PRÁCTICA 3

TÉCNICAS DE AISLAMIENTO Y CULTIVO DE PATÓGENOS (HONGOS Y

BACTERIAS)
PRESENTAR VIERNES 15 FEBRERO
INTRODUCCIÓN:
La mayoría de las enfermedades de las plantas se diagnostican al observarlas a
simple vista o mediante el microscopio, lo cual hace innecesario el aislamiento del
patógeno. Sin embargo, hay muchas enfermedades fungosas en las que es imposible
identificar al patógeno que ya se encuentra mezclado con uno o más contaminantes,
porque aún no ha producido sus cuerpos fructíferos característicos y esporas, debido
a que una misma enfermedad puede deberse ya sea a uno o a varios patógenos
morfológicamente semejantes o tal vez a algún factor del ambiente, o bien a que la
enfermedad es causada por un nuevo patógeno hasta ese momento desconocido, el
cual debe aislarse y estudiarse. Como es habitual, los patógenos de enfermedades
desconocidas deben aislarse de los tejidos enfermos de una planta a fin de que se
pueda llevar a cabo un estudio de sus características, hábitos, etc.

OBJETIVOS

Conocer las técnicas de aislamiento de los patógenos que causan enfermedades en

las plantas.

Definir medios de cultivo, señalando los diferentes constituyentes básicos de un

medio de cultivo e indicar la función de cada uno de ellos.

Clasificar los medios de cultivo, según: el estado físico, la naturaleza de sus

constituyentes y los propósitos de uso.

MEDIOS DE CULTIVO
De manera general se denomina “medio de cultivo” a cualquier material que presente
una adecuada combinación de nutrientes para permitir el crecimiento o el incremento
del número de células de una población de microorganismos. (Fig. 53).

Constituyentes básicos de los medios de cultivo

1. Fuentes de energía
1.1 Orgánicas: carbohidratos, proteínas, polisacáridos, grasas, ácidos orgánicos, etc.
1.2 Inorgánicas: Ej. amonio, nitritos, azufre, etc.
1.3 Luz.
2. Componentes estructurales celulares
2.1 Componentes principales: Carbono, hidrógeno, oxígeno, nitrógeno, azufre,
fósforo, potasio, magnesio, calcio, hierro y sodio.
2.2 Elementos trazas: Cobalto, zinc, molibdeno, cobre y manganeso.
2.3 Factores de crecimiento: Se llama así a cualquier compuesto orgánico que un
microorganismo requiere como precursor o constituyente de su material orgánico
celular, pero que no puede sintetizarlo a partir de sus fuentes de carbono más simples,
por lo que se le debe proporcionar como nutriente. Ej. aminoácidos, purinas,
pirimidinas y vitaminas.
3. Agua
 Clasificación de los medios de cultivo
1. Según su estado físico
1.1 Líquidos
Usualmente se denominan caldos ya que contienen los nutrientes disueltos en agua.
Permiten obtener suspensiones con un elevado número de microorganismos. Ej.
Caldo nutritivo.
1.2.Sólidos
Se pueden preparar a partir de medios líquidos a los cuales se les añaden agentes
solidificantes como agar, gelatina o sílica gel. Se utilizan con frecuencia en el
aislamiento y mantenimiento de los microorganismos en el laboratorio. Ej. Agar
nutritivo.
2. Según la naturaleza de sus constituyentes
2.1 Medios naturales o complejos
Están constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal y usualmente
se complementan con el añadido de minerales y otras sustancias. No se conocen
todos los componentes del medio de cultivo, ni las cantidades exactas en que están
presentes. Ej. Extracto de carne, extracto de levaduras.
2.2 Medios sintéticos o químicamente definidos
Se preparan a partir de ingredientes químicamente puros y por lo tanto se puede
conocer exactamente su composición cualitativa y cuantitativa. Por su costo sólo se
emplean en procedimientos especiales.
[Link]ún sus propósitos de uso
3.1 Medios de enriquecimiento
Se llama enriquecimiento a cualquier cultivo en medio líquido que resulte en un
incremento en el número de un tipo dado de microorganismo en relación con el
número de otros tipos de microorganismos que puedan estar en el inóculo. Un medio
de enriquecimiento puede contener sustancias que favorezcan el crecimiento del
microorganismo que nos interesa o que inhiban el crecimiento de los otros tipos de
microorganismos presentes. La selectividad de un cultivo de enriquecimiento no está
determinada únicamente por la composición química del medio usado, sino que en
un medio dado puede ser variada significativamente modificando otros factores tales
como: temperatura, pH, fuerza iónica, iluminación, aireación etc.
3.2 Medios selectivos
Son básicamente iguales a los de enriquecimiento, se diferencian por ser medios
sólidos y están diseñados para el aislamiento de microorganismos específicos.
3.3 Medios diferenciales
No contienen sustancias inhibidoras, es decir, permiten el crecimiento de muchos
tipos de microorganismos, pero si contienen indicadores de productos derivados de
la actividad metabólica de los microorganismos sobre algunos de los componentes
del medio. Se utilizan para la identificación de los microorganismos. Ej.: Agar base
rojo fenol utilizado para detectar fermentación de carbohidratos.

Fig.53. Diferentes medios de cultivo

AISLAMIENTO

Los géneros que se encuentra con relativa frecuencia en la naturaleza, por ejemplo sobre los
frutos en putrefacción, semillas, forrajes, cueros, maderas, etc. También se lo encuentra
normalmente en el suelo. Para aislarlo se tiene en cuenta su estado natural, procediendo
luego de acuerdo con las técnicas siguientes:

a) POR DILUCIÓN EN AGAR:

Una serie de 4 a 6 tubos de cultivo, cada uno de los cuales contiene 10 ml de un medio de
agar adecuado (Medio de Czapeck, medio de Sabouraud, medio de malta), se calienta en
baño de agua para fundir el agar. Enfriar el contenido de los tubos a 45º C; se añade a cada
uno de ellos una pequeña cantidad del material que contiene el moho agitando
cuidadosamente, se lleva una pequeña porción a un segundo tubo y el resto se vierte
asépticamente en una placa de Petri; se agita el segundo tubo y se separa una pequeña
porción para el tercero, vertiendo el resto en la placa de Petri. Se continúa del mismo modo
hasta obtener 4 o 6 muestras, y como el cultivo se va diluyendo de una a otra, en alguna de
ellas habrá ya un cultivo puro.

b) POR SEPARACIÓN DE ESPORAS DE UNA COLONIA.

Una vez seleccionada una colonia que se presume pura, se recogen de la misma unas
cuantas esporas mediante una aguja esterilizada, llevándolas a un tubo que contiene un
medio favorable para el crecimiento. La operación se efectúa con ayuda de una lupa o bien
con el microscopio.

c) MEDIANTE EL MICROMANIPULADOR:
El micromanipulador más conocido es el de Peterfi, construido por la Zeiss; es de tipo
mecánico ya que las agujas, pipetas, ansas y escalpelo se mueven por juegos de tornillos en
todas direcciones. Consta de una camarita en la cual se coloca una gota del material a aislar;
se observa a través del microscopio. Mediante los dispositivos laterales del micromanipulador
se mueven en todo sentido dos microagujas o dos micropipetas que permiten recoger o
aspirar un solo microorganismo de la suspensión.

d) POR GERMINACIÓN DE UNA SOLA ESPORA:

Se hace una dilución de esporas en agua estéril o salina hasta que cada gota contenga solo
una espora, lo que puede comprobarse con auxilio del microscopio. Se ponen entonces varias
gotas sobre la superficie de agar, marcando su posición para poder localizar el cultivo correcto
en el caso de existencia de algún contaminante.

e) POR MODIFICACIÓN DEL MÉTODO DE UNA SOLA ESPORA DE KEITT:

Esta modificación se debe a Ezekial (1930). Con ayuda de una aguja de extremo plano
cargada con el material que contiene las esporas, se hacen varios trazos paralelos sobre la
superficie de un medio agarizado convenientemente, se invierte entonces la placa
incubándola durante 16-24 horas. y observándola a través del fondo con el microscopio
(objetivo de 16 mm). Una vez descubiertas las esporas, se marca con tinta su posición.

f) POR MEDIO DE UNA AGUJA DE PUNTA CILÍNDRICA (que obra como sacabocado)
se corta el cilindro de agar que contiene el esporo. Este cilindro se siembra en una caja de
Petri y se observa para estar seguro de que existe un solo elemento, y luego de desarrollado
se resiembra en un tubo con medio de cultivo apropiado. Se incuba y aparecerá la colonia de
desarrollo monocitogenético.

g) MÉTODO DE HANSEN: En este método (Hansen,1926) se prepara una suspensión

de esporas en agar, que se aspira en tubos capilares de diámetro no mucho mayor que el de
las esporas. Los tubos capilares se observan al microscopio y cuando se descubre una espora
aislada se rompe el tubo de manera que el segmento contenga solo una espora. El cristal se
trata con alcohol y luego se coloca en un medio fresco. La espora se desarrolla dando lugar
a una colonia. Este método resulta eficaz con esporas grandes y coloreadas, en cambio no
lo es con esporas pequeñas.
 AISLAMIENTOS MONOESPÓRICOS
Serán obtenidos a partir de un aislamiento multiespórico con una edad del cultivo no superior
a 30 días.
Procedimiento: Una vez esporulado el cultivo original, lo cual se logra entre los 5 a 10 días
siguientes a la siembra en el medio agar-papa y a una temperatura promedio de 25º C, se
procede a obtener una suspensión de esporas con una concentración de 3x10 5
esporas/ml(Fig.54).

Fig.54. Metodología para obtener cultivos monoespóricos

Previamente, con un marcador se hicieron 6 estrías por el reverso de las cajas de petri
esterilizadas, con el fin de facilitar la lectura al microscopio. Luego de servir una fina capa del
medio de cultivo agar-papa en las cajas de petri, se tomaron 3 ml de la suspensión de esporas
(3x105 esporas/ml) y se depositaron en el extremo superior de la estría. Con un asa en
argolla y sin cambiar el lado del asa que se venía utilizando, se esparció el inóculo. La
incubación se hizo a temperatura ambiente durante 24 horas y se observó la germinación de
esporas al microscopio con el objetivo de 10X. Con un bisturí #3 y una cuchilla #10,
debidamente desinfestados en alcohol y flameados, se cortaron y colocaron las estrías sobre
un portaobjeto estéril, teniendo en cuenta el orden en que fueron cortadas. Se observaron al
microscopio y una vez se ubicó la espora germinada fue demarcada el área con el objetivo
de 40X y se cortó el bloque de agar con el bisturí. Antes de ser transferida al medio agar-
papa, se observó de nuevo el bloque de agar para asegurar el aislamiento de una sola espora
y se llevó a incubación a 25º C en luz constante. Todo este proceso se realiza asépticamente,
en cámara de flujo laminar.

IDENTIFICACIÓN PRELIMINAR DE CULTIVOS DE HONGOS

Para la identificación de un moho se precisa una descripción completa del organismo. Para
estudiar sus características, se prefiere el medio de Czapeck que es un medio satisfactorio y
da muy buenos resultados con fines comparativos.
El examen de los cultivos debe hacerse diariamente, por lo menos durante la primera y
segunda semana de incubación. Las observaciones macroscópicas deben realizarse con la
ayuda de una lupa. En general es posible determinar, por el examen visual, si una colonia de
hongos es filamentosa o levaduriforme. Las colonias de hongos filamentosos tienen un
aspecto velloso o acordonado, mientras que las levaduras producen colonias mantecosas con
superficies lisas.
Las colonias individuales desarrolladas en el medio Czapeck, se pueden estudiar a simple
vista, con la lupa y al microscopio con poco aumento. Podemos así deducir lo siguiente:
velocidad y forma de crecimiento, tamaño y color de los cuerpos fructíferos e hifas; elevación
y densidad de las distintas partes de la colonia, presencia o ausencia de peritecios,
variaciones en la forma y tamaño de los núcleos de mohos. Debe observarse la consistencia
de la superficie de la colonia, el plegamiento, la nitidez del borde y la presencia de pigmentos
en la superficie o el reverso o su difusión hacia el medio circundante. Invirtiendo la placa de
Petri puede observarse el color del fondo de la colonia, así como cualquier coloración
producida en el medio.
Estas observaciones son suficientes para indicar la clase u orden a que pertenece el hongo,
pero para identificar el género y la especie es preciso el estudio al microscopio. Con las
esporas se efectúan las observaciones siguientes: forma, tamaño, color, características y
colocación. En las hifas fértiles se examinan: ramas, tabiques, anchura, color, características
y naturaleza de las paredes (lisas, picadas o rugosas). A partir de las observaciones así
adquiridas y complementadas con las técnicas de coloraciones conocidas, puede intentarse
la identificación del moho conociendo la descripción de los géneros.

AISLAMIENTO A PARTIR DE TEJIDO VEGETAL

A partir del tejido vegetal enfermo es posible aislar a los patógenos. Se busca tomar trozos de la
zona de avance para incrementar las oportunidades de aislar al patógeno. Los trozos de tejido
vegetal se someten a una desinfección superficial. En el caso de bacterias es posible macerar
un trozo de tejido afectado y luego sembrar

Fig.55. Trozos de tejido vegetal mostrando la zona de avance del patógeno .Luego estos fueron
sembrados en placa Petri. Se observa el crecimiento de los hongos patógenos (Ver fig. 64).

Aislamiento directo a partir del signo

Fig.56. Cuando la muestra vegetal presenta signo es posible tomar una pequeña porción del mismo y
sembrar en una placa con medio de cultivo. Se observa crecimiento de hongo patógeno.

Aislamiento a partir del exudado bacteriano

.
 Fig.57. Un trozo de tallo de una planta afectada vascularmente es colocado en agua en recipiente con agua o
salina estéril. En el vaso se observa flujo bacteriano estéril y en la placa Petri un estriado en placa sobre la cual
crece bacteria patógena

Inducción del signo

Fig. 58. La aparición de signo puede ser inducida mediante cámara húmeda.

AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DEL SUELO

Fig. 59. La muestra de suelo (izquierda) se suspende en agua estéril. Se hacen diluciones 10 -1 a 10-10 veces
(centro) . De cada dilución se siembran por extensión dos placas con 100 μL (0.1 ml) en medios de cultivo
(dependiendo del tipo de microorganismos que queramos aislar) y luego se incuban (derecha) . Se aíslan
colonias separadas de distinta morfología y se purifican mediante repiques.

MÉTODO DE EXTENSIÓN EN PLACA

Fig. 60. Para que se pueda contar el número de colonias en la placa debe estar entre 30 y 300.
a. Método de estriado en placa

Fig. 61. Esquema práctico del aislamiento de bacterias por el método de estriado en placa. Se observan las
colonias aisladas (color amarillo) colonias aisladas

b. Método de diluciones seriadas (Fig. 62, 65)

Fig. 62. A partir de una suspensión concentrada de microorganismos se realizan diluciones [Link]
toman 0,1 ml de la solución, se siembra en superficie y se esparce mediante rastrillo de vidrio.

MATERIAL DE PRÁCTICA:
A. Biológico:
 Órganos de plantas enfermas.
 Muestras de suelo de campo de cultivo (1/2 Kg)
B. De laboratorio:
 01 pliego de papel de filtro*
 100 ml agua estéril*(ADE)
 02 Mecheros*
 01 Estufa
 01 Escobilla*
 01 Autoclave
 01 Baguetas de vidrio*
 01 Cocina eléctrica*
 01 litro de alcohol comercial*
 01 Cámara aséptica
 250 ml de lejía comercial*
 250 g. agar*
 01 litro de ron comercial*
 500 g de detergente*
 01 paquete de papel de aluminio*
 06 envases de vidrio (250 ml)*
 02 Pipetas
 02 Cajas petri
 06 Tubos de ensayo
 02 vasos de precipitación
 02 probetas
 02 matraces
*Material que debe traer el alumno
PROCEDIMIENTO:
1. PREPARATIVOS PARA EL AISLAMIENTO
Siempre que se desee aislar un hongo patógeno de los tejidos de una planta enferma, deben
llevarse a cabo los siguientes procedimientos preliminares:

a. Esterilización del material de cristalería, que incluye cajas petri, tubos de ensayo,
pipetas, etc., mediante calor seco (de 150 a 160º C durante una hora o más) o autoclave, o
bien sumergiendo ese material durante un minuto más en una solución de ácido sulfúrico-
dicromato de potasio, en cloruro mercúrico 1:1000, en formalina al 5% o en alcohol etílico al
95%. Todo el material de cristalería que se trate químicamente debe enjuagarse por lo menos
tres veces en agua estéril (esterilizada en autoclave o mediante ebullición).

b. Preparación de soluciones para tratar la superficie del tejido infectado o infestado,

con el fin de eliminar o reducir notablemente los contaminantes de superficie que pudieran
interferir con el aislamiento del patógeno. Ello son:

Hipoclorito de sodio (lejía) al 2.0 %

Alcohol etílico al 70%
Cloruro mercúrico 1:1000

c. Preparación de medios de cultivo en los que se desarrollarán los hongos. Puede

utilizarse un número casi infinito de medios de cultivo para cultivar hongos fitopatógenos.
Los medios de cultivo que con mayor frecuencia se utilizarán son papa-dextrosa-agar
(PDA), el cual es bueno para la mayoría de los hongos (pero no para todos). El agar-agua o
agar-glucosa (de 1 a 3% de glucosa en agar- agua) que se utiliza para separar algunos
hongos (Phythium y Fusarium) de bacterias.(Fig. 55) (Ver medios sintéticos y naturales).

BACTERIAS
Aislamiento y Purificación
De las muestras foliares recolectadas, que presentaban síntomas de pudriciones húmedas y
manchas foliares, se procede a lavarlos con abundante agua con el fin de eliminar la mayor
cantidad de contaminantes que pudieran tener. Posteriormente en un ambiente aséptico se
cortan trozos de tejido de 3 a 4 mm aproximadamente, que incluyan el área próxima a la sección
que se encuentra afectada, luego se colocan en agua destilada estéril (ADE), para permitir que
las bacterias fluyeran al líquido, una vez verificada la presencia de flujo bacteriano, se procedió
a realizar los aislamientos en Agar Nutritivo (AN) por el método de agotamiento en cajas de petri.
Estas se incubaron a temperaturas de 26 a 28º C de 24 a 48 horas; transcurrido el tiempo de
incubación, las colonias desarrolladas después de 24 horas, se repicaron individualmente en
cajas de petri con AN, para obtener cultivos puros.

HONGOS
Aislamiento y Purificación
Las muestras traídas de campo con evidentes signos de enfermedad, se lavan con abundante
agua y jabón, se someten a un proceso de desinfección superficial sumergiendo las muestras en
hipoclorito (2%) por un minuto luego en ADE, se cortan en trozos de un tamaño de 3-4 mm, se
dejan secar en una toalla absorbente estéril y con una pinza estéril se ponen en agar-papa-
dextrosa (PDA) la incubación se hizo por un período de 8 días aproximadamente a una
temperatura de 25ºC.(Fig. 56).
Inducción de la Esporulación
Para inducir a la esporulación de algunos hongos se realizaba un repique en medio V8 (Ver
medios sintéticos y naturales). Por otra parte se preparan cámaras húmedas consistentes en
cajas de petri estériles, toallas o papel absorbente humedecidos con ADE, donde se depositan
los trozos de aproximadamente 2-3 cm del material vegetal afectado con el propósito de
mantenerlos y favorecer la esporulación, para la posterior identificación gracias a las
características morfológicas tenidas en cuenta en la clave de Barnett (1972) para identificación
de hongos.
Las muestras se dejan en cámaras húmedas por un tiempo entre 48 y 72 horas, se revisan
periódicamente con el fin de evidenciar las características micro y macroscópicas de los hongos
resultantes; si posterior al tiempo de incubación no se observaba esporulación alguna se
descartaba que el problema fuera de origen fungoso.
RESULTADOS:

 Dibujar el procedimiento para aislar y cultivar un hongo fitopatógeno

 Reportar el patógeno aislado (colonia e individuo)

CUESTIONARIO:

1. Escriba una relación de 10 medios de cultivo específicos para

bacterias y 10 medios de cultivo específicos para hongos
fitopatógenos.
- Agar sangre
- Agar chocolate
- Agar McConkey
- Agar Hektoen entérico
- Fenilalanina Agar
- Agar granada
- Agar tergitol
- Agar tripticasa soya
-
2. Esquematizar las siete técnicas de aislamiento propuestas
3. ¿Cuál es la finalidad de realizar un aislamiento monoespórico?
4. Explique el procedimiento de la técnica inducción del signo.
¿Cuál es su finalidad?
5. Se aíslan patógenos del suelo y de los tejidos vegetales. ¿Con
qué finalidad se realiza cada uno de ellos?
 Fig. 63. Preparación de medios de cultivo nutritivos

Fig. 64. Aislamiento de patógenos a partir de hojas enfermas

Fig. 65. El método de dilución seriada: Un recuento en placa es una medida directa y proporciona un recuento de
viables. En primer lugar, la muestra se diluye seriadamente, transfiriendo 1 ml de la muestra a 9 ml de medio estéril
y se mezclan adecuadamente. Este proceso se repite basta obtener una dilución apropiada en este ejemplo,
1:100000 (10-5). Posteriormente se añade 0,1 ml a una placa de agar nutritivo, bien extendiéndolo en la superficie de
la misma (método de extensión en placa) o mezclándolo con el medio (método de vertido en placa). Las placas se
incuban y se recuentan las colonias que se desarrollan. Debido a razones estadísticas, las placas deben contener
entre 30 y 300 colonias. En este ejemplo, la placa tiene 225 colonias.

…las cepas nativas serán aisladas a partir de muestras de suelo y se usará el método de
dilución en placa en PDA. Un gramo (1 g) de suelo se diluye en 10 ml de agua destilada
estéril y se realizan diluciones seriadas hasta 1 x 10-4. Cada dilución se siembra en medio
PDA y se incuba a 30oC durante diez días. Los resultados de porcentaje de inhibición del
crecimiento se transformaron con la fórmula arcoseno (Ѵx/100) y se sometieron a análisis
de varianza y prueba de Tukey (p≤0.05).(Reyes y col., 2012)

…hojas con síntomas de necrosis foliar se colectaron, luego se cortaron en fragmentos de

1 cm2 que incluyeron parte enferma y aparentemente sana, se desinfectaron con
hipoclorito de sodio al 2% durante un minuto y se enjuagaron dos veces con agua
destilada para eliminar residuos de cloro. En cámara de flujo laminar, las muestras se
colocaron sobre papel absorbente previamente esterilizado para eliminar excesos de
agua, luego sembrar (ver fig. 55, 64)
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

GONGORA SALGADO, A.; ROJAS GRACIA, P. 2006. Incidencia de las enfermedades en

uchuva Physalis peruviana l. por estado fenológico y de acuerdo con la ubicación en los
diferentes estratos de la planta, en el departamento de Cundinamarca. Trabajo de grado.
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA. Pg 32-35

REYES A, CRISTOBAL J, RUIZ E, TUN J. 2012Inhibición del crecimiento in vitro de Fusarium

sp. aislado de chile habanero (Capsicum chinensis) con hongos antagonistas. Fitosanidad
16(3):161-165