UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MÉXICO
FES ZARAGOZA
QUÍMICA FARMACÉUTICO BIOLÓGICA
Laboratorio de Microbiología General I
Grupo. 2602
Asesor. Carina Gutiérrez
Informe. Pruebas Bioquímicas
Equipo. 6
Ayala Rivera Juan C
De los santos Páez Andrés
Gutiérrez Campos Nora A.
López Arrieta Meryt Karina
Resumen
En esta práctica se evaluaron y elaboraron pruebas bioquímicas con una bacteria
conocida ( Bacilluscereus) la cual fue utilizada como control y guía para la
identificación de una cepa desconocida mediante el uso de medios líquidos,
semisólidos y sólidos donde fueron evaluados cada uno de sus resultados y
comparados con el microorganismo conocido.
Objetivos:
1. Clasificar las diferentes pruebas bioquímicas según el tipo de reacción que se
lleva a cabo.
2. Interpretar las diversas pruebas bioquímicas considerando los resultados
falsos negativos y/o falsos positivos.
Diagrama de Flujo
RESULTADOS
1. Tinción de Gram
Descripción:
Gram: Gram negativa
Forma: Bacilos
Agrupación: Sin Agrupación aparente
2. Morfología Colonial
Morfología Colonial
Características Agar EMB Agar Sangre Salmonella-
Shigella
Tamaño Grandes -
Forma de colonia circular -
Borde de Colonia Entero -
Elevación convexa -
Superficie Lisa - No hubo
Luz transmitida Transparente - inoculación
Luz reflejada Brillante -
Color de la colonia Grisáceas
Textura cremosa -
Otras - -
3. PRUEBAS BIOQUIMICAS
FOTOGRAFIAS.
ALMIDÓN SIM
MIO
RF + GLUCOSA VP Fenilalanina
RM CITRATO
RF+
TSI LIA
GELATINA NUTRITIVA SACAROSA
UREA RF+MANITOL
1.1
OF BACILLUS
1.2
2.1
2.2
OF DESCONOCIDO
RESULTADOS DE PBQ
Cepa: Bacilluscereus
Prueba Resultado Practico Resultado Teórico
Utilización de Carbohidratos
Caldo RF + Glucosa POSITIVO
Caldo RF + Manitol NEGATIVO
Caldo RF + Sacarosa POSITIVO
KIA
O/F + GLUCOSA NEGATIVO FERMENTATIVOS
Crecimiento: Si
TSI Producción de H2S: NO
Ac/Ac
Prueba del IMViC
Indol NEGATIVO -
Rojo de metilo NEGATIVO
Voges- Proskauer NEGATIVO POSITIVO
Crecimiento: NO
Citrato
NEGATIVO POSITIVO
Degradación de Aminoacidos
LIA POSITIVO
Descarboxilación de la oritina
Desaminación de la fenilalanina NEGATIVO
Hidrolisis de
Urea POSITIVO (crecimiento)
Gelatina POSITIVO POSITIVO
Almidón Positivo POSITIVO
MIO
Producción de H2S POSITIVO
Indol NEGATIVO
Motilidad POSITIVO
Ornitina NEGATIVO
SIM
Producción de H2S NEGATIVO
Indol NEGATIVO
Motilidad NEGATIVO
otras Pruebas
Reducción de Nitratos POSITIVO POSITIVO
Catalasa POSITIVO POSITIVO
Cepa: Desconocida
Resultado Teórico
Prueba Resultado Practico
Para Salmonella
Utilización de Carbohidratos
Caldo RF + Glucosa POSITIVO POSITIVO
Caldo RF + Manitol POSITIVO POSITIVO
Caldo RF + Sacarosa POSITIVO POSITIVO
KIA No se realizó -
O/F + Glucosa NEGATIVO Negativo
Crecimiento: Si SI
TSI Producción de H2S: NO SI
Alc/Ac Alc/Ac
Prueba del IMViC
Indol POSITIVO POSITIVO
Rojo de metilo NEGATIVO POSITIVO
Voges- Proskauer NEGATIVO NEGATIVO
Crecimiento: NO NO
Citrato
NEGATIVO NEGATIVO
Degradación de Aminoacidos
LIA
Descarboxilación de la oritina POSITIVO POSITIVO
Desaminación de la fenilalanina NEGATIVO NEGATIVO
Hidrolisis de
Urea NEGATIVO NEGATIVO
Gelatina NEGATIVO NEGATIVO
Almidón Negativo NEGATIVO
MIO
Producción de H2S POSITIVO POSITIVO
Indol NEGATIVO NEGATIVO
Motilidad POSITIVO POSITIVO
Ornitina NEGATIVO POSITIVO
SIM
Producción de H2S NEGATIVO POSITIVO
Indol POSITIVO NEGATIVO
Motilidad NEGATIVO POSITIVO
otras Pruebas
Reducción de Nitratos POSITIVO POSITIVO
Catalasa POSITIVO POSITIVO
Índice de kappa
Pruebas bioquímicas Datos de la literatura
Resultado Positivo Negativo Total
Positivo 10 0 10
Datos Experimentales
Negativo 1 7 8
Total 11 7 18
U=(C1) (R1) =(11)(10)= 110
T=(C2) (R2) = (7)(8)= 56
R=U+T=110+56= 166
K=n (VP+VN)-R/n2 - R=18(10+7)-R/n2-R-= 0.89
∴el grado de concordancia es muy buena
ANALISIS DE RESULTADOS
LOPEZ ARRIETA MERYT KARINA Para la identificación de la bacteria primero se realizó la tinción de
Gram obteniéndose bacilos Gram negativos, esto indicó que podría pertenecer a las Entero
bacterias, para su identificación se realizaron las pruebas bioquímicas (PBQ) que indica la literatura
según el siguiente
recuadro:
Nota: Las única prueba que no se llevaron a cabo fue KIA ya que no se consideró esenciales
para su identificación, pues se realizó la prueba TSI.
Caldo RF + Glucosa, Caldo RF + sacarosa, Caldo RF + manitol:
En esta prueba se determina la capacidad de un m.o. para fermentar un hidrato de carbono,
en este caso glucosa, sacarosa y manitol. Si se genera ácido, y el pH llega a 6.8 o menos,
el indicador vira a amarillo, que fue lo que sucedió en los tres carbohidratos, y se reporta
un resultado positivo.
O/F:
En esta prueba se evalúa la oxidación del manitol, si es que el medio se torna amarillo,
gracias al indicador azul de bromotimol, en el tubo con tapón de aceite mineral y en el tubo
sin tapón sin embargo el color que presentaba el medio antes de inocular no era un color
característico, por lo que no se logró observar un resultado confiable y claro.
TSI:
El resultado fue Alc/Ac, se observó crecimiento, no hubo producción de gas y sihubo
producción de H2S, esto significa que el microorganismo es fermentador de glucosa pero
no de lactosa.
La producción de H2S indica que la bacteria tiene enzimas que provocan la liberación sulfuro
(S2-) del tiosulfato de sodio, el cual después se acopla con el ion hidrógeno para formar H2S,
que se detecta gracias al sulfato ferroso, ya que forman sulfuros de metales pesados que
parecen como un precipitado negro.
Pruebas IMViC
Prueba RM: Se obtuvo un resultado negativo, lo que significa que NO hubo fermentación
de la glucosa por la vía ácido-mixta y por tanto no produjó suficiente ácido para mantener
el pH del medio por debajo de 4.4, y al agregar el indicador (rojo de metilo) no cambio a
una coloración amarilla.
Prueba Vogues Proskauer: Al no tornarse en medio rojo, significa un resultado negativo,
como era de esperarse, ya que las Enterobacterias Vogues Proskauer negativas, son rojo
de metilo positivo y viceversa. Esto indica que indica que no se produjo acetil-metil-
carbinol (acetoína), que a su vez no se convirtió a diaetilo, por la acción del KOH y el
oxígeno atmosférico, y por lo tanto no formo el complejo por la acción de α-naftol, y no se
dio la cloración roja.
Citrato de Simmons: se obtuvo un resultado negativo, lo que indica que el m.o. NO
puede utilizar el citrato como fuente de carbono.
Indol: Se obtuvo un resultado positivo
Caldo nitrato:
Se obtuvo un resultado positivo, por lo tanto esta prueba confirmó que la bacteria en
cuestión pertenece a la familia de las Enterobacterias.
Fenilalanina desaminasa:
Se obtuvo un resultado negativo, ya que no hubo un cambio de color al agregar el reactivo
cloruro férrico, por lo tanto el m.o. no tiene la enzima fenilalanina desaminasa que
desamina la fenilalanina (un aminoácido), y no se produce el ácido fenilpirúvico
Catalasa:
Cuando se agregó H2O2, indico un resultado positivo, y significa que el peróxido de
hidrogeno se convirtió en agua y en O2.
GUTIÉRREZ CAMPOS NORA ATZIN.
En cuanto a los resultados obtenidos para la identificación de una cepa bacteriana
desconocida se realizó inicialmente la técnica de tinción de Gram siendo esta una técnica
diferencial que clasifica las bacterias de acuerdo a la composición de la pared celular. En
este caso la bacteria que se tenía presentaba una coloración rojiza lo que indicaba ser
ungram - negativo con forma de bacilo, posicionándola en la familia de las enterobacterias.
Al determinar el gram se continuó con la selección de medios de cultivos específicos para
gram-negativa con el objetivo de sembrar mediante aislamiento para la identificación de la
morfología colonial.
En este proceso solo se logró apreciar el crecimiento en agar EMB y se observaron
parámetros como tamaño de las colonias el cual fue grande, forma circular, margen o borde
entero, con elevación convexa, luz brillante y translucida, consistencia cremosa y coloración
grisácea mientras que en otros medios no se logró una correcta inoculación.
Por otro lado, al aplicar las pruebas bioquímicas de obtuvo que la cepa desconocida es
fermentadora de carbohidratos como son la sacarosa, glucosa y manitol, sin embargo,
dentro de la prueba O/F se logra distinguir fugazmente que no crea una reacción oxidativa
de la glucosa.
Para la degradación de aminoácidos se realizaron las pruebas LIA, MIO y fenilalanina, en
las cuales se apreció la descarboxilación de la ornitina, sin embargo, no hubo una
desaminación de la fenilalanina por endeno se produce el ácido fenilpirúvico, más en
cambio produce nitrito a partir de nitrato por una reacción de reducción. Seguido de esto se
realizó también las pruebas para identificar la hidrólisis del almidón, urea y gelatina, en las
cuales para todas se obtuvo un resultado negativo. En la prueba para TSI el resultado fue
Alc/Ac, sin producción de gas ni producción de H2S dando a entender que el
microorganismo no cuenta con las enzimas necesarias para liberar el sulfuro del tiosulfato
de sodio detectado por el sulfato ferroso, lo que indica que el microorganismo es
fermentador de glucosa, pero no de lactosa.
Finalmente, para la identificación de la especie se realizó las pruebas IMViC, en las cuales
se logró apreciar;
-Voges Proskauer: Resultado negativo, indicando que no hay producción deacetoína (acetil-
metil-carbinol), por lo que no se lleva a cabo la reacción de la formación de complejos con
los reactivos KOH y α-naftol.
-Rojo de Metilo: Resultado negativo, indicando la ausencia de fermentación de la glucosa
por la vía ácido-mixta y así inhibiendo el ácido que mantiene un pH ácido.
-Citrato de Simmons: Resultado negativo, indicando que la bacteriano puede utilizar el
citrato como fuente de carbono.
-Indol: Resultado positivo, indicando que la bacteria tiene la capacidad de producir el
encima triptófano que desdobla el aminoácido triptófano en indol, acido pirúvico y amonio.
Ayala Rivera Juan Carlos
El primer paso para la identificación de la cepa desconocida fue llevar a cabo de la tinción
de Gram, en la cual se observaron bacilos Gram negativos por la presencia de estructuras
un poco alargadas y que se tiñeron de color rosa. Esta tinción tiene como utilidad reducir el
grupo en el que se va a inclinar la búsqueda y comparación posterior de resultados de las
pruebas bioquímicas, ya que puede haber resultados de Gram positivos y Gram negativos.
En los positivos y negativos pueden observarse bacilos o cocos y para cada resultado la
interpretación es distinta en las pruebas bioquímicas. Para este caso (bacilos Gram
negativos) se intuyó que se trataba de alguna enterobacteria,
En las pruebas de degradación de carbohidratos se observó que los caldos cambiaron de
color ojo a amarillo, lo cual indica que la cepa de bacterias fue capaz de degradar glucosa,
manitol y sacarosa como fuente de carbono.
En las pruebas IMViC primero se llevó a cabo la lectura de los resultados del medio Citrato
de Simons debido a que esta prueba corre el riesgo de presentar un error de lectura debido
a que el citrato prueba la capacidad de ser utilizado como única fuente de carbono. Se
obtuvo un resultado negativo por la coloración verde característica.
La prueba Rojo de metilo Voges Proskauer presentó un resultado negativo, por lo tanto se
descarta la posibilidad de que la bacteria fuera productora de acetoina y de que fermentara
la glucosa para así producir algún ácido o ácidos.
En el tubo de fenilalanina se observó un resultado negativo, aun después de la adición de
cloruro férrico, esto quiere decir que no hubo desaminación por parte de la bacteria
inoculada.
Para las pruebas de hidrólisis se obtuvieron resultados negativos en almidon,urea y
gelatina, ya que no fue posible la degradación del almidón y se observó el tubo sin cambio
de color, así como también un color morado en el pico. El tubo de gelatina nutritiva
permaneció en forma un tanto rígida, es decir, la consistencia fue igual que al inicio lo que
cual quiso decir que no hubo producción de gelatinasa para poder licuar la gelatina. En la
prueba de urea no hubo cambio de tonalidad, lo que indica un resultado negativo(a
diferencia del positivo que presenta color rosa), esto indica que no se logró romper la urea
para producir amoniaco y de esta manera hubiera un cambio de tonalidad por la basicidad.
Además, se observó que la bacteria tuvo movilidad en MIO, pero no en SIM, lo cual puede
considerarse que hubo una mala lectura en alguno de los tubos y por la punción que se
realiza con el asa, pudo haberse movido y parecer que si había motilidad.
De los santos Páez Andrés
Para la caracterización y diagnóstico de la bacteria, se realizó un frotis y elaboro tinción de
gran al microrganismo, de esta forma se observó un microorganismo gran negativo en forma
de bacilo, sin agrupaciones, de acuerdo al resultados inicial se esperó un resultado positivo
y confirmativo para una entero bacteria por medio de la pruebas bioquímicas elaboradas,
la pruebas definitivas para dicha especulación fueron la pruebas IMViC puesto que la
mayoría de los resultados coincidieron con la bacteria, debido que IMViC son una serie de
prueba para el diagnóstico de enterobacterias, el resultado más acertado para esta fue
salmonella con respecto a pruebas de degradación de carbohidratos, todas fueron positivas
debido al poder y capacidad fermentativa de la bacteria y en las pruebas de hidrolisis y
degradación de aminoácidos los resultados fueron variantes pero asertivos para el
diagrama de diagnóstico, lo cual en determinadas pruebas se comprobó la capacidad
enzimática de la bacteria para hidrolizar, desdoblar ciertos sustratos. Aunque el resultado
del índice de KAPPA resulto con una buena asertividad, se considera que la pruebas deben
de ser realizadas por cada diagnóstico por lo menos en duplicado para eliminar en cierta
parte problemas sistemáticos y del analista, ya que en veces la interpretación de los medios
es mal interpretada y de esta forma puede compararse y eliminarse la variabilidad de
interpretaciones, así también es necesario contar con una cepa control con un diagnostico
conocido en cada prueba para comparar resultados positivos y negativos.
Conclusión.
López Arrieta Meryt Karina
Debido a la forma vista en la tinción de Gram (Bacilos, Gram negativos, sin agrupación
aparente), los resultados obtenidos en las pruebas bioquímicas comparadas con la teoría y
el índice de kapa obtenido, se sospecha que el Género de la bacteria es Salmonella sin
embargo se hubiera esperado un crecimiento de UFC en los medio Salmonella shigella y
Agar sangre sin embargo no fue asi, ya que no hubo crecimiento aparente debido a que
pudo haberse realizado un mal sembrado por falta de inoculo al momento de la toma de
muestra, así como también se cree que pudo haber afectado el exceso de agua de
condensación con la que fueron encontraron los medios.
GUTIÉRREZ CAMPOS NORA ATZIN.
Debido a que las pruebas bioquímicas ayudan en la determinación e identificación de una
bacteria desconocida gracias a la tipificación en la que se encuentran dado que permite
conocer las actividades metabólica y enzimática de los microorganismos, estas son
utilizadas para la identificación de cepas desconocidas que llegan a causar alguna
enfermedad. Gracias a la tinción de Gram se pudo empezar a clasificar a la bacteria
desconocida, descartando a las que no son Gram negativas, con forma de bacilos cortos,
una vez terminada la clasificación se aisló para ver la morfología colonial y con esto reducir
aún más el género de la bacteria que ya se intuía hasta conjeturar la especie por medio de
las pruebas IMViC, dando como resultado de la cepa desconocida como Salmonella typhi,
sin embargo ya que no se logró apreciar un crecimiento en el medio Salmonella-Shigella no
se puede asegurar al cien si es dicha bacteria ya que el sembrado se pudo ver afectado por
distintos factores.
Conforme a los resultados positivos en comparación a los totales en la práctica se obtuvo
un índice de Kappa muy buena.
Ayala Rivera Juan Carlos
Con base a los resultados observados en cada una de las pruebas, en la tinción de Gram
y en los medios inoculados, se pudo inferir que el género de la cepa era Salmonella sp,
aunque no se obtuvo crecimiento en el medio Salmonella-Shigella, esto pudo deberse una
toma de muestra errónea principalmente, puesto que en este medio el crecimiento de
Salmonella sp o Shigella sp es bastante notorio. La determinación del género se vio
apoyada por el índice de kappa, el cual muestra la concordancia del valor teórico y práctico
para así saber que tan buena es dicha concordancia y probar de alguna manera que los
resultados cualitativos son confiables.
De los santos Páez Andrés
La pruebas bioquímicas son de gran ayuda para la caracterización y tipificación de cepas y
microrganismos desconocidos y aunque el diagnostico no sea cien por ciento seguro
existen procedimiento para aumenta la fiabilidad de estos, como lo es el índice de KAPPA
el cual a base diagnósticos verdaderos, y falsos positivos genera una probabilidad de
asertividad y fiabilidad para el diagnóstico de la cepa.
Bibliografía:
1. Mc Faddin J.F., Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia
2. Madigan M.T, Martinko J.M., Dunlap P.V. and Clark D.P., Brock Biología de los
microorganismos, 12a edición, UK, Pearson Education, 2009.
3. Prescott L.M., Harley J.P. and Klein G.A., Microbiología, 3a edición, Madrid, México, Mc
GrawHill-Interamericana, 2009.
