Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

UNIVERSIDAD VERACRUZANA

Universidad Veracruzana

FACULTAD DE BIOANALISIS
REGION VERACRUZ

MAUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA EL

LABORATORIO DE LA E.E.
MICROBIOLOGÍA GENERAL

AUTORES:
MIE Elba Celia Ramos
Mtra. Teresa de Jesús Lagunes Torres

Microbiología general
Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

UNIVERSIDAD VERACRUZANA

FACULTAD DE BIOANÁLISIS

QUÍMICA CLÍNICA

MICROBIOLOGIA GENERAL

MANUAL DE PRACTICAS

ALUMNO:
LANDA FERMAN CHRISTIAN ALEXIS

DOCENTE: SARA ORTIGOZA GUTIERREZ

Microbiología general
Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

INTRODUCCIÓN

La microbiología es la ciencia que estudia los microrganismos que no se observan

a simple vista, (bacterias, hongos, parásitos, virus) estos desempeñan diversos
efectos que pueden ser protectores o provocar serios problemas de salud, tanto en
el reino animal como el vegetal alertando los ecosistema y provocando un gran
impacto en el humano.

El incremento del crecimiento de las poblaciones en los países subdesarrollados y

desarrollados, los avances tecnológicos, la industrialización de productos de
consumo humano animal y el uso de los químicos ha incrementado las
enfermedades como la tuberculosis, VIH/SIDA, la influenza,VPH, Neumonías,
cáncer y principalmente los procesos degenerativos etc. Los cuales son hasta el
momento incontrolables por los mecanismos de transmisión provocados por la falta
de información y deficiente cobertura delos sistemas de salud en algunas zonas del
país lo que ha traído como consecuencia que los profesionales de la salud como el
químico clínico, apoyen los diagnósticos presuntivos mediante técnicas
actualizadas y eficaces que permitan controlas la morbilidad y mortalidad tan
frecuente que se presenta por la presencia de estos microrganismos y ofrecer al
paciente una mejor calidad de vida.

La microbiología general forma parte del plan de estudios de la licenciatura de

química clínica, se imparte 4 horas de laboratorio y tres de teoría es disciplinar, y
durante el proceso enseñanza aprendizaje el alumno adquirirá los conocimientos
teórico- práctico para (aislar e identificar)a los agentes etiológicos de la probable
patología . Aprenderá a desarrollar habilidades para caracterizar la gran diversidad
de microorganismos. Aplicara las metodologías adecuadas de identificación,
crecimiento, metabolismo y reproducción. El plan de estudios del químico clínico
está enfocado a la clínica que incluye el campo de las bacterias, dentro del
programa se considera y se observa el efecto ocasionado por agentes físicos,
químicos y antimicrobianos.

Los contenidos permitirán al estudiante contar con fuentes de información

relacionadas con las diversas entidades clínicas ocasionadas por microorganismos
patógenos así mismo reforzará el aprendizaje teórico con la realización de las

Microbiología general
Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

prácticas y reportara sus observaciones, lo cual será utilizado como estrategia de

evaluación, elaboración de ensayos , trabajos de investigación y evaluación escrita,
apoyándose con herramientas computacionales, consulta de textos en inglés ,
actuando con responsabilidad y honestidad para ser agente de cambio en beneficio
de la sociedad.

El manual de prácticas del Laboratorio de Microbiología General, tiene como

objetivo:

Que el estudiante cuente con el material didáctico de apoye que le permita

realizar el aislamiento , identificación y caracterización de los
microorganismos( bacterias, hongos y parásitos mediante las metodologías
experimentales realizadas en el laboratorio, reafirmando los conocimientos
teóricos acerca de esta área del conocimiento y su aplicación en los diferentes
ámbitos de la ciencia

Los alcances de la microbiología son tan amplios, que es necesario que en

esta experiencia educativa aborde las metodologías básicas mínimas
necesarias que sean aplicativas a todas las áreas de la microbiología general,
las cuales serán reforzadas en los siguientes periodos del área de formación
del plan de estudio de la licenciatura de Química Clínica. El presente manual
está integrado por 12 prácticas de laboratorio que a su vez se subdivide en
contenidos, que dan lugar a actividades que permitirán al estudiante cumplir
el objetivo planteado para este curso.

En cada práctica se redacta una introducción, que contempla el marco teórico,

la metodología de la determinación, apartados que permiten dar las bases
teóricas e incluye los requerimientos para la realización de cada práctica,(
reactivos, equipo de laboratorio, material de vidrio, material biológico)lo cual
permitirá agilizar las, actividades que se van a realizar, se anexa un apartado
del sistema de medición, en donde se dan indicaciones específicas de la forma
de trabajar y de las técnicas o procedimientos de cada una de las prácticas
para que el alumno las lea con anticipación y favorecer el aprendizaje de la
práctica que se va a realizar , se anexa apartados para la observación
analítica, el análisis de la información , habilidades y receptivos en sus
interpretaciones, resultados, redacción de observaciones, conclusiones y
respuestas adecuadas de los cuestionarios.

Microbiología general
Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

RECOMENDACIONES:
Usos del sistema de medición, confiabilidad analítica, lo que permitirá que el
estudiante aplique control de calidad en ésta área del conocimiento de la
Microbiología General disciplina esencial para la formación en integración del
conocimiento del egresado de químico clínico en la corroboración del diagnóstico
bajo sospecha clínica , donde los microorganismos(bacterias, virus, hongos y
parásitos son los principales agentes etiológico de la patología no solo de los
humanos sino de la gran mayoría de los seres vivos con quién compartimos
nuestras vidas, y que son la causa de las altas tasas de morbilidad y mortalidad.

Cada práctica está sustentada con su bibliografía

ÍNDICE
CONTENIDO

Microbiología general
Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

INTRODUCCIÓN
NORMAS GENERALES DE TRABAJO EN EL
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
MATERIAL DE LABORATORIO
MICROSCOPÍA
a) Microscopía de campo claro
b) Microscopía de campo oscuro
c) Microscopía de contraste de fase
d) Microscopio de fluorescencia
TÉCNICAS DE TINCIÓN
a) Método húmedo
b) Método fresco
c) Fijación de bacterias tomadas de medio de cultivo
d) Fijación de bacterias tomadas de exudado
TÉCNICAS DE TINCIÓN
a) Tinción simple
b) Tinción de Gram
c) Tinción de Ziehl – Neelsen
MORFOLOGÍA CELULAR
ESTERILIZACIÓN
MEDIOS DE CULTIVO
AISLAMIENTO Y CULTIVO DE
MICROORGANISMOS
a) Aislamiento por estrías en placa (Morfología colonial)
b) Resiembra por estrías en tubo inclinado
c) Resiembra en medio líquido
d) Resiembra por picadura en medio semisólido

Microbiología general
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INFLUENCIA DE LOS FACTORES AMBIENTALES

SOBRE EL CRECIMIENTO BACTERIANO
a) Efectos de la temperatura
b) Efectos de la presión osmótica
c) Efectos del pH
EFECTOS DE LOS AGENTES QUÍMICOS SOBRE
EL DESARROLLO BACTERIANO
a) Acción de los metales pesados
b) Acción de halógenos, álcalis y alcoholes
CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS
a) Cuenta de colonias por dilución
b) Recuento de microorganismos por turbidimetría
c) Recuento de microorganismos por el método del asa
calibrada

PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD A LOS

ANTIMICROBIANOS
a) Método de difusión en placa

PRUEBAS BIOQUÍMICAS
a) Prueba de la catalasa
b) Prueba de la oxidasa
c) Pruebas en el medio de SIM
d) Pruebas en el medio de Kligler
e) Prueba en el medio de Citrato de Simmons
f) Reacción de la ureasa
g) Pruebas en el medio de LIA
h) Pruebas en el medio de MIO
i) Prueba de Voges - Proskauer

Anexos

Microbiología general
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NORMAS GENERALES DE TRABAJO EN EL

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

El laboratorio de Microbiología debe contar con una infraestructura óptima para la

realización de las metodologías necesarias para el procesamiento de las técnicas
de aislamiento e identificación de los diferentes microorganismos. Y mantener las
condiciones de asepsia, utilizando de ser posible (campanas o en la proximidad de
la llama de una lámpara de alcohol o mechero). Lo cual permitirá la obtención de
resultados confiables en su proceso analítico y proporcionar al paciente un
resultado verídicos. NOTA: Aunque los microorganismos que se manipulen no se
consideren patógenos el manejo inadecuado estará directamente relacionado con
el tipo de:

1. Los agentes, sustancias y productos peligrosos que se localicen en el

laboratorio
2. La metodología de trabajo del laboratorio
3. El equipamiento del laboratorio
4. Medidas a tomar en caso de emergencia
5. Reglas relacionadas con la seguridad biológica

Siempre que se trabaje en el laboratorio es necesario:

1. Restringir la presencia de los microorganismos en estudio a sus recipientes y

medios de cultivo para evitar el riesgo de contaminarse uno mismo o a un
compañero
2. Evitar que los microorganismos ambientales( presentes en piel, pelo, aire,
ropa, etc.) contaminen nuestras muestras

Para que se produzca un accidente por agente biológico deben ocurrir básicamente
cuatro elementos:
1. un huésped susceptible

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2. un agente infeccioso
3. una concentración suficiente de éste
4. una ruta de transmisión apropiada
De todos ellos, el que mejor se puede controlar en el laboratorio es la ruta de
transmisión más comunes en el laboratorio son el área y la inoculación directa, muy
por encima de todas las demás, aunque la oral, la percutánea y el contacto directo
con la piel o las mucosas también son posibles.

Para controlarlo es obligatorio en cualquier laboratorio de microbiología respetar las

siguientes reglas:

MEDIDAS GENERALES DE SEGURIDAD

1. El acceso al laboratorio estará limitado al personal autorizado (alumnos y
docente de la sección correspondiente)
2. Cuando se realizan las practicas, no deben entrar con el alumno al
laboratorio familiares ni amigos
3. Entrar al laboratorio en forma ordenada, dejar las carteras, libros y otros
objetos personales en el lugar que se les indique
4. Antes de asistir al laboratorio, deben leer el fundamento y las actividades a
realizar, para así evitar posibles accidentes
5. Durante la práctica las puertas y ventanas deberán permanecer cerradas y
los ventiladores y clima apagados para mantener la adecuada contención
biológica.
6. Todas las superficies de trabajo se limpiaran y desinfectaran antes y
después de la práctica y siempre que se produzca un derrame.
7. Es importante conocer el manejo de todos los equipos y reactivos a emplear
antes de iniciar las actividades indicadas en la práctica. Si tiene alguna duda
diríjase al profesor
8. Mantener mesas de trabajo libres de libros, cuadernos u objetos personales,
excepto aquellos equipos y materiales necesarios para la realización del trabajo
práctico.
9. Todo el material no contaminado como algodón (tapones de tubos de
ensaye, matraces etc.), papel cerillos etc. deben ser depositas en el bote de
basura municipal. No se debe tirar basura en el suelo ni en la tarjea.
10. Para deshacerse de material contaminado (hisopos, guantes, torundas,
expectoraciones, exudados, etc.) se utilizan bolsas de polietileno de color rojo
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traslucido marcadas con el símbolo de riesgo biológico y leyenda RPBI (las

bolsas deberán llenarse como máximo al 80%).
11. Las cajas petri de plástico con medios de cultivo contaminados se
recomienda someterlos a tratamientos que los vuelven no infecciosos
(esterilizar) antes de disponer de ellos en la bolsa de residuos (roja).
12. Los objetos punzocortantes contaminados (cristalería de laboratorio roto,
portaobjetos cubre objetos, pipetas Pasteur) deberán ser desechados en los
recipientes rígidos de polipropileno rojos marcados con el símbolo de riesgo
biológico y leyenda RPBI
13. Nunca se debe tirar algo contaminado por tarja o a la basura municipal.
14. Tener cuidado con el alcohol cuando manipule el mechero
15. Emplear técnicas asépticas para el manejo de cultivos de microorganismos
16. Nunca inhale, deguste o huela imprudentemente reactivos o medios de
cultivos
17. El transporte de las muestras dentro o entre laboratorios se realizará en
soportes rígidos, resistentes a los golpes y de fácil desinfección (gradillas,
canastas metálicas)
18. Por ningún motivo se deben sacar de laboratorio, guardar en gaveta o
mezclar con objetos personales tubos de ensaye o cajas petri que contengan
desarrollo bacteriano.

19. Llevar puesta la bata de laboratorio en todo momento. La misma debe

permanecer completamente cerrada.
20. La bata nunca debe ser usada fuera del área de trabajo y si se quita debe ser
guardada como material contaminado. La bata contaminada debe ser colocada en
una solución desinfectante (cloro) antes de lavarse.
21. El alumno debe poner especial cuidado en evitar el contacto de la piel con
materiales potencialmente infecciosos. Con este fin deben usarse guantes cuando
se manipulen muestras o cultivos que contengan posibles patógenos.
22. Los guantes siempre serán desechados antes de salir del laboratorio. Jamás se
saldrá del mismo con los guantes puestos, ni con ellos se tocaran los objetos
personales, maniguetas de las puertas, bancas, etc.
23. Tras quitarse los guantes, se realizará un lavado de manos

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24. Se usaran gafas protectoras y mascarillas faciales si existe riesgo de salpicadura

y / o aerosoles
25. Se pondrá extremo cuidado en minimizar el riesgo de autoinoculación y de
generación de aerosoles
26. Los derrames y accidentes deben ser informados inmediatamente al docente o
al responsable del laboratorio
27. Está rigurosamente prohibido pipetear con la boca
28. Evitar llevar en el laboratorio accesorios que podrían ser fuente de contaminación
(por ejemplo joyas)
29No deberán usarse lentes de contacto
30Recoger el cabello largo
31. Evitar desplazamientos innecesarios, movimientos bruscos. Hablar sólo lo
indispensable
32. Realizar solamente aquellas actividades indicadas por el profesor, no llevar a
cabo experimentos no autorizados
33. Comer, beber, fumar y aplicarse cosméticos está formalmente prohibido en el
laboratorio, así como el almacenamiento de comida o bebida.
34. El alumno debe lavarse las manos frecuentemente durante las actividades de la práctica,
tras acabar la práctica y siempre antes de abandonar el laboratorio. Al lavarse se usará un
jabón antiséptico y el secado se realizará con papel.
35. Las heridas y cortes en las manos, si se han producido en el laboratorio, serán
comunicados al docente o técnico académico
36. Las heridas y cortes realizados antes de la práctica deben ser convenientemente
vendados y después es imprescindible ponerse guantes

MEDIDAS EN CASO DE EMERGENCIA

A continuación se mencionan los pasos que se deben seguir en caso de que
ocurran los siguientes accidentes:
Derrame de material biológico sobre el cuerpo
Remover la ropa inmediatamente
Lavar vigorosamente el área expuesta con agua y jabón por un minuto
Reportar el incidente al profesor
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Buscar atención médica si es necesario

La ropa contaminada debe ser colocada en una solución desinfectante antes
de lavarla
Salpicaduras en los ojos con materiales biopeligrosos
Lavar inmediatamente el globo ocular e interior dela superficie del párpado con
abundante agua durante 15 minutos aproximadamente. Abrir el ojo para
asegurar efectivamente el lavado , comenzando por los párpados
Reportar el incidente al profesor
Cortadas menores y heridas por pinchazos
Lavar vigorosamente con agua y jabón por varios minutos
Reportar el incidente al profesor
En caso de derrames
Reportar el incidente al profesor
Limpiar y desinfectar inmediatamente el área
La persona que realice la operación debe llevar puesto guantes, para limpiar
la porción del derrame, los trozos de vidrio rotos y / o cultivo deben cubrirse
con toallas de papel impregnadas en solución desinfectante. Al cabo de 10
minutos debe limpiarse empleando nuevas toallas de papel y desinfectante
El material contaminado ya esterilizado debe ser colocado en bolsas de color
rojo traslucido marcadas con el símbolo de riesgo biológico y leyenda de RPBI

NORMAS OPERATIVAS

1. No se permitirá la entrada al laboratorio al alumno que llegue 10minutos

después de la hora de entrada
2. La práctica iniciara de acuerdo al horario estipulado para la experiencia
educativa, al inicio se pasará lista no habrá retardos y se pondrá falta a quién
no llegue en el lapso establecido
3. Durante el desarrollo de la práctica, queda estrictamente prohibido que el
alumno entre y salga del laboratorio así como la estancia de personas ajenas
a la sección
4. Ningún alumno permanecerá en el laboratorio si no porta la bata blanca, de
manga larga y abrochada
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5. Al entrar al laboratorio el alumno colocará en los anaqueles del laboratorio

libros, carpetas, abrigos y cualquier otro material que no se utilice para la
realización de la práctica
6. El alumno deberá de estar provisto del material personal y del material
biológico solicitado de lo contrario no podrá permanecer en el laboratorio
7. El alumno deberá traer su manual a cada sesión de laboratorio que asista
8. Al alumno deberá realizar el 100% de las practicas establecidas para este
periodo (el 100% comprende asistir al laboratorio, efectuar la práctica y
reportarla). El alumno que no cumpla con este criterio no podrá acreditar la
experiencia educativa
9. Al final de la práctica el alumno deberá presentar al docente el formato
establecido para que confirme mediante su firma la realización de la práctica.
Este documento solo se presentará el día que se realice la práctica
10. A los ocho días de realizada la práctica el
alumno deberá entregar al docente el reporte de la misma. Si por algún motivo
no se cumple con esta solicitud, podrá entregarlo al final del periodo siempre
y cuando no exceda el 20% de las prácticas efectuadas en el periodo.
Porcentajes mayores quitan al alumno el derecho a examen ordinario o
extraordinario según sea el caso
11. El reporte deberá contener hoja de
identificación (con firma del docente que avala la realización de la práctica)
generalidades material, reactivos, técnica observaciones, esquemas
conclusiones cuestionario y bibliografía
12. Al final del curso el alumno deberá entregar su
manual (engargolado que contiene el total de prácticas realizadas por el
periodo), en la fecha indicada por el catedrático. El no entregarlo deja al
alumno sin derecho para acreditar la experiencia educativa.

MATERIAL NECESARIO PARA LAS PRÁCTICAS DEL

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA GENERAL

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10 Tubos de ensaye de 13 x
100

10 Tubos de ensaye de 10 x
75

5 Tubos de ensaye de 15 x
150

4 Pipetas Pasteur

2 Pipetas graduadas de 10
ml

2 Pipetas graduadas de 5
ml

2 Pipetas graduadas de 2
ml

2 Pipetas graduadas de 1
ml

1 Gradilla

1 Mechero de bunsen o
lámpara de alcohol

MATERIAL INDIVIDUAL

1. Escobillones

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2. Jabón para las manos

3. Detergente

4. Toalla

5. Franela

6. Alcohol

7. Cubrebocas

8. Guantes desechables

9. Recipiente con cloro

10. Recipiente con torundas

de algodón

11. Sanitas

12. Cloro

13. Gasas

14. Bolsas

15. Cerillos

16. Aplicadores

17. Porta objetos

18. Cubre objetos

19 Papel kraft

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QUIMICA CLINICA

MICROBIOLOGIA GENERAL

PRACTICA 1: MICROSCOPIA

ALUMNO: LANDA FERMAN CHRISTIAN ALEXIS

DOCENTE: SARA ORTIGOSA GUITIERREZ

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MICROSCOPIA
1.-INTRODUCCIÓN
La microbiología se ocupa generalmente de organismos tan pequeños que el ojo
humano no los puede ver claramente a simple vista. Debido a la naturaleza de esta
disciplina, el microscopio tiene una importancia crucial; la mayor parte de los
conocimientos sobre los microorganismos se han descubierto con microscopios, no
obstante la obtención de una buena imagen está sujeta a la habilidad del usuario
para manejarlo, gran número delos errores diagnósticos no tienen su base en el
preparado , sino en la errónea manipulación del instrumento. El uso adecuado de
los recursos ópticos del microscopio permitirá identificar detalles y variaciones
tintoriales, que ayudarán al correcto diagnóstico, por eso es importante, que para
su manejo, se encuentre con técnicas adecuadas de su manejo, que permitan
mantener al instrumento en buenas condiciones

2. PRINCIPIO Y METODOLOGIA DE LA DETERMINACION

El estudio de microorganismos precisa el uso de instrumentos que amplifiquen el
tamaño dela imagen hasta hacerlos visibles para el ojo humano. El microscopio
tiene como función principal generar una aumento adecuado, sin embargo en
ocasiones se requiere mayor contraste o resolución para observar las muestras de
interés, por tal motivo los microbiólogos utilizan diversas técnicas microscópicas en
su trabajo, que seleccionan de acuerdo a lo que necesitan estudiar y describir de
los microorganismos, tales como: microscopio de campo claro, de campo oscuro,
de contraste de fase y de fluorescencia
El trabajo en el microscopio binocular ordinario, reciben el nombre de técnicas de
campo claro, porque forma una imagen opaca frente a un fondo claro (interferencia
destructiva) generalmente sirve para observar muestras gruesas sin teñir o
muestras teñidas sin embargo, las células y organismos vivos delgados y sin teñir
tienen mejor visibilidad en los microscopios que ocupan técnicas de campo oscuro
o contraste de fase.

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El campo oscuro es posible hacerlo enviando la forma en que se ilumina las

estructuras. Generalmente se enfoca un cono hueco de luz sobre la muestra, de
manera que no penetre en el objetivo los rayos de luz directa, solo lo harán los
rayos difractados por la muestra, observándose un campo oscuro con las
estructuras brillantes (interferencia constructiva) facilitando el estudio de la forma
de los microorganismos. En el de fase, por medios ópticos se transforman una
imagen de fase en una imagen de amplitud.
El microscopio de contraste de fase requiere de algunos accesorios adicionales,
como, objetivos con una placa de fase y un condensador de fase el cual carece de
diafragma y lleva intercalado una ranura anular, este microscopio produce una
imagen oscura detallada de la célula viva sin teñir sobre un campo brillante. Esta
técnica microscópica permite estudiar el movimiento y las estructuras celulares
internas.

En la microscopia de fluorescencia, el contraste se aumenta por medio de

fluorescencia (capacidad de una muestra de emitir luz de longitud de onda larga
cuando es iluminada con luz de longitud de onda corta). Generalmente en este
microscopio la muestra es teñida con fluorocromos que se iluminan con luz
ultravioleta (longitud de onda corta), lo que le permite emitir luz visible, y el
microorganismo se observa intensamente brillante (interferencia constructiva)
sobre un fondo oscuro. En esta técnica se requiere de tinciones especiales
(inmunofluorescencia) lo que la hace altamente específica para identificar
determinadas estructuras en los microorganismos, e incluso facilita su identificación

1. LISTA DE REQUERIMENTOS
1.1 Reactivos
NUM CLAVE MOMBRE DEL CONC CANTIDAD
REACTIVO
Xilol
Mezcla de 80% 10% 100 ml
alcohol-cetona 10%
éter
1.2 Equipo de Laboratorio
1. Microscopio de campo claro
2. Microscopio de campo oscuro
3. Microscopio de contraste de fase
4. Microscopio de fluorescencia
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1.3 Materiales de laboratorio

NUM CANTIDAD DESCRIPCION

- - Porta objetos

- - Cubre objetos

- - Papel para lentes

- - Preparaciones fijas

4.- TECNICA O PROCEDIMIENTO

a. 4.1 Muestra
Cortes histológicos, frotis sanguíneos y bacteriano
4.2 Preparación del sistema de medición
4.2.1 Seguir las instrucciones para enfocar en el microscopio una
muestra biológica
4.2.2 Disponer cuando menos de dos laminillas por alumno

4.3 Sistema de medición

a) Microscopio de campo claro

1. Colocar el microscopio en una mesa que permita una cómoda

observación a través del ocular
2. Limpiar el sistema óptico y de iluminación
3. subir el condensador hasta el tope y cerrar el diafragma iris
aproximadamente a la mitad
4. Seleccione con el revolver el objetivo de menor aumento (10x)

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Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

5. Bajar la platina y colocar la preparación (fijarse que quede

firmemente sujeta al carro, y que el cubre objetos y el objeto estén
situados hacia arriba) acomodando la preparación que se va a
examinar en la apertura central de la platina
6. Mirando por lo extremos subir loa platina hasta el tope, si no hay
tope acercar la platina lo mas cerca posible a la lente objetiva, hasta
apoyarlo levemente sobre la preparación. Normalmente los
microscopios convencionales poseen un tope que impide su ascenso
por arriba de cierta marca. Sin embargo, puede darse el caso que tal
tope no exista (este tope solo existe en la lente objetiva de 10x
7. Mirando por los oculares bajar la platina con el tornillo
macrométrico hasta que empiecen a distinguirse los detalles de la
preparación
8. Afinar los detalles de la imagen moviendo el tornillo micrométrico
9. Ajustar la distancia interpupilar (distancia entre los ojos).
10. Ajustar dioptrías (agudeza visual) en el porta ocular izquierda, o
bien con el ocular enfocable izquierdo
11. Cerrar gradualmente el diafragma de la fuente de luz (diafragma
de campo) hasta ver una imagen poligonal
12. Descender, ligeramente el condensador hasta ver nítido el borde
de diafragma de campo
13. Si la imagen poligonal no está en el centro, centrarla utilizando
los tornillos del condensador.
14. Una vez centrado el condensador abrir el diafragma de la fuente
de luz hasta que el polígono abarque todo el campo, realizado este
paso ya no mover el diafragma de campo ni la altura del condensador
15. Abrir completamente el diafragma del condensador, volver a
cerrar lo necesario (hasta que la imagen tenga un buen contraste).

16. Al cambiar de objetivo, enfocar con el tornillo micrométrico y

contrastar la imagen con el diafragma iris y para ajustar el brillo
modificar la intensidad de la fuente luminosa o colocar filtros.

17. Una vez conseguido el enfoque correcto, recorra toda la

preparación, a fin de ir reconociendo imágenes que le sean
familiares. Recordar que el objetivo de 10x permite ver la visión
panorámica del preparado.
Es decir, los tejidos, su ubicación, y sus relaciones (fusión importante
al inicio del estudio que ahorrara tiempo dedicado al análisis de la
muestra).
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18. Cambiar a un objetivo de más aumento (sin bajar la platina con

el tornillo macrométrico) y enfocar únicamente con el tornillo
micrométrico.
19. Para usar el objetivo de 100x, aleje la lente de la muestra,
deposite una gota de aceite de inmersión en el porta objetos (sin
quitar la laminilla de la platina) en el punto de mayor concentración
luminosa, hacer que la lente de 100x lentamente hasta que esta se
encuentre en contacto con el aceite (observar lateralmente este
movimiento). Observe por el ocular y mueva ligeramente el tornillo
micrométrico hasta encontrar la imagen
20. Recordar que los objetivos de 40x y 100x, permiten ver detalles
de una célula, o la confirmación celular de una estructura. Se puede
observar la forma y tamaño de células o grupo de ellas, aspecto que
permite analizar la muestra de madera eficiente.
21. Al finalizar su observación, apague la fuente de luz, colocar la
lente de menor aumento. Aleje la platina del objetivo, retire la laminilla
y limpie las lentes objetivas y la platina

4.4 Uso del sistema de medición

Checar el sistema óptico, de iluminación y mecánico del microscopio

Confirmar que el sistema óptico se encuentre limpio
Revisar el sistema eléctrico del instrumento (clavijas en buenas condiciones)
Seguir las instrucciones para el enfoque de la muestra
Terminado el trabajo apagar el microscopio, limpiar su sistema óptico y
entregarlo al encargado de laboratorio

PROCESAMIENTO Y REPORTE DE RESULTADOS

Dibujar los campos microscópicos observados al enfocar el microscopio de
campo claro

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REDACTAR CONCLUSION

Se identifico que el microscopio óptico se pueden hacer notar muchas células de diferentes
tipos, basilos, cocos y bacterias entre otras , tiene la capacidad de dar buena iluminación y
detectar algunos detalles de las muestras, es necesario resaltar que es el microscopio que
mas utilidad se le da, por su mayor capacidad de visualizar algunos microorganismos.

B) Microscopio de campo oscuro

1. colocar la fuente luminosa al microscopio y centrarla (la lámpara se
centra con el objetivo seco débil y con el condensador de campo claro)
2. Una vez centrada la luz colocar el condensador de campo oscuro
3. Colocar el portaobjeto con muestra en la platina
4. Seleccionar con el revolver el objetivo de menor aumento (10x).
5. Bajar la platina y colocar la preparación (fijarse que quede firmemente
sujeta al carro, y que el cubreobjetos y el objeto estén situados hacia
arriba) acomodando la porción de la preparación que se va a examinar
en la apertura central de la platina)
6. Mirando por los extremos subir la platina hasta el tope, si no hay tope
acercar la platina lo más cerca posible a lente objetiva, hasta apoyarlo
levemente sobre la preparación. Normalmente los microscopios
convencionales poseen un tope que impide su ascenso por arriba de
cierta marca. Sin embargo, puede darse el caso que tal tope no exista.
(Este tope solo existe en la lente objetiva de 10x).
7. Mirando por los oculares bajar la platina con el tornillo macrométrico
hasta que empiecen a distinguirse los detalles de la preparación.
8. Afinar los detalles de la imagen moviendo el tornillo micrométrico..
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9. Una vez conseguido el enfoque correcto, recorra toda la preparación,

a fin de ir reconociendo imágenes que le interesen. Cambiar a un
objetivo de más aumento (sin bajar la platina con el tornillo
macrométrico) y enfocar únicamente con el tornillo micrométrico.
10. Para usar el objetivo de 100x, aleje la lente de la muestra, deposite
una gota de aceite de inmersión en el portaobjetos (sin quitar la laminilla
de la platina) en el punto de mayor concentración luminosa, acerque la
lente de 100 lentamente hasta que esta se encuentre en contacto con el
aceite (observar lateralmente este movimiento). Observe por el ocular y
mueva ligeramente el tornillo micrométrico hasta encontrar la imagen.
11. Al finalizar su observación, apague la fuente de luz, colocar la lente
de menor aumento. Aleje la platina del objetivo. Retire la laminilla y
limpie las lentes objetivas y la platina.

4.4 Uso del sistema de medición

Instalar un microscopio de campo oscuro
Seleccionar el lugar adecuado para su colocación (alejada de las
ventanas y luz apagada de preferencia en un área oscura)
Alistar muestras biológicas para su observación al microscopio
Para una mejor observación de los objetos utilizar muestras sin
teñir
Checar que el condensador este colocado en el microscopio de
forma adecuada
Utilizar portaobjeto cuyo espesor se encuentre entre 0.9-1.1mm y
cubreobjetos de 0.17mm
Cuidar que la abertura numérica del objetivo sea
aproximadamente 0.1 menor que la abertura límite inferior del
condensador
Usar cubreobjetos nuevos (libre de arañazos) perfectamente
limpios
Confirmar la perfecta limpieza del sistema óptico (sin grasa y
polvo)
Al montar la preparación procurar que no sea demasiado gruesa
Evitar que se formen burbujas al colocar el cubre objetos o el
aceite de inmersión a la preparación
Los objetos a examinar deben estar libres de (agua, o aceite de
inmersión, etc.,)

PROCESAMIENTO Y REPORTE DE RESULTADOS

16
Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

Dibujar los campos microscópicos observados al enfocar

Agua contaminada

REDACTAR CONCLUSIONES

En el campo oscuro se pueden detectar ciertas especies con mayor nitidez

puesto que en el microscopio óptico se aprecian pero no con muchos detalles
en este podemos detectar las anormalidades de estas.

c )Manejo del microscopio de contraste de fase

1. Colocar la fuente luminosa al microscopio y centrar la lámpara con el

objetivo seco débil y el condensador de campo claro

17
Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

2. Ajustar el condensador de fase, colocando la ranura anular de 10x y la lente

objetiva de 10x
3. Desplazar el ocular de la izquierda y colocar el ocular de fase. Enfocar la
imagen girando el ocular de fase y con los botone de ajuste situados en el
condensador, centrar los anillos
4. Retirar el ocular de fase y colocar nuevamente el ocular normal
5. Bajar la platina y colocar la preparación que quede firmemente sujeta al
carro, y que el cubreobjetos y el objeto estén situados hacia arriba, la
preparación a examinar debe quedar en la apertura central de la platina
6. observando por los extremos subir la platina hasta el tope, si no hay tope
acercar la platina a la lente del objetivo, hasta estar sobre la preparación.
7. Observando por los oculares bajar la platina con el tornillo macrométrico
hasta que empiece a distinguirse los detalles de la preparación
8. Afinar los detalles de la imagen moviendo el tornillo micrométrico
9. Una vez efectuado el enfoque correcto, recorra toda la preparación, a fin de
ir reconociendo imágenes de interés
10. Al cambiar el objetivo de mayor aumento sin bajar la platina con el tornillo
macrométrico, cambiar la posición del condensador colocando la ranura anular
correspondiente y enfocar únicamente con el tornillo micrométrico
11. Al finalizar su observación, apague la fuente de luz, colocar la lente de
menor aumento. Aleje la platina del objetivo. Retire la laminilla y limpie las
lentes objetivas y la platina.

4.5 Uso del sistema de medición

Las estructuras a observar deben estar sin teñir o escasamente teñidas

Los objetos a estudiar deben ser extremadamente delgados
Las superficies ópticas, tanto del microscopio, como de la preparación deben
estar perfectamente limpias
La fuente luminosa deberá tener una luz muy intensa
Checar que esté colocado en el microscopio el condensador de contraste de
fase y las lentes objetivas de fase adecuada
Confirmar que coincida la ranura anular con el tipo de lente del objetivo a
utilizar

18
Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

Evitar que se formen burbujas al colocar el cubreobjetos o el aceite de

inmersión a la preparación
Los objetos a examinar deben estar libres de agua, aceite de inmersión, etc,

PROCESAMIENTO Y REPORTE DE RESULTADOS

Dibujar los campos microscópicos observados al enfocar

REDACTAR CONCLUSION.
En el podemos detectar mayor nitidez conforme a la muestra que captamos
puesto que al tener un contraste de fases se notan todas las especies de
diferente campos, para mayor visualización de ellas.

GARANTIA DE CALIDAD
Checar constantemente el sistema eléctrico de los instrumentos
Cada vez que el instrumento se use revisar el sistema óptico las muestras
pueden ser sustituidas no necesariamente tiene que ser muestras bacterianas

19
Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

PRACTICABILIDAD
Se pueden usar acetatos o diapositivas para describir el microscopio
La muestra puede ser sustituida sustituidas no necesariamente tiene que ser
muestras bacterianas
CUESTIONARIO

1. ¿Cuál es la función del aceite de inmersión en microscopia?

R=sirve para dar al objetivo 100x mayor nitidez
2. , Cite las partes del sistema óptico del microscopio
R=ocular, objetivos
3. Explicar que indican cada una de las siglas que traen inscritas las lentes
objetivas
R=el nivel de aumento de cada objetivo
4. ¿Qué es poder de resolución?
La calidad o nitidez con la que se verán las muestras en el microscopio
5. Cite las partes del sistema de iluminación del microscopio
R=fuente de iluminación, condensador, espejo, diafragma,

MONTAJE DE MUESTRAS BACTERIANAS

1.- INTRODUCCION

20
Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

Aunque los microorganismos se pueden examinar directamente con un microscopio

óptico, se utilizan otras técnicas, tanto para determinar la presencia de
microorganismos como para observar ciertas características fisiológicas o
serológicas. Las técnicas utilizadas para observar al microscopio óptico son: las
preparaciones en fresco, en húmedo y preparaciones fijadas (frote directo y de
cultivo). Todas ellas muy fáciles de preparar, cuya utilidad estará sujeta a las
necesidades del microbiólogo.
2.- PRINCIPIO Y METOLOGIA DE LA DETERMINACION
Los microorganismos obtenidos a partir de una muestra pueden verse vivos o
muertos, estando esto sujeto al tipo de técnica utilizada para su observación, en el
laboratorio se pueden realizar las siguientes:
1. Observación de bacterias vivas:
a) en fresco
b) en húmedo
2. Observación de bacterias muertas:
a) Preparación fija
1. Observación de baterías vivas
a) Observación en freso. Este método de examen permite observar el
microorganismo vivo y evita las deformaciones de su morfología, que se producen
por las técnicas de coloración. Esta técnica consiste en suspender una gota de
solución fisiológica entre un portaobjetos y un cubreobjetos, procurando no formar
burbujas de aire, la muestra se toma introduciendo un hisopo del exudado tomado
al paciente, y mezclado hasta la completa homogenización y observar al
microscopio. La importancia de esta técnica es el estudio de movilidad de los
microorganismos. Sin embargo, el examen en fresco de microorganismos sin teñir
da resultados deficientes debido al reducido contraste entre las muestras y el medio
circundante. Esto se observa mejor con técnicas microscópicas de campo oscuro y
contraste de fase.
b) Preparación húmeda. Se coloca una gota de la suspensión de microorganismos
(bacteria proveniente de cultivo que se homogeniza en solución fisiológica) entre
un porta y cubreobjetos, se observa directamente al microscopio. Su aplicación se
relaciona con el estudio de la movilidad de los microorganismos proveniente de
cultivo. Al igual que la muestra en fresco una mejor observación se logra al
combinarla con técnicas microscópicas de campo oscuro o contraste de fase.
2. Observación de bacterias muertas

21
Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

Se realiza un extendido de bacterias en portaobjeto; luego se fija la preparación de

medios químicos o físicos. El medio químico consiste en colocar en la preparación,
alcohol metílico, éter, etc. En el medio físico el extendido se expone al calor. Con
este proceso se fija el protoplasma de la celula antes de ser teñido. La muestra
puede proceder de dos fuentes: de cultivo puro o de un exudado. El cultivo
bacteriológico se toma con un asa de platino bacteriológica de una proporción de
la colonia, esta se suspende en (solución fisiológica) previamente colocada en un
portaobjeto, con el asa se extiende la muestra en dos tercios distales de un
portaobjeto. En el exudado, se utiliza un hisopo estéril, se frota sobre la mucosa del
paciente (exudado) y posteriormente se extiende en el portaobjeto.
Esta técnica tiene la ventaja que permite observar las bacterias mas claramente
después de ser teñidas y proporciona información de las propiedades químicas y
morfológicas.
3.- LISTA DE REQUERIMIENTOS
3.1 Reactivos

NUM. CLAVE NOMBRE DEL CONC. CANTIDAD

REACTIVO

Solución salina 0.9% 300ml

Mezcla de 80%/10%/1 100ml

alcohol-cetona- 0%
éter

3.2 Equipo de Laboratorio

1. Microscopio de campo claro
2. Estufa de cultivo
3. Horno
4. Autoclave
3.3 Materiales de Laboratorio

NUM CANTIDAD DESCRIPCION

Porta Objetos

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Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

Cubre Objetos(num1)

Papel para lentes

Mechero bunsen

Tubos de ensaye de 13 x 100

Hisopos estériles

Pipeta Pasteur

Asa Bacteriológica

Caja Petri

4.- TECNICA O PROCEDIMIENTO

4.1 Muestreo y muestra
 Cepas de: Staphyloococcus y levaduras
 Aislar e identificar las cepas a utilizar
 Resembrar las cepas el día anterior a la practica
 Toma de exudado faríngeo (para frote directo o en fresco)

4.2 Preparación del sistema de medición

 Microscopio de campo claro
 Tubos de ensaye
 Laminillas
 Hisopos estériles
 Meche de Bunsen
 Solución fisiológica
 Cajas Petri

TÉCNICA
A) Método en húmedo
1. En un portaobjeto limpio colocar una gota de solución salina 0.9%

23
Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

2. Esterilizar el asa bacteriológica a la flama

3. Enfriar el asa en el medio
4. Tomar una proporción de la colonia bacteriana
5. Colocar la porción de la colonia en la solución salina que puso en el portaobjeto
y realizar una emulsión, se coloca el cubreobjeto limpio.
6. Esterilizar el asa nuevamente
7. Observar al microscopio de campo claro y contraste de fase con objetivo de 10X
y 40X

PROCESAMIENTO Y REPORTE DE RESULTADOS

DIBUJAR LOS CAMPOS MISCROSCOPICOS OBSERVADOS AL ENFOCAR EN

EL MISCROCOPIO DE CAMPO CLARO.

10X________________________ 40X______________________

DIBUJAR LOS CAMPOS MISCROSCOPICOS OBSERVADOS AL ENFOCAR EN

EL MISCROCOPIO DE CONTRASTE DE FASE.

24
Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

10X________________________ 40X_______________________

DE ACUERDO A LAS IMÁGENES CAPTADAS ANTERIORMENTE REDACTAR

SUS OBSERVACIONES EN EL SIGUIENTE CUADRO.

TIPO DE OBSERVACIONES OBSERVACIONES

MUESTRA

CAMPO CLARO CONSTRASTE DE

FASE

10X

40X

REDACTAR CONCLUSIÓN

25
Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

B) Método en fresco
1. Tomar con un hisopo estéril una pequeña porción de un exudado
2. Colocar el hisopo en un tubo de ensaye estéril, el cual debe tener 1ml de solución
fisiológica, agitar el hisopo hasta obtener una emulsión homogénea.
3. Sacar el hisopo y colocar una gota en un portaobjeto limpio y cubrir la
preparación con un cubreobjeto.
4. Observar al microscopio de 10X y 40X

PROCESAMIENTO Y REPORTE DE RESULTADOS

DIBUJAR LOS CAMPOS MISCROSCOPICOS OBSERVADOS AL ENFOCAR EN

EL MISCROCOPIO DE CAMPO CLARO.

10X________________________ 40X_______________________

26
Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

DE ACUERDO A LAS IMÁGENES CAPTADAS ANTERIORMENTE REDACTAR

SUS OBSERVACIONES EN EL SIGUIENTE CUADRO.

TIPO DE OBSERVACIONES OBSERVACIONES

MUESTRA

CAMPO CLARO CONSTRASTE DE

FASE

10X

40X

REDACTAR CONCLUSION.

C) Fijación de bacterias tomadas de medio de cultivo

1. Limpiar perfectamente un portaobjeto y flamear ligeramente
2. Colocar una pequeña gota de solución salina fisiológica en el centro de un
portaobjeto. Es necesario colocar muy poca cantidad de solución salina, por lo
que se puede usar el asa bacteriológica, ya que en el extremo curvo de su
filamento queda retenida una mínima gota de agua, que resulta suficiente.
3. Flamear el asa bacteriológica, tomar en condiciones asépticas una pequeña
cantidad del cultivo bacteriano en medio sólido y transferirlo a la gota de solución
salina. Remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensión
homogénea que quede bastante extendida para facilitar su secado.
4. Dejar secar la preparación al aire y fijar la preparación por calor o con metanol.
 Por calor: Pasar 3 veces el portaobjeto por la llama durante unos segundos,
checar que la temperatura del portaobjeto sea tolerada por la mano, si se nota
que la temperatura es muy alta esperar a que esta baje para volver a pasarlo

27
Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

por el mechero. En este proceso hay que tener precaución de no calentar

demasiado el portaobjeto pues la células pueden deformarse o romperse.
 Con metanol: Para bacterias procedentes de medio líquido. Añadir unas gotas
de metanol sobre la extensión completamente seca. Golpear el portaobjeto
por su canto con cuidado contra la mesa de trabajo para retirar de inmediato
el exceso de metanol. Esperar a que el metanol se evapore completamente.

PROCESAMIENTO Y REPORTE DE RESULTADOS

DIBUJAR LOS CAMPOS MISCROSCOPICOS OBSERVADOS AL ENFOCAR.

10X________________________ 40X_______________________

DE ACUERDO A LAS IMÁGENES CAPTADAS ANTERIORMENTE REDACTAR

SUS OBSERVACIONES EN EL SIGUIENTE CUADRO.

TIPO DE MUESTRA OBSERVACIONES

10X

40X

REDACTAR CONCLUSIÓN.

28
Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

D) Fijación de bacterias tomadas de exudado

1. Limpiar un portaobjeto y flamear ligeramente
2. Con un hisopo estéril tomar la muestra directamente de un exudado
3. Frotar ligeramente el hisopo en el portaobjeto con movimiento de izquierda a
derecha
4. Dejar secar la preparación al aire
5. Fijar la preparación a la flama (pasar rápidamente el portaobjeto sobre la flama
del quemador por el lado donde no esta la muestra, checar que la temperatura
del portaobjeto sea tolerada por la mano, si se nota que la temperatura es muy
alta esperar a que esta baje para volver a pasarlo por el mechero.
6. Enfriar la preparación y observar al microscopio con objetivo de 10X y 40X

PROCESAMIENTO Y REPORTE DE RESULTADOS

DIBUJAR LOS CAMPOS MISCROSCOPICOS OBSERVADOS ADIBUJAR
ENFOCAR.

10X________________________ 40X_______________________
DE ACUERDO A LAS IMÁGENES CAPTADAS ANTERIORMENTE REDACTAR
SUS OBSERVACIONES EN EL SIGUIENTE CUADRO.

29
Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

TIPO DE MUESTRA OBSERVACIONES

10X

40X

REDACTAR CONCLUSION.

5.- CONFIABLIDAD ANALITICA

1. Checar que las laminillas estén limpias. Las placas que no han sido previamente
lavadas o con restos de grasa pueden ser causa de una mala fijación y tinción
de muestra.
2. Al colocar la muestra sobre el portaobjeto hacerlo con suavidad para no dañar
las estructuras celulares.
3. Cuidar el tiempo que expone la laminilla al calor para fijar la muestra. El
sobrecalentamiento provoca un daño físico en la pared celular de las bacterias
por lo tanto puede afectar la retención de los colorantes.

6.- PRACTICABILIDAD
1. Para las técnicas indicadas en este apartado se pueden utilizar muestras de
cepas bacterianas Gram Positivas o Gram Negativas diferentes a las señaladas.
2. Los exudados pueden ser de cualquier tipo
3. Las muestras pueden ser tomadas por el docente o el alumno.

BIBLIOGRAFIA
Brock, (1997) Madigan, Martinko, Parker, biologia de los microorganismos,
editorial Prentice Hall, octava edición.
Koneman, Alle, DoweL (2001) diagnostico microbiológico, texto y atlas a color,
editorial panamericana quinta edición.
Presccott, Harlesy, KLEIN (1999) Microbiologia ed. MC GRAW-HILL –
Interamericana, cuarta edicion, España S.A
Mateos Pedro, Observacion de los microorganismos: el microscopio
preparación y examen de muestras, Departamento de Microbiologia y
Genetica. Facultad de Farmacia, Universidad de Salamanca.

30
Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

Gamazo Carlos (2005), Manual Practico de Microbiologia, 3° edición, editorial

Masson España S.A

CUESTIONARIO
1. ¿Qué utilidad tiene cada una de las técnicas utilizadas en esta práctica?
2. De manera general citar las medidas que tienen: bacterias, hongos y virus
3. Explicar ¿Cuáles son las medidas que se deben seguir al realizar un frotis?
Indicar porque es necesario seguirlas.
4. Explicar ¿Cuáles son las medidas que se deben seguir para realizar una buena
preparación en húmedo?

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Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

UNIVERSIDAD VERACRUZANA

FACULTAD DE BIOANÁLISIS

QUÍMICA CLÍNICA

MICROBIOLOGIA GENERAL

REPORTE DE PRACTICA 3:TECNICAS DE TINCION

ALUMNO:
LANDA FERMAN CHRISTIAN ALEXIS

DOCENTE: SARA ORTIGOZA GUTIERREZ

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Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

TÉCNICAS DE TINCIÓN
1.- INTRODUCCIÓN
En el tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles
de ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre
la célula y el medio que la rodea. La forma más simple de aumentar el contraste
es la utilización de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos
diferentes de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes
celulares, tales como flagelos, esporas, capsulas, paredes celulares, centros de
actividad respiratoria, etc. De ahí la importancia de utilizar en microbiología los
colorantes y las técnicas de tinción de forma adecuada.

2.- PRINCIPIO Y METODOLOGÍA DE LA DETERMINACIÓN

La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad
especifica por los materiales celulares. La mayoría de los colorantes utilizados con
frecuencia en el laboratorio de microbiología son moléculas cargadas positivamente
(cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados
negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos. Ejemplo
de colorantes catiónicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina.
Otros colorantes son moléculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan
con los constituyentes celulares cargados positivamente tales como las proteínas.
Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina acida y el rojo congo. Otro grupo de
sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con os
materiales lipídicos de la célula, usándose a menudo para relevar la localización de
las gotitas o depósitos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro
Sudán.
Algunos colorantes teñirán mejor solo después de que la célula haya sido tratada
con otra sustancia química, que no es colorante por sí mismo. Esta sustancia se
llama mordiente (ácido tánico). El mordente combina un constituyente celular y lo
altera de tal modo que ahora si podrá atacar el colorante.
Si se desea simplemente incrementar el contraste de las células para la
microscopia, son suficientes los procedimientos de tinción simple (utilizan un solo
colorante).

33
Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

El azul de metileno es un buen colorante simple que actúa sobre todas las células
bacterianas rápidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los
detalles celulares. Es especialmente útil para detectar la presencia de bacterias en
muestras naturales, puesto que las células tienen una composición química
diferente a la del entorno, de modo que ambos se comportan de forma diferente
frente al colorante.
La tinción negativa es el reverso del procedimiento de tinción usual: las células se
dejan sin teñir, pero se colorea el medio que las rodea. Lo que se ve por tanto, es
el perfil de las celular. La sustancia utilizada para la tinción negativa es un material
opaco que tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea
a las células. La tinción negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste
de las células en la microscopia óptica, pero su máxima utilidad esta en relevar la
presencia de capsulas alrededor de las células bacterianas.
Por su parte las tinciones diferenciales se basan en el hecho de que distintos tipos
de células tienen distinta composición química, y por lo tanto reaccionan de forma
diferente frente a una tinción, lo que permite clasificar los microorganismos en
diferentes grupos, según su capacidad de tinción. En este apartado están dos
tinciones de importancia taxonómica y medica: la tinción de gram y la de ácido –
alcohol resistencia (Ziehl – Neelsen), usan más colorante. La tinción de Gram es
de gran importancia en microbiología porque clasifica a las bacterias en dos
grandes grupos (Gram + y Gram -), según se comporten ante esta tinción. El
fundamento radica en la diferente estructura de la pared celular de ambos grupos:
las Gram positivas tienen una gruesa capa de peptidoglicano en su pared, mientras
que las Gram negativas tienen una capa de peptidoglicano más fina y una capa de
lipopolisacarida externa. Tras la tinción con el primer colorante (cristal violeta) se
tratan con yoduro para favorecer la retención del colorante, a continuación se
decoloran con alcohol cetona que arrastrada al colorante solo en las Gram-,
mientras que en las Gram+ el colorante se queda retenido en las células
permanecerán moradas. Las células Gram – se teñirán después con un colorante
de contraste (safranina) para que puedan observarse.
La tinción de Ziehl - Neelsen es una tinción diferencial que demuestra la resistencia
de la celula a ser decolorada por lo álcalis, acidos y alcohol. Se basa en que ciertos
microorganismos acido – alcohol resistente. Una vez realizada la decoloración con
esta mezcla se utiliza un colorante de contraste (azul de metileno) para poder
observar las células sensibles a la decoloración por acido – alcohol. La propiedad
acido resistente esta relacionada con su alto contenido en lípidos de su pared
celular. Por lo que la tinción de las bacterias debe hacerse con colorantes que
tengan alta afinidad por tales células.

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Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

3.- LISTA DE REQUERIMIENTOS

3.1 Reactivos
NUM CLAVE NOMBRE DE REACTIVO CONC. CANTIDAD

1 Cristal violeta

2 Alcohol de metileno

3 Oxalato de amonio

4 Yodo metálico

5 Yoduro de potasio

6 Etanol

7 Acetona

8 Safranina O

9 Fucsina básica

10 Fenol

11 Ácido clorhídrico

12 Azul de metileno

13 Hidróxido de potasio

14 Solución salina de 0.9%

cloruro de potasio

15 Aceite de inmersión

16 Agar nutritivo

35
Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

3.2 Equipos de Laboratorio

1. Microscopio
2. Estufa de cultivo
3. Horno
4. Auto clave

3.3 Materiales de Laboratorio

NUM CANTIDAD DESCRIPCION

Asa bacteriológica

Mechero bunsen

Lámpara de alcohol

Goteros

Aplicadores

Cronometro

Pipeta Pasteur

Porta Objeto

Cubre Objeto

4.- TECNICA O PROCEDIMIENTO

4.1 Muestro y Muestra
Cepas de: Staphylococcus, Streptococcus, Escherichia Coli, Proteus,
Lactobacilluis, Gardnerella vaginalis, Klebsiella, Citrobacter. Enterobacter,
Mycobacterium tuberculosis.
Aislar e identificar las cepas bacterianas a utilizar en las practica.
Resembrar las cepas el día anterior a la práctica.
36
Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

Preparación del sistema de medición

Preparar un microscopio de campo claro
Colocar un quemador bunsen
Preparar los siguientes reactivos:
 Colorante Cristal violeta oxalatada
 Solución mordente (Yoduro de Potasio)
 Solución de colorante (alcohol – cetona)
 Safranina al 2,5%
 Solución fenicada de Ziehl
 Solución de alcohol – acido
 Solución de azul de metileno

A) Tinción simple
1. Preparar una muestra fijada al calor, utilizando bacterias procedentes de un
medio de cultivo
2. Una vez fría la preparación cubrir con azul de metileno durante 3 minutos
3. Lavar con agua y secar al aire.
4. Observar la preparación al microscopio con el objetivo de inmersión

PROCESAMIENTO Y REPORTE DE RESULTADOS

DIBUJAR LOS CAMPOS MISCROSCOPICOS OBSERVADOS AL ENFOCAR EN
EL MISCROCOPIO DE CAMPO CLARO.

37
Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

REDACTAR CONCLUSIÓN.
Al observar la muestra las bacterias no se veian muy definidas ya que era
tinción simple solo se diferenciaban los cocos o bacilos del entorno, que en
esta muestra en particular no se encomntraron bacilos solo cocos.

B) TINCION DE GRAM

1. Utilizando bacterias procedentes de un cultivo preparar frotis delgados y fijarlas

al calor
2. Cubrir la preparación con cristal violeta – oxalato 1 min
3. Enjuague la lámina con agua corriente
4. Aplique solución de lugol (mordiente) durante 1 min
5. Lave la lámina con abundante agua y sacuda el exceso
6. Decolórela con alcohol cetona durante 30-60 segundos
7. Lave la lámina con abundante agua

38
Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

8. Cubra el frotis con colorante contraste (fucsina o safranina) 15 segundos

9. Lave la laminillas con agua, deje secar al aire y observe con el objetivo de
inmersión

PROCESAMIENTO Y REPORTE DE RESULTADOS

DIBUJAR LOS CAMPOS MISCROSCOPICOS OBSERVADOS AL ENFOCAR EN
EL MISCROCOPIO DE CAMPO CLARO.

Bacteria Gram positiva Bacteria Gram Negativa

DE ACUERDO A LAS IMÁGENES CAPTADAS ANTERIORMENTE REDACTAR
SUS OBSERVACIONES EN EL SIGUIENTE CUADRO.

TIPO DE OBSERVACIONES
MUESTRA

Bacteria Gram Se observan cocos, diplococos y cocos en

positiva agrupados en cadena teñidos de morado.

Bacteria Gram Se observan cocos teñidos de rojo en la

negativa muestra.

39
Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

REDACTAR CONCLUSIÓN.
Con este método de tinción se observan mejor las bacterias y se puede saber
el tipo que son y su clasificación de acuerdo a Gram positivas o negativas ya
que se observan de diferente color cada una, en el caso de las Gram+ se
observan de color morado y en las Gram- de un color rojo.

C) Tinción de Ziehl – Neelsen

1. Utilizando dos aplicadores realice un frotis de la muestra (expectoración), seque
al aire y fíjelo al calor.
2. Cubra la preparación con fucsina fenicada de Ziehl – Neelsen y caliente hasta
emisión de vapores durante 5 min, cuidado de que no hierva el colorante, añada
colorante cada vez que se seque.
3. Lave con agua de la llave
4. Decolore con alcohol – acido
5. Lave con agua de la llave
6. Cubra el frotis con azul de metileno durante 30 – 60 segundos
7. Lave con agua de llave
8. Deje secar al aire y observe con el objetivo de inmersión
9. Una vez observadas las muestras desechar las laminillas en un recipiente con
fenol al 5%

PROCESAMIENTO Y REPORTE DE RESULTADOS

DIBUJAR LOS CAMPOS MISCROSCOPICOS OBSERVADOS AL ENFOCAR EN
EL MISCROCOPIO DE CAMPO CLARO.

40
Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

Bacilos acido – alcohol

resistentes positivos
DE ACUERDO A LAS IMÁGENES CAPTADAS ANTERIORMENTE REDACTAR
SUS OBSERVACIONES EN EL SIGUIENTE CUADRO.

TIPO DE OBSERVACIONES
MUESTRA

Bacilos alcohol Se logro observar los bacilos en diferentes

– resistentes forma ya sea en cadena o agrupados

REDACTAR CONCLUSIÓN.
Este método de tinción es adecuado para algunos tipos de bacterias que
necesitan, por su estructura y composición química, ser teñidos mediante
otros métodos para lograr observarlos en un microscopio

41
Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

4.2 USO DEL SISTEMA DE MEDICION

4.2.1 Checar que el sistema óptico del microscopio se encuentre limpio
4.2.2 Ajustar el enfoque de la muestra
4.2.3 Ajustar el microscopio las dioptrías y la distancia interpupilar
4.2.4 Regular la iluminación del microscopio
4.2.5 Observar el portaobjeto coloreado al microscopio con el objetivo de inmersión
en aceite
4.2.6 Terminado el proceso apagar el microscopio y limpiar el sistema óptico
4.2.7 Desechar la laminilla en un recipiente con fenol al 5%
4.2.8 Las cepas utilizadas para el estudio deberán entregarse al responsable del
laboratorio para su posterior esterilización

5.- REPORTE DE RESULTADOS

Lectura:
Bacterias teñidas con azul de metileno: Morfología celular observada
Bacterias gram positivas: Bacterias teñidas de color violeta o moradas
Bacterias gram negativas: Bacterias teñidas de color rojo
Bacilos acido – alcohol resistentes BAAR positivos: Bacterias teñidas de color rojo
Bacilos acido – alcohol resistentes BAAR negativos: Bacterias teñidas de color azul

Reporte de muestras observadas con azul de metileno:

Se observan cocos aislados, diplococos, cocos en cadena agrupados.

Reporte de muestras observadas con la tinción de Gram:

Se observan: cocos gram positivos aislados asi como diplococos y cocos en cadena
teñidos de morado.
También se observan cocos gram negativos en color rojo.

42
Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

Reporte de técnica de Ziehl – Neelsen

Negativo= No se encuentran BAAR en el campo observado
Positivo (+)= Menos de un BAAR por campo en promedio en 100 campos
observados
Positivo (++)= De 1 a 10 BAAR por campo en promedio en 100 campos observados
Positivo (+++)= Mas de 10 BAAR por campo en 20 campos observados
6.0 CONFIABILIDAD ANALÍTICA

6.1 checar que las laminillas estén perfectamente limpias. Las placas que no han
sido lavadas previamente pueden ser causa de mala fijación y tinción de la muestra
6.2 Cuidar el tiempo que se expone la laminilla al calor para fijar la muestra. El
sobrecalentamiento provoca un daño físico en la pared celular de las bacterias que
puede afectar la retención de los colorantes
6.3 El lavado muy fuerte de la laminilla durante la tinción puede producir arrastre de
la muestra
6.4 La clasificación correcta de las bacterias, dependen de la pureza, reactividad y
estabilidad de los reactivos
6.5 Para el estudio de la pared celular utilizar siempre cepas jóvenes (no mayor de
24 horas de cultivo)
6.6 A la hora de realizar la tinción confirmar que los tiempos a los que se expone la
bacteria a los colorantes sea el indicado
6.7 Antes de utilizar los colorantes checar su concentración. La concentración de
las soluciones por efecto de la evaporación de los solventes o las variaciones
introducidas en los métodos recomendados, puede afectar los resultados de modo
adverso
6.8 Usar siempre reactivos recién preparados y si por algún motivo emplea uno que
este almacenado revisar que no contenga colorante precipitado o contaminantes.
El Violeta Cristal tiene a hacer precipitación, lo cual puede ser causa de
observación de estructuras ficticias en el frotis
6.9 En el caso de la tinción de Gram, se recomienda tener especial cuidado con la
mezcla de alcohol – acetona. Es posiblemente que este reactivo sea el que
produzca mayores problemas ya sea por decoloración excesiva o por débil
decoloración de los microorganismos.

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6.10 La tinción de Zielh – Neelsen tiene sus limitaciones en cuanto a no ser

específica para micobacterias y su baja sensibilidad, ya que el nivel de detección
es de 5,000 a 10,000 bacilos por mililitro de esputo. Esto debe ser tenido en cuenta
al evaluar una laminilla.

7.- CONTROL DE CALIDAD

7.1 Para efectuar el control de calidad de los colorantes se pueden utilizar las
siguientes cepas bacterianas:
 Bacterias gram positivas Staphylococcus aureus 25923, Staphylococcus
pyogenes 19615
 Bacterias Gram negativas Escherichia coli 25922
 Bacilos acido – alcohol resistentes Mycobacterium tuberculosis ATCC 25177
 Bacilos no acido – alcohol resistentes Escherichia coli 25922

7.2 El control de calidad de los colorantes debe realizarse primero con cada nuevo
lote de colorante preparado; luego es suficiente un control cada semana para
mantener un grado de seguridad apropiado en su uso.
7.3 Para facilitar el control de los colorantes, se recomienda que además de las
cepas control se preparen frotes con microorganismos aislados e identificados en
el trabajo rutinario, utilizando cepas frescas, tomando en cuenta aquellos que
pudieran ser más útiles según la tinción a evaluar.
7.4 Algunos colorantes como Safranina y Fucsina básica pueden contaminarse. Si
se sospecha esto cultive 1 ml de Tioglicolato o descarte el colorante.

8.- PRACTICABILIDAD

8.1 Para las técnicas de tinción indicadas en este apartado se pueden utilizar las
muestras de las cepas bacterianas Gram positivas o negativas diferentes a las
señaladas.
8.2 Como colorante de contraste se podrá utilizar otro colorante ejemplo verde de
malaquita

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9.- BIBLIOGRAFIA

Brock (1997) Madigan, Martinko, Parker, Biologia de los microorganismos, editorial Prentice
Hait. Octava edición
Koneman Allen Dowei (2001) Diagnostico microbiológico, texto y atlas a color, editorial
panamericana quinta edición
Presccott, Harlesy Klein (1999) Microbiologia , ed,MC Graw Hitt – interamericana, cuarta edición,
España S.A
Citoplasma bacteriano http://fai.unne.edu.ar/biologia
El peptidoglicano http://microbiologia.com.ar/general
Eubacterias Gram Negativa http://microbiologia.com.ar/gramnegativo
La pared celular bacteriana http://ugr.es/microbiologia

10.- CUESTIONARIO
1. ¿Qué es un colorante?
R=es una sustancia que tiene como función darle color a microorganismos para
lograr observarlos en un microscopio y asi clasificarlos o saber de que
microorganismo se trata
2. ¿Para que sirve la tinción en microscopia óptica?
R=sirve para lograr observar microorganismos en un microscopio colorándolos y
poder clasificarlos.
3. Da dos ejemplos de colorantes catiónicos
R=el azul de metileno mas comúnmente utilizado y el amarillo basico
4. Como se define una tinción simple
R=como una tinción básica con solo un colorante que sirve para diferenciar
algunas células o microorganismos del medio en el que se encuentran usa
5. Como se define una tinción diferencial
R=es una tinción en la que hay que agregar otros componentes químicos a los
microorganismos para asi poder agregarles colorante y este reaccione y asi se
puedan observar las células.
6. Señal una situación en la cual sea preferible utilizar un tinción simple de una
diferencial

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Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

R=cuando se necesita un resultado rápido y a gran escala para saber solo si

existe algún microorganismo o no.
7. ¿Cuál es el fundamento de la tinción de gram?
R=las bacterias con una pared celular mas gruesa no pierden tanto el colorante
cristal violeta como las de pared celular mas delgada y por lo tanto lo que se ve
es el colorante que se queda adherido a la pared celular y estas se clasifican de
acuerdo a esto, las de pared gruesa son Gram+ y las delgadas Gram -
8. ¿Por qué razón el alcohol cetona decolora con facilidad a las bacterias gram
positivas?
9. ¿Cuáles son las diferencias principales entre bacterias gram positivas, gram
negativas y acidos alcohol resistentes?
r=el grosor de la pared celular que hace que absorba mas un colorante que otro.
10. Hacer una lista de bacterias gram positivas y de gram negativas
R=
Gram positivas Gram negativas

Staphylococcus aureus Escherichia coli

Streptococcus pneumoniae Salmonella

Streptococus sanguis Brucella abortus

11. ¿Por qué la tinción de gram es una de las mas importantes y uno de los
métodos de tinción cuyo uso es mas amplio en microbiología? R=por que con
esta tinción es fácil saber el tamaño de la pared celular asi como la composición
de los microorganismos de acuerdo a la clasificación de estos.
12. Dar ejemplos de algunos microorganismos patógenos que sean acido
alcohol resistentes
R= Mycobacterium tuberculosis

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Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

UNIVERSIDAD VERACRUZANA

FACULTAD DE BIOANÁLISIS

QUÍMICA CLÍNICA

MICROBIOLOGIA GENERAL

REPORTE DE PRACTICA 4: MORFOLOGIA

BACTERIANA

ALUMNO:
LANDA FERMAN CHRISTIAN ALEXIS

DOCENTE: SARA ORTIGOZA GUTIERREZ

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MORFOLOGÍA CELULAR

1.- INTRODUCCIÓN

La forma de las células bacteriana (morfología celular) es una característica que

está determinada genéticamente, por ello es constante para cada especie (a pesar
de que existen pequeñas variaciones durante los ciclos reproductivos) y es una
característica fundamental en taxonomía e identificación de especies en el
laboratorio.

2.- PRINCIPIO Y METODOLOGÍA DE LA DETERMINACIÓN

Observando los microorganismos a través de un microscopio podemos apreciar su

morfología (tamaño, forma, disposición). Si se observa con aumento mayor se
puede apreciar, tanto en la superficie como dentro de la célula, un mayor número
de estructuras. La ausencia o presencia de ciertas estructuras sirve para clasificar
a los microorganismos.
El tamaño de las bacterias varían dependiendo de la especies entre menos de 1µm
y 250µm; siendo lo más habitual entre 1 y 10µm.Una característica de las
bacterianas es la alta proporción que existe entre el área de la superficie y el
volumen de la célula. Esto significa que posee una gran superficie a través de la
cual pueden entrar nutrientes para alimentar a un pequeño volumen; con lo cual
pueden realizar diversas reacciones metabólicas y crecer rápidamente. La forma
de una bacteria viene determinada por la rigidez de su pared celular. Las bacterias
poseen una de las tres formas fundamentales: esférica, cilíndrica o espiral. Las
células esféricas se denominan cocos y suelen ser redondas aun que pueden ser
ovoides o elípticas. A las de forma cilíndrica se les denomina bacilos. Los extremos
de estas células suelen ser redondeados rectos en forma de hueso o cuerno. Alas
de forma espiral o helicoidal se les denomina espirilos y se caracterizan por su
forma sacacorchos.
Existen modificaciones a estas tres formas fundamentales y aunque la mayor parte
de las bacterias mantienen su forma, algunas especies pueden variar la forma por
lo que se les llama pleomòrficas.

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Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

Muchas veces al mirar al microscopio se observan las células unidas unas con
otras. Mientras que las bacterias de forma espiral (espirilos) suelen ser células
separadas, otras células suelen creer en una disposición característica, disposición
que va a depender del plano en el que se realice la división celular y la célula hija
permanece junto a la célula madre una vez que realiza la división celular. Cada una
de estas disposiciones es típica de cada especie particular y puede usarse en
identificación.
Cuando un coco se divide en un plano forma diplococo en dos células juntas
(Neisseria). Cuando un coco se divide en un plano y permanece unido después de
varias divisiones formando una cadena se denomina estreptococo (Streptococcus).
Si las células se dividen en más de un plano o dimensión la disposición es más
complicada. Cuando se divide en un ángulo recto al primer plano de división forma
tétradas o tetracocos (Pediococcus). Una posterior división en el tercer plano puede
resultar en un paquete cubico de ocho células conocido como sarcinas (Sarcina).
Si la división en los tres planos es denominada irregular se forman racimos de uva
(Staphylococcus).
Los bacilos generalmente no se agrupan en disposiciones características, aunque
hay excepciones. Por ejemplo, el bacilo de la difteria tiende a agruparse en
empalizada. Las células del género Caulobacter (bacilo acuático) crece en roseta
sobre rocas y superficies similares. Dentro del género de Bacillus algunas especies
forman cadenas y se llaman Streptobacilos además algunas bacterias poseen
estructuras típicas típicas que permiten diferenciarlas, entre ellas se tiene a
presencia de capsulas, esporas, flagelos entre otras. En conjunto permiten la
identificación de un microorganismo.
3.- LISTA DE REQUERIMIENTOS
3.1 Reactivos

NUM. CLAVE NOMBRE DEL CONC. CANTIDAD

REACTIVO

1 Cristal violeta

2 Alcohol metílico

3 Oxalato de amonio

4 Yodo metálico

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5 Yoduro de potasio

6 Etanol

7 Acetona

8 Safranina O

9 Solución salina de 0.9%

cloruro de sodio

10 Aceite de inmersión

11 Agar nutritivo

3.2 Equipos de laboratorio

1. Microscopio de campo claro
2. Estufa de cultivo
3.- Horno
4. Autoclave

3.3 Materiales de laboratorio

NUM. CANTIDAD DESCRIPCION
Asa bacteriológica
Quemador bunsen
Goteros
Cajas petri
Lámparas de alcohol
Aplicadores
Cronometro
Pipeta Pasteur

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Porta objetos
Cubre objetos

4.1 Muestreo y muestra

Cepas de: Staphylococcus, Streptococcus, Escherichia coli, Proteus, Lactobacillus,

Gardnerella vaginalis, Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter, Mycobacterium
tuberculosis
Aislar e identificar las cepas bacterianas a utilizar en la práctica
Resembrar las cepas el día anterior a la práctica.

Preparación del sistema de medición

Preparar un microscopio de campo

Tener listas las asas bacteriológicas
Tener listos frascos goteros con solución salina fisiológica
Colocar un quemador bunsen
Preparar los siguientes reactivos
 Colorante de cristal violeta oxalatada
 Solución mordiente (yodo-ioduro de potasio)
 Solución decolorante (alcohol-cetona)
 Safranina o al 2,5%
 Azul de metileno

TÉCNICA O PROCEDIMIENTO

1. Utilizando bacterias procedente de un cultivo y procurando que sean del

mismo de colonia preparar dos frotis delgados y fijar al calor
2. Teñir un frotis por la técnica simple y otro por la técnica de Gram
3. Observar las preparaciones con objetivo de inmersión

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4. Identifique en cada preparación la forma tamaño y agrupación de las

bacterias
PROCESAMIENTO Y REPORTE DE RESULTADOS
DIBUJAR EN LOS CAMPOS MICROOSCOPIOS OBSERVADOS AL ENFOCAR EN
MICROOSCOPIO DE CAMPO CLARO

TINCIÓN CON AZUL DE METILENO TINCIÓN DE GRAM

DE ACUERDO CON LAS IMÁGENES CAPTURADAS ANTERIORMENTE

REDACTAR SUS OBSERVACIONES EN EL SIGUIENTE CUADRO

Tinción Lectura

Azul de Se observaron cocos y cocos agrupados en cadena

metileno

Tinción Se observaron muchos cocos agrupados en cadenas a si

de Gram como diplococos en toda la muestra con una buena
definición

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4.3. USO DEL SISTEMA DE MEDICIÓN

Checar que el sistema óptico del microscopio se encuentre perfectamente limpio.
Ajustar el enfoque de la muestra.
Ajustar en el microscopio las dioptrías y la distancia interpupilar.
Regular la iluminación del microscopio.
Observar la muestra con el objetivo de inmersión en aceite.
Terminando el proceso apagar el microscopio y limpiar el sistema óptico.
Desechar la laminilla en un recipiente con fenol al 5%.
Las cepas utilizadas para el estudio deberán entregarse al responsable del
laboratorio para su posterior esterilización.

5.- REPORTE DE RESULTADOS

Lectura:
Bacterias teñidas con azul de = Morfología celular observada
metileno
Bacterias Gram positivas =Bacterias teñidas de color violeta o moradas
Bacterias Gram negativas
=bacterias teñidas de color rojo
Reporte de muestras observadas con azul de mètileno:
Se observan cocos aislados, agrupados en pares, cadenas, bacilos aislados,
bacilos largos, etc.

Reporte de muestras observadas con la tinción de Gram

Se observan: coco gran positivo aislados y en pares no capsuladas no esporuladas
Bacilos fusiformes Gram negativos etc.
6.0. CONFIABILIDAD ANALÌTICA

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 Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

6.1Cuidar el tiempo que expone la laminilla al calor para fijar la muestra. El

sobrecalentamiento provoca un daño físico a la pared celular de las bacterias que
pueden afectar la retención de los colorantes.
6.2 La clasificación correcta de las bacterias, dependen de la pureza, reactividad y
estabilidad de los reactivos.
6.3 Para el estudio de la pared celular utilizar siempre cepas jóvenes (no mayor a 24hrs
de cultivo)
6.4 Usar siempre reactivos recién preparados y si por algún motivo emplea uno que
este almacenado revisar que no contenga colorante precipitado o contaminantes. El
cristal violeta tiene que hacer precipitación, lo cual pude ser causa de la observación
de estructuras ficticias en el frotis

7.- CONTROL DE CALIDAD

7.1 Para efectuar el control de calidad de los colorantes se puede

utilizar las siguientes cepas bacterianas:

Bacterias Gram positivas

Staphylococcus aureus 25923.
Streptococcus pygenes 19615.
Bacterias Gram negativas Escherichia coli 25922.

7.2 El control de calidad de los colorantes debe realizarse primero con cada nuevo
lote de colorantes preparado; luego es suficiente con un control cada semana
para mantener un grado de seguridad apropiado a su uso.
7.3 Para facilitar el control de los colorantes, se recomienda que además de las
cepas control se preparen frotes con microorganismos aislados e identificados
en el trabajo rutinario, utilizando cepas frescas, tomando en cuenta aquellos que
pudieran ser más útiles según la tinción a evaluar.
7.4 Algunos colorantes como safranina y fucsina básica pueden contaminarse. Si se
sospecha esto, cultive 1ml en Tioglicolato, o descarte el colorante.

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 Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

8.-PRACTICABILIDAD
8.1 Para las técnicas de tinción indicadas en este apartado se pueden utilizar muestras
de cepas bacterianas Gram positivas o negativas diferenciales de las señaladas.
8.2 Como colorantes de contraste se podrá utilizar otros colorantes ejemplo verde
malaquita.

9.- BIBLIOGRAFÌA
Brock. (2003) Madiga, Martinko, Parker, Biología de los microorganismos. editorial prentice HaIL 10ª
edición, Madrid España.
Koneman , allen, Dowel (2001). Diagnóstico microbiológico, texto atlas a color editorial paramericana
quinta edición
Presccott, Harlesy, Klein. (2004) Microbiología ed. MMc Graw-Hill.-interramericana, quinta edición,
Españas s.a.
Morfología celular bacteriana.
http://agronomia.uchile.cl/webcursos/microbiologiagral/pagina%20microbiologia1/word/Guia_Lab_07_(1).doc
Microbiology lab manual http://www.cat.cc.md.us/courses/bio141/labmanua/toc.html
Manual de prácticas de laboratorio
Http://edición-micro.usal.es/web/ducativo/entrada.html
Microbiología general http://www.unavarra.es/genmic/programa%20micribiologia_general.htm
Microbiología http://biblioweb.dgsca.unam.mx/libros/microbios/index.html

CUESTIONARIO
1. ¿Cuáles son las principales tipos morfológicos de los procariotas?
R= cocos, bacilos, espirilos
2. ¿Cuáles son las estructuras externas que más se observan en las bacterias.
r=pared celular, membrana plasmática, mesosomas, flagelos, pelos.
3. Dibuje una célula típica e identifique todas sus partes( estructuras externas e
internas)

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Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

R=
4. ¿Cuáles son las agrupaciones más comunes que tienen las bacterias que
observo en las muestras estudiadas?
R=agrupados en cadena
5. Afecta la edad de los cultivos a la reacción de la tinción de Gram (si o no) r= no
afecta ya que las células se siguen reproduciendo y al ser mas vieja hay mas
bacterias.

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Esterilización

1.- INTRODUCCION

En el medio ambiente existen microorganismos que están contaminando los objetos

que se encuentran en él; así que el aire, agua y suelo existen patógenos y/o
saprofitos que aprovechan los nutrientes a su alcance para desarrollarse o
permanecer sobre ellos; por tal motivo, es difícil considerar algún lugar libre de
microorganismos. Esta situación crea dificultades en los estudios de los
microorganismos, pues para estudiar a los microorganismos es fundamental
tenerlos en cultivos puros. El proceso mediante el cual se elimina toda forma de
vida de un medio o material recibe el nombre de esterilización. La esterilización es
un proceso esencial para el fundamento de un laboratorio de microbiología o
cualquier área que utilice todos los instrumentos quirúrgicos, implantes y muchos
otros dispositivos absolutamente libres de microorganismos.

2.-PRINCIPIO Y METODOLOGIA DE LA INVESTIGACIÒN

La esterilización es una técnica de saneamiento preventivo para conseguir la

prevención de todos los microorganismos y sus formas resistentes, que vienen en
la superficie o en el espesor de un objeto cualquiera. A través de esta, los materiales
de laboratorio para determinados diagnósticos los elementos quirúrgicos y a piel
del enfermo alcanzan un estado de desinfección que evita la contaminación
operativa. El material tratado se denomina estéril.
La esterilización se puede conseguir por procedimiento físicos, químicos y
mecánicos, los más usados son los primeros, aun que en los últimos años se están
desarrollando los procesos químicos. Ejemplos, de esterilización por medios
físicos, son: aplicación de radiaciones, muerte de los microorganismos por calor
(autoclave, horno, flameado); por productos químico: la utilización de acido fénico,
el acido cianhídrico, el oxido de etileno, los derivados mercuriales, los derivados del
yodo y numerosas sustancia. También se pueden eliminar las bacterias el
combinando adecuadamente factores como la temperatura con agentes químicos,
o modificando el tiempo de exposición. No obstante, el método para eliminar
bacterias está limitado por las características del material a esterilizar; la

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Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

esterilización por calor seco se puede utilizar para esterilizar instrumental

quirúrgico, material de vidrio,
Porcelana, metal, polvos termoestables; el calor húmedo para gasas, apósitos,
algodón, ropa de laboratorio instrumental quirúrgico, agua disoluciones acuosas
termoestables, medios de cultivo entre otros.
En los procedimientos microbiológicos es frecuente el empleo de material de vidrio
y dado que este tiene una gran influencia en la calidad de los resultados, es muy
importante tomar en cuenta su adecuada limpieza y esterilización. En principio se
tienen dos tipos de materiales: el contaminado. Cuando se trata de material
contaminado, se deberá esterilizar en autoclave a 121ºC, 15 libras de presión,
durante 20 a 30 minutos antes de someterlo al proceso de lavado. El material no
contaminado puede utilizarse en el horno.
Los líquidos,

3.- LISTA DE REQUERIMIENTOS

3.1 Reactivos
Sol. Hipoclorito de sodio al 3%
Jabón biológico

3.2.- Equipos de laboratorio

Horno
Autoclave

3.3 material de laboratorio

NUM CANTIDAD DESCRIPCION

Matraces Erlemeyer 125,250,500,1000 ml

Tubos de ensayo 13 ×100

Cajas petri

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Pipetas graduadas 5-10ml

Cinta testigo

Gasa

Algodón

Papel Craft. o papel aluminio

Aplicadores

4.- TECNICA O PROCEDIMIENTO

4.1 Muestreo y muestra

4.1.1 Material de laboratorio para esterilizar.

4.2.- Preparación del sistema de medición

4.2.1 Preparar la autoclave
4.2.2 Preparar el horno

TÉCNICA

a) Esterilización por calor seco

Lavar el material de cristalería con solución de jabón líquido y enjuagarlo con

suficiente agua de la llave, después con agua destilada, escurrirlo y secar al
horno. Proceder a esterilizar, el material, el cual deberá empacarse de manera
que se pueda mantener estéril hasta el momento del uso. Para tal efecto seguir
las siguientes recomendaciones:

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Esterilización de tubos de ensayo

1. Una vez de que el material este limpio y seco se tapa cada tubo con una tapa de
plástico (tapón de rosca sin penetrar) o una torunda de algodón procurando que
éste pueda ser manipulado con facilidad, para ello no debe quedar ni muy
apretado ni muy flojo y debe alcanzar por lo menos 3 cm dentro del material de
vidrio.
2. Colocar los tubos preparados en una cesta y cubierta con papel Craft
3. Cuando no se disponga de canastas apropiadas, usando papel Craft envolverlos
por paquetes de 5 tubos.

Esterilización de matraces

1. Lavar los matraces y secar

2. ya secos colocar un tapón de algodón siguiendo las instrucciones dadas para los
tubos de ensaye
3. Colocar a los matraces un gorro de papel Craft o aluminio.

Esterilización de pipetas

1. Con ayuda de un alambre colocar una pequeña torunda de algodón en el extremo

superior y en la punta de la pipeta.
2. Envolver completamente con papel craft pegar con una cinta testigo
3. Rotular, por la parte externa del papel, la capacidad de la pipeta. Por ejemplo:
5mL, 1Ml, etc.

Esterilización de cajas petri

1. Envolver con papel craft siguiendo las indicaciones del profesor.

2. Colocarles cinta testigo
3. Dependiendo de las necesidades, las cajas petri se pueden envolver
individualmente, o por paquete.
Listo el material se esteriliza en el horno a una temperatura de 180ºC a 200ºC
durante una hora. Checar que la cinta testigo cambie de color.

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b) Esterilización por calor húmedo (autoclave)

1. Se debe acomodar el material de tal forma que exista una libre circulación de
vapor entre ellos (no tratar de llenar el autoclave hasta sobrecargarlo).
2. Esterilizar los líquidos separándolos de otros materiales.
3. Cuando se esterilizan los líquidos, deben hacerse con el material debidamente
preparado( matraces y tubos de ensaye con tapones de algodón y gorros de
papel craft)
4. La cristalería deberá esterilizarse colocando los recipientes boca abajo u
horizontales (nunca con la boca hacia arriba).
5. Observar que el nivel del agua este hasta la marca del tubo de cristal que se
encuentra fuera del autoclave.
6. Colocar en la canastilla el material a esterilizar.
7. Cerrar el autoclave y asegurarla con las llaves de seguridad que se encuentran
alrededor de la tapa
8. Conectarla a la electricidad y girar el boto de encendido.
9. Esperar que se caliente el agua
10. Dejar que salga la válvula de escape el vapor que se encuentra en el interior.
11. Al cabo de 5 min. Cerrar la válvula de escape de vapor
12. Esperar que el nanómetro suba a 15 libras de presión que corresponde a 121ºC
controlándola con el botón de encendido.
13. Una vez alcanzada la presión adecuada mantener el proceso durante 15 min.
Concluido el tiempo de eterización apagar el autoclave y desconectarlo
14. Esperar a que baje la presión a 0 lbs
15. Abrir la válvula de escape, cuando ya no salga vapor, abrir las llaves de
seguridad y destapar la autoclave

PROCESAMIENTO Y REPORTE DE RESULTADOS

DIBUJAR ESQUEMAS DEL PROCEDIMIENTO QUE SE REALIZA PARA
PREPARAR EL MATERIAL PARA ESTERILIZAR

Tubos de ensaye

61
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Matraces

Pipetas

Cajas petri

DE ACUERDO A LAS IMÁGENES REALIZADAS ANTERIORMENTE REDACTAR

SUS OBSERVACIONES EN EL SIGUIENTE CUADRO

TIPO DE MATERIAL DESCRIPCIÓN

Tubos de ensaye

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Matraces

Pipetas

Cajas petri

Redactar conclusión

4.3 USO DEL SISTEMA DE MEDICIÒN

4..3.1 Verificar que la autoclave tenga suficiente agua

4.3.2 Checar que el horno este calibrado
4.3.2 Confirmar la existencia de testigos de esterilización

5.- CONFIABILIDAD ANALÍTICA

5.1 Checar que el material este completamente limpio

5.2 Verificar que el jabón utilizado sea adecuado
5.3 Confirmar que el material se enjuago previamente con agua destilada
5.4 Ver que el material para esterilizar se prepare de acurdo a las indicaciones
dadas en la técnica.
5.5 Vigilar la forma como se llena la autoclave
5.6 Cuidar el tiempo que expone el material al calor sea el indicado para que se
esterilice
5.7 checar que existan las precauciones pertinentes para evitar accidentes.
6.- control de calidad

63
Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

6.1 para efectuar el control de calidad del proceso de esterilización usar los
testigos de esterilización químicos, físicos o biológicos.
6.2 Deberán realizar cultivos para confirmar le esterilidad del producto final.
7.- Practicabilidad
7.1 se puede utilizar cualquier testigo para confirmar la esterilidad.
8.- Bibliografía
Brock,(1997) Mandigan, Martinto, Parker, Biologia de los microorganismos. editorial
Prentice HaIL, octava edición
Koneman, Allen, Dowel (2001) Diacnostico Microbiológico, texto y atlas a color
editorial panamericana quinta edición
Presccott, Harlesy, Klein. (1999) Microbiología ed. MC Graw-Hill-interamericana,
cuarta edición, española s.a.
Esterilización > Agentes físicos
http://www.microobiologia.comm.ar/bacteriologia/esterilizacion.php?Mostrar=controles
ESTERILIZACIÓN Y ANTISEPSIA http://www.cirugest.com/Reviciones/Cir02-01-02-01.htm
Esterilización de material de platico para laboratorio
http://www.vitlab.de/es/default.htm?/es/reinigung.htm
Técnicas microbiológicas http://www.solocienca.com/biologia/microbiologia-tecnicas.htm
Cuestionario
1) ¿Por qué se envuelve el material en papel?
2) ¿Qué es una autoclave? Poner esquema con principales componentes
3) ¿Cuál es el efecto del calor húmedo y el calor seco en la célula bacteriana?
4) ¿Cuál de los dos métodos es más efectivo para esterilizar?
5) De 5 ejemplos de esterilización de objetos por calor seco y cinco por calor
húmedo.
6) Cuando se unas la incineración
7) De un ejemplo de esterilización a la llama explicando el proceso.

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UNIVERSIDAD VERACRUZANA

FACULTAD DE BIOANÁLISIS

QUÍMICA CLÍNICA

MICROBIOLOGIA GENERAL

REPORTE DE PRACTICA : MEDIOS DE CULTIVO

ALUMNO:
LANDA FERMAN CHRISTIAN ALEXIS

DOCENTE: SARA ORTIGOZA GUTIERREZ

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Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

MEDIOS DE CULTIVO

1.- INTRODUCCIÓN
Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es
observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el
laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el
Medio de Cultivo y crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Para que las
bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una
serie condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno,
así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe
contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de
todo microorganismo contaminante. Los medios de cultivo son esenciales en el
laboratorio de Microbiología por lo que un control en su fabricación, preparación,
conservación y uso, asegura la exactitud, confiabilidad y reproductibilidad de los
resultados a obtener.

2.- PRINCIPIO Y METODOLOGÍA DE LA DETERMINACIÓN

El conocimiento de la nutrición microbiana permite el cultivo de los microorganismos
en el laboratorio. Todos los microorganismos tienen requerimientos de macro – y
micronutrientes, aunque la forma en que cada nutriente es captado puede variar
mucho entre unas bacterias y otras, así como la cantidad relativa de cada nutriente.
En los laboratorios de microbiología se utilizan los medios de cultivos, que son
materiales nutritivos en el que se pueden recuperar, multiplicar y aislar los
microorganismos, así como efectuar pruebas de susceptibilidad. Generalmente se
ocupan diferentes tipos de medios de cultivo que pueden ser clasificados de la
siguiente manera:
Por su naturaleza
Medios complejos o indefinidos: son medios cuya composición química exacta
se desconoce, ya que son el producto de realizar infusiones y extractos de
materiales naturales complejos: Con ellos se logra un tipo de medio rico en
nutrientes, aunque indefinido químicamente. Estos medios generalmente se usan
en trabajos de investigación.
Medios sintéticos o definidos: se obtienen disolviendo en agua destilada
cantidades concretas de distintas sustancias químicas puras, orgánicas y/o
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Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

inorgánicas. La composición concreta de un medio sintético dependerá de la

bacteria que se quiera cultivar: lógicamente, un medio definido para una bacteria
con grandes capacidades biosintéticas será más sencillo que el medio definido de
otra bacteria con menores posibilidades biosintéticas.
Medio semisintético: llevan algunas sustancias químicas cuya naturaleza y
cantidad se conocen, junto con sustancias de naturaleza y composición indefinidas.
Por su aspecto físico:
Medios líquidos: Se emplean fundamentalmente para estimular y promover la
selección de algún o algunos microorganismos e impedir que otros se multipliquen
o identificar al microorganismo estudiando mediante pruebas bioquímicas.
Medios semisólidos, Se utilizan para identificaciones bioquímicas y averiguar si el
germen estudiado es móvil. Los medios semisólidos tienen una consistencia
blanda.
Medios sólidos. Se utilizan para obtener colonias aisladas de microorganismos.
Los medios sólidos constituyen la mayor parte de los medios de cultivo que se
emplean en Microbiología.
Por su uso:
Medios selectivos, son medios sólidos que contienen sustancias que impiden el
desarrollo de algunos microorganismos, pero en una flora mixta permiten el
aislamiento y recuperación del germen o grupo de gérmenes de interés.
Medios selectivos de enriquecimiento. Son medios líquidos que estimulan la
multiplicación de algún germen determinado e impiden o inhiben la reproducción de
otros.
Medios diferenciales, son aquellos que contienen indicadores de ácido base,
redox o sustancias que detectan cambios de la actividad microbiana de los
microorganismos sobre el medio o en las características típicas de las colonias.
Permiten revelar características fisiológicas de los microorganismos.
Medios para cultivar gérmenes anaeróbicos, son medios de cultivo para aquellos
gérmenes que requieran condiciones de anaerobiosis o de microaerofilia.
Medios de cultivo para medir la potencia de los antibióticos.
Medios de transporte. Sirven para transportar los especímenes que contienen a
los microorganismos, del sitio de la toma del producto hasta el laboratorio donde va
a efectuarse el estudio. Estos medios impiden que se altere la proporción original
de la flora microbiana en las muestras.

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Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

Medios para filtración a través de membrana, pueden ser líquidos o sólidos. En el

primer caso, se preparan a la concentración usual y permiten el crecimiento de
microorganismos presentes en la membrana.
De forma general los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir
de casa uno de sus constituyentes básicos o por simple rehidratación de productos
adquiridos comercialmente (medios de cultivo deshidratados). Generalmente se
prefiere el uso de los medios de cultivo deshidratados porque, además de
simplificar el trabajo, con ellos se tiene mayor probabilidad de obtener resultados
reproducibles.
Para su preparación se deben tener en cuenta los siguientes aspectos:
Prepararlos sólo a partir de productos que provengan de fabricantes o proveedores
que suministren productos de calidad. Utilizar agua destilada o desmineralizada con
una calidad microbiológica y fisicoquímica adecuada. Utilizar material de vidrio bien
lavado y enjuagado con agua destilada o desmineralizada. Controlar el tiempo y la
temperatura recomendada durante su esterilización. Nunca se deben exceder las
condiciones señaladas por el fabricante.

3.- LISTA DE REQUERIMIENTOS

3.1 Reactivos
NUM. CLAVE NOMBRE DEL CONC. CANTIDAD
REACTIVO
1 Agua destilada
2 Medios de cultivo
3 Caldo nutritivo
4 Agar nutritivo
5 Agar a base de sangre de
bajo Ph
6 Agar estafilococo 110
7 Agar Eosina Azul de
Metileno (EMB)
8 Agar Sal de manitol
9 Caldo tripticasa soya
10 Agar Sim

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11 Agar Kligler

3.2 Equipos de Laboratorio

1. Estufa de cultivo
2. Horno
3. Autoclave
4. Balanza granataria
5. Parrilla

3.3 Material
NUM. CANTIDAD DESCRIPCIÓN
Matraces Erlemeyer 500, 250, 1000 ml
Probetas 100, 500, 1000 ml
Pipetas 5, 10 ml
Tubos de ensayo de 13 x 100
Tubos de ensayo de 13 x 100 con tapón de rosca
Quemador bunsen
Cajas petri
Gasa
Algodón
Papel craft
Cerillos
Vasos de precipitado de 500 ml
4.1 Material biológico
Cepas bacterianas
Sangre con anticoagulante
4.2. Preparación del sistema de medición
4.2.1. Preparar balanzas granatarias
4.2.2. Tener los medios de cultivo listos
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4.2.3. Disponer de suficiente agua destilada

4.2.4. Tener el material limpio y seco
4.2.5. Preparar el autoclave
4.2.6. Colocar un quemador bunsen

TÉCNICA O PROCEDIMIENTO
1. Anotar para cada medio proporcionado: Nombre del medio de cultivo, tipo de
medio de cultivo de acuerdo a su consistencia y utilidad, para que tipo de
microorganismos se utiliza o qué pruebas se pueden realizar en el etc.
2. Leer cuidadosamente las instrucciones de preparación del medio de cultivo
asignado.
3. Rotular los recipientes en donde se van a preparar los medios de cultivo,
indicando nombre del medio y volumen a preparar.
4. Pesar la cantidad exacta del medio deshidratado o las porciones correctas de
cada uno de los ingredientes (de acuerdo a las especificaciones de la etiqueta).
5. Cerrar inmediatamente el frasco de medio de cultivo, para evitar su hidratación.
6. Disolver la porción pesada de acuerdo con las indicaciones del fabricante
(colocar un pequeño volumen de agua destilada caliente al matraz en donde se
va a preparar el medio, agregar poco a poco el polvo del medio de cultivo
correspondiente, mezclar constantemente hasta incorporar el total del polvo
pesado, agregar el resto de agua, calentar cuidadosamente el medio de cultivo,
hasta su disolución completa, agitar constantemente para evitar que se forme
demasiadas burbujas que provoquen derrames y puedan producir quemaduras
o que el medio se pegue en el fondo del matraz).
7. Distribuir el medio de cultivo en recipientes adecuados.
8. Si el medio de cultivo es un caldo, se distribuye en tubos de ensaye con tapón
de rosca o tubos de ensaye con tapones de algodón (deben quedar bien fijos)
para esterilizarlos luego.
9. Si el medio de cultivo es sólido (agar), se deja en el matraz, se le fabrica un tapón
con gasa y algodón bien ajustado a la boca del matraz y se cubre con un pedazo
de papel aluminio o de papel de craft.
10. Si se requieren medios para técnicas de un tubo inclinado o para picadura,
se prepara el agar en un matraz erlemeyer, se disuelve y se distribuye en tubos,
para su posterior esterilización.
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11. De acuerdo a las indicaciones del fabricante esterilizar los medios de

cultivo preparados, generalmente este proceso se realiza en autoclave a 15lb de
presión/121°C/15-20 minutos.
12. Una vez esterilizados los medios sólidos se vacían en cajas de Petri
estériles, procurando realizar el proceso en condiciones estériles y cuidando que
al servir el medio no esté muy calientes y que no tenga burbujas. Una vez que
solidifiquen y enfríen se guardan en refrigeración (en posición invertida) para su
posterior uso.
13. Si el medio era líquido y se usaron tubos con tapón de rosca se ajustan y
se guardan.
14. Si el medio era sólido y se preparó en tubos de ensaye, después de
esterilizar se colocan en posición inclinada hasta que solidifique, una vez fríos se
almacenan en un lugar fresco y seco o en el refrigerador.
15. Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y esterilizado es
esencial que identifique el lote de medio de cultivo preparado indicando su
nombre, y fecha de preparación
16. Es conveniente que se efectúen controles para confirmar que el medio es
satisfactorio y cumple con el propósito de uso deseado. Por ello se deben realizar
pruebas para verificar la esterilidad, capacidad de promoción de crecimiento, etc
NOTAS: es importante
 No olvidar rotular los medios de cultivo con su nombre o siglas para poder
identificarlos y de preferencia también la fecha de elaboración.
 Colocar una tira pequeña de cinta testigo a los tubos y matraces de los medios,
antes de meter a esterilizar.
4.3.- PROCESAMIENTO Y REPORTE DE RESULTADOS
MEDIO DE CULTIVO :AGAR SANGRE
CANTIDAD PREPARADA: 50 ML
ASPECTO DEL MEDIO DE CULTIVO: LIQUIDO
CANTIDAD PESADA: 16.1 GR

4.3.1 DIBUJAR ESQUEMAS DE LA FORMA FINAL COMO QUEDÓ EL MEDIO

DE CULTIVO PREPARADO

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Conclusiones

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ES MUY FACIL PREPARAR LOS MEDIOS DE CULTIVO YA QUE

GENERALMENTE YA VIENE ESPECIFICADO LA CANTIDAD QUE SE LE
ADICIONARA A UN LITRO DEL AGUA DESTILADA Y SOLO HAY QUE HACER
LOS CALCULOS RAPIDAMENTE Y MEDIR LA CANTIDAD CORRECTA.
LO MAS COMPLICADO ES AL PREPARAR LA MUESTRA EVITAR QUE
LLEGUE AL PUNTO DE EBULLICION YA QUE SE DEBE ESTAR MUY ATENTO
Y MOVIENDO LA MEZCLA PARA QUE ESTO NO PASE.

4.4. USO DEL SISTEMA DE MEDICIÓN

4.4.1. Limpiar y nivelar las balanzas antes de pesar.
4.4.2. Ver que el autoclave esté limpia y tenga el nivel adecuado de agua.
4.4.3. Terminada la esterilización apagar el autoclave y ver que quede limpia.
4.4.4. Verificar que los medios se almacenen de la manera adecuada.
4.4.5. Confirmar la existencia de testigos de esterilización.
5.- CONFIABILIDAD ANALÍTICA
5.1. Checar que el material se lave de la manera adecuada.
5.2. Revisar que los medios no estén caducados o hidratados.
5.3. Checar el pH de los medios preparados.
5.4. Confirmar que la autoclave llegue a la presión y temperatura requerida.
5.5. Cuidar el tiempo que expone el medio a la esterilización.
6.-CONTROL DE CALIDAD
La viabilidad de los medios debe probarse con cepas específicas de
Staphylococcus aureus 25923
Streptococcus pyogenes 19615. Escheruchia coli 2592
7.- PRACTICABILIDAD

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Para esta práctica se puede utilizar cualquier medio procurando tener la menos,
un medio líquido, un sólido y un semisólido.
8.- BIBLIOGRAFÍA
Brock, (1997) Madigan, Martinko, Parker, Biología de los microorganismos. Editorial Prentice HalL, octava
edición.
Koneman, Allen, Dowel (2001). Diagnóstico microbiológico, texto y atlas a color, editorial panamericana
quinta edición.
Presccott, Harlesy, Klein. (1999) Microbiología ed. MC Graw-Hill. – interamericana, cuarta edición, España
s. a.
Técnicas de microbiología http://www.solociencia.com/biologia/microbiologia-tecnicas.htm
NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-065-SSA1-1993, ESPECIFICACIONES SANITARIAS DE LOS
MEDIOS DE CULTIVO http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/065ssa13.html
Selección de Medios de Cultivo y Sistemas Miniaturizados para la Identificación de Microorganismos
http://www.ucv.ve/Farmacia/Micro_web/selecciones/mcultivos.htm
Los medios de cultivo en microbiología http://www.qb.fcen.uba.ar/microinmuno/SeminarioMedios.htm
Medios de cultivo http://www.etsea2.udl.es/invitro/medios.htm

CUESTIONARIO
1Enumere los requerimientos nutricionales (sustancias químicas) que son
necesarios para el crecimiento de las bacterias: AGUA, CARBONO, AZUFRE,
FOSFORO Y OXIGENO
2 ¿Cuáles son los ingredientes del caldo nutritivo? PLURIPEPTONA, EXTRACTO
DE CARNE
3 ¿Qué es un medio de cultivo sintético? SON LOS QUE CONTIENEN UNA
COMPOSICION QUIMICA DEFINIDA
4 ¿Qué es un medio selectivo? SON LOS QUE SOLO PERMITEN EL
CRECIMIENTO DE UN MICROORGANISMO INHIBIENDO EL DE OTROS POR
EJEMPLO EL AGAR SANGRE.
5 ¿Qué es un medio diferencial? ESTE MEDIO SE USA PARA DETECTAR
REACCIONES QUIMICAS DE LOS MICROORGANISMOSNPARA SABER SUS
CARACTERISTICAS COMO EL TSI
7 ¿Por qué se deben almacenar los medios de cultivo preparadas en caja Petri en
posición invertida? PARA QUE EL CRECIMIENTO DE LAS COLONIAS SE
REALICE APROPIADAMENTE,TAMBIEN PARA QUE NO SE CONTAMINE Y
CRESCAN OTROS MICROORGANISMOS.
8 ¿Por qué se tapan los tubos y matraces que contienen los medios para esterilizar?
PARA EVITAR UNA CONTAMINACION DEL MEDIO
74
 Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

9 ¿Cómo creas un área estéril para vaciar los medios de cultivo ya esterilizados a
las cajas de Petri? EN UN AREA DE UNA MESA DE TRABAJO CON UNOS
MECHEROS ALREDEDOR PARA TENER CALOR SECO EN EL AREA ¿y por qué
es necesario? PARA EVITAR CONTAMINACION DEL MEDIO
10 ¿Qué es una bacteria autotrófica? LAS BACTERIAS EN LAS QUE SU FUENTE
DE ENERGIA ES DE CARBONO Y LO OBTIENEN DEL CO2 Y DE CARBONATOS
11¿Qué es una bacteria heterótrofa? SON AQUELLOS MICROORGANISMOS QUE
UTILIZAN COMPUESTOS ORGANICOS COMO FUENTE DE CARBONO

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UNIVERSIDAD VERACRUZANA

FACULTAD DE BIOANÁLISIS

QUÍMICA CLÍNICA

MICROBIOLOGIA GENERAL

REPORTE DE PRACTICA : AISLAMIENTO Y CULTIVO

DE MICROORGANISMOS

ALUMNO:
LANDA FERMAN CHRISTIAN ALEXIS

DOCENTE: SARA ORTIGOZA GUTIERREZ

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AISLAMIENTO Y CULTIVO DE MICROORGANISMOS

1.-Introducción
En los ambientes naturales los microorganismos se encuentran usualmente como
poblaciones mixtas, pero si se quieren estudiar, caracterizarlos e identificarlos, se
requiere tenerlos como cultivos puros o axénicos.
Un cultivo puro es aquel que contiene un solo tipo de microorganismo que procede
de una sola célula, las bacterias al estar en un medio sólido y crecer en él da lugar
a una masa de células fácilmente visible que recibe el nombre de colonia. Las
colonias obtenidas en el medio de cultivo reúnen una serie de características típicas
para cada microorganismo. Cada uno de los cultivos puros que componen una
especie se denomina cepa.
Para obtener cultivos axénicos o puros a partir de una población microbiana mixta,
se utilizan las denominadas técnicas de aislamiento. En todo estudio
microbiológico, el primer paso es la separación de la población mixta a un cultivo
puro y luego su posterior identificación (familia, género, especie.
2.-Principio y metodología de la determinación
Se entiende por aislamiento, al proceso que permite separar uno o más
microorganismos presentes en un sustrato, forzándolos a crecer en medios de
cultivos artificiales. No todos los microorganismos pueden cultivarse en medios
artificiales, es el caso de los organismos biotróficos (parásitos obligados), solo se
desarrollan sobre tejido vivo de su hospedante (Rickettsias, etc.).
El aislamiento de bacterias en medios artificiales permite obtener diferentes tipos
de colonias correspondientes a los diferentes microorganismos presentes en la
población original. No obstante, para llevar a cabo su estudio, es necesario separar
unos de otros y trabajar con especies aisladas, obteniendo cultivos puros.
La obtención de un cultivo puro, a partir de una población mixta, se lleva a cabo en
dos etapas:
1. La muestra debe diseminarse de manera tal que los diferentes microorganismos
queden lo suficientemente separados sobre la superficie de un medio de cultivo
sólido, de manera que luego de la incubación ellos formen colonias visibles aisladas
(aislamiento).

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Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

2. Luego de tener las colonias aisladas, éstas deben transferirse con el asa a un
medio para cultivar esa colonia aislada; este procedimiento se conoce como
resiembra.
Para garantizar la pureza del cultivo obtenido, es conveniente, a partir de cada tipo
de colonia aislada, repetir el proceso de aislamiento. Se considera que se ha
obtenido un cultivo puro cuando al realizar este procedimiento, todas las colonias
obtenidas presenten las mismas características. El medio de cultivo utilizado en el
aislamiento dependerá, entre otros factores, de los requerimientos nutricionales de
los microorganismos que se espera aislar y de la presencia de microorganismos
que, por sus características y/o por la cantidad en que se encuentren en la muestra,
dificulten la obtención del microorganismo objeto del aislamiento. En este último
caso, se deben utilizar medios de enriquecimiento y medios selectivos que inhiban
el desarrollo de gérmenes contaminantes. La temperatura y otras condiciones de
incubación, variarán según los microorganismos, usualmente la temperatura óptima
de los microorganismos patógenos para el hombre oscila entre 30 y 40ºC. Cuando
el microorganismo que se intenta instalar es anaeróbico, deben tomarse las
precauciones necesarias a fin de eliminar la presencia de oxígeno en el ambiente
donde se desarrollará el mismo. La colonia microbiana obtenida después de
cultivarlas también es llamada unidad formadora de colonias (UFC) debido a que
está constituida por individuos de la misma especie provenientes de una célula o
un grupo de ellas.
Las especies bacterianas se pueden identificar basándose en el aspecto que tienen
al desarrollar en los diferentes medios. La pigmentación, el tamaño, la forma, borde,
elevación, superficie, aspecto, luz transmitida o reflejada, consistencia, producción
de pigmento, son indicadores importantes para lograrlo.
3.-Lista de requerimientos
3.1 Reactivos
NUM. CLAVE NOMBRE DEL REACTIVO CONC. CANTIDAD

1 Agua destilada

2 Medios de cultivo

3 Caldo nutritivo

4 Agar nutritivo

5 Agar Eosina Azul de Metileno (EMB)

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6 Agar Sal de manitol

7 Cristal violeta

8 Alcohol metílico

9 Oxalato de amonio

10 Yodo metálico

11 Yoduro de potasio

12 Etanol

13 Acetona

14 Safranina O

3.2 Equipos de Laboratorio

1. Estufa de cultivo
2. Horno
3. Autoclave
4. Balanza granataria
5. Microscopio de campo claro
3.3 Material
NUM. CANTIDAD DESCRIPCIÓN

Matraces Erlenmeyer 500,250,1000 ml.

Probetas 100,500,1000 ml.

Pipetas 5,10 ml.

Tubos de ensayo de 13x100

Tubos de ensayo de 13x100 con tapón de rosca

Quemador bunsen

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Tela de asbesto

Triple

Cajas Petri

Gasa

Algodón

Papel craft

Cerillos

Vasos de precipitado de 500 ml.

Asa bacteriológica

4.1 Material biológico

Cepas bacterianas
Sangre con anticoagulante
4.2. Preparación del sistema de medición
4.2.1. Tener los medios de cultivo a temperatura ambiente
4.2.2. Sembrar las muestras un día antes
4.2.3. Limpiar las mesas con cloro 3%
4.2.4. Colocar los quemadores bunsen en la mesa
4.2.5. Tener listos los colorantes para la tinción de Gram
TÉCNICA O PROCEDIMIENTO
1. Prender el quemador bunsen para crear un área estéril y así evitar que te
contamines o se contaminen los medios de cultivo.
2. Coloca las placas en posición invertida sobre la mesa del trabajo.
A).- AISLAMIENTO POR ESTRÍAS EN PLACA (morfología colonial)
1. Con 1 hisopo con algodón estéril se hace un raspado de la mucosa de la boca
y sembrar en medio de agar sangre y agar de sal de manitol
2. Para sembrar proceder de la siguiente manera: tomar una placa donde vaya a
sembrar (con agar sangre, agar sal de manitol) y con cuidado para no romper el
agar, inocular la muestra con el hisopo en un extremo de la placa.

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Realizar estrías muy juntas, Fig. 1.

Fig. 1.-Inoculación o descarga de la muestra

1. Esterilizar el asa bacteriológica y dejarla enfriar. Rozar una vez con el asa las
estrías sembradas con el hisopo y realizar sobre una porción sin inocular del agar
una segunda tanda de estrías, sin tocar posteriormente la primera estría fig.2.

Fig.2 estriado del inoculo

2. Repetir exactamente la operación descrita en el punto anterior, pero rozando al
empezar la segunda tanda de estrías, y realizar sobre una porción sin inocular
del agar una tercera estría fig.3.

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Fig.3 estriado del inoculo

3. Llevar la caja sembrada a la estufa de cultivo y dejarla en posición invertida 24
horas a 37°c.
4. Al término de la incubación describir la morfología de las colonias utilizando el
microscopio estereoscopio. De cada colonia diferente realizar un frote y teñir por
la técnica de Gram.
5. Realizar el mismo procedimiento utilizando una muestra de heces y sembrando
en agar EMB.
Procesamiento y reporte de resultados

DIBUJAR EL PATRON DE CRECIMIENTO EN LAS CAJAS AGAR SANGRE,

AGAR SAL DE MANITOL, AGAR NUTRITIVO Y MEDIO EMB

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MC CONKEY

AGAR SANGRE

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MIO CALDO NUTRITIVO TSI

DE ACUERDO AL DESARROLLO OBTENIDO EN LOS MEDIOS

ANTERIORMENTE DESCRITOS REDACTAR SUS OBSERVACIONES EN EL

SIGUIENTE CUADRO.
Coloni Forma Color Característi Elevaci Aspecto consisten
a colonial cas del ón cia
borde

Agar Si se Verde Mas Poco gelatino

sang formar - gris desarolla estetic so
re on do en el o
colonia borde
s de
bacteri
as.

Mc Muy Neg No muy No se gelatino

conk pocas ro desarrolla desarro so
ey do llo en
toda la
84
Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

colonia línea y
s se ve
por
partes
las
colonia
s

REDACTAR CONCLUSIÓN
Al ser la primera vez que se siembra en un caja la forma del estriado no fue la
correcta en la mayoría de los casos por lo tanto al crecer las colonias no se
aprecia con mucha definición las diferencias de este.
Aunque es la misma muestra, al ser diferentes medios de cultivo el
crecimiento de las colonias es diferente ya que una crecio mas rápido y con
otro color.

4.3.- USO DEL SISTEMA DE MEDICIÓN

4.3.1. Checar que la estufa de cultivo esta calibrada
4.3.2. Confirmar que los medios de cultivo estén a temperatura ambiente
4.3.3. Las cepas deben de resembrarse un día antes de la práctica.
4.3.4. Las cepas utilizadas para el estudio deberán entregarse al responsable del
laboratorio para su posterior esterilización
4.3.5. Verificar que el microscopio se encuentre en óptimas condiciones
5.- REPORTE DE RESULTADOS
En agar sangre crecieron mas rápido las colonias de bacterias a diferencia de Mac
Conkey en este el crecimiento fue menor, además de que el color de las colonias
es diferente en cada medio.
6.- CONFIABILIDAD ANALÍTICA

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Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

6.1. Checar que los medios de cultivo no estén contaminados

6.2. Verificar que los medios sólidos no tengan líquido de condensación en la superficie
6.3. Procurar que los medios estén a temperatura ambiente
6.4. Confirmar que la autoclave llegue a la presión y temperatura requerida
6.5. Usar cepas de referencia para el control de calidad de los medios
6.6. Checar que el material para la toma de muestra este estéril
6.7. Ver que la muestra se tome de forma adecuada
6.8. Supervisar la siembra y resiembra de bacterias, para que se realice de forma
adecuada
7.-CONTROL DE CALIDAD
7.1 Para efectuar el control de la calidad de los medios se pueden utilizar las
siguientes cepas bacterianas:
 Bacterias Gram positivas Staphylococcus aureus 25923
Streptococcus pyogenes 19615
 Bacterias Gram negativas Escherichia coli 25922
8.- PRACTICABILIDAD
8.1. Para el aislamiento de bacterias se pueden utilizar otros medios de cultivo
8.2. Las muestras del paciente pueden ser de otro tipo
8.3. Las cepas bacterianas Gram positivas o negativas pueden ser diferentes a las
señaladas

9.-BIBLIOGRAFIA
Brock, (2003) Madigan, Martinko, Parker, Biología de los microorganismos.
Editorial Prentice HaIL, 10ª edición, Madrid España
Koneman, Allen, Dowel (2001). Diagnostico microbiológico, texto y altas a color,
editorial panamericana quinta edición
Presccott, Harlesy, Klein. (2004) Microbiología ed. Mc Graw-Hill.- interoamericana,
quinta edición, España s.a.
Pedrique de Aulacio, obtención de cultivos puros
www.ucv.ve/Farmacia/Micro_Web/Catedras02/cultipu.pdf
86
Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

Gamazo Carlos (2005) Manual práctico de microbiología editorial Masson 3ª

edición
Cultivo de microorganismos.
http://www.unavarra.es/genmic/microgral/tema%2002.-
%20Cultivo%20de%20microorganismos.pdf
Cultivo de microorganismos http://apuntes.rincondelvago.com/cultivo-de-
microorganismos.html
Aislamiento de microorganismos
http://www.ucm.es/info/mfar/pdfs/GuiaMicro2.pdf

CUESTIONARIO.

1. Defina los términos siguientes: a) Cultivo puro: son aquellos que solo
contienen un tipo de microorganismo
b) medio estéril: es un medio libre de cualquier microorganismo que pueda
crecer en el.
c) inoculo: es el conjunto de microorganismos transferidos de su ambiente natural
o medio a otro medio.
d)Técnica aséptica: son las medidas correctas para realizar un procedimiento de
laboratorio y asi prevenir accidentes o algún tipo de contaminación.
e)Colonia: conjunto de miles de microorganismos que se encuentran en un
mismo sitio.
2. Indique y defina los tres tipos de crecimiento que se pueden considerar en
un cultivo en caldo: inoculacion, estriado del inoculo
3. Defina los términos siguientes:
cromógenos pigmento soluble en agua: son sustancias colorantes que al entrar
en contacto con otras sustancias teñirán de un color diferente la muestra.
pigmento soluble en agua: es un tipo de colorante que si es soluble en agua y no
solamente se dispersa en esta
4. ¿Cuáles son las medidas de seguridad que debes manejar durante el
proceso de este tipo de técnicas?
Usar guantes y cubrebocas para evitar una contaminación
Trabajar en una mesa de trabajo limpia
Trabajar cerca del calor de la flama para evitar contaminación
Esterilizar las asas cada ves que se utilizaran

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No dejar mucho tiempo las cajas Petri abiertas

Desechar los isopos en el lugar correspondiente
Rotular todo el material de trabajo correctamente

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INFLUENCIA DE LOS FACTORES AMBIENTALES

SOBRE EL CRECIMIENTO BACTERIANO
1._ el crecimiento de los microorganismos están influido notablemente por la
naturaleza química y física de su ambiente. Aunque la mayoría de los
microorganismos crece tan solo en condiciones ambientales bastante moderada, la
capacidad de algunos para adaptare a ambientes extremos e inhóspito es
verdaderamente notable. Las bacterias habitan casi en cualquier lugar donde
puede existir vida. De hecho una condición ambiental puede ser dañina para un
organismo y beneficiosos para otro, sin embargo, los microorganismos pueden
tolera algunas condiciones adversas, que rebasadas, no les permite crecer, es por
ello importante distinguir entre las condiciones ambientales y su efecto sobre la
viabilidad y su reproducción. El conocimiento de estas influenzas ambientales
permite controlar el crecimiento bacteriano y estudiar la distribución ecológica de
los microorganismos.
2._ principio y metodología de la determinación
Para el desarrollo de un microorganismo además de los requerimientos
nutricionales, existen un gran número de factores ambientales que influyen sobre
el en su crecimiento, supervivencia y actividades metabólicas que influyen sobre su
crecimiento, supervivencia y actividades metabólicas. Los factores más importantes
son: temperatura. PH, disponibilidad de agua, oxigeno entre otras. La temperatura
es uno de los factores ambientales más importantes que afecten el crecimiento y la
supervivencia microbiana, puede influir en los microorganismos vivos de forma muy
diferente. A medida que la temperatura sube, las reacciones enzimáticas son más
rápidas y el crecimiento se hace más rápido, sin embargo por encima de una cierta
temperatura, las proteínas, ácidos nucleicos y otros componentes celulares pueden
dañarse irreversiblemente. Por encima de ese punto las funciones celulares paran.
No obstante, para cada microorganismo existen a temperatura mínima (por debajo
de esto no existe crecimiento), una óptima (a la cual existe un crecimiento optimo)
y una máxima (no hay crecimiento). En base a la temperatura de crecimiento optimo
de microorganismo se clasifica en: psicrofilos si posen temperatura optima de
desarrollo entre 10° y 20°C, mesofilos entre 30° y 40° C y los termófilos entre 50° y
60° C
Cada microorganismo a su vez tiene pH dentro del cual es posible su crecimiento,
normalmente posee un pH optimo muy definido. La mayoría de los ambientes
naturales tienen valores de pH de 5.9, y los microorganismo con pH optimo son de
pH 7, solo unas pocas especies pueden crecer a pH inferior a 2 o superior 10. Las

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bacterias que crecen a pH bajos se le llama acidofilas, las neutrofilas son las que
crecen a un pH cercano a 7.
Los micoorganismos también varían en cuantos a sus necesidades de oxígeno, los
microorganismos se pueden dividir en diversos grupos dependiendo del efecto del
oxígeno. Las bacterias que se clasifican como: aerobias: dependen de O2.
microaerofilas: prefieren concentraciones bajas(2%). Anaerobias facultativas:
utilizan O2 si está presente, pero pueden crecer en su ausencia. Pueden ser
anaerobias estrictas: elO2 es toxico, - aeroduricas o aerotolerantes : toleran el O2.
A su vez se tiene que el agua es indispensable para el desarrollo de los
microorganismos, debido a que es el solvente en donde ocurren las reacciones
químicas enzimáticas de la célula, la disponibilidad del agua se expresa
generalmente en términos físicos tales como la actividad del agua (abreviada aw)
del medio representa la fracción molar de las moléculas de agua totales que están
disponibles , y que existen entre la presión del vapor de la solución al respecto a la
del agua pura(p/po). El valor mínimo d aw en el cual las bacterias pueden crecer
varían ampliamente, pero el valor optimo para muchas especies es mayor a 0.99.
algunos bacterias halófilas crecen mejor con el aw = 0.80 variaciones en la actividad
de agua puede afectar la tasa de crecimiento, debido a que si no disponen de
suficiente cantidad de agua libre en el medio necesita realizar más trabajo para
obtenerla y disminuirá el rendimiento del crecimiento . El agua se difunde al interior
del citoplasma mediante osmosis. Cuando el agua se difunde al interior de la célula
bacteriana este en un ambiente con baja actividad de agua, tal como disoluciones
de azúcar o sal, se produce u balance negativo y se produce plasmosis. Otros
factores ambientales son: presión hidrostática y atmosférica.

3._ lista de requerimientos

3.1 reactivos
NUM. CLAVE NOMBRE DEL REACTIVO CONC. CANTIDAD

1 Solución salina de cloruro de sodio 0.9%

2 Cloruro de sodio

3 Agua destilada

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4 Agar EMB

5 Agar nutritivo

6 Caldo nutritivo con cloruro de sodio 0.5%

7 Caldo nutritivo con cloruro de sodio 1%

8 Caldo nutritivo con cloruro de sodio 5%

9 Caldo nutritivo con cloruro de sodio 10%

10 Caldo nutritivo pH 5,7,8,9

3.2 equipos de laboratorio

1. estufa de cultivo
2. horno
3. autoclave
4. microscopio de campo claro
5. refrigerador
6. jarra de Gas-Pak
3.3 Material

NUM. CANTIDAD DESCRIPCION

Asa bacteriológica

Quemador bunsen

Caja Petri

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Tubos de ensaye de 13x100

Lámparas de alcohol

Probeta de 1000ml.

Cronometro

Pipeta Pasteur

Pipetas graduadas de 10 ml

Papel estraza

Algodón

Matraces Erlenmeyer de 500ml.

Pipetas graduadas

4.1 muestreo y muestra

4.1.1 cepas de: staphylococcus, escherichia coli, proteus, lactobacillus, klebsiella,
citrobacter, enterobacter
4.1.2 aislar e identificar las cepas bacterianas a utilizar en la práctica resembrar las
cepas el día anterior a la práctica
4.2
4.2.1 preparar el microscopio de campo
4.2.2 tener lista las asas bacteriológicas
4.2.3 tener listo los frascos y goteros con solución salina fisiológica
4.2.4 preparar los siguientes cultivos
- tubos de ensaye con leche inoculada con bacterias Gram positivo incubadas a
10°C
-tubos de ensaye con leche inoculada con bacterias Gram positivo incubado a 37°C
-tubos de ensaye con leche inoculada con bacterias Gram negativos incubadas a
10°C

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-tubos de ensaye con leche inoculadas con bacterias Gram negativos incubadas a
37°C
-caldo nutritivo a diferentes concentraciones de cloruro de sodio (0.5%.5%,10%)
inoculadas con bacterias Gram positivas
-caldo nutritivo a diferentes concentraciones de cloruro de sodio (0.5%.5%,10%)
inoculadas con bacterias Gram negativo
- caldo nutritivo a diferentes pH (5, 7, 8,10) inoculadas con bacterias Gram positivas
- caldo nutritivo a diferentes pH (5, 7, 8,10) inoculadas con bacterias Gram negativas

Técnica o procedimiento

a) Efectos de temperatura
1. Rotular 4 tubos de ensaye de 13x100 estériles y agregar a cada uno 5 ml de
leche
2. Inocular 2 tubos con cepas de bacterias Gram positiva
3. Inocular 2 tubos con cepas de bacterias Gram negativa
4. Incubar uno de los tubos inoculados con bacterias a 10°C y otro a 37°C durante
24 horas. Realizar lo mismo con bacterias Gram negativas
5. De los tubos inoculados con bacterias Gram negativos con el asa bacteriológica
tomar una pequeña cantidad de leche e inocule y estrié encajas Petri que
contenga agar nutritivo, incubar a 37°C durante 24 horas, observar y anotar el
grado de crecimiento de placa
6. De los tubos inoculados con bacterias Gram positivos con el asa bacteriológica
tomar una pequeña cantidad de la leche e inocule y estrié en cajas Petri que
contenga agar nutritivos, incubar a 37°C durante 24 horas, observar y anotar el
grado de crecimiento de placa

Procesamiento y reporte de resultados

DIBUJAR EL DESARROLLO OBTENIDO DE LA RESEMBRE DE LA MUESTRA
DE LECHE EN EL MEDIO DE AGAR NUTRITIVO A 10°C Y 37°C
GRAM POSITIVA GRAM NEGATIVAS GRAM POSITIVAS GRAM NEGATIVAS

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Resembra de muestra de leche a 10°C resiembra demuestra de leche a 37°C

REDACTAR SUS OBSERVACIONES DEL DESARROLLO DECTECTADO EN EL

AGAR NUTRITIVO DE LAS BACTERIAS A DIFERENTE TEMPERATURA

TEMP. Bacterias Gram positiva Bacterias Gram negativas

10°C En resiembra de muestra de En la resiembra de

leche de gram + a 10° c no hubo muestra de leche de gram
crecimiento de bacterias. – si hubo un poco de
crecimiento, aunque este
crecimiento no fue
significativo ya que solo se
observo en el primer
estriado.

37°C En la resiembra de muestra de En la resiembra de la

leche de gram + se observo un muestra de leche a 37°c
mayor crecimiento de bacterias de bacterias gram – el
en el estriado, sin ser aun crecimiento si fue
significativo ya que el bastante, se lograron
crecimiento fue poco. observar muchas colonias

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de bacterias a lo largo del

estriado.

REDACTAR CONCLUSIÓN
Las bacterias crecen rápidamente a la temperatura adecuada para su crecimiento
que es 37° y al disminuir la temperatura estas no proliferan rápido e incluso el
crecimiento se detiene.

B )Efectos de la presión osmótica

1. Preparar un caldo nutritivo a diferente concentraciones de cloruro de sodio (al
0.5%, 1%, 5%,10%), distribuirlos en tubos de ensaye de 13x100 y esterilizar. Una
vez estéril y fríos inocular en cada uno de ellos una cepa bacteriana, incubar a
37°C durante 24 horas
2. Con el alza bacteriológica estéril tomar una pequeña cantidad de caldo nutritivo
incubado el día anterior con bacterias e inocules en cajas Petri que contengas
agar nutritivo, incubar a 37°C durante 24 horas, observar y anotar el grado de
crecimiento en placa

PROCESAMIENTO Y REPORTE DE RESULTADO

DIBUJAR EL DESARROLLO OBTENIDO EN EL MEDIO DE AGAR NUTRITIVO

INOCULADA CON BACTERIAS RESEMBRADAS EN EL CLORURO DE
SODIO A DIFERENTE CONCENTRACIÓN

DESARROLLO DE BACTERIAS GRAM NEGATIVO DESARROLLO DE BACTERIA GRAM POSITIVO

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REDACTAR EL EFECTO SOBRE EL DESARROLLO DE LA BACTERIAS DE

CLORURO DE SODIO A DIFERENTES CONCENTRACCIONES

NaCl Bacterias Gram positivo Bacterias Gram negativo

0.5% No se observo crecimiento Se observo formación de

de bacterias. colonias de bacterias en todo
el estriado

5.0% No se observo crecimiento Se obserbo crecimiento de

de bacterias. bacterias en todo el estriado
formándose grandes colonias
.

10.0% No se observo crecimiento Se observo crecimiento de

de bacterias. bacterias pero en menor
proporción en comparación

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Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

con la concentración de NaCl

menor.

REDACTAR CONCLUSIÓN
Una mayor concentración de NaCl detiene la prolifercion de bacterias ya que
la presión osmótica generada es mayor y por lo tanto el crecimiento
disminuye.

C) efectos del pH
1. Rotular cuatro tubos de ensaye de 13x100 estériles y agregar a cada uno 2 ml.
Caldo nutritivo procurando que tengan diferente pH(5,7,8,10)
2. Siembre en cada tubo de ensaye una bacteria
3. Incubar a 37°C durante 24 horas
4. Tomar de cada tubo con el asa bacteriológica una pequeña cantidad del cultivo
e inocule y estrié en cajas Petri que contengan el medio agar nutritivo, incubar a
37°C durante 24 horas y observar

PROCESAMIENTO Y REPORTE DE RESULTADOS

DIBUJAR EL DESARROLLO OBTENIDO EN EL MEDIO DE AGAR NUTRITIVO
INOCULADO CON BACTERIAS RESEMBRADAS DE MEDIOS A DIFERENTE PH

DESARROLLO DE BACTERIAS GRAM POSITIVO DESARROLLO DE BACTERIA GRAM NEGATIVO

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Diferente pH Diferente Ph
Redactar el efecto sobre el desarrollo de las bacterias del pH del medio
Ph Bacterias gram positivo Bacterias gram negativo

5 No se observo crecimiento Se observo formación de

de bacterias. colonias en algunas partes
del estriado

7 No se observo crecimiento Se observo formación de

de bacterias colonias en todo el estriado

Redactar conclusión
Las bacterias gram – se reproducen rápidamente cuando tienen un pH
mayor.

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4.3 uso del sistema de medición

4.3.1 checar que el sistema óptico del microscopio se encuentre perfectamente
limpio
4.3.2 terminando el proceso de limpiar sistema óptico del microscopio
4.3.3 checar que la estufa de cultivo este calibrada
4.3.4 las cepas den resembrarse un día antes de la practica
4.3.5 las cepas utilizadas para el estudio deberán entregarse al responsable del
laboratorio para su posterior esterilización
5. reporte de resultados

Lectura:
Aislamiento del medio: se observa colonias
Resiembra en medios inclinados
Se observa desarrollo (ramificación, perlado en punta, liso rizoide esparcido etc.)
Resiembra de medio liquido
Se observa: muestra si crecimiento, turbio(con desarrollo), desarrollo flocúlenlo,
desarrollo en folicular, desarrollo intermedio, desarrollo en fondo
Resiembra en medios semisólidos
Se observa: microrganismo inmóvil, microrganismo móvil
6. confiabilidad analítica
6.1 checar los medios de cultivo que no estén contaminado
6.2 verificar que lo medio solidos no tengan liquido de condensación en la
superficie
6.3 procurar que lo medios estén a temperatura ambiente
6.4 confirmar que la autoclave llegue a la presión y a la temperatura requerida
6.5 usar cepas cepas de referencia para el control de calidad de los medio
6.6 checar que el material para la toma de muestra este estéril
6.7 ver que la muestra se tome de forma adecuada
6.8 supervisar la siembra y resiembra de bacterias, para que seralice de forma
adecuada
7. control de calidad
7.1 ara efectuar el control de calidad de los medios se pueden utilizar la siguientes
cepas bacterianas:

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Bacterias Gram positivas: staphylococcus aureus 25923

Streptococcus pyogenesis19615
Bacterias gram negativo: escherichia coli 25922
8. practicabilidad
8.1 para el aislamiento de bacterias se puede utilizar otros medio de cultivo
8.2 las muestras del paciente pueden ser de otro tipo
8.3 las cepas Gram positivas o negativas pueden ser diferentes a las señalada
9. BIBLOGRAFIA
Brock(2003) Mandinga, Martinko,Parker, biología de los microscopios, esditorial prentice hail, 10 edicion Madrid
España

Komeman, Allen,Dowell(2001) diagnostico microbiológico, texto y atlas a color, editorial panamericana quinta
edición
Prescott Harley, Klein (2004) microbiología Ed Mc Graw-Hill.- interamericana, quinta edición España s.a.

Predique de aulario, obtención de cultivo puro

www.ucv,ve/faracos/micro_web/catedras02/cultipu.pdf

Gamazo Carlos (2005) manual práctico de microbiología editorial Masson 3ª edición

Sanz J:L: microbiología ambiental, UAM.
Fisiología bacteriana y requerimiento físico
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Microbiología general http://edicion-micro.usal.es/web/esducativo/entrada.html
Timothy paustian microbiología http://www.bact.wisc.edu/MicritexBook/BacterialStructure/Itroduction.html
Introducción a la microbiología básica http://medic.med.uth.tmc.edu./path/00001450.html

EFECTO DE LOS AGENTES QUÍMICOS SOBRE EL

DESARROLLO BACTERIANO
1.- INTRODUCCIÓN

100
Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

Los microorganismos se controlan, inhiben o matan por medio de agentes físicos,

o químicos. Se cuenta con una gran variedad de técnicas y agentes de control que
actúan de maneras diferentes y cada uno presenta sus propias limitaciones.
Las razones principales para controlar los microorganismos son:
 Prevenir la transmisión de la infección y la enfermedad
 Prevenir la contaminación o la proliferación de microorganismos perjudiciales.
 Prevenir el deterioro o destrucción de materiales por los microorganismos.
2.- PRINCIPIO Y METODOLOGÍA DE LA DETERMINACIÓN
Se define como muerte bacteriana, a la pérdida irreversible de la capacidad de
reproducción en un medio adecuado. Para poder determinar la eficacia
antimicrobiana (la muerte de los microorganismos) se utilizan técnicas que
descubran a los sobrevivientes, es decir, a los capaces de reproducirse. Esto se
determina generalmente mediante métodos de siembra en placa en los que los
supervivientes se detectan porque forman colonias.
Las sustancias químicas que influyen negativamente sobre las bacterias, ejercen
dos tipos de efectos diferentes, Bacteriostáticos: cuando impiden el crecimiento
bacteriano; Bactericidas: cuando mata a las bacterias. Si las sustancias químicas
actúan en cualquier tipo de microorganismos, son llamados agentes
microbiostáticos y microbicidas. Para una misma sustancia química, el límite entre
un efecto microbiostático ó microbicida depende de varios factores, algunos de ellos
son:
Temperatura, En muchos casos, un aumento de la temperatura conjuntamente con
la acción de otro agente de control acelera la destrucción de los microorganismos.
De esa forma una pequeña cantidad de agente químico a una temperatura elevada
logra el mismo resultado que en una cantidad mayor del mismo agente a una
temperatura más baja.
Clases de microorganismos. Las especies de microorganismos difieren en su
susceptibilidad a los agentes químicos o físicos. Las células vegetativas en
desarrollo de las especies que forman esporas son mucho más susceptibles que
las esporas; éstas, en cambio, son más resistentes.
Estado fisiológico de los microorganismos. Las células jóvenes, por tener
intenso metabolismo, son más vulnerables que las células viejas de menor actividad
metabólica.
Ambiente. Las propiedades físicas o químicas del medio o de las sustancias que
contiene el medio en que viven los microorganismos, tienen gran influencia en la
velocidad y eficacia de la destrucción microbiana. Por ejemplo, el calor es más
101
 Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

eficaz en medio ácido que en medio alcalino; la consistencia del material, acuoso o
viscoso, influye en la penetración del agente; las concentraciones altas de los
carbohidratos aumentan, por lo regular, la resistencia térmica de los
microorganismos; la presencia de materia orgánica extraña reduce marcadamente
la eficacia de los agentes microbianos por inactivación de éstos o por proteger a los
microorganismo de la acción de éstos.
3.- LISTA DE REQUERIMIENTOS
3.1 Reactivos
NUM. CLAVE NOMBRE DEL REACTIVO CONC. CANTIDAD

1 Sulfato de cobre

2 Nitrato de plata

3 Yodo

4 Mercurocromo

5 Cristal violeta

6 Fenol

7 Hipoclorito de sodio

3.2 Equipos de Laboratorio

4.3 Estufa de cultivo
5.3 Horno
6.3 Autoclave
7.3 Refrigerador
3.3 Material
NUM. CANTIDAD DESCRIPCION

Matraces Erlemeyer 500, 250

Probetas 1000 ml

Tubos de ensayo de 13x100

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 Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

Asa bacteriológica

Quemador bunsen

Tela de asbesto

Triple

Cajas Petri

Gasa

Algodón

Papel craft

Cerillos

Pinzas de depilar

Papel filtro (discos)

4.1 Material biológico

 Cepas bacterianas
4.2 Medios de cultivo
 Agar nutritivo
 Caldo nutritivo
 Agar Mueller Hinton
4.3 Preparación del sistema de medición
4.3.1. Tener los medios de cultivo a temperatura ambiente
4.3.2. Sembrar las muestras un día antes
4.3.3. Limpiar las mesas con cloro 3%
4.3.4. Colocar los quemadores bunsen en la mesa
4.3.5. Tener listos los sensidiscos con agentes químicos a usar
TÉCNICA
a).- Acción de los metales pesados
1. Preparar dos cajas petri con Agar Mueller Hinton.

103
Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

2. Inocular una caja con bacterias Gram positivas y otra con bacterias Gram
negativas
3. Colocar en cada una discos de papel filtro impregnadas uno con sulfato de cobre,
otra con nitrato de plata y otro con mercurocromo (Fig.1)
4. Incubar en estufa de cultivo a 37°C durante 24 hrs.
5. Medir los halos de inhibición de desarrollo para cada uno

Fig. 1.-Esquema sugerido para la

colocación de los discos

Bacterias Gram Bacterias Gram

Positivas Negativas
b).- Acción de halógenos, álcalis y alcoholes
1. Preparar dos cajas petri con Agar de Mueller Hinton
2. Inocular una caja con bacterias Gram positivas y otra con bacterias Gram
negativas
3. Colocar en cada una discos de papel filtro impregnadas uno con yodo, otro con
fenol, con hipoclorito de sodio y cristal violeta (Fig. 1)
4. Incubar en estufa de cultivo a 37°C durante 24 hrs.
5. Medir los halos de inhibición de desarrollo para cada uno.
PROCESAMIENTO Y REPORTE DE RESULTADOS
DIBUJAR EL DESARROLLO OBTENIDO EN EL MEDIO DE MUELLER HINTON
DESPUUES DE INCUBAR CON SINSIDISCOS IMPREGNADOS CON AGENTES
QUIMICOS

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Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

DESARROLLO DE BACTERIAS DESARROLLO DE

GRAM POSITIVAS BACTERIAS GRAM
NEGATIVAS

REDACTAR SUS OBSERVACIONES DEL DESARROLLO DETECTADO EN EL

AGAR NUTRITIVO DE LAS BACTERIAS A DIFERENTE TEMPERATURA

TIPO DE MUESTRA AGENTE HALO RESULTADO

QUÍMICO

Bacteria Gram Hg 1 cm
positiva
Ag 1.2 cm

Cu 1.8 cm

Yodo 0 cm

Fenol 0 cm

Cl 1.1 cm

Cv 1.5 cm

Hg 0 cm

105
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Bacteria Gram Ag 0.8cm

negativa
Cu 2.2 cm

Yodo 0.7 cm

Fenol 0 cm

Cl 1 cm

Cv 0.8 cm

REPORTE DE RESULTADOS
Lectura:
Desarrollo bacteriano cerca = Bacteria resistente al agente químico
del sensidisco
Sin desarrollo bacteriano = Bacteria sensible al agente químico
cerca del sensidisco
REDACTAR CONCLUSIONES
Las bacterias gram + presentaron sensibilidad al sulfato de cobre, cristal violeta,
hipoclorito de sodio y plata, siendo mas sensible al sulfato de plata.
Las bacterias gram – también presentaron sensibilidad pero en menor proporción
comparado con las gram +.

5.- CONFIABILIDAD ANALÍTICA

∞ Checar los medios de cultivo no estén contaminados
∞ Verificar que los medios sólidos no tengan líquido de condensación en la
superficie
∞ Procurar que los medios estén a temperatura ambiente
∞ Confirmar que la autoclave llegue a la presión y temperatura requerida
∞ Usar cepas de referencia para el control de calidad de los medios

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Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

∞ Supervisar la siembra y resiembra de bacterias, para que se realice de forma

adecuada
∞ Checar que la estufa de cultivo esté calibrada
6.- CONTROL DE CALIDAD
6.1 Para efectuar el control de la calidad de los medios se pueden utilizar las
siguientes cepas bacterianas:
 Bacterias Gram positivas Staphylococcus aureus 25923

 Bacterias Gram negativas Escherichia coli 25922

7.- PRACTICABILIDAD
7.1. Para el aislamiento de bacterias se pueden utilizar otros medios de cultivo
7.2. Las cepas bacterianas Gram positivas o negativas pueden ser diferentes a las
señaladas.
8.- BIBLIOGRAFÍA
Brock, (1997) Madigan, Martinko, Parker, biología de los microorganismos. Editorial Prentice Hall, octava edición.
Koneman, Allen, Dowel (2001). Diagnóstico microbiológico, texto y atlas a color, editorial panamericana quinta
edición.
Presccott, Harlesy, KLEIN. (1999) Microbiología ed. MC GRAW-HILL. – Interamericana, cuarta edición, España S.A.
Técnicas de eliminación y de conservación de microorganismos
http://www.unavarra.es/genmic/microgral/Tema%2003.-20Eliminacion%20y%20conservacion.pdf
Esterilización y desinfección http://www.cirugest.com/Revisiones/Cir02-01/02-01-01.htm
Agentes antimicrobianos y microorganismos http://edicion-micro.usal.es/web/educativo/micro2/tema20.html
Control de microorganismos http://www.fing.edu.uy/iq/bio/Practico7_2005.pdf

∞ CUESTIONARIO
1. ¿Qué es bacteriostasis?
R=detección de la multiplicación de las bacterias.
2. ¿Cómo es la sensibilidad a los colorantes en las bacterias Gram positivas y en
las Gram negativas?
R= es las bacterias gram + la sensibilidad a los colorantes es mayor que las
gram -
3. ¿Cuál es el mecanismo de acción del mercurio sobre la bacteria?

107
Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

R= El mercurio deprime los mecanismos enzimáticos celulares mediante su

unión covalente con el azufre de los grupos sulfhidrilos De esta manera,
este metal inactiva enzimas interfiriendo con el metabolismo y funciones
de las células.
4. ¿Cuál es el mecanismo de acción del hipoclorito de sodio sobre la bacteria?
R= El proceso químico por el cual el NaOCl realiza su acción antimicrobiana
ocurre cuando entra en contacto con las proteínas tisulares, haciendo que
se formen hidrógeno, formaldehído y
acetaldehído. Las cadenas peptídicas se rompen para disolver las
proteínas; en este proceso el hidrógeno es sustituido por el cloro con
formación de cloramina, que interviene directamente como antimicrobiano,
ya que interfiere en la acción oxidativa celular con inactivación enzimática
irreversible en la degradación de lípidos y ácidos grasos; de este modo se
disuelve el tejido necrótico y el NaOCl penetra
y limpia mejor las áreas infectadas
5. ¿Qué es el coeficiente fenólico?
R= Entendemos por coeficiente fenol, coeficiente fenólico o coeficiente de
Lancet, el número que representa el valor germicida de una substancia en
relación con el fenol.

Cuantificación de microorganismos

1.INTRODUCCION:

108
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En diversos estudios microbiológicos es importante conocer con exactitud el

número de microorganismos presentes presentes en las muestras. Así en el campo
de la alimentación y la higiene es esencial conocer la carga microbiana de aguas,
alimentos, superficies de trabajo, etc. Para determinar la repercusión sanitara o la
calidad de los productos analizados. También en muestras clínicas como la orina,
el recuento es de gran interés con vistas al diagnóstico y tratamiento.
Los métodos de recuento bacteriano más utilizados son las medidas indirectas del
crecimiento microbiano como las medidas de turbidez, o medidas directas como el
recuento de colonias tras siembra de diluciones sucesivas de la muestra.
2.PRINCIPIO Y METODOLOGIA DE LA DETERMINACION:
Se suele definir el crecimiento de cualquier sistema biológico como el incremento
ordenado de todos los elementos componentes de ese sistema, lo cual complica
un aumento de la masa celular que eventualmente conduce a la multiplicación
celular. En organismos pluricelulares dicha multiplicación se traduce en un aumento
del tamaño del individuo, mientras que en unicelulares que se dividen por fisión o
por germinación, lo que ocurre es un aumento de la población.
Existen varias formas de cuantificar el crecimiento bacteriano. De forma general los
métodos se clasifican en directos e indirectos.
MÉTODOS INDIRECTOS
Entre los más frecuentes se tiene:
Medida de consumo de nutrientes o de producción de algún metabolito por unidad
de tiempo. Ejemplos: consumo de oxigeno (QO2) y consumo de carbónico (QCO2),
determinados por el respirómetro de Warburg. Producción de ácidos
Métodos turbidimétricos. La base común de estos métodos consiste en la medición
de la cantidad de luz dispersada o transmitida a través de un cultivo bacteriano.
Escala de MacFarland: Se trata de una serie de patrones de turbidez previamente
calibrados. Consiste en varios tubos de vidrio herméticamente cerrados que
contienen [1.175% de Ba Cl + cantidades de H2 SO4 al 1%] por lo tanto, en cada
tubo se origina un precipitado de BaSO4, origen de la turbidez. Para cada cepa
bacteriana hay que establecer la equivalencia entre la turbidez de cada tubo y masa
o la concentración bacterias (en cels/ml) que genera una turbidez similar.
Espectrómetro: Este aparato mida la absorbancia. La cantidad de luz dispensada
es proporcional al cociente entre el tamaño de la partícula y la longitud de onda
incidente, la sensibilidad de la técnica aumenta a longitudes de onda(ƛ) cortas.
Nefelómetro: Es un aparato similar al anterior, pero el dispositivo sensor está
situado en el Angulo respecto de la dirección de la luz incidente, y lo que se mide
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es pues, la luz dispersada directamente por la preparación. Posee mayor

sensibilidad que el espectrofotómetro
Recuento de viables de placa: consiste en sembrar pequeñas alícuotas de
diluciones adecuadas de un cultivo original de sobre placas con medio solido (con
agar). Cada célula viable dará origen a una colonia visible después de tiempo
adecuado de incubación. Contando las colonias visibles, teniendo en cuenta la
dilución de la que proceden y el volumen de alícuota utilizado, es fácil decir el
número de células viables en la suspensión original
Reencuentro sobre filtros: se usa para suspensiones diluidas de bacterias, se hace
pasar por un gran volumen de suspensión a través de una membrana de
nitrocelulosa o de nylon estériles ( con un diámetro de poro que retiene las bacterias
pero permite el tránsito de sustancias). Posteriormente, el filtro se deposita sobre
la superficie un medio de cultivo sólido. Las colonias se cuentan, deduciéndose la
concentración original de variables en función del volumen de suspensión que se
hizo pasar por el filtro.
Método del número más probable: Basado en series de diluciones y calculo
estadístico del número de bacterias presentes en las diluciones más altas. Se
puede hacer 3 o 5 tubos.
Métodos directos
Cámara de recuento de petroff-hauser: Consiste en un portaobjetos especial con
una graduación en superficie y unas medidas muy concretas. La muestra, una vez
dispensada entre el porta y el cubre se deja reposar sobre la plataforma del
microscopio durante unos minutos, y se cuenta el número de células en varias
celdillas (normalmente en 16, equivalentes a uno de los cuadros grandes). Se anota
el número de n de células observadas en esas 16 celdillas. Entonces, la
concentración celular es fácil de establecer: n×25×50×1000= concentración en
células/ml.
Contadores electrónicos de partículas (tipo coulter): Se hace pasar una suspensión
microbiana por un tubo capilar, entre los dos polos de una corriente eléctrica. Cada
vez que por un orificio (30 µm de diámetro) pasa una partícula ( p. eje., bacteria) se
interrumpe la corriente, lo cual es recogido por un dispositivo de registro electrónico,
que detecta el número y el tamaño de de las partículas que van pasando. (El
tamaño detectado es función de la intensidad del pulso de el voltaje al paso de la
partícula).
Medida de masa bacteriana. Entre los que se encuentran: determinación del peso
húmedo, determinación del peso seco, determinación del nitrógeno total: técnica de

110
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micro-kjeldahl, determinación de un componente característico: peptidoglucano,

ADN, ARN, proteínas, etc.
3.- LISTA DE REQUERIMIENTOS
3.1 reactivos

NUM. CLAVE NOMBRE DEL CONC. CANTIDAD

RECTIVO

1 Solución salina 0.85%

2 Cloruro de bario 1.175%

3 Acido sulfúrico 1%

3.2 Equipos de laboratorio

1. Microscopio de campo claro
3. Horno
4. Autoclave
3.3 MATERIAL
NUM. CANTIDAD DESCRIPCION

Matraz Erlemeyer 125 ml

Tubos de ensaye de 15×150 tapón de rosca

Asa bacteriológica

Pipetas graduadas de 10 ml estériles

Cajas Petri

Gradillas

Quemador bunsen

4.1 Medios de cultivo

 Caldo nutritivo
 Agar nutritivo

111
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4.2 Materia biológico

 Agua contaminada
 Cepas bacterianas
4.3 Preparación del sistema de medición
4.3.1 Tener los medios de cultivo a temperatura ambiente
4.3.2 Sembrar las cepas bacterianas un día antes
4.3.3 Limpiar las mesas con cloro 3%
4.3.4 Colocar los quemadores bunsen en la mesa
4.3.5 Tener listas las muestras con agua contaminada

TECNICA O PROCEDIMIENTO
a) Cuenta de colonias por dilución
1. Tomar una muestra de agua en un recipiente estéril
2. Rotule 3 tubos de ensaye de 15×150 estériles
3. Preparar diluciones de la muestra con solución salina de la siguiente manera:

Tubo N° 1 2 3
Sol. Sal. (ml)
9.9 9.9 9.9

↨ Transferir Transferir
Muestra (ml) Mezclar >0.1 ml >0.1
DILUCION
0.1

1:100 1:10000 1:100000

4. Rotular 3 cajas Petri. Marcar la primera como dilución 1:100, la segunda 1:10000
y la tercera 1.100000
5. Depositar en cada un 1 ml de la dilución correspondiente
6. Agregar a cada caja de 20 a 30 ml de agar nutritivo fundido, agitar la placa
suavemente para que se distribuya uniformemente el inocuo en el medio de
cultivo
7. Dejar solidificar los medos a temperatura ambiente
8. Una vez Solidificado incubar a 37°C colocando las placas en posición invertida
en la estufa de cultivo por 24 horas
112
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9. Seleccionar las cajas que tengan desarrollo bacteriano, contar el número de

colonias que tengan cada una.
10. Multiplicar el número de colonias por el factor de dilución
11. Reportar el número de UFC/ml

PROCESAMIENTO Y REPORTE DE RESULTADOS

DIBUJAR EL DESARROLLO OBTENIDO EN LAS CAJAS SEMBRADAS CON LAS
DILUCIONES SERIADAS REALIZDA LA MUESTRA DE AGUA
DESARROLLO BACTERIANO DESARROLLO BACTERIANO

Dilución 1:100 Dilución 1:10000

DESARROLLO BACTERIANO

Dilución 1:100000

113
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REDACTAR SUS OBSERVACIONES DEL DESARROLLO DETECTADO EN LAS

CAJAS SEMBRADAS CON DILUCIONES DE LA MUESTRA DE AGUA

DILUCION OBSERVACIONES

1:100

1:10000

1:100000

REPORTE DE RESULTADOS
UFC/ml en la muestra de agua=

REDACTAR CONCLUSIÓN

114
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Recuento de microorganismos por turbidimetria

Escala de McFarland
1. Rotular 11 tubos de ensaye de 15×150 con tapón de rosca y preparar diluciones
como se indica en la siguiente tabla:
Escala de McFarland. Preparación e interpretación
Volumen (ml) Equivalente en
Estándar N° BaCL2 H2SO4 N° de UFC/ml
(1.175%) (1%) (×108 )
0.5 0.05 9.95 1.5
1 0.1 9.9 3
2 0.2 9.8 6
3 0.3 9.7 9
4 0.4 9.6 12
5 0.5 9.5 15
6 0.6 9.4 18
7 0.7 9.3 21
8 0.8 9.2 24
9 0.9 9.1 27
10 1.0 9.0 30

2. Cerrar los tubos

3. Mezclar perfectamente cada tubo
4. El precipitado de sulfato de bario formado corresponde a la densidad de las
células de microorganismo por mililitro
Modo de uso
1. Al llevar a cabo la medición agitar con suavidad los tubos estándar
2. De manera aséptica, agregar una alícuota medida de un cultivo del caldo a probar
en un tubo estéril del mismo diámetro y tamaño que los tubos estándar
3. De manera aséptica, agregar una cantidad determinada de solución fisiológica
estéril (NaCl 0.85%) hasta que la turbidez se correlacione con el número del
estándar deseado

115
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PROCESAMIENTO Y REPORTE DE RESULTADOS

REDACTAR SUS OBSERVACIONES DE LA MUESTRA AL COMPARARALA CON
LA ESCALA DE MCFARLAND

DILUCION OBSERVACIONES

REPORTE DE RESULTADOS
UFC/ml de la muestra =
Comparada
REDACTAR CONCLUSIÓN
b) Recuento de microorganismos por el método del asa calibrada
1. Esterilizar un asa bacteriológica calibrada de 0.01ml
2. Una vez fría el asa sumergirla en la muestra, observar que quede cargada
3. Inocular una caja Petri con agar nutritivo practicando una estría cruce la parte
central del medio de cultivo (inoculación primaria ver fig 1a)
4. Sin tomar más muestra ni esterilizar el asa, realizar una estría cerrada en zigzag
de manera que intercepte la línea central de lado a lado formando ángulos de 90°
procurando diseminar el inoculo uniformemente (inoculación secundaria ver fig
1b)
5. Dar vuelta a la placa en Angulo de 90° y diseminar nuevamente el inoculo hasta
que cubra toda la superficie del agar
6. Incubar los medios durante 24 horas
7. Después del periodo de incubación contar una a una las colonias aisladas sobre
el medio y el número total de colonias multiplicarlo por 100 para calcular el
número de UFC/ml

116
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a) inoculación primaria b)estría angulo recto c)estría Angulo recto después de girar
90°
figura 1. Técnica de inoculación del medio para recuento de colonias bacterianas
PROCESAMIENTO Y REPORTE DE RESULTADOS
DIBUJAR EL DESARROLLO OBTENIDO EN LA CAJA SEMBRADA CON EL ASA
CALIBRADA
DESARROLLO BACTERIANO

ASA CALIBRADA
REDACTAR SUS OBSERVACIONES DEL DESARROLLO DETECTADO EN LA
CAJA SEMBRADAS CON EL ASA CALIBRADA

ASA CALIBRADA OBSERVACIONES

0.O1ML

117
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REPORTE DE RESULTADOS
UFC/ml de muestra de orina
REDACTAR CONCLUSIÓN

5 CONFIABILIDAD ANALITICA
5.1 Checar los medios de cultivo no estén contaminados
5.2 Procurar que las soluciones de cloruro de bario y acido sulfúrico estén recién
preparados
5.3 Supervisar la siembra y la resiembra de bacterias, para que se realice la forma
adecuada
5.4 Checar que la estufa de cultivo este calibrada
5.5 Verificar que se realicen las mediciones de las soluciones de forma correcta
5.6 Confirmar la temperatura del medio cultivo fundido antes de agregar a la
muestra de orina diluida
5.7 Confirmar la temperatura del medio de cultivo fundido antes de agregar a la
muestra de orina
5.8 Checar que los estándares y la muestra para la escala de McFarland se realicen
contra un fondo adecuado

6.CONTROL DE CALIDAD
6.1 Para efectuar el control de calidad de los medios se pueden utilizar la siguiente
cepa bacteriana:
Bacterias Gram positivas Staphilococcus aureus 25923
Bacterias Gram negativas Escherichia coli 25922

118
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7. PRACTICABILIDAD
7.1 La cuantificación de microorganismos pueden realizarse en cualquier tipo de
muestra

8. BIBLIOGRAFIA
Brock, (1997) Mdigan, Parker, biología de los microorganismos. Editorial Prentice Hall, octava edición
Koeman, Allen, Dowel (2001). Diagnostico microbiológico, trxto y atlas a color, editorial panamericana quinta edición
Presccott, Harlesy, Klein, (1999) microbiología ed. MC Graw-Hill-interamericana, cuarta edición, España s.a
METODOS GENERALES DE AALISIS
http://www.unavarra.es/genmic/curso%20microbiologia%20general/12-metodos%20de%20recuento.htm
CINETICA DEL CRECIMIENTO
http://www.monografias.com/trabajos10/10cincrec/10cincrec.shtml
iáñez Enrique Microbiología general http://fai.unne.edu.ar/biologia/microgeneral/micro-iañes/13_micro.htm
ciclo celular y crecimiento http://www.urg.es/~eianez/Microbiologia/12crecimiento.htm#_Toc58934317

CUESTIONARIO
1. cite ejemplos de métodos utilizados para medir el crecimiento bacteriano
2. ¿Por qué el recuento en placa se expresa a menudo como unidades formadoras
de colonias?
3. De dos ejemplos de aplicación en muestras biológicas de los métodos para medir
el crecimiento bacteriano
4. Escriba la reacción química que se lleva acabo al mezclar los reactivos en la
técnica de McFarland
5. Si al llevar acabo el recuento de microrganismos por turbidometria usando la
escala de McFarland la turbidez de la muestra fue comprobable con el tubo
estándar número 5 ¿Cuál es el número de microorganismos presentes’

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PRUEBAS BIOQUÍMICAS

1.- INTRODUCCIÓN
La identificación de un aislamiento bacteriano puede realizarse utilizando diferentes
combinaciones de características y diferentes criterios en la evaluación de
similitudes. Una de las pruebas tradicionalmente utilizadas en la identificación
bacteriana son los ensayos bioquímicos, ó pruebas bioquímicas convencionales.
La identificación bioquímica se fundamenta en las características metabólicas
específicas de cada microorganismo, en la detección de la actividad de ciertas
enzimas, etc. Al igual que la mayor parte de los seres vivos, las bacterias son
capaces de modificar al ambiente que las rodea, captando sustancias necesarias
para su multiplicación y liberando al medio productos de desecho, enzimas,
exotocinas etc. Las interacciones que cada tipo bacteriano establece con el entorno
son propias y características. Esta especificidad depende del genotipo de la
bacteria y se expresa en un determinado tipo enzimático. Por ello la caracterización
de dichas enzimas es una herramienta útil para la identificación y clasificación
bacterianas.
2.- PRINCIPIO Y METODOLOGIA DE LA DETERMINACIÓN
Las pruebas o ensayos bioquímicos, son pruebas simples que se han desarrollado
para demostrar de forma clara una determinada característica bioquímica como
presencia o ausencia; de una determinada actividad enzimática, grupo de enzimas
o determinada vía metabólica, crecimiento a una determinada temperatura,
crecimiento en presencia de inhibidores, etc. Para llevarlas a cabo, se pueden
utilizar diferentes sistemas de trabajo (medio de cultivo, indicador, revelador, etc.)
que puede ser diferente aun para el mismo ensayo si se trata de diferentes
microorganismos.
Existen diferentes sistemas que facilitan la realización de tales ensayos, porque
proponen el mejor conjunto de pruebas bioquímicas para la identificación de un
grupo bacteriano; simplifican la interpretación de un resultado utilizando un valor
numérico; proveen los reactivos listos para uso; son totalmente automatizables.
De forma general la realización de una prueba bioquímica implica:
1) Cultivar el microorganismo en un medio que contiene un determinado sustrato o
inhibidor y luego de la incubación visualizar el crecimiento y la degradación de
un sustrato, ya sea por viraje del indicador o por agregado de un reactivo
revelador de la presencia del sustrato, o de algún producto de su degradación.

120
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2) Cultivar el microorganismo en un medio de propagación que contenga el sustrato

de una enzima inducible y luego de la incubación demostrar la actividad
enzimática.

En todos los casos se debe de tener un cultivo fresco (18-24 hrs. De incubación)
en un medio en que el microorganismo se desarrolla en forma óptica, a pH, fuerza
iónica, atmosfera y temperatura adecuados.
Existen una gran variedad de pruebas bioquímicas empleadas con fines de
identificación, a continuación se citan algunas;
MEDIO Tratamiento
DE CULTIVO PROPOSITO INOCULACION Post Positivo Negativo
Incubación

Agar de Productor de la 24-48 h/ 37°C Yodo (2-3 Area Color negro

exoenzima gotas) clara alrededor
Almidón Amilasa alrededo del cultivo
r del
cultivo

Agar con Produccion de 24-48 h/ 37ªC Colocar en Licuefac Solidificació

gelatina la exoenzima nevera por 30 ción de la n
Siembra por minutos gelatina
Gelatinasa picadura hasta
2/3 partes del
tubo

Caldo de Determinar si la 24-48 h/ 37ªC Amarillo Rojo,

Rojo Fenol y bacteria puede (producci aumento del
Carbohidrat utilizar Inoculación por ón de pH
o carbohidratos agitacion acidos, (producción
fermenta de
ción del sustancias
 Dextrosa carbohid alcalinas por
 Manitol rato) utilizacion de
 Lactosa puede peptonas
 Sacaros haber
a producci
on de
gas

121
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MEDIO Tratamieto

DE PROPOSITO INOCULACION Post POSITIVO NEGATIVO

CULTIVO Incubación

Agar de Ver el 18-24h/ 37ªC Utilización de Utilización

tres patron de glucosa de peptonas
azucares fermentacio 1.-Siembra por
y hierro n de la picadura hasta las
bacteria 2/3 partes del tubo
(TSIA)
2- estriar

Amarillo
Utilizacion de
Lactosa y/o
sucrosa
2

En ambos
puede haber
produccion de
gas y H2S
(negro)

SIM 1.determina 24-48h/37ª Para indol:2 a 3 Rojo(anillo)- Amarillo,la

r si la gotas del reactivo presencia de bacteria no
bacteria a de kovac indol puede
traves de siembra por degradar el
triptofanas (triptofano fue triptofano
picadura hasta las degradado)
as pueden 2/3 partes del tubo
degradar el
triptofano a
indol Negro
Medio de
2.determina (precipitado)pro cultivo se
r si hay duccion de H2S queda igual
produccion
de H2S a
partir de
aminoacido
s azufrados. Difuminacion de
la bacteria hacia
3.determina los dos La bacteria
r si la solo crece
bacteria es en la linea
movil de
inoculacion

Catalasa: Determinar Desarrollo en 1 gota de H2O2 a Efervescencia Permanece

si la bacteria placa una colonia igual
Agar produce
Nutritivo catalasa
para
degradar el
H2 O2-

122
Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

MEDIO PROPOSITO Tratamiento

DE INOCULACIÓN Post POSITIVO NEGATIVO
CULTIVO Incubación

Caldo MR- Determinar 48h/37ºC 2 a 3 gotas de rojo

VP Prueba habilidad de las de metilo
de rojo de bacterias para inoculacion por Rojo, Amarillo, no
metilo producir acidos agitacion presencia de producción de
estables por acidos, pH 4 ácidos estables
fermentacion de
la glucosa 10 gotas de a
naphtol No desarrollo de
color rosa,
Color rosa, ausencia de
Determinar la
Prueba de presencia de acetoina
capacidad de
Voges- acetoina
producir 48h/37ºCinoculacion
Proskauer
acetoina por por agitación
fermentacion de
la glucosa

Simmons Utilización del 24-48 h/ 37° C Ninguno Azul Verde

citrato como
Citrate única fuente de Estriar
carbono

Caldo de Determinar si la 48h/ 37°C Ninguno Rosa intenso Medio

bacteria se permanece igual
Urea degrada en Inoculación por
urea agitación

Nitrato Determinar si la 18-24 h/ 37°C 1 gota de acido

bacteria tiene la sulfanilico
capacidad de Estriar Rojo Medio
reducir nitratos 1 gota de a permanece igual
naphtilamina (sin echar el (con el polvo de
a nitritos
polvo de zinc) zinc cambia a
Polvo de zinc rojo)

3.-LISTA DE REQUERIMIENTOS
3.1 Reactivos

123
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NUM. CLAVE NOMBRE DEL REACTIVO CONC. CANTIDAD

1 Azul de metileno

2 Agua destilada

3 Peroxido de hidrogeno 30%

4 Tetrametil para fenilen diamina 0.5%

5 Alcohol amilico

6 Para dimetil amino

benzaldehido

7 Acido clorhidrico

8 Alcohol etilico

9 Reactivos de kovacs

Acido acetilico glacial

Acido sulfanilico

Zinc en polvo

Alfa naftol

Hidroxido de potasio

3.2EQUIPOS DE LABORATORIO
1.Estufa de cultivo
2. Horno
3. Autoclave
4. Refrigerador
5. Balanza granataria
3.3 Material

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NUM. CANTIDAD DESCRIPCION

Tubos de ensayo de 13 x 100 con tapon de

rosca

Tubos de ensayo de 13 x 100

Tubos de fermentacion

Asa bacteriologica

Pipetas graduadas de 10 ml.esteriles

Pipetas pasteur

Goteros

Gradillas

Quemador bunsen

Cajas petri

4.1 Material biologico

 Cepas bacterianas

4.2 Medios de cultivo

 Caldo nutritivo
 Agar hierro kligler
 Agar de citrato de simmons
 Agar de SIM
 Caldo urea
 Agar de MIO
 Agar de lisina descarboxalisada (LIA)
 Agar Voges-Proskauer

4.3 Preparacion del sistema de medicion

4.3.1 Tener los medios de cultivo a temperatura ambiente
4.3.2 sembrar las cepas bacterianas a estudiar un dia antes
4.3.3 limpiar las mesas con cloro 3%
125
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4.3.4 colocar los quemadores bunsen en la mesa

TECNICA O PROCEDIMIENTO
1. Preparar los medios de cultivo para las diferentes pruebas bioquimicas a estudiar
2. Inocular cada una de acuerdo al tipo de medio
3. Incubar a 37ºC durante 24 horas
4. Leer e interpretar cada prueba

A)Prueba de la catalasa
Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra el la
mayoria de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen
citromo.La principal excepcion es Streptococcus
Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes
generos:
 Streptococcus(-)de micrococcus(+)y/o staphyñococcus(+)
 Bacillus(+) de clostridium(-)
 Lysteria monocytogenes(+) y/o corynebacterium (+,con las excepciones de
C.pyogenes y C.haemolyticum.ambos (-)de Erysipelothrix(-)

Tecnica
1. Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24 horas y
colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio
2. Agregar con gotero o pipeta pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre el
microorganismo sin mezclarlo con el asa
3. Observar la formacion inmediata de burbujas(resultado positivo)
4. Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante
5. Si se invierte el orden del metodo (extender la colonia sobre el agua oxigenada
)pueden producirse falsos positivos
Interpretacion de la prueba

Pueba positiva : Inmediata liberacion de burbujas

Prueba negativa : Ausencia de burbujas
B)Prueba de la oxidasa
Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reaccion
de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citromooxidasa que activa la
oxidacion de citocromo que es reducido por el oxigeno molecular que produce agua
126
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o peroxido de hidrogeno según la especie bacteriana. El oxigeno actua por tanto

como aceptor final de electrones en la cadena transportadora de electrones.por lo
general ,el sistema citromooxidasa solo se encuentra en los organismos aerobios
,algunos anaerobios facultativos y,excepcionalmente ,en algun microaerófilo (Vibrio
fetus), pero los anaerobios estrictos carecen de actividad oxidasa. Asimismo, la
presencia de la oxidada va ligada a la producción de catalasa, ya que está degrada
el peroxido de hidrógeno que se produce como consecuencia de la reducción del
oxígeno y cuya acumulación es tóxica
Método en placa directa
 Agregar directamente 2-3 gotas de reactivo Kovacs 1% a algunas colonias. No
inundar toda la placa invertirla.
 Observar los cambios de color. Con el reactivo de Kovacs la reacción se produce
en unos 10-15 segundos
Interpretación de la prueba
Prueba positiva : Color púrpura
Prueba negativa : Incoloro
Método indirecto sobre papel
 Colocar un trozo de papel filtro de 3x3 cm aproximadamente en una placa de
Petri, o porta objeto limpio.
 Agregar 2-3 gotas del reactivo de tetrametilen para fenilen diamina al 0.5% en el
centro del papel.
 Tomar con el asa de siembra la colonia de la placa EMB
 Poner la colonia sobre la tira de papel en la zona que contiene el sustrato y
extenderla cuidadosamente con el asa de siembra.
 Esperar 20-60 segundos y observar si existe algún cambio en la coloración.
Interpretación de la prueba
Prueba positiva : Presencia de color azul o morado oscuro en el sitio donde colocó
la colonia bacteriana.
Prueba negativa : Ausencia de color en el sitio donde se colocó la prueba
bacteriana.

C) Pruebas en el medio SIM

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Medio semisolido diferencial, para estudios bioquímicos de enterobacterias. Se

puede comprobar la formación de sulfuro, índol y movilidad. El tripfano puede ser
oxidado por ciertas bacterias para formar tres metabólicos: índol, escatol e
indolacetico. El indol se manifiesta con el reactivo de Kovacs formando un anillo
rojo en la superficie del medio. El ácido sulfhudrico que se libera por acción de los
microorganismos sobre los aminoácidos azufrados, se combina con sales de fierro
presentes en el medio, produciendo una reacción que se manifiesta con un
precipitado negro en el medio. La movilidad se observa porque al haber una
cantidad menor de agar que la normal de los medios sólidos, los microorganismos
móviles pueden desplazarse fácilmente por todo el medio produciendo túrbidas
alrededor de la picadura.
Técnica
 Inocular los microorganismos aislados por picadura en un tubo de medio SIM.
 Incubar 24-48 horas a 37 C.
 Leer la presencia de movilidad y producción de ácido sulfhidrico
 Agregar 0.5 ml de reactivo de Kovacs, leer inmediatamente
Interpretación de la prueba
Prueba Resultado negativo. Resultado positivo.

Movilidad. Crecimiento a lo largo de la Microorganismos migran desde

linea de siembra, el medio la línea de siembra y se difunde
que la rodea permanece en el medio (medio turbio)
claro.
Indol. Anillo turbio amarillo en la. Anillo fucsia brillante en la interfase
Interface del medio (color del medio.
del reactivo).
Ácido Ausencia de ennegrecimiento Cualquier ennegrecimiento del
Sulfhidrico. del medio. medio.

Ejemplos:

128
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Microorganismos cepa Movilidad Indol Sulfhídrico

Escherichia coli ATCC + + -

25922

Salmonella ATCC + - +
typhimurium 14028

Proteus vulgaris ATCC + + +

8427

Shigella flexneri ATCC - - -

12022 o
9199

D)pruebas en el medio de kligler

Medio de cultivo para la diferenciación bioquímica de enterobacterias ,en base a la
fermentación de la glucosa ,lactosa y la capacidad de producir acido sulfhídrico .la
fermentación en este medio tiene lugar tanto en aerobiosis (pico de flauta)como en
anaerobiosis (fondo). En el pico de flauta la glucosa es catabolizada inicialmente
por la vía metabólica anaeróbica de Embden-Mayerhof-Parnas ,usada por aerobios
y anaerobios para producir el acido pirúvico ,el cual es degradado en el ciclo de
Krebs por aerobios o anaerobios facultativos para producir CO2 H2O y energía. En
el fondo del tubo la glucosa sufre una degradación anaeróbica
(fermentación)formando productos finales ácidos ,los que acidifican el medio y
hacen que el indicador vire a amarillo ,la reacción acida se mantiene en el fondo
debido a la tensión de oxigeno baja, base que sirve para la lectura de la
fermentación de la glucosa. Los microorganismos que no fermentan lactosa del
medio utilizan la glucosa ,cuando este se agota se empiezan a usar las peptonas
como nutrientes para su desarrollo . el catabolismo de la peptona libera amoniaco
que alcaliniza el pH del medio haciendo que el indicador vire a rojo (pico de
flauta),sin embargo el fondo tiene un color amarillo debido a la degradación
anaeróbica dela glucosa .en el fermentación de glucosa como de lactosa se
observa vire del indicador rojo de fenol a amarillo en todo el medio . No obstante
,hay que tomar en cuenta que si el medio donde se sembró un microorganismo
fermentador de glucosa fuera leída antes de 12 horas el pico de flauta estaría acido,
debido a que la glucosa no esta completamente agotada dandouna reacción falsa
positiva para lactosa. De manera similar si el tubo de kligler se lee después de 48
horas el pico de flauta y el fondo pueden ser alcalinos (rojos) lo que indicaría que
129
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ningún carbohidrato fue fermentado .al agotarse la glucosa del medio, los ácidos
estables del fondo del tubo se oxidan y los microorganismos empiezan a usar las
peptonas como nutrientes lo que da como resultado un pH alcalino y resultados
falsos .por otra parte se tiene que en el medio de kligler ,las bacterias que producen
H2S a partir del tiosulfato de sodio se manifiestan por una colaboración negra
debido a la reacción del H2S con el citrato férrico de amonio con la consecuente
formación de burbujas o desplazamiento del medio.
Para obtener buenos resultados es importante tomar en cuenta que el medio de
cultivo se debe inocular por estria en la superficie y picadura hasta las 2/3 partes
del tubo e incubar de 18 a 24 h a 35ºC
Técnica
1. Con el asa bacteriológica recta inocular en un tubo de medio kligler los
microorganismos a estudiar
2. La siembra se hara de la siguiente manera:sembrar la superficie por estria y
sembrar la parte interna del medio por picadura ,hasta las 2/3 partes del
tubo.incubar 18 a 24 horas a 35ºC .Observar e interpretar los cambios producidos
en el medio
Características del medio
Medio preparado: rojo
Lectura
Reacción del medio Color del medio Interpretación de la reacción

Pico alcalino/fondo Pico rojo/fondo amarillo El microorganismo solo

acido fermenta glucosa

Pico acido/fondo acido Pico amarillo/fondo amarillo El microorganismo fermenta

glucosa, y lactosa

Pico alcalino/fondo alcalino Pico rojo/fondo rojo El microorganismo es no

fermentador de azucares

La presencia de burbujas Ruptura del medio de Indica que el microorganismo

cultivo produce gas

Ennegrecimiento del El microorganismo produce

medio acido sulfhídrico

130
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Ejemplos:

Microorganismo Cepa Pico/fondo Producción de gas Producción de acido

sulfhídrico

E.coli ATCC 25922 A/A + -

K.pneumoniae ATCC 700603 A/A + -

P.mirabilis ATCC 43071 K/A + +

S.typhimurium ATCC 14028 K/A - +

S.enteritidis ATCC 13076 K/A + +

S.flexneri ATCC 12022 K/A - -

P.aeruginosa ATCC 27853 K/K - -

Nomenclatura: A: ácido K:alcalino

E)prueba en el medio de citrato de Simmons

Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como
única fuente de carbono y compuesto amoniacales como única fuente de nitrógeno
en su metabolismo . El metabolismo del citrato se realiza ,en aquellas bacterias
poseedoras de citrato se realiza ,en aquellas bacterias poseedoras de citratos
permeasa ,a través del ciclo del acido tricarboxilico.
Ed desdoblamiento del citrato de progresivamente ,oxalacetato y piruvato. Este
ultimo, en presencia de un medio alcalino ,da origen a ácidos orgánicos que ,al ser
utilizados como fuente de carbono ,producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos
,el medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la producción de citrato
permeasa.

131
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El agar citrato es Simmons contiene citrato de sodio y fosfato de amonio como

fuentes de carbono y de nitrógeno respectivamente y azul de bromotimol como
indicador de pH .solo las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán
multiplicarse en el .

Limitaciones
-Si se usa un inóculo denso para sembrar el medio de cultivo, puede variar el
color del pico del verde al amarillo-amarronado.
Esto no afecta el color verde del resto del medio de cultivo, pero puede afectar
la visualización azul de un resultado positivo.
-Inóculos muy densos, pueden originar resultados falsos positivos.
-Cuando se siembra una serie de pruebas bioquímicas a partir del mismo cultivo,
se debe esterilizar la aguja de inoculación antes de inocular la prueba del citrato
o sino inocularla primero. Cualquier arrastre de materia orgánica puede originar
resultados falsos positivos.

F) Reacción de la ureasa
Se empieza para la diferenciación de bacterias por medio de la utilización de la
urea como única fuente de carbono. La enzima ureasa hidroliza la urea en 2
moléculas de amoniaco y anhídrido carbónico, con la resultante alcalinidad. El
indicador rojo de fenol, vira de amarillo claro a ligeramente rosado o rosa
mexicano. La ureasa es una importante enzima microbiana relacionada con la
descomposición de los compuestos orgánicos, es de tipo constitutivo debido a
que es sintetizada por ciertas bacterias sin tomar en consideración la presencia
o la ausencia de su sustrato (la urea). Desde un principio, la enzima fue
característica de todas las especies de Proteus y se utiliza sobre todo para
diferenciar los microorganismos Proteus rápidamente ureasa positivos de otros
miembros de la familia Enterobactereaceae, que dan una reacción positiva
tardía.

Técnica

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1. Inocular con bacterias el medio de Caldo de urea

2. Incubar 24 a 48 horas a 35°C.
3. Observar e interpretar los cambios producidos en el medio.

Interpretación de la prueba
Prueba positiva : Medio vira a rojo
Prueba negativa : Medio de no cambia de color

Las pruebas de descarboxilasa se utilizan sobre todo para determinar grupos

bacterianos entre los miembros de la familia. Enterobacteriaceae,
especialmente del Género Salmonella (excepto Salmonella paratyphiA, que es
lisina descarboxilasa negativa). Edwarsiella, Klebsiellapneumoniae,
Enterobacteraerogenes, Serratiamarcescens, que dan la prueba positiva por
arriba del 80%.
Presentan prueba Negativa los Géneros Shigella, Citrobacter,
Enterobactercloacaey el grupo Proteus.- Providencia. Las colonias
seleccionadas se inoculan estriando el agar inclinado (pico de flauta) y con
doble picadura en el centro sin tocar el fondo del tubo.
TECNICA
1. Inocular con bacterias el medio de agar lisina descarboxilasa(LIA)
2. Incubar 24a 48 horas a 37°C.
3. Observar e interpretar los cambios producidos en el medio.
Características del medio
Medio preparado: color violeta
Prueba Resultado negativo Resultado positivo

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Decarboxilación de la Pico violeta/fondo amarillo Pico violeta/fondo púrpura

lisina (en anaerobiosis y
en presencia de ácido)

Desaminación Pico amarillo/fondo amarillo Pico rojo/fondo amarillo Esto sucede con
capas del género Proteus, Providencia y
De la lisina (en aerbiosis) algunas capas de Morganellaspp.

Producción de ácido Ausencia de ennegrecimiento del Ennegrecimiento del medio

sulfhídrico medio (especialmente en el límite del
pico y fondo)

Ejemplo
MICROORGANISMO CEPA RESULTADOS

SUPERFICIE FONDO H2S

Citrobacterfreu ATCC Sin cambio Acido-Amarillo + (-)

ndii 8090

Shigellaflexneri ATCC 12022 Sin cambio Acido-Amarillo -

O 9199

Salmonella ATCC 14028 Alcalina- Púrpura Alcalina- +

typhimurium Púrpura

Proteusvulgaris ATCC 8427 Rojo Acido-Amarillo - (

+)
Serratiamarces ATCC Alcalina- Púrpura Alcalina- -
cens 13880 Púrpura

Citrobacterfreu ATCC 8090 Alcalina- Púrpura Acido-Amarillo +

ndii

Klebsiellapneumoniae ATCC Alcalina- Púrpura Acido-Amarillo -

10031

Salmonella ATCC 14028 Alcalina- Púrpura Alcalina- +

typhimurium Púrpura

Proteusvulgaris ATCC Roja Acido-Amarillo - (+)

8427

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Serratiamarces ATCC Alcalina- Púrpura Alcalina- -

cens 13880 Púrpura

H) pruebas en el medio de MIO

Para la diferenciación de Enterobacterias, basándose en las pruebas de movilidad,
ornitinadescarboxilasa y la producción de indol. Las peptonas proporcionan las
fuentes de nitrógeno y carbono, el extracto de levadura proporciona vitaminas y la
dextrosa es la fuente de energía.
Inocular el medio de cultivo por picadura. Incubar 18-24 h a 35°C. La prueba de
movilidad se pone de manifiesto por turbidez difusa alrededor de la línea de
inoculación. La descarboxilasa tiene la facultad de descarboxilar el aminoácido
ornitina formando la amina putrescina y liberando bióxido de carbono (coloración
violeta-púrpura). El triptófano por acción de la triptofanasa forma indol y otros
compuestos (escatol e indolacético), al agregar reactivo de Kovacs (p NN
dimetilaminobenzaldehido), se produce un compuesto de color rojo.

TECNICA
1. Inocular con bacterias el medio de agar MIO (picadura)
2. Incubar 24 a 48 horas a 37°C.
3. Observar e interpretar los cambios producidos en el medio.

Interpretación de la prueba
Prueba Resultado negativo Resultado positivo
Movilidad Crecimiento a lo largo de la línea de Microorganismos migran
siembra, el medio que la rodea desde la línea de siembra
y
permanece claro se difunde en el medio
(medio turbio)
Ornitina Amarillo en el fondo Violeta-púrpura
Descarboxilasa
Indol Anillo turbio amarillo en la interfase Anillo rojo brillante en la
del medio (color del reactivo) interfase del medio
135
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Ejemplo
RESULTADO

MICROORGANISMO CEPA Movilidad Indol Ornitina

Escherichia coli ATCC + + +

25922

Klebsiella pneumoniac ATCC - - -

10031

Proteus mirabilis ATCC + - +

12453

Enterobacter aerogenes ATCC + - +

13048

Salmonella enteritidis ATCC + - +

S-031

I) Reacción de Voges-Proskauer
La prueba de Voges-Proskauer se basa en la detección de acetoina, un producto
final neutro, acetil metilcarbinol (AMC, acetoina), derivado del metabolismo de la
glucosa. La glucosa se metaboliza a ácido pirúvico, el principal intermediario en la
glúcolisis. A partir de ácido pirúvico, las bacterias pueden seguir muchos caminos
metabólicos; la producción de acetoina es una de las vías metabólicas de la
degradación de la glucosa de las bacterias. La prueba de Voges-Proskauer (VP)
para la acetoina se utiliza sobre todo para separar Escherichia coli de los grupos de
Klebsiella – Enterobacter, aunque otros miembros de la familia Enterobactereaceae
pueden producir resultados positivos de VP. Los miembros de la familia
Enterobactereaceae se clasifican de manera característica como fermentadores de
ácido mixtos o del ácido fórmico, lo que indica que sus productos finales de la
fermentación de la glucosa son ácidos: ácido fórmico, ácido acético, ácido succínico,
etanol, hidrógeno y dióxido de carbono. Los fermentadores de ácidos mixtos pueden

136
Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

ser divididos posteriormente en dos grupos: a) los que producen ácidos, pero no 2,3-
butanodiol (o 2,3-butileno glicol), como E coli (VP-) y b) los que
producen 2,3- butanodiol como sus principales productos finales, como los grupos
Klebsiella – Enterobacter (VP+).
El principal producto final de la utilización del piruvato de los grupos Klebsiella –
Enterobacter especies de Serratia, especies de Bacilus y muchos otros
microorganismos es el 2,3- butanodiol. Sin embargo la prueba de VP se basa en la
detección de acetoina, un precursor en la producción del 2,3- butanodiol. Una
molécula de acetoina se forma por la descarboxilación de dos moléculas de ácido
pirúvico. Harden y Walpole establecieron que la acetoina es un estadío intermedio
en la conversión de 2,3- butanodiol. Tanto la acetoina como el 2,3- butanodiol son
productos neutros de la fermentación de la glucosa. Las especies que llevan a cabo
la fermentación a butanodiol de la glucosa acumulan acetoina en el medio. Las
bacterias se inoculan en caldo glucosa-peptona, las especies que llevan a cabo la
fermentación butanodiólica de la glucosa forman acetoina en el medio. Se añade
alfanaftol y creatinina en medio alcalino. La acetoina se convierte en diacetilo con la
aparición de un color rojo

Técnica
1. Inocular con bacterias el medio de Voges-Proskauer
2. Incubar 24a 48 horas a 37°C.
3. Agregar 0.6 ml de alfa naftol al 5%, mezclar bien y agregar 0.2 ml de KOH al
40% a 2.5 ml de cultivo y agitar
4. Agitar vigorosamente el tubo, y dejar a temperatura ambiente durante 10-15
minutos
5. Observar e interpretar los cambios producidos en el medio.

Interpretación de la prueba
Prueba positiva : Desarrollo de un color rojo en poco minutos después de
una completa agitación del tubo.
Prueba negativa : Ausencia de color rojo.

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Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

Microorganismo Cepa Crecimiento VP

E. coli ATCC Bueno -

25922

K. pneumoniae ATCC Bueno +

700603

P. mirabilis ATCC Bueno -

43071

S. typhimurium ATCC Bueno -

14028

Citrobacter freundii Bueno -

Enterobacter aerogenes Bueno +

Limitaciones

En algunas cepas positivas para la prueba VP, pueden no desarrollar el color rojo en
la superficie mediante el revelado por la metodología descrita anteriormente.
En estos casos, se recomienda calentar el medio de cultivo para favorecer el
desarrollo de color rojo.

Caracteristicas del meido

Medio preparado: ámbar claro, transparente sin precipitado.

Almacenamiento
Medio deshidratado: a 10-35°C.
Medio preparado: a 2-8°C.

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PROCESAMIENTO Y REPORTE DE RESULTADOS

Pruebas Bioquimicas

DE ACUERDO AL DESARROLLO OBTENIDO EN LOS DIFERENTES MEDIOS

INOCULADOS REDACTAR SUS OBSERVACIONES EN EL SIGUIENTE CUADRO

MEDIO ESTADO COLOR RESULTADO

MIO Solido Violeta (+) amarillo

Kigler Solido Rojizo (+)rojo intenso

Caldo de urea Liquido Rosa (+) verde

139
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Citrato de Solido Azul

Simmons

LIA Solido Violeta Purpura

Malonato Liquido Verde Azul

DE ACUERDO A LAS BIOQUÍMICAS REALIZADAS ELABORAR ESQUEMAS

REPORTE DE RESULTADOS
(Indicar familia, género, especie del microorganismo identificado)

Microorganismo aislado: __Escherichia coli__________________________

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5.- CONFIABILIDAD ANALÍTICA

5.1. Checar que el material se lave de la manera adecuada
5.2. Revisar que los medios no estén caducados o hidratados
5.3. Checar el pH de los medios preparados
5.4. Confirmar que la autoclave llegue a la presión y temperatura requerida
5.5. Cuidar el tiempo que expone el medio a la esterilización

6.- CONTROL DE CALIDAD

7.1 La viabilidad de los medios debe probarse con cepas certificadas de

Escherichia coli 2592

8.- PRACTICABILIDAD

8.1 Para esta práctica se puede utilizar cualquier medio procurando tener al
menos, 6 pruebas bioquímicas diferentes

Bibliografía
MacFaddin (2003). Pruebas Bioquímicas para la de bacterias de importancia clínica, tercera edición. Editorial
Panamericana. Buenos Aires Argentina
Gamazo Carlos (2005). Manual Práctico de Microbiología, tercera edición. Editorial Masson, Barcelona España

141
Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

Koneman W. Elmer (2001). Diagnóstico Microbiológico texto y atlas a color. Quinta edición. Editorial Médica
Panamericana. Madrid España
Identificación de una cepa bacteriana
http://www.qb.fcen.uba.ar/microinmuno/SeminarioPruebasBioquimicas.htm
Identificación de bacterias http://bilbo.edu.uy/-microbio/identific02.html

CUESTIONARIO
1. ¿Qué son las pruebas bioquímicas?
R= Determinan la actividad metabólica de una cepa pura. Son empleadas
principalmente la identificación y clasificación de bacterias
2. ¿Cuáles son los medios de cultivo indicados para estudiar movilidad en una
bacteria?
R=Prueba bioquímica MIO
3. ¿Por qué en el Medio de Kligler se debe sembrar por picadura y estría?
4. ¿Cuáles son las reacciones que se llevan a cabo en un medio de TSI?
Indicar cómo y en que parte del tubo se efectúan
5. ¿Qué indica una prueba de citrato positiva?
R= Esta prueba nos permite diferenciar un grupo de bacterias que son capaces
de crecer con citrato como única fuente de carbono y sales amónicas inorgánicas
como única fuente de nitrógeno, provocando la alcalinización del medio.
6. ¿Qué indica una prueba de catalasa positiva?
R= La presencia de bacterias Gram +

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Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

ANEXOS:

A.- REACTIVOS

A1.- Acido sulfanílico y alfa naftilamina para nitritos

Solución A
Ácido sulfanílico…………..... 0.8 g
Ácido Acético 5 N…………. 100 ml
Disolver por calentamiento suave

Solución B
Alfa naftilamina……………... 0.5 g
Ó
NN, dimetil -1-naftilamina.... 0.5 g

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Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

Acido Acético 5 N………….. 100 ml

Disolver por calentamiento suave

Nota: Alfa naftilamina es carcinógena, en el nn, dimetil -1-naftilamina no se ha

Comprobado esto, sin embargo, se debe trabajar con cuidado evitando formar
Aerosoles, pipetear y el contacto con la piel.

A2.- Ácido sulfúrico al 1%

Ácido 1 ml
sulfúrico………………………….
Agua destilada ……………... 99 ml

A3.- Solución de alcohol-ácido

Alcohol etílico al 95%.............. 97 ml

Alcohol clorhídrico …………. 3 ml

A4.- Solución de alcohol – cetona

Alcohol etílico…………………......... 2 ml
Acetona ……………………………. 1 ml

A5.- Solución de Cloruro de bario 1. 175%

Cloruro de bario…………………. 1.175 gr

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Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

Agua destilada…………………... 100 ml

A6.- Solución de hidróxido de sodio 1N

Hidróxido de sodio……………. 40 gr
Agua destilada……………………. 1 L

A7.- Reactivo de Kovacs

Alcohol amílico o butílico……… 150 ml
p- dimetil amino benzaldehído. 10.0 g
Ácido clorhídrico concentrado…… 50.0 ml
Disolver el aldehído en alcohol en baño María a 50-
60° C. Agregar lentamente el ácido a la mezcla fría.
Guardar en frasco ámbar en el refrigerador

A8.- Reactivo de Ehrlich para prueba de Indol

Alcohol etílico……………………. 95.0 ml
P- dimetil amino benzaldehído. 1.0 g
Ácido clorhídrico concentrado…. 20.0 ml
Disolver el aldehído en alcohol. Agregar lentamente
el ácido a la mezcla fría. Guardar en frasco ámbar
en el refrigerador

A9.- Solución mordiente Yodo-ioduro de potasio (lugol)

Yodo………………………………. 1.0 g
Yoduro de potasio………………. 2.0 g
Agua destilada…………………… 300 ml

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Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

B.- COLORANTES
Azul de metileno

Azul de metileno……………… 0.3 g

Alcohol metílico ………………. 30 ml
Agua destilada ………………. 100 ml

Azul de metileno (contraste para Ziehl- Neelsen)

Azul de metileno……………. 0.3 g
Alcohol metílico ……………. 30 ml
Agua destilada ……………… 100 ml
Solución acuosa de potasa 1/100 100 ml

Cristal violeta oxalatada

Solución A
Cristal violeta ……………………. 2.0 g
Alcohol etílico …………………… 20 ml
Mezclar y disolver

Solución B
Oxalato de amonio ……………… 8.0 g
Agua destilada …………………. 80 ml
Mezclar y disolver
Empleo: agregar la solución A, a solución B
conservar durante 24 hrs. filtrar antes de usar

146
Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

Safranina 0 al 2,5%

Safranina O ……………………... 2,5 g

Alcohol etílico……………………. 100 ml

Modo de empleo:
Solución madre …………………. 10 ml
Agua destilada …………………. 90 ml

Colorante de Fucsina básica

Fucsina básica …………………. 3.0 g
Alcohol etílico ……………………. 100 ml

Modo de empleo:
Solución madre ………………… 10 ml
Agua destilada …………………. 90 ml

Solución de fenicada de Ziehl

Solución A
Fucsina básica………………… 0.3 g
Alcohol etílico…………………. 10 ml

Solución B
Fenol (cristal fundido) …………. 5.0 ml
Agua destilada…………………. 95 ml

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Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

Empleo: Mezclar la solución A y B

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE BIOANALISIS

Laboratorio de
Microbiología general

Reporte de prácticas

Nombre de práctica ____________________________________

_____________________________________
_____________________________________

148
Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de laboratorio

Nombre del alumno _____________________________________

_____________________________________

Sección _____________________________________

Fecha de realización de
la práctica ____________________________________

Fecha de reporte de la
práctica ____________________________________

Firma al terminar la
práctica ____________________________________

149