Sorting y Targeting

Sorting:  Selección
Targeting:  “El Apuntar”, “la destinación de…”, “cómo una vesícula llega a su
compartimiento blanco”.
Dentro de las células hay vesículas moviéndose de un lado para otro llevando material.
Se puede pensar en un “gran Transantiago”, buses que llevan gente de un lugar a otro.
En este caso, el Sorting es la selección de pasajeros, y el Targeting, el destino de ellos.
“uno se sube a un bus porque sabe dónde va a llegar”. Estas vesículas hacen “lo
mismo”.
Seleccionan la carga y la llevan a otro compartimiento.

Endocitosis y Exocitosis.

Exocitosis: mecanismo mediante el cual, vesículas sintetizadas al interior de la célula

(con carga), llegan a la membrana plasmática y son liberadas al medio extracelular.

Endocitosis: mecanismo en el cual, moléculas o sustancias del medio extracelular, son

internalizadas y son incorporadas al medio intracelular.

Si uno hace un corte, lo primero que ve en el interior de la célula son vesículas u

organelos.

Esquema:
Vesículas de la Red Transgolgi
dirigidos al Sist. Endosomal y
estos a los Lisosomas.
Vesículas que salen (secretoras),
adición de membrana a la
membrana plasmática. Flujo
anterógrado y retrógrado.

“Tráfico vesicular”
 1º Formación de la
Vesícula. (Sorting)

2º Separación (Budding)
desde el compartimiento
dador.

3º Fusión con el
compartimiento de
Destino (Targeting)

4º Liberación de la Carga

¿Cómo se regula este Tráfico? :

SELECTIVIDAD.
Esta se da en Sorting, seleccionando la carga
y también en el Targeting, seleccionando la
destinación.

Se define el proceso de selección o sorting,

como el empacamiento de determinado tipo
de proteínas en una vesícula con el fin de
dirigirlo a un compartimiento blanco. Por
ejemplo, proteínas del RE se seleccionarán
para no salir del RE o para ser recuperadas;
proteínas destinadas al Golgi se seleccionan
en vesículas que irán al Golgi; proteínas que
forman el lisosoma se seleccionan en una
ruta Golgi-lisosoma. El Sorting ocurre en
la membrana del organelo de origen.

La destinación o targeting se define como

el proceso por el cual una vesícula con un
cargo determinado alcanza su
compartimiento blanco. Esto ocurre por
movimiento de las vesículas y
reconocimiento de una señal en el
compartimiento aceptor.
Entonces acá tenemos un “Transantiago”, pero los mecanismos de selección de carga y
de alcanzar un compartimiento blanco, es un mecanismo molecular.
Proteínas de Cubierta: Cop I y Cop II
Son importantes en el proceso de selección del cargo de una vesícula.
Cop I: Tráfico Golgi  R. Endoplasmático.
Cop II: Tráfico R.E.  Golgi
Estas proteínas ayudan a formar las vesículas.

En cambio la Clatrina (otra proteína de cubierta), ayuda a la formación de vesículas que

vienen de la membrana plasmática, por el proceso de Endocitosis.

Entonces conocemos por lo menos 3 Proteínas de Cubierta:

COP I Golgi  RE
COP II RE  Golgi
Clatrina M.P.  Interior célula.
Existen también otras proteínas importantes en el tráfico vesicular, llamadas proteínas
“G”, que son proteínas que unen guanidin nucleótidos (GDP, GTP), y que pueden estar
en 2 estados:
Estado activo: (cuando se encuentran unidas a GTP), en el cual estas proteínas se
pegan o acoplan a la membrana.
Estado inactivo: (cuando se encuentran unidas a GDP), cuando se sueltan de la
membrana.
La activación o inactivación de las proteínas G, está regulado por la acción de GTPasas
(GHP, GNRP, GEF entre otras.)

Las vesículas que están cubiertas por la proteína COP II, tienen también asociadas una
proteína G llamada SAR 1, lo que en realidad es mas bien, que la activación de SAR 1
hace que se acople a la membrana y que reclute el COP II que se encuentra libre en el
citoplasma para poder seguir formando la vesícula. Lo mismo ocurre con otra proteína;
la ARF 1, cuya activación produce el reclutamiento de la proteína COP I y así formar la
vesícula.
El proceso de activación de la proteína G (en el esquema proteína SAR 1) ocurre de la
siguiente manera: la proteína G, que se encuentra en el medio citosólico, es atrapada por
una proteína que se encuentra en la membrana del organelo donde se formará la vesícula
(en el caso del esquema, RE) llamada GEF (guanidine Exchange factor), la que produce
el cambio de GDP a GTP (se activa). Al ocurrir esto, la proteína G sufre un cambio que
hace evidente una cola de un lípido (hidrofóbica), la cual se une a la membrana del
retículo endoplásmico. La especificidad de la formación de la vesícula está dada
entonces por las GEF.

Una vez formada la vesícula, que tiene un cargo específico, pierde su capa COP, ya que
para unirse a su blanco debe haber un contacto entre ambas membranas, y la proteína
COP actúa como una coraza, lo que impediría la unión. Este proceso ocurre gracias a la
hidrolización de la proteína G, por acción de GTPasas, lo cual hace que se suelten de la
membrana de la vesícula. Todo esto nos hace ver que el balance de activación de
proteína G es fundamental para la formación de vesículas.

Una vez que la vesícula se ha liberado de su capa COP, debe encontrar su

compartimiento blanco (targeting). El proceso de reconocimiento del compartimiento
blanco está dado por un set de proteínas llamadas SNARES. Los SNARES, que se
encuentran en la vesícula, se llaman v-snares (vesicular snare), y estas interactúan con
el set de snares que se encuentran en el blanco, llamadas t-snares (targets snares). La
interacción es altamente específica entre v-snares y t-snares, ya que un tipo de v-snare
tiene afinidad con un tipo de t-snare.

Cada snare es propio de la vesícula y propio del compartimiento blanco, además puede
haber complejos de más de un t-snare o más de un v-snare. Ejemplificaremos este
proceso mediante el proceso de targeting entre vesículas sinápticas y células nerviosas,
ya que estos SNAREs son los mejor estudiados.
Acá, v-snare es la sinaptobrevina, que es una proteína transmembrana con 1 dominio α-
hélice, y hay 2 estructuras t-snare, la sintaxina, que es una proteína transmembrana con
1 dominio α -hélice, y Snap25, que es una proteína periférica con 2 dominios α -hélice.
En el proceso de acoplamiento o “Docking”, estos snares interactúan formando una
estructura de resorte enrollado de 4 α -hélices (3 de los t-snares, 1 de v-snares)
denominado coiled coil*, que ancla a la vesícula a su blanco.

Una vez establecido el proceso de Docking, las membranas se fusionan, esto ocurre
gracias a la acción de una proteína llamada NSF (proteína chaperona citosólica con
actividad ATPasa), que, unida a las proteínas SNAP, primero cataliza el desensamblaje
de los SNAREs, gracias a la energía de hidrolización de ATP que separa la interacción
del coiled coil e induce la fusión de las membranas, acercándolas.

El Snap es una proteína soluble que se une a la NC (ATPasa). Cuando el Snap se une a
ésta, ocurre la hidrólisis. Al ocurrir esta unión, esto es activo y se une a Snare. Entonces
Snap (proteína pequeña que se une a NSF y el complejo entre SNAP y NC se llama
Snap receptor y actúa sobre los Snare.
Hay otras proteínas, llamadas proteínas Rab. Estas son proteína GTP. No basta la
interacción entre Snares, ya que hay algunas proteínas que hacen “el control de
calidad”. Las vesículas que se producen en diversas membranas tienen también una Rab
particular y la proteína Rab es una proteína G. Entonces, en su estado activo como GTP
se pega a la membrana. Cuando viene la vesícula viajando con su Snare y con su
proteína Rab, estos se empiezan a reconocer y la proteína Rab interactúa con otra, es
decir, el sistema de reconocimiento tiene otro componente: el componente Rab. Hay
una proteína también que se llama efector de Rab. Entonces tenemos el receptor de
Snare y este efector especifico. Hay proteínas rab 1, rab 2, rab 3, rab 15, rab 20 que
están involucradas en los diferentes tráficos. Cada Rab está involucrada en un tráfico
específico. Entonces hay un sistema de seguridad de control de calidad del
acoplamiento.

Una vez que el Snare y los Snap se

fusionan, esta proteína Rab ya cumplió
su trabajo y entonces el GTP se
hidroliza y al hidrolizarse la proteína
RAB se suelta y vuelve a formar parte
del cúmulo de proteínas Rab.

Estos dos sistemas aseguran finalmente

con un alto grado de certeza que esta
vesícula que salió se pueda fusionar con
un compartimiento específico y no con
otro.

Cada flujo, cada recorrido tiene su Snare especifico y su Rab especifico. Rab 1 está en
vesículas que van desde el retículo endoplásmico al golgi, Rab 2 son vesículas propias
del Golgi cis, rab 3, rab 4, rab 6 están encargadas del trafico entre el Golgi medio y
Golgi trans y el rab 7 está encargado del tráfico que va hacia los endosomas tardíos.

La endocitosis es la forma mediante la cual, las células internalizan sustancias, del

medio externo. Y tenemos acá la fagocitosis (comer una cantidad grande de materia
como una bacteria o un glóbulo rojo). En la macropinocitosis también se forman
invaginaciones, gran cantidad de volumen del medio externo es internalizado (Fago=
comer, pino = beber). Existen algunas pinocitosis pequeñas y estas son la endocitosis.
Está la endocitosis mediada por clatrina, endocitosis mediada por *cable dolina y la
endocitosis constitutiva. Los filamentos de actina son los que ayudan a que se forme la
vesícula. También la ayudan a separarse de la membrana plasmática por una atracción
mecánica. Hay múltiples rutas de entrada, los tamaños de las vesículas son alrededor de
100nm, por lo tanto nunca se podrá ver en un microscopio óptico la endocitosis mediada
por clatrina.
Las vesículas se diferencian en el cargo, en lo que ellas seleccionan para entrar, se
diferencian en el tamaño y se diferencian en el mecanismo mediante el cual forman la
vesícula. La más común es la endocitosis mediad por clatrina, en esta, se forma una
vesícula cubierta por clatrina, se disocia rápidamente para que quede esta vesícula
desnuda que sea capaz de fusionarse. Una vez que se fusiona esta vesícula, se fusiona
con un compartimiento llamado el endosoma temprano y aquí se ingresa al sorting de
selección porque salen vesículas hacia todas partes. Desde este endosoma, el cargo que
venía puede seguir una ruta llamada ruta degradativa, que llega finalmente al
lisosoma.

La ruta degradativa tiene los siguientes componentes: vesícula, endosoma temprano,

superficie celular, cuerpos multivesiculares (son muy parecidos a los lisosomas), luego
está el endosoma tardío y el lisosoma. La ruta de reciclaje va de la superficie celular al
endosoma temprano, de ahí, al otro sistema endosomal, llamado de reciclaje y de aquí
hacia la membrana plasmática. Mucho de este tráfico se realiza a través de vesículas,
otro es a través de un proceso de maduración (la mayoría piensa que el sorting madura
en un cuerpo multivesicular, y este cuerpo multivesicular madura en un endosoma tardío
y el endosoma tardío madura en un lisosoma). Los diferentes componentes endosomales
tienen sus características propias, como su composición, enzimas y ubicación.
El endosoma temprano está cerca de la periferia de la célula, el endosoma de reciclaje es
perinuclear, los cuerpos multivesiculares están por todos lados del citosol y los
endosomas tardíos son perinucleares. Tienen una morfología que es muy característica,
como túbulos vesiculares (composición esférica con mucha membrana interna). El pH
en el lumen de estos compartimientos endosomales es ácido o acídicos, y su pH es así
porque tienen estas bombas vacuolares que bombean protones al interior.

Tienen marcadores específicos.

Hay sistemas de ligando y de
receptor que hacen la ruta de
reciclaje y hay otros sistemas que
hacen la ruta degradativa y tienen
proteínas G que son especificas,
como las Rab. Cada proteína Rab
tiene una distribución sub-celular
característica y cada organelo tiene
a lo menos una Rab en su cara
citosólica. Rab 4 ó Rab 5 son
típicas de los endosomas de
selección o de sorting. Rab 4-11 en
el endosoma de reciclaje, rab 4
participa en el sorting y en el
reciclaje.
Los diferentes compartimientos endosomales tienen diferente morfología, pH en el
lumen, diversas proteínas que los caracterizan. Hay todo tipo de endocitosis: la
endocitosis de reciclaje, la endocitosis de degradación. La endocitosis es específica
con respecto a su cargo porque es mediada por receptores.
Ej: tenemos en el plasma sanguíneo LDL parte de nuestros lípidos de la sangre.
Tenemos en la célula receptores para LDL. Este receptor se internaliza (vesícula
endocítica, se selecciona ahí) y llega al endosoma temprano. En este endosoma hay un
cambio de pH y el receptor se disocia del LDL porque hubo cambios en la estructura de
la proteína con el pH. El receptor sigue en la membrana de este compartimiento túbulo
vesicular. Normalmente en los túbulos hay mucha más membrana que líquido, y en la
parte vesicular tenemos nuestro LDL y el receptor. De ese túbulo, salen vesículas hacia
el endosoma de reciclaje y ahí va el receptor y posteriormente llega a la membrana
plasmática. En este caso, nuestro receptor pasó por la ruta de reciclaje y no le pasó nada,
es decir, hizo el trabajo de entregar LDL. La LDL ahora está en la parte vesicular, ésta
empieza a madurar en un cuerpo multivesicular: el lisosoma, y ahí la LDL es degradada.

El caso dos es el receptor de transferrina con la transferrina. La transferrina es una

proteína del plasma sanguíneo y su receptor reside en la membrana plasmática. Su
función: entregar hierro a las venas.
Viene la transferrina y se une a su receptor, forman una vesícula, un endosoma
temprano y cambian de pH (este complejo es estable al pH 6 [no hay disociación]), se
va a los túbulos. Se seleccionan vesículas, pasa al endosoma de reciclaje y se devuelve a
la membrana plasmática. En este caso tanto el receptor como su ligando hicieron la ruta
de reciclaje. Hay otros casos en los cuales viene el receptor, llega al endosoma
temprano, no se disocian, pero el receptor aquí está en la membrana en la parte que mira
al citosol. Tienen señales que le dicen: “Usted no sale de aquí, usted va a seguir la ruta
degradativa”. Entonces en este caso, tanto el receptor como el ligando que traía
finalmente, se degradan en el lisosoma.

Una de las características que va a definir el destino final de ligando-receptores es la

estabilidad que tengan al pH del endosoma de sorting (o endosoma temprano): Si se
disocian, el destino será diferente; si permanecen unidos, el destino será el mismo
(principalmente reciclaje o degradación). Depende de la señal que pueda tener el
receptor en su segmento citosolar.

Las clases de los sistemas son:

-Uno: El ligando va a la ruta degradativa y el receptor a la ruta de reciclaje.
-Dos: El receptor y el ligando van a la ruta de reciclaje.
-Tres: El receptor y el ligando van a la ruta degradativa (son receptores que van ligados
a la transducción de señales).
-Cuatro: Ocurre en las células polarizadas (Aquellas del epitelio que tienen membrana
apical y basolateral diferente; Ej.: células del epitelio intestinal) Se internaliza el
ligando-receptor en una de las membranas, se entrega a la otra membrana y se libera la
proteínas. El caso típico es la inmunoglobulina AG.
En el recién nacido, tenemos receptores para EGA y EGE en las células de epitelio y
cuando toma leche de la mamá, reconoce estas proteínas, las internaliza y las pasa desde
la parte que mira hacia el lumen del intestino al interior (hacia la circulación sanguínea)
y pasan sin que se modifiquen las inmunoglobulinas. Esto se llama transcitosis (tránsito
a través de las células).

Por los distintos métodos de endocitosis podemos degradar proteínas viejas (proteínas
que ya cumplieron su función) y/o que sufrieron modificaciones, las cuales son
reconocidas por receptores específicos. Por ejemplo, los receptores para
acialoglicoproteína. Todas las proteínas secretadas tienen residuos glicosídicos, el
último de estos es el ácido ciálico. Si esa proteína pierde el ácido ciálico por motivos de
uso, es reconocida por un receptor que la internaliza y la lleva a la ruta de degradación.
Así que podemos reciclar nuestras proteínas del plasma sanguíneo, etc.

El receptor de factor de crecimiento epidermal, cuando llega una señal con el mismo
nombre, se une a este receptor y hacen un sistema de transducción de señales que lleva
finalmente a inducir la división celular, entonces cuando esa señal se hace efectiva
ocurre un proceso llamado down-regulation. Este receptor y ligando se internalizan y
son degradados, de esta manera desaparece este receptor de la membrana plasmática y
deja de estar esa señal que le “dice” a la célula que se divida.
Recapitulación: llegó la señal, la célula desencadenó su sistema de transducción de
señales, inició su proceso de división celular pero no quiere seguir dividiéndose después
de eso (sino tendríamos crecimiento inorgánico de un tejido), entonces con el proceso
de down-regulation sacamos ese receptor y la célula se hace insensible a cualquier señal
que haya que le diga “divídase”.
El proceso de selección (sorting) acá ocurre a través de unas proteínas que están
presentes en la membrana.

La capa de proteínas que

hacen los COP acá es la
clatrina. La unidad
estructural y funcional de la
clatrina es el trisquelion
(tres extremedidades). Están
formados por tres
subunidades pesadas y por
tres subunidades livianas de
clatrina. Cuando se unen
muchos trisquelion empiezan
a formar una malla que será
una capa COP (capa de
clatrina). También hay otras
proteínas llamadas
adaptinas, las cuales tienen
una composición compleja:
tienen dos cadenas grandes,
una cadena mediana, una
cadena chica, y el sitio de
reconocimiento de cargo.
Entonces se empieza a formar esta vesícula. Estas
adaptinas se adicionan primero a la membrana,
después las clatrinas se adicionan sobre las
adaptinas y empieza a formar la vesícula y al
mismo tiempo las proteínas forman una
invaginación que está cubierta por clatrina.
Las proteínas van pasando cada 2 a 4 segundos, o
sea, cualquier proteína puede pasar por uno de
estos pozos. Hay algunas proteínas que pasan
porque sí, pero hay otras que tienen señales que se
reconocen acá y se quedan “pegadas”. De esta
manera, y a medida que se va formando la
vesícula, se selecciona el cargo (este es el proceso
que más se conoce).
Hay otra proteína G que es importante: la dinamina. La dinamina en su estado activo es
capaz de polimerizarse y formar una especie de collar. La dinamina tiene un dominio
con actividad GTPasa, tiene un dominio llamado “del medio”, un dominio pH que
interactúa con fosfolípidos, una guanidina, un dominio de intercambio de nucleótidos y
un dominio de riconclorina. Entonces esta es una proteína que es capaz de “pegarse” a
otras proteínas (ya hablamos del ejemplo del collar), entonces cuando la proteína
intercambia su GDP por GTP, se activa y se forma un collar naturalmente y este se pone
justo en el cuello de la vesícula que se va a formar. Cuando se gatilla la actividad
GTPasa, este collar se contrae. Este movimiento mecánico hace que las membranas de
este cuello se junten y se fusionen y ahí está la vesícula formándose. Este es el caso que
en forma mecánica la dinamina va a ayudar a formar una membrana.

Observaciones de apoyo:
a) Ubicación de dinamina-1
(neuronal) y dinamina-2 (ubicota)
en “coated pit” de la membrana
plasmática.
b) La capacidad de dinamina para
autoensamblarse en anillos
helicales localizados en
invaginaciones de c-p.
c) Interacciones in Vitro entre
dinamina y AP2s.
d) La capacidad GTPásica de
dinamina.
e) La necesidad de GTP y el efecto
de análogos en la endocitosis
mediada por el receptor en
células perforadas.