TALLER SUBREGIONAL

SOBRE ASEGURAMIENTO DE CALIDAD Y

VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA
ANÁLISIS QUÍMICOS

Dra. Nora Angelini

Consultora Internacional de la FAO
VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA
PARA ANÁLISIS QUÍMICOS

Dra. Nora Angelini

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 VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA ANÁLISIS QUÍMICOS

VALIDACIÓN
Es la confirmación mediante el suministro de evidencia
objetiva de que se han cumplido los requisitos para
una utilización o aplicación específica prevista

VERIFICACIÓN
Es la confirmación mediante el aporte de evidencia
objetiva de que se han cumplido los requisitos
especificados
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VALIDACION DEL METODO

Es el proceso para establecer las características de

funcionamiento y limitaciones del método y la
identificación de influencias que pueden cambiar estas
características y hasta que punto; cuando el método
se desarrolla sin un problema particular previsto

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Definición de la aplicación, Protocolo evaluado y

propósito y alcance del método autorizado por el
Supervisor
Sustancias y
matrices Materiales, patrones
DISEÑO y reactivos
VALIDACION especificados
Cualitativo o cuantitativo,
LD, LC, rango lineal, Características
precisión y exactitud de equipos

Parámetros de rendimiento Diseño de experimentos

y criterio de aceptación Dra. Nora Angelini
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Experimentos de
pre-validación Método aprobado
incluirlo en el Manual
de Procedimientos
Ajustar Analíticos
parámetros del EJECUCION
método
POE para ejecutar el
método en la rutina
Ajustar criterios
de aceptación
Realizar experimentos de validación
interna en forma completa

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Criterios para aceptación datos y revalidación.

Requisitos seguridad. Conclusiones
Experimentos
Control calidad, Curva de
y resultados
calibración, Incertidumbre
Objetivo y alcance
(aplicabilidad, tipo) Preparación muestra,
INFORME estadística y cálculos
Sustancias
Parámetros del
y matriz
método y críticos
Drogas, reactivos,
Controles de calidad
patrones y controles
patrones y drogas
Lista equipos y requisitos
funcionamientos y rendimiento Dra. Nora Angelini
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FORMATO PROCEDIMIENTO DE VALIDACION

En todas las hojas en el encabezado o al pie de página

debe constar los siguientes datos:
Organismo
Laboratorio
Título: Validación de.....
Código: PP (Procedimiento particular número)
Página 1 de
Versión: 1
Fecha de entrada en vigencia:
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FORMATO PROCEDIMIENTO DE VALIDACION

CONTENIDO
Objetivo
Alcance
Areas afectadas
Responsabilidades
Relaciones
Desarrollo
Registro y Archivo
Anexos
Histórico
Referencias Dra. Nora Angelini
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SUSTANCIAS que se pueden determinar

MATRICES y en la presencia de qué
interferencias
CONDICIONES
NIVELES DE PRECISIÓN y EXACTITUD
que se pueden lograr
Proceso para verificar que un método es
ADECUADO para ese PROPÓSITO

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VALIDACIÓN DE INSTRUMENTAL

Proceso para establecer que un

instrumento opera según la especificación

Se logra mediante calibración o control del

funcionamiento

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ADECUADO PARA EL PROPÓSITO

Proceso de medición que le permiten al usuario
tomar decisiones técnica y administrativamente
correctas para un propósito preestablecido

BUENOS RESULTADOS ANALÍTICOS

Pueden identificarse 6 principios de la práctica
analítica, los cuales cuando se implementan
simultáneamente, conducen a una buena práctica
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1. Mediciones analíticas deben satisfacer requisito acordado

2. Utilizar métodos y equipos probados que aseguren son
aptos para un determinado propósito
3. Personal que realiza las mediciones competente y
calificado
4. Verificación externa y periódica de la competencia técnica
del laboratorio
5. Mediciones analíticas realizadas en un laboratorio
consistentes con las que se realizan en otro
6. Quienes efectúan mediciones analíticas deben tener POE
de control de calidad y de aseguramiento de la calidad
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Razones para validar un método

Si el resultado de un ensayo no es confiable, no es útil

y es mejor no realizarlo
El cliente recurre a un laboratorio porque necesita
resolver un problema y confiar en los resultados
El analista tiene que garantizar que los resultados son
adecuados para el uso destinado, para resolver el
problema del cliente y expresados de manera que él pueda
entenderlos y utilizarlos para tomar decisiones
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Razones para validar un método cont.

La validación del método demuestra que el método

utilizado es adecuado para el propósito

Implica que se conoce el comportamiento del método,

que se evalúa la incertidumbre, de modo que el
usuario esté seguro del grado de confianza que puede
tener el resultado

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Acciones para validar un método

1. Conjunto de pruebas utilizadas para establecer que un

método es apropiado para un determinado propósito

2. Está implícito que los estudios se realizan utilizando

equipos que cumplen con las especificaciones, que
funcionan y que están calibrados correctamente; que el
operador está capacitado para tomar decisiones
apropiadas durante los estudios
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Criterios según categoría de método

Categoría I: cuantificación de materia prima o principio

activo en producto terminado
Categoría II: determinar impurezas en materia prima o
compuestos de degradación en producto terminado y
análisis de residuos en material biológico o alimentos
Categoría III: determinar las características de
funcionamiento como disolución o liberación de droga

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CRITERIOS SEGUN CATEGORIA

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Criterios según tipo de método

Método Normalizado Modificación de Método Método Interno

Normalizado

Comprobar que el Comprobar que el Laboratorio Comprobar que el

Laboratorio domina el domina el ensayo y lo utiliza Laboratorio domina el
ensayo y lo utiliza correctamente ensayo y lo utiliza
correctamente correctamente

Exactitud Exactitud Exactitud

Repetibilidad Repetibilidad Repetibilidad
Incertidumbre Reproducibilidad Reproducibilidad
Límite de Detección (si No difieren del método Son suficientes para el
la Norma lo indica) original objetivo de aplicación

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Método Modificación de Método Interno

Normalizado Método Normalizado

Determinar: Determinar: Determinar:

S
E
Intervalo de trabajo Intervalo de trabajo Selectividad
Linealidad Linealidad Linealidad G
Recuperación Recuperación Exactitud U
Robustez Robustez Intervalo de trabajo
Selectividad Selectividad Repetibilidad
N
Estabilidad Estabilidad Reproducibilidad
Reproducibilidad Reproducibilidad Estabilidad M
Límite detección
Límite cuantificación E
Recuperación T
Robustez O
Sensibilidad
Incertidumbre D
O
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En todos los casos

Realizar Carta de control con los resultados

de materiales de referencia

Controles Intralaboratorios

Participar en ensayos interlaboratorios

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EXACTITUD
Es la cantidad que se refiere a las diferencias entre la
media de una serie de resultados o un resultado individual
y el valor que se acepta como verdadero o valor correcto,
para la cantidad medida
[IUPAC Compendium of Chemical Technology, 1985]]]

Proximidad entre el resultado de una medición y el valor

verdadero
Grado de concordancia entre el resultado de ensayo y el
valor de referencia. Se obtiene determinando la veracidad
y la precisión
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VERACIDAD (SESGO)

Grado de concordancia entre el VALOR MEDIO

OBTENIDO de una serie de mediciones y el valor de
referencia. Se expresa como sesgo

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Analizar un MRC con matriz

igual a la muestra
Si no hay MRC realizar ensayo
de recuperación, mínimo 10
repeticiones del ensayo 3 días
consecutivos
Comparar el promedio de los
valores obtenidos (X) con el
valor de referencia certificado,
considerar la incertidumbre del
material. La diferencia da el
sesgo del método: s = X - MRC Dra. Nora Angelini
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VALOR
Valor aceptado que sirve como referencia de
comparación previamente acordado y el cual deriva de:
A. Establecido o teórico, basado en principios
científicos
B. Asignado o certificado, basado en el trabajo
experimental de organizaciones nacionales e
internacionales
C. Consensuado o certificado, basado en trabajo
experimental colaborativo
D. Cuando a), b) y c) no es posible, la medición de una
cantidad [ISO 3534-]
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VALOR VERDADERO
Es el consistente con la definición de una cantidad
particular dada
[VIM 1993]
VALOR VERDADERO CONVENCIONAL
Atribuido a la cantidad particular y aceptada, algunas
veces por convención, que tiene una incertidumbre
adecuada para el propósito dado
[VIM 1993]

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PRECISION
Es la proximidad entre
resultados de análisis
independientes obtenidos bajo
condiciones estipuladas
Depende sólo de la distribución
de los errores aleatorios y no
se relaciona con el valor
verdadero o valor especificado.
Se computa como desviación
estándar de los resultados de
los análisis [ISO 3534-1]
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VERACIDAD (SESGO) Y PRECISION

VALOR VERDADERO

X X X X X X XXXXXX
MAS VERAZ MENOS VERAZ
MENOR SESGO MAYOR SESGO
MENOS PRECISO MAS PRECISO

CONCENTRACION (X)
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DESVIACION ESTANDAR

Es la medida de cómo se dispersan los valores alrededor

de la media en la distribución de valores: La desviación
estándar  para toda la población de valores n
En la práctica usualmente se analiza una muestra y no la
población, la desviación estandar de la muestra esta dada
por
s ó DS: { (Σ (xi – x )2 /n-1}1/2 donde i: 1 a n

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LINEALIDAD

Define la capacidad del método para obtener los

resultados de los análisis proporcionales a la
concentración de la sustancia
El Rango Lineal es por inferencia del rango de
concentraciones de la sustancia en el cual el método da
resultados del análisis proporcional a la concentración de
la sustancia
[AOAC-PVMC]
Se verifica mediante la obtención de coeficientes de
correlación mayores o iguales a 0,995
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RANGO (cont.)
Determinar el intervalo de concentración de analito en el
cual el método es aplicable
Dentro del intervalo de trabajo puede haber un intervalo
en el que la respuesta del sistema de detección es lineal.
Interesa conocerlo para determinar el modo de calibración
Cuando se utiliza algún tipo de instrumentación es útil
considerar la sensibilidad y el umbral de discriminación

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INTERVALO DE TRABAJO

Es el intervalo entre el nivel más bajo y más alto de

concentración que ha sido demostrado que puede ser
determinado con la precisión y la exactitud requeridas para
una determinada matriz
CURVA DE CALIBRACION

Es la representación gráfica de la señal de medida

como una función de cantidad de la sustancia
[AOAC-PVMC]
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Para ello
a) Preparar un blanco y 4 -6
concentraciones diferentes
del analito o 4 -6 muestras
fortificadas c) Repetir los pasos a)
y b) dentro del ámbito
b) Representar la señal lineal y efectuar un
obtenida en función de la estudio estadístico de
concentración y determinar los resultados
el ámbito lineal y los obtenidos
extremos superior e inferior
del intervalo de trabajo
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Coeficiente correlación 0,999

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COEFICIENTE DE CORRELACIÓN
Es un parámetro cualitativo, adimensional, da una idea primaria
sobre la bondad del modelo lineal
Para tener una idea más confiable se deben realizar análisis
gráficos de residuos

CRITERIOS
Métodos Cuantitativos
Respuesta lineal ≥ 0.99, DS de residuales ≤ 0.1
Respuesta no lineal ≥ 0.98
Métodos Criba o Screening
Respuesta lineal ≥ 0.98, DS de residuales ≤ 0.2
Respuesta no lineal ≥ 0.95 Dra. Nora Angelini
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DISCRIMINACION
Es la capacidad de un instrumento de medición
para responder a pequeños cambios en el valor del
estímulo
Puede depender del ruido (interno o externo),
fricción, amortiguamiento , inercia, etc

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SENSIBILIDAD
Es el cambio en la respuesta del instrumento de
medición dividido por el cambio correspondiente en el
estímulo
El estímulo puede ser cantidad de analizado presente
También se aplica al método analítico globalmente,
teniendo en cuenta otros factores tales como el efecto
de los pasos de extracción y purificación
[VIM 1984 y IUPAC Orange Boo
AREA = 1899
ng/g
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BLANCO
El valor obtenido cuando el analito no está presente
en la muestra durante la medición. Si existe una
señal o valor medido para el componente se debe a
factores ajenos y debe ser descontado del valor de
la medición cuando ésta se realiza con el analito
presente

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CONFIRMACIÓN DE LA IDENTIDAD
Establecer que la respuesta del instrumento se atribuya
sólo al analito en estudio y no a la presencia de
interferencias. Usar técnicas distintas
Se aplica al análisis cualitativo y cuantitativo

Analizar muestras, patrones y materiales de referencia

por el método en estudio y otros métodos independientes
Usar los resultados de las técnicas complementarias para
evaluar la capacidad del método en confirmar la
identidad del analito
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SELECTIVIDAD
El grado en que otras sustancias interfieren con la
determinación de una sustancia de acuerdo con un
procedimiento dado
[IUPAC Compendium of Chemical] T

Término recomendado en química analítica para expresar

el grado en que un método puede determinar un analito
en presencia de interferencias de otros componentes
Se desaconseja el empleo del término “especificidad”
para el mismo concepto, dado induce a confusión

Codex Alimentarius, ALINORM 04/23]

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Para ello
Analizar blancos de al menos 20 matrices diferentes

Analizar varias interferencias probables en presencia

del analito de interés

Examinar el efecto de interferencias, ver si incrementa o

inhibe la detección o cuantificación del analito

Si ocurre esto, es necesario trabajar más en el

desarrollo del método
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LIMITE DE DETECCION
Es el contenido más bajo
que se puede medir con
seguridad estadística
razonable
[AOAC- PVMC]

Es necesario sólo para

decisiones cualitativas, si la
sustancia está presente o
no
a) 3 veces la dispersión Dra. Nora Angelini
(DS) del Blanco Consultora Internacional de la FAO
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LD cont.
b) 2,5 a 5 veces la relación señal/ruido del equipo de
medida que utiliza
c) la concentración cL o la cantidad qL, es la medida más
pequeña xL que se puede detectar con seguridad
razonable
xL = x bl + k S bl
x bl media de las medidas de las muestras blanco (MB)
S bl desviación estándar de las medidas de la MB
k factor numérico de acuerdo al nivel de confianza de
trabajo
[IUPAC, 1985] Dra. Nora Angelini
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FALSOS NEGATIVOS/ POSITIVOS

Para métodos cualitativos, se puede determinar la
proporción de falsos positivos/negativos
Comparar con método confirmatorio, si es aplicable a las
mismas matrices y al mismo rango de concentración

FALSO POSITIVO
Probabilidad que la concentración real de una sustancia en la
muestra de laboratorio sea menor que el valor límite
aceptado, mientras que las medidas realizadas en una (1) o
más porciones de muestra, indican que la concentración
excede ese valor. Valores aceptados para esta probabilidad
están entre uno (1) a cinco (5) por ciento (%)
[Codex Alimentarius, ALINORM 01/24A] Dra. Nora Angelini
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FALSO NEGATIVO
Probabilidad que la concentración real de una sustancia en
la muestra de laboratorio sea mayor que el valor límite
aceptado mientras que las medidas realizadas en UNA (1)
o más porciones de muestra, indican que la concentración
no excede ese valor. Los valores aceptados para esta
probabilidad están en el rango de uno (1) a cinco (5) por
ciento (%)
[Codex Alimentarius, ALINORM]

En ausencia de un método para realizar la comparación,

se deben analizar las poblaciones de muestras negativas
o positivas fortificadas
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Se pueden determinar los falsos positivos/negativos como

sigue a continuación:

Proporción falso positivo (%)= falso positivo x 100

total negativos

Proporción falso negativo (%)= falso negativo x 100

total positivos
[AOAC Research-Institute - Performance tested Methods Programme]
Procedure

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LIMITE DE CUANTIFICACION
Los límites de cuantificación son
las características de realización
que marcan la capacidad de un
proceso de medidas químico para
cuantificar la sustancia en forma
adecuada
[IUPAC Orange book]

Puede establecerse como 6 ó 10

veces la DS del blanco o 3 veces
el LD
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LC (cont.)
LQ = k Q x Q, donde
LQ es el límite de cuantificación
Q es la desviación estándar en ese punto
k Q es el factor cuya inversa multiplicada por el RSD iguala
al cuantificando seleccionado
El valor por defecto que expresa para k Q es 10
[IUPAC Orange book]
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MATERIAL DE REFERENCIA
(MR)
MR CERTIFICADO (MRC)
Es el material o sustancia
en el cual Uno(1) o más Es el MR cuyas propiedades
valores de sus propiedades están certificadas con
son homogéneos y están rasteabilidad a la unidad en la
bien definidos para permitir que se expresan y se
utilizarlos para la calibración acompaña de la incertidumbre,
de un instrumento, la con la indicación de un nivel de
evaluación de un método de confianza
medición o la asignación de
valores
[ISO/IEC Guide 30-1992, 2.1]
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RECUPERACION
Es la fracción de la sustancia agregada a la muestra
(muestra fortificada) antes del análisis, al ser analizadas
muestras fortificadas y sin fortificar, el porcentaje de
recuperación (%R) se calcula

%R = [(CF-CU)/CA] x 100
CF concentración de la sustancia medida en la muestra
fortificada
CU concentración de la sustancia medida en la muestra sin
fortificar
CA es la concentración de la sustancia agregada (valor
teórico) en la muestra fortificada
[AOAC-PVMC]] Dra. Nora Angelini
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RECUPERACION (cont.)

CF concentración de la sustancia medida en la muestra

fortificada: 170 ng/kg

CU concentración de la sustancia medida en la muestra en

la muestra sin fortificar: 10 ng/kg

CA es la concentración de la sustancia en la muestra

fortificada (valor teórico): 200 ng/kg

%R = [(170- 10)/ 200] x 100 = [(160)/ 200] x 100 = 80

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REPETIBILIDAD

Es la precisión bajo las condiciones de

repetibilidad, es decir, los resultados de análisis
independientes se obtienen con el mismo método
en muestras idénticas en el mismo laboratorio por
el mismo operador utilizando el mismo
equipamiento dentro de intervalos cortos de tiempo

[ISO 3534-1]

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REPETIBILIDAD (cont.)
CONCENTRACION ug/kg
REPLICADOS 25 50 100 150 200
1 80 85 98 96 95
SEMANA 1
RECUPERACIONES 2 90 90 90 87 90
1 92 97 96 96 103
SEMANA 2
RECUPERACIONES 2 106 100 97 100 97
1 85 89 100 89 107
SEMANA 3
RECUPERACIONES 2 99 93 89 96 89
PROMEDIO 92,0 92,3 95,0 94,0 96,8
D. S 9,4 5,5 4,5 4,9 7,1
RDS (CV= DS/R) 0,102 0,06 0,047 0,053 0,073
CV % 10 6 5 5 7

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VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA ANÁLISIS QUÍMICOS

REPETIBILIDAD (precisión de las repeticiones

internas)

• RECOMENDADO 10 REPLICADOS DE LA MISMA

MUESTRA

• INCLUR TODOS LOS PASOS DEL PROCEDIMIENTO:

•toma de muestra si corresponde, preparación de
muestra, calibración, extracción, concentración

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VALIDACION ANALISIS FISICOQUIMICOS

ROTULO MUESTRA ESQUEMA 1
Blanco de reactivos
1 BR1
Solución patrón
2 P1 0.09 C
Solución patrón
3 P2 0.4 C
Solución patrón
4 P3 0.7 C
Solución patrón
5 P4 0.9 C
Muestra agua natural o Matriz de interés
6 M1
M1 + Solución patrón 0.09 C
7 M2
M1 + Solución patrón 0.4 C
8 M3
M1 + Solución patrón 0.7 C
7 M4
M1 + Solución patrón 0.9 C
8 M5
C: Límite Superior del Parámetro Seis replicados
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VALIDACION ANALISIS FISICOQUIMICOS

ROTULO MUESTRA ESQUEMA 2
Blanco de reactivos
1 BR1
Solución patrón
2 P1 0.8 C
Solución patrón
3 P2 0.9 C
Solución patrón
4 P3 1.0 C
Solución patrón
5 P4 1.2 C
Matriz de interés
6 M1
M1 + Solución patrón 0.8 C
7 M2
M1 + Solución patrón 0.9 C
8 M3
M1 + Solución patrón 1.0 C
7 M4
M1 + Solución patrón 1.2 C
8 M5
C: Límite Superior del Parámetro Cinco -Seis replicados
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REPRODUCIBILIDAD
Es la precisión bajo las condiciones de reproducibilidad,
es decir, los resultados de análisis independientes se
obtienen con el mismo método en muestras idénticas en
distintos laboratorios con diferentes operadores, usando
distintos equipos
Se requiere la especificación de las condiciones
cambiadas, se puede expresar en forma cuantitativa en
términos de dispersión de los resultados
[ISO 3534-1]

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CONCENTRACIÓN REPETIBILIDAD RANGO RECUPERACIÓN

PROMEDIO %

100% < 1.3% 98- 102

10% < 1.8% 98- 102

1% < 2.7% 97- 103

0.1% < 3.7% 95- 105

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CONCENTRACIÓN REPETIBILIDAD REPRODUCIBILIDAD RANGO

RECUPERACIÓN
g/kg PROMEDIO %

> 1000 μg/kg < 14% < 19% 70- 110

> 100 μg/kg < 18% < 25% 70- 110
1000 μg/kg
> 10 μg/kg  100 < 22% < 34% 70- 120
μg/kg
> 1 μg/kg  10 < 32% < 46% 60- 120
μg/kg
 1 μg/kg < 36% < 54% 50- 120
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Intervalo de Confianza (IC)

A partir de los estimadores obtenidos en un método se puede
establecer entre qué límites se encontrará el verdadero
parámetro con una probabilidad preestablecida
Estimador  DS del estimador común para todos los estimadores
IC de la Media: . - raíz(DS2/n) < μ < .+ raíz(DS2/n)

95% Dra. Nora Angelini

5%
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RASTREABILIDAD
Es la propiedad de un resultado de una medida o valor de
un estándar por el cual se puede relacionar, con la
incertidumbre establecida, a referencias establecidas,
normas nacionales e internacionales (una cadena
ininterrumpida de comparaciones)
Pruebas de significación para el aseguramiento
Test de t (distribución de la t de Student)
Depende de los grados de libertad (relacionados con n) y
P (nivel de confianza)
µ = X ± t DS/ (n)1/2

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Test de F (de Fisher)

Se utiliza para comprobar homogeneidad de varianzas,

se recomienda empezar por el test de la F

Fexp = DS1 2
DS2 2

Si Fexp < que Fcrítico no hay diferencias

estadísticamente significativas entre las varianzas de los
dos conjuntos de datos
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Test de t

texp = X -x
DS/ (n)1/2 Grados de libertad: n1+ n2 - 2

Si texp < que tcrítico los resutados medios son

estadísticamente equivalentes para el nivel de
confianza elegido
Se puede comparar
Media con valor de Equivalencia entre analistas
Referencia (legislación) Interlaboratorios
Dos medias
Dos conjuntos de datos Dra. Nora Angelini
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CARTA DE CONTROL
Método de elección para el control interno de rutina de
métodos. No se aplica en métodos que se utilicen
menos de 3 veces/mes
Analizar muestra control (M incurrida o MR certificado
o no) con las muestras, el resultado se registra en la
carta de control
Las variantes más importantes son:
Carta de control de un sólo valor
Carta de control del blanco
Carta de control para recuperación
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TIPO DE CALCULOS DETECTA ANALISIS

GRAFICO NECESARIOS
Valor medio y DS, Errores de mayor magnitud (DS de la Análisis de la MCl a
Gráfico de límites de media. Errores sistemáticos (tendencias, intervalos regulares
X advertencia (LA) y cambios de la media). Errores aleatorios de tiempo
de control (LC) (dispersión de valores individuales).
Generalmente para control de la precisión
Gráficos Rango medio, DS y Incertidumbre Mínimo 2 análisis en
de Rango LC muestras reales
Gráfico de Recuperación Errores sistemáticos proporcionales Mínimo un análisis
Recupera- media, DS, LA y LC de c/ MC o muestra
ción real
Gráfico de Media y DS, LA y LC Control de los valores blancos, errores en Al menos 2 blancos
control de medidas instrumentales y desviaciones
blancos debidas a los reactivos
Valor de referencia y Falta de exactitud, derivas Análisis deMC
Gráfico de DS, distancias del
CUSUM vértice y ángulo.
Cálculo de sumas
acumulativas

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INCERTIDUMBRE

Parámetro asociado con el resultado de una medida,

que caracteriza la dispersión de los valores que se
pueden atribuir razonablemente al analizado
Puede ser una desviación estándar (o múltiplo dado de
ella) o la amplitud de un intervalo de confianza
[VIM 1993]

Imprescindible para lograr la acreditación según

Norma ISO 17025
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INCERTIDUMBRE (cont.)

Incluye los errores sistemáticos y aleatorios

Para su determinación existen varias posibilidades:
Indicación acerca de la repetibilidad
 Resultados de las cartas de control
 Resultado de intercomparaciones

Evaluación por miembros del personal experimentados,

competentes y, por lo tanto, autorizados
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Fuentes de incertidumbre

a) definición incompleta de la sustancia a medir

b) realización imperfecta de la definición de la sustancia
c) muestreo no representativo
d) efectos no conocidos de las condiciones ambientales
e) desviaciones personales en la lectura de instrumentos
f) límites en la discriminación o resolución del instrumento
g) valores inexactos de los patrones y MR
h) variaciones en mediciones de la sustancia realizadas en
condiciones aparentemente idénticas Dra. Nora Angelini
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Fuentes de incertidumbre
(cont.)
i) Condiciones de almacenamiento
j) Efectos atribuibles a los instrumentos de medición,
incluyendo función de calibrado, número de cifras
significativas, redondeo de cifras relevantes
k) Pureza de los reactivos
l) Condiciones de medición
ll) Efectos de la muestra (matriz)
m) Corrección por blanco
n) Efectos atribuibles al operador
o) Efectos aleatorios
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p) software
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QUÍMICOS
Fuentes de incertidumbre
(cont.)
p) Mediciones térmicas q) Pesadas y calibración de
 Termómetros de balanzas
referencia Calibración y estabilidad de
Instrumentos eléctricos pesas de referencia
Resolución Incertidumbre de la
Inestabilidad, gradientes pesada: repetibilidad,
térmicos linealidad, excentricidad
Corrección de una escala Empuje del aire
o tabla de referencia Condiciones ambientales
Contribuciones del
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termómetro a calibrar
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Distribuciones de Probabilidad de
los componentes de Incertidumbre

Indican la probabilidad de que un resultado de medición

tome uno u otro valor
Depende de la naturaleza de cada componente
Distribución normal: los resultados centrales, cerca del
promedio son los más probables (X  2 DS)
Distribución rectangular: todos los resultados son
igualmente probables (DS = a/ 3 1 / 2 )
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Componentes con distribución normal

Distribución Normal se aplica:

A. Cuando los desvíos menores son más probables

que los mayores
B. Cuando está explícita o implícitamente declarada
(certificado de calibración)
C. La relación entre incertidumbre estándar y
expandida es 1: 2
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Componentes con distribución rectangular

Se aplica cuando no hay motivos para suponer que el

valor central es más probable que los extremos
[Link]ón de lecturas
[Link] de temperatura
[Link] declarada de equipos
[Link] de materiales de referencia
[Link] no se tiene información sobre la naturaleza del
componente
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EJEMPLO INCERTIDUMBRE
Determinación de Cadmio en Alimento
Alcance: se determina Cadmio en alimento en el rango de
0.5- 5 mg /kg

Descripción
Resumen: Se toma 0.5 g ± 0.1 mg de alimento, se adiciona
2.5 ml de ácido nítrico, después de la mineralización la
solución se transfiere cuantitativamente a un frasco o
redoma de 100 ml y se analiza por Absorción Atómica
usando horno de grafito. La curva de calibración se realiza
con patrones comerciales disponibles Dra. Nora Angelini
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EJEMPLO
Preparación de la muestra INCERTIDUMBRE (cont.)

Pesada Preparación de la
Curva de calibración
con patrones
Mineralización

AA Calibración del AA

Resultados
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EJEMPLO INCERTIDUMBRE (cont.)

c 0  VS
m Cd 
m
c0 = cantidad de Cadmio en µg/l análisis por AA
VS = volumen de muestra en litro
m = cantidad de muestra

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EJEMPLO INCERTIDUMBRE (cont.)

Identificar y analizar las fuentes de incertidumbre

 Pesada de la Muestra (Up)

 Volumen (Uv)
 Solución concentrada o stock para calibración (Ucstock)
 Función de Calibración

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EJEMPLO INCERTIDUMBRE (cont.)

Pesada de la Muestra (Up) 0.15 mg
U (p)   0.09 mg
Certificado de calibración de la 3
balanza ± 0.15 mg para linalidad

Esta contribución puede ser contada dos veces, una para la

tara y otra para el peso, porque cada una es una
observación independiente. Esto da una incertidumbre
estandard de

U(p)  2  (0.09) 2 U (p)  0.13 mg

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EJEMPLO INCERTIDUMBRE (cont.)

 Volumen (Uv)
0.5 g son transferidos después de la digestión a una
redoma de 100 ml

Efecto del volumen: el certificado del proveedor expresa

100 ml ± 0.1 ml para la incertidumbre

U (V) 
0.1 ml
3
U (V)  0.06 ml
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EJEMPLO INCERTIDUMBRE (cont.)

Efecto de paralaje: se realizan 10

mediciones y la DS es 0.05
100.2 0.05
100.0 u (Par) 
100.0 10
99.9
:
: u (Par)  0.02 ml
100.0
DS = 0.05 Dra. Nora Angelini
N = 10 Consultora Internacional de la FAO
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EJEMPLO INCERTIDUMBRE (cont.)

Efecto de Temperatura:
Temperatura ambiente 20 °C ± 3 °C
Coeficiente de expansión del volumen para el agua
2.1 x 10-4 / °C
4
100 ml  2.110  3 C
u (T) 
3C
u (T)  0.035 ml
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EJEMPLO INCERTIDUMBRE (cont.)

Incertidumbre estandard de la redoma de 100 ml

s (V100ml)  u (V)  u (Par)  u (T)

2 2 2

DS(V100ml)  0.062  0.022  0.0352

DS(V100ml)  0.07 ml
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EJEMPLO INCERTIDUMBRE (cont.)

Incertidumbre del Patrón de Calibración

Certificado del proveedor 1000 ± 5 mg/l

5 mg
u (Cstock ) 
3 l
u (Cstock )  2.89 mg/l
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EJEMPLO INCERTIDUMBRE (cont.)

Curva de Calibración
Patrón(ug/L) 1 2 3
0.5 0.058 0.057 0.061
1 0.104 0.104 0.104
2 0.197 0.194 0.194
3 0.284 0.279 0.285
4 0.363 0.349 0.367
Muestra 0.07 0.068 0.069
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Patrón ug/kg y x(ci) (ci-cort) (ci-cort)2
0.5 0.058 0.47 -1.83 3.33
0.5 0.057 0.46 -1.84 3.38
0.5 0.061 0.51 -1.79 3.21
1.0 0.104 1.01 -1.29 1.67
1.0 0.104 1.01 -1.29 1.67
1.0 0.104 1.01 -1.29 1.67
2.0 0.197 2.08 -0.22 0.05
2.0 0.194 2.05 -0.25 0.06 Resultado de
2.0 0.194 2.05 -0.25 0.06 la muestra:
3.0 0.284 3.09 0.79 0.62 0.6 µg/l
3.0 0.279 0.03 0.73 0.53
3.0 0.285 3.10 0.80 0.64
4.0 0.363 4.00 1.70 2.89
4.0 0.349 3.84 1.54 2.37
4.0 0.367 4.05 1.75 3.05
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2.30 Sxx 25.22
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EJEMPLO INCERTIDUMBRE (cont.)

Coeficiente de correlación r = 0.9997
Desviación estandar de la calibración: 0.0040
a = 0.00017 ordenada al origen
S 1 1 (c0  c) 2
b = 0.0865 pendiente u(c )  0  
S : DS residual B1 p n Sxx
B1 : pendiente
p : número de medidas para determinar c0 n
n : número de medidas para la calibración Sxx   (ci  c) 2
c0 : Concentración de Cadmio determinada i 1
c : valor promedio de los diferentes patrones de calibración
Sxx : Suma de cuadrados de las diferencias entre concentraciones y
concentración media de patrones
i : índice para el número de patrones de calibración
j : índice para el número de medidas para obtener
la curva de calibración Dra. Nora Angelini
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EJEMPLO INCERTIDUMBRE (cont.)

n
Sxx   (ci  c)  25.22
2

i 1

0.0040 1 1 (0.60  2.3) 2

u(c 0 )     0.033 µg/l
0.0865 3 15 25.22

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EJEMPLO INCERTIDUMBRE (cont.)

Incertidumbre combinada
2
 u C0 
2 2 2
u C (Cd)  uP   uV   u Cstock 
          
c(Cd)  CP   CV   CC   CCstock 
 0
2 2 2 UCstock= (2.89/1000)2 =
u C (Cd)  0.13   0.07   0.033 
       (0.00289)2 = 0.000008352
c(Cd)  0.5   100   0.6 
u C (Cd)
 0.0262  0.00072  0.0552
c(Cd)
u C (Cd)
 0.06
c(Cd) Dra. Nora Angelini
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INCERTIDUMBRE (cont.)

c0  V 0.6  0.1
m m  0.12 mg/kg
P 0.5
U c (Cd)  0.06  0.12  0.007  0.01
Cd  0.12  0.01 mg/kg
Incertidumbre expandida: Informe de resultados
k = factor de cobertura Cd = 0.12 ± 0.02 mg/kg
k = 2 (95 % intervalo de confianza) Dra. Nora Angelini
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ROBUSTEZ
La robustez de un procedimiento analítico es una medida
de su capacidad para permanecer inalterado por
variaciones pequeñas pero deliberadas en parámetros del
método y brinda una indicación de su confiabilidad
[ICH Q2A, CPMP/ICH/ 381/95]
El objetivo es optimizar el método y las
condiciones para obtener resultados exactos con alta
seguridad, que funcione después de intervalos largos de
tiempo y en otros laboratorios
Un método es más robusto cuanto menos dependan los
resultados de una modificación en sus condiciones
Dra. Nora Angelini
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ROBUSTEZ (cont.)

Condiciones que afectan el método de medición:

Laboratorio
Lugar de la medición
Personal
Aparatos
Estabilidad de Muestras, Reactivos, Solventes y Patrones
Caudal de las fase móvil (en HPLC)
pH de la fase móvil (en HPLC)
Gradiente de temperatura (en GC)
Dra. Nora Angelini
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ROBUSTEZ (cont.)
Estabilidad de muestras, patrones y reactivos
(condiciones de almacenamiento y ensayo) Parámetros:
·Sensibilidad a la temperatura
·Sensibilidad a la luz
·Hidrólisis (por la humedad del aire)
·Facilidad de oxidación
 Descomposición química
·Efectos catalíticos (por las paredes del contenedor)
·Adsorción (durante la filtración de soluciones con residuos)
· Precipitación (al dejar mucho tiempo una solución)
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Realizar variaciones
Identificar las variables sistemáticas en los
que afectan el método factores “sospechosos”
observar variación del
resultado
Analizar MR o
Diseñar experimentos
para monitorear el muestras de
efecto de cambios composición Diseño factorial
sistemáticos en las conocida de experimentos
variables

Diseñar control de calidad para

Clasificar variables según
el control de variables críticas
magnitud efecto producido
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El efecto de cada una de las variables se calcula haciendo

la media de los 4 análisis que contienen la variable en su
valor más alto (mayúsculas) y aquéllos que corresponden al
valor más bajo (minúsculas). El efecto de cambio del Factor
“A” a “a” se mide por la diferencia:
(s+t+u+v)/4 - (w+x+y+z)/ 4
Con las 7 comparaciones (A-a,...G-g) se conoce el efecto de
cada variable; cuanto > sea la diferencia > influencia tendrá
La diferencia entre la media de subgrupos de 4 > que
(2)1/2 DS, indica que el método es sensible a los cambios de
esa variable
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Test de Robustez de Youden para un método analítico

VALOR DE ANALISIS
LAS
1 2 3 4 5 6 7 8
VARIABLES
A, a A A A A a a a a
B, b B B b b B B b b
C, c C c C c C c C c
D, d D D d d d d D D
E, e E e E e e E e E
F, f F f f F F f f F
G, g G g g G g G G g
Resultados s t u v w x y z

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INTERCOMPARACIONES

Dan información valiosa sólo si las muestras se

manejan de la misma manera que las muestras de un
análisis de rutina
Se realizan en intervalos de tiempo largos; por ello no
son suficientes para el aseguramiento de calidad rutinario,
sino que funcionan como complemento
Cuanto más distintas son las matrices de las muestras
de intercomparación y las del análisis, menor información
del análisis rutinario
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INTERCOMPARACIONES (cont.)

La interpretación de los resultados debe realizarse con

el mayor cuidado, especialmente en el caso de resultados
aberrantes o desviaciones, para obtener las mayores
posibilidades de mejora

Si no hay disponibles en el mercado de organismos

oficiales o proveedores reconocidos se pueden realizar
comparaciones con otros laboratorios
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PARAMETROS A EVALUAR PROCEDIMIENTO NUMERO DE

DETERMINACIONES

LINEALIDAD Análisis de patrones Patrones 5 niveles + blanco

reactivos ≥ 3 replicados

Inmunoanálisis 6 niveles +
RANGO blanco reactivos ≥ 2
EXACTITUDSESGO replicados
(desviación o error Materiales de
sistemático) referencia o 5 niveles + blanco reactivos +
SELECTIVIDAD (interferencias) muestras blanco muestras 6 replicados
EFECTO MATRIZ fortificadas
LD/ LC Inmunoanálisis 5 niveles +
RECUPERACIONES blanco reactivos 6 replicados
INCERTIDUMBRE + 20 blancos de matriz

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PARAMETROS A EVALUAR PROCEDIMIENTO NUMERO DE
DETERMINACIONES

PRECISION (repetibilidad) Replicados de Mínimo 2 replicados por día y

muestras 2 días diferentes

PRECISION INTERMEDIA Análisis de muestras Analistas distintos, 4 a 6

(repetibilidad) naturales o tandas, distribuidas en 2
fortificadas y semanas consecutivas o un
materiales de lapso mayor
referencia
REPRODUCIBILIDAD Distintos analistas, Replicados realizados por
usualmente, no distintos analistas, diferentes
exclusivamente laboratorios, utilizando
ensayos diferentes equipos
interlaboratorios
ROBUSTEZ Muestras naturales Al menos 8 muestras, Test de
o fortificadas y Youden y Steiner
materiales de
referencia
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PARAMETROS NIVELES NUMERO DE CUANTITATIVOS CRIBA

MUESTRAS

METODO DESARROLLADO EN EL LABORATORIO

ESTABILIDAD DE A≤ NA O ≥5 REPLICADOS DE NO TIENE QUE AL FINAL DEL

ANALITOS EN LC CADA PUNTO + CERO HABER CAMBIOS PERIODO DE
SOLUCIONES DE CADA ANALITO SIGNFICATIVOS EN CONSERVACION
PATRONES Y /ALIMENTO LA LOS RESIDUOS
SOLUCIONES DE REPRESENTATIVO CONCENTRACION AGREGADOS AL
EXTRACCION FORTIFICAR DEL ANALITO EN NIVEL LC SON
MUESTRAS BLANCO SOLUCIONES DETECTADOS
COMPARAR PATRONES Y
CONCENTRACION CON EXTRACTOS
SOLUCIONES CONSERVADOS
PATRONES RECIEN
PREPARADAS Y
CONSERVADAS
“VIEJAS”

HOMOGENEIDAD AL NA O ≥5 REPLICADOS DE CV %≤ 10 CV %≤ 15
DE LA MUESTRA LC MUESTRAS
REPRESENTATIVAS,
HALLAR EL CV%

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OTROS CRITERIOS

Límite Mínimo de Performance Requerido (LMPR)

Concentración Nominal de Referencia (CNR) relacionada al
LMPR

GC-MS y GC-MS-MS, HPLC-MS y HPLC-MS-MS Sustancias

Prohibidas:
CINCO (5) niveles de concentración y Blanco de Muestra
separados a intervalos regulares a partir de una concentración
igual o inferior al LMPR; por ejemplo: CNR, 1.5CNR, 2CNR,
4CNR, 6CNR. CNR = MRPL (o inferior) 6 replicados

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CRITERIOS DE ACEPTACION

CONCENTRACIÓN REPETIBILIDAD REPRODUCIBILIDAD RANGO REC.

g/kg PROMEDIO %

> 1000 μg/kg < 14% < 19% 70- 110

> 100 μg/kg < 18% < 25% 70- 110
1000 μg/kg
> 10 μg/kg  100 < 22% < 34% 70- 120
μg/kg
> 1 μg/kg  10 < 32% < 46% 60- 120
μg/kg
 1 μg/kg < 36% < 54% 50- 120
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OTROS CRITERIOS DE ACEPTACION

CONCENTRACIÓN g/kg REPETIBILIDAD REPRODUCIBILIDAD

> 1000 μg/kg < 12% < 17%

> 100 μg/kg 1000 < 15% < 20%
μg/kg
> 10 μg/kg  100 < 20% < 25%
μg/kg
> 1 μg/kg  10 μg/kg < 25% < 30%
 1 μg/kg < 30% < 35%
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OTROS CRITERIOS DE ACEPTACION

CONCENTRACIÓN g/kg MUESTRAS MUESTRAS

INTRALABORATORIO INTERLABORATORIO

> 100 μg/kg ± 15% ± 20 %

 100 μg/kg ± 20% ± 25%

10 μg/kg ± 25% ± 30 %

1 μg/kg ± 30% ± 35 %

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OTROS CRITERIOS DE CONFIRMACION

TIEMPOS DE RETENCION (con respecto a los patrones)

± 1 % (GC)
± 5 % (HPLC)

TIEMPOS DE RETENCION RELATIVO AL PATRON INTERNO

(con respecto a los patrones)
± 0.5 % (GC)
± 2.5 % (HPLC)

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OTROS CRITERIOS DE CONFIRMACION

GC-MS, HPLC-MS
Cuatro (4) iones para sustancias prohibidas
Tres (3) iones para sustancias con LMR

GC-MS-MS, HPLC-MS-MS: un ión precursor y 2 iones

hijos
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OTROS CRITERIOS DE CONFIRMACION

RELACION DE ABUNDANCIAS (R) entre IONES: Intervalo de

aceptación definido a partir de los patrones

Relación de Abundancias GC-MS GC-MS-MS/HPLC-MS/HPLC-MS-MS

R > 50 % ± 10 % ± 20 %
20 % < R < 50 % ± 15 % ± 25 %
10 % < R < 20 % ± 20 % ± 30 %
R < 10 % ± 50 % ± 50 %
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OTROS PARAMETROS

Límite de Decisión CC: Límite en el cual y a partir del cual se puede

concluir con una probabilidad de error  que una muestra no es
conforme.

Error : es la probabilidad de que la muestra analizada sea realmente

conforme aunque se haya obtenido una medición no conforme.

Sustancias prohibidas, CC es el nivel de concentración más bajo al

cual un método puede discriminar si el analito identificado está
presente con una probabilidad estadística de (1-).

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Métodos de criba (screening) cuantitativos se puede determinar

como el Valor Promedio + 3 Desvíos Standard del análisis de veinte
(20) muestras blanco.

CCα (para sustancias prohibidas) para Métodos de Confirmación:

Se determina en base al gráfico de Respuesta en función de
Concentración Nominal obtenido en condiciones de reproducibilidad
interna
Se calcula como la intersección al eje y (ordenada al origen:
a0 + 2.33 DS (desvío estándar de la ordenada al origen)

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VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA ANÁLISIS QUÍMICOS

OTROS PARAMETROS

CCα (para sustancias con LMR):

Es la concentración por encima de la cual se puede decidir que el
contenido del analito identificado está por encima del LMR con una
probabilidad estadística de 1-.

LMR + 1.64 DS (desvío estándar de la Reproducibilidad

intralaboratorio)

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Capacidad de detección CCβ: contenido mínimo de la sustancia

que puede ser detectado, identificado o cuantificado en una muestra
con una probabilidad de error β.

Error β: es la probabilidad de que la muestra analizada sea realmente

no conforme, aunque se haya obtenido una medición conforme.

CCβ (para sustancias prohibidas) para métodos de

confirmación:
CCα + 1.64 DS (desvío standard de la Reproducibilidad
Intralaboratorio al nivel del CCα)
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CCβ (para sustancias con LMR):

CCα + 1.64 DS (desvío standard de la Reproducibilidad
intralaboratorio al nivel del CCα)

CCβ (para métodos de screening cuantitativos):

CCα + 1.64 DS (desvío standard de la Reproducibilidad
Intralaboratorio al nivel del CCα)

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Alimentos representativos
– Muestras para validación
residuos de pesticidas
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