DETERMINACIÓN DE CAFEINA EN UNA BEBIDA GASEOSA (POR HPLC)
1. OBJETIVO
Determinar la concentración real de cafeína en una bebida gaseosa (por HPLC)
Determinar el número de platos
Curva de calibración
2. FUNDAMENTO TEÓRICO
El HPLC o cromatografía líquida de alta precisión es en definitiva una cromatografía en
fase líquida en columna a la cual se aplica una sobrepresión que permite acelerar el
proceso de separación y para obtener un análisis cuantitativo de la muestra en cuestión.
La columna utilizada en este caso corresponde a una C-18.
Como bien sabemos, la cafeína es un alcaloide sólido de color blanco que actúa como
una droga psicoactiva y estimulante, la cual se encuentra presente en varios bebestibles
que consumimos comúnmente, tales como el té, café, coca-cola (normal y light),
bebidas energizantes, analgésicos, en las que está cuantificada la cantidad exacta de
cafeína que se puede consumir por mL (en el caso de las bebidas) o por mg (analgésicos).
En la parte experimental se utilizó una solución madre de cafeína preparada de 1µg /
µL, de la que se extrajo 1 mL y se aforó hasta 10 mL, la que denominaremos solución 2.
A partir de ésta última se hicieron las distintas extracciones desde 100 µg/µL hasta 900
µg/µL mezclándolas con agua desionizada en las proporciones exactas para la obtención
de 1 mL y luego siendo inyectadas en el HPLC para obtener la curva de calibración
absoluta.
El cromatograma de las muestras en cuestión dará una serie de picos los cuales están
correlacionados con las áreas de cada estándar y que tienen directa relación con la
concentración de las muestras de cafeína inyectadas, lo que generará una curva de
calibración absoluta.
Ahora, para el cálculo de la cantidad de cafeína inyectada a partir de los datos obtenidos
en la curva de calibración, se debe tener en cuenta la ecuación de la recta y la ecuación
de dilución:
y(x)= mx – n (1)
X corresponderá a la cantidad de muestra inyectada (µg)
Y(x) corresponderá al área de la muestra
Ésta fórmula será utilizada para el cálculo de la masa inyectada en el caso de las bebidas
y el analgésico.
Debido a las diversas diluciones realizadas y con los volúmenes y concentraciones
correspondientes conocidas, se utilizará la siguiente fórmula:
C1 x V1 = C2 x V2 (2)
Para la obtención de la masa inyectada de los estándares de cafeína/agua, se
considerará el volumen del loop de 20 µL:
Masa cafeína inyectada = C2 x VLoop (3)
Figura 1: Estructura de la cafeína.
3. REACTIVOS, MATERIALES Y EQUIPOS
REACTIVOS
Bebida gaseosa
Agua destilada
MATERIALES
Filtro jeringa
Vaso de Precipitación de 250 ml
Tubo de ensayo de plástico 50 ml
Pipeta graduadas
EQUIPOS
HPLC
Agitador magnético
4. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
1. Preparar un estándar de 1000 𝑚𝑔⁄𝐿 a partir de un medicamento
100 𝑚𝑔 𝑐𝑎𝑓𝑒𝑖𝑛𝑎
= 1000 𝑚𝑔⁄𝐿
100 𝑚𝑙
2. Preparar las soluciones estándar diluidas.
sol ppm
1 10
10.0 ml con agua ultrapura o
2 20
3 40 Tipo I
4 60
3. Preparar la muestra
100 ml de bebida gaseosa y agitarla por 10’
25 ml con una pipeta la depositan en un tubo de ensayo de 50 ml y lo aforan
con H2O tipo I
4. Preparar la muestra para la medición por HPLC:
Con una jeringa hipodérmica de 3-5 ml. Tendrá de (3) y luego se filtrará con el
“filtro jeringa” y se depositará en el vial.
1.5 ml
5. Condiciones para la medición del instrumento de HPLC.
Columna: C-18 ⊘= 4.6 𝑚𝑚
Tamaño del poro: 4.6 mm
Longitud de la columna: 15 cm
Fase móvil:
Solución de acetato de sodio 0.01 M de ph= 4.2 (de acético glacial)
Luego se filtra con una membrana de poro de 0.45 mm (celulosa)
Disolver acetonitrilo se filtra con membrana de nylon de poro de 0.45
mm.
5. CÁLCULOS Y RESULTADOS
Determinar la concentración real de cafeína en una bebida gaseosa (por HPLC)
y = 9.2355x + 7.9945
Área = 9.2355 𝐶𝑚 + 7.9945
Área de la concentración de la cafeína: 512.37138
512.37138 = 9.2355 𝐶𝑚 + 7.9945
𝐶𝑚 = 54.61283959
𝟓𝟎 𝒎𝒍
𝑪𝒓𝒆𝒂𝒍 = 𝑪𝒎 ∗
𝟐𝟓 𝒎𝒍
𝐶𝑟𝑒𝑎𝑙 = 109.2256792
Curva de calibración
ppm Área
10 99.55567
20 195.07567
40 374.65255
60 563.30403
Área vs ppm y = 9.2355x + 7.9945
R² = 0.9999
600
500
400
Área
300
200
100
0
0 10 20 30 40 50 60 70
ppm
Determinar el número de platos
𝒕𝑹 𝟐
𝑵 = 𝟏𝟔 ∗ ( )
𝒘
360.100 2
𝑁 = 16 ∗ ( )
𝑤
6. CONCLUSIONES
Este método permite determinar el contenido de cafeína en bebidas energéticas
carbonatadas. La disolución que contiene la cafeína es sometida al HPLC en una columna
C-18, octadecilo comercial con una longitud de 10 cm con detector de ultravioleta. La
cafeína contenida es cuantificada por comparación con una solución estándar tratada
similarmente.
7. BIBLIOGRAFÍA
SKOOG, Douglas A. y West, Donald M. Análisis Instrumental, 2da Edición. México,
McGraw-Hill, 1992.
México. 2. Skoog D. A., Leary J.J 1994. Análisis Instrumental. 4ª edición. McGRAW-
HILL
México. 3. Christian G. D. 2009. Química Analítica. 6ª edición. McGRAW-HILL,
México.
