MATERIALES Y METODOS
1. MATERIALES
a. Material biologico :
M
u
e
st
ra c. Instrumentos y equipos
de suelo de cultivo Cocina
Balanza analítica
Autoclave
b. Material del laboratorio Cernidor
d. Reactivos de laboratorio
Medio para azotobacter :
Agar Ashby Manitol
(g/100ml)
Manitol 2.0
Fosfato de dipotasio 0.02
Sulfato de magnesio 0.02
Placas petri Cloruro de sodio 0.02
Matraz
Beaker
Asa de kolle
Mechero
Papel aluminio
Espátula
Algodón
Papel kraf
Sulfato de potasio 0.01
Carbonato de calcio 0.5
Agar 2.0
2. MÉTODOS
a. PREPARACIÓN DEL MEDIO AGAR ASHBYS- MANITOL
1) Pesar todo los componentes del medio en una balanza analitica
2) En un matraz suspender los componenetes en 100ml de agua destilada
3) Calentar sólo a ebullición
4) Esterilice en autoclave a 121 ° C durante 2 horas
5) Mezclar bien y verter en placas Petri ésteriles
Pesar todo los En un matraz suspender Agregar al matraz
componentes del medio los componentes del 100ml de agua
en una balanza analítica medio destilada, calentar sólo
a ebullición
Esterilizar en autoclave a Mezclar bien y verter en
121°C durante 2 horas placas Petri estériles
b. AISLAMIENTO DE LA BACTERIA Azotobacter sp
Con un asa de kolle coger una porción de muestra de suelo y colocarla en la
superficie del medio Agar Ashby Manitol previamente servido en una placa
Petri, En 5 lugares diferentes.
Incubar a 25°C durante 5 días, hasta que exista crecimiento.
Para la purificación de la cepa tomar una porción de la colonia con el asa de
Kolle sembrar de manera consecutiva en placas con el mismo medio (Agar
Ashby manitol) e incubar.
Observar al microscopio las colonias mediante coloración Gram.
Analizar y realizar la caracterización microscópica de las colonias aisladas.
Colocar la muestra de suelo en la
Con un asa desuperficie
kolle cogerdeluna porción
medio Agar Ashby
de muestra de suelo
Manitol previamente servido en una
placa Petri, En 5 lugares diferentes
Incubar a 25°C durante 5 días, hasta
que exista crecimiento
RESULTADOS
AISLAMIENTO DE LA BACTERIA Azotobacter sp
Pasado el tiempo de incubación se observó el crecimiento de colonias pequeñas
transparentes alrededor de la muestra de [Link] 1
Se observó las características microscópicas de las bacterias Azotobacter sp
mediante la coloración Gram. FIGURA 2
FIGURA [Link]ísticas macroscópicas de Azotobacter sp. Colonias pequeñas
transparentes alrededor de la muestra de suelo en Medio Agar Ashby Manitol.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
CLAVIJO, Claudia et [Link], caracterización e identificación de bacterias
diazotróficas de la rizósfera del cultivo de Olea europea "olivo" en Tacna Perú. Ecol.
apl. [online]. 2012, vol.11, n.2, pp.89-102. ISSN 1726-2216.
Jiménez, D. 2007. Caracterización molecular de cepas nativas colombianas de
Azotobacter spp. mediante el análisis de restricción del DNA ribosomal 16S. Tesis
Microbiólogo. Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, Colombia.
Lara, C.; Villalba, M.; Oviedo, L. 2007. Bacterias fijadoras asimbióticas de nitrógeno
en la zona agrícola de San Carlos. Revista Colombiana de Biotecnología 9(2): 6-14.
Escobar, C.; Horna, Y. 2011. Caracterización de cepas nativas de Azotobacter spp. y
su potencial como promotoras del desarrollo vegetativo de “tomate” (Lycopersicon
esculentum Mill.). Tesis de Licenciatura. Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo,
Lambayeque.
AISLAMIENTO DE AZOTOBACTER
INTRODUCCION
La familia Azotobacteriaceae comprende a las bacterias del género Azotobacter, las cuales
son Eubacterias Gram-negativas que tienen una pared celular compleja que consiste de
una membrana externa y una capa interna de peptidoglicano que contiene ácido
murámico y mureína.
Se reproducen por fisión binaria, viven en suelos y en aguas frescas, son células ovoides y
grandes de 1.5 a 2.0 um de diámetro. Son pleomórficas, variando su morfología desde
bacilos hasta células en forma de cocos. Se les observa como células individuales, como
pares o formando agregados irregulares y algunas veces formando cadenas de tamaño
variable. Algunas especies como [Link] y [Link] sufren un proceso de
diferenciación para formar quistes resistentes a la desecación. Se mueven por flagelos
peritricos, son aerobios, pero pueden crecer en concentraciones de oxigeno bajas. Algunas
producen pigmentos solubles o insolubles en agua.
Son quimioorganotróficas, utilizan azucares, alcoholes y sales inorgánicas para crecer, son
fijadores de nitrógeno; en vida libre fijan al menos 10mg. de N2 por gramo de
carbohidrato (glucosa) consumido. Requieren molibdeno para fijar nitrógeno que puede
ser parcialmente reemplazado por vanadio. Utilizan nitrato y sales de amonio y ciertos
aminoácidos como fuentes de nitrógeno, son catalasa positivos; el Rango de pH en el que
crecen en presencia de nitrógeno combinado es 4,8-8,5 el pH óptimo para crecer cuando
fijan nitrógeno es 7,0-7,5.
Azotobacter vinelandil es una bacteria poliploide, es decir posee varias copias de su
cromosoma, se calcula que pueden tener hasta 80 copias. El número de copias varía
dependiendo del medio y las condiciones de cultivo así como de la fase de crecimiento. Es
de tamaño muy grande de 2x 5nm. De diámetro es decir 5 a 10 veces el volumen de E.
coli. Se ha asociado el tamaño con la poliploidia.
Las capacidades metabólicas y genéticas por las que [Link] ha sido y es objeto de
estudio son principalmente:
Fija nitrógeno en presencia de oxigeno por tres sistemas diferentes de
nitrogenasa.
Posee mecanismos de protección de la nitrogenasa.
Posee una alta capacidad respiratoria que en condiciones diazotroficas o de
fijación de nitrógeno es hasta 10 veces más alta que la de Escherichia coli .
Sufre un proceso de diferenciación morfológica para formar quistes
resistentes a la desecación.
La fijación biológica de nitrógeno o reducción de N2 a NH4, es un proceso que pueden
llevar a cabo solo algunos procariontes gracias a que poseen el complejo enzimático
conocido como nitrogenasa, la cual está formada por dos proteínas : una proteína que
contiene fierro( proteína–Fe). La nitrogenasa que contiene molibdeno “Mo” es la más
ampliamente distribuida.
En cualquier ecosistema los diazotrofos responden a condiciones variadas del ambiente
para regular el muy caro proceso de fijación de nitrógeno. Todos los diazotrofos regulan la
nitrogenasa a nivel transcripcional. Algunos también poseen sistemas rápidos de
regulación postranscripcional.
La fijación de nitrógeno o reducción de N2 a NH4 requiere 8 electrones, por lo tanto se
requiere un mínimo de 16 ATP para reducir una molécula de N2. Atmosférico, el ATP
utilizado en la fijación de nitrógeno lo provee la respiración aeróbica, por lo tanto la
fijación de nitrógeno aeróbica requiere una concentración de 02 mínimas.
OBJETIVO:
Aislar Azotobacter sp en medio Ashby Manitol a partir del suelo
FIGURA2Características microscópicas de Azotobacter [Link]
negativas, pleomórfica, variando su morfología desde bacilo hasta
célula en forma de coco. Se le observa como célula individual, como
pares o formando agregados irregulares, y algunas veces formando
cadenas de tamaño variable.
