la
trayectoria de los electrones.
• Las células (mamífero y bacterias) son demasiado gruesas para ser examinadas
satisfactoriamente en preparaciones enteras
enteras. La observación de su estructura interna
exige que sean fijadas, deshidratadas, embebidas en plásticos y seccionadas (50 nm
aprox). Los cortes luego se tiñen con sales de metales pesados y se montan.
• En el MET los rayos X generados revelan la estructura interna, tamaño y
distribución de partículas, red cristalina, interfases y defectos puntuales de la red
atómica, etc.
• El MET permite estudiar la composición química de la muestra. Puede hacerse
un detallado estudio cristalográfico del material investigado.
21
6) Microscopio electrónico de transmisión (TEM)
Célula eucariota
Bacteria
(Brucella)
1 uM
22
7) Microscopio Electrónico de Barrido (MEB) ó
Scanning Electron Microscopy (SEM)
-Se utiliza un haz de electrones e imanes como lentes.
-Se genera vacío para evitar que los electrones colisionen con los átomos del aire y
se desvíen.
-Se captan los electrones emitidos por el objeto (no transmitidos).
-Tratamiento de las muestras:
-Fijación
-Deshidratación
-Cobertura con metales pesados.
-Se observan topologías de superficies.
23
24
La muestra es irradiada con
un haz muy estrecho de
electrones hace que la
muestra desprenda
electrones de baja energía
(secundarios) que pueden
ser recogidos sobre una
placa cargada positivamente
(ánodo) generando de este
modo una señal eléctrica
que es puede ser utilizada
para generar
p g una imagen
g de
la muestra.
El generador de barrido
hace que el haz de
electrones atraviese la
muestra siguiendo un
rastreo de barrido
25
7) Microscopio electronico de barrido (SEM)
Bacterias (Rhizobium)
Pelos
l radiculares
di l
26
7) Microscopio de Fuerza Atómica (MFA)
• Microscopio mecano-óptico
• Resolución < 1nm
• Registra la topología de la muestra
• FUNDAMENTO:
FUNDAMENTO Se S basa
b en la
l detección
d ió de
d las
l fuerzas
f atómicas
ó i (d l orden
(del d ded los
l
nanoNewton) ó moleculares de interacción entre una punta y la superficie del
material estudiado.
• El MFA ha sido esencial en el desarrollo de la nanotecnología
COMPOSICIÓN
• Cantilever: dimensión aprox. 200 um.
• Láser: La flexión del cantilever es registrado
mediante un haz láser (medición óptica) que se
refleja en su parte posterior para luego
alcanzar un fotodetector.
• Punta: cristal de forma piramidal o cónica
cónica.
Sus dimensiones bordean los 5 nm y 100 A de
diámetro.
27
7) Microscopio de fuerza atómica (MFA)
La muestra es movida en las tres direcciones,
mientras el cantilever traza la superficie de la
muestra en detalle
detalle.
Todos los movimientos son controlados por
una computadora.
d
La fuerza de interacción entre la superficie
p
de la muestra y la punta hacen que el
cantilever se flexione.
Un detector mide esta flexión conforme la
punta barre la superficie y con ello se
obtiene
bi un mapa topográfico.
áfi
28
7) Microscopio de fuerza atómica (AFM)
Algunos artefactos de la MFA
Muestra Imagen Muestra Imagen
29
7) Microscopio de fuerza atómica (AFM)
Proteína de unión a ADN (23 kDa)
ADN (500 pb)
30
Microscopía
Algunas muestras requieren de TINCIONES para ser
obser adas por un
observadas n determinado microscopio
¿Cuáles son las tinciones más comunes que podemos utilizar en
microbiología para observar y distinguir entre distintos
microorganismos?
31
TINCIONES
Catiónicos: se combinan con los constituyentes
celulares cargados negativamente tales como
ácidos nucléicos, polisacáridos ácidos y superficies
celulares. Ejemplos: Azul de metileno, Cristal
violeta,
l Safranina.
f
Colorantes Aniónicos: se combinan con los constituyentes
celulares cargados positivamente,
positivamente tales como
numerosas proteínas. Ejemplos: Eosina, Fucsina
acida y Rojo congo.
Liposolubles: se combinan con las sustancias grasas.
Ejemplos: Sudan negro.
32
Tinciones
Simples: uso de un solo colorante.
Positivas: Colorantes que Sirven para distinguir formas
formas.
tiñen al microorganismo
y no al medio. Diferenciales: uso de un colorante
iniciall y lluego un colorante
l d
de
contraste. Sirven para diferenciar
2 TIPOS distintos tipos de células (Ejemplo:
tinción Gram)
Negativas: Colorantes que no tienen afinidad por los
componentes celulares (Ejemplo: nigrosina). Tiñen al medio y
no a las bacterias, sirven para ver células con cápsulas de
mucopolisacáridos.
mucopolisacáridos
33
