INSTITUTO TECNÓLOGICO NACIONAL DE MÉXICO.

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE MÉRIDA.

MICROBIOLOGIA ALIMENTARIA

ALUMNO:

JOSE SANTIAGO CHACON CAAMAL

UNIDAD lI
7B BIOQUÍMICA.

PRACTICA 4: RECUENTO DE ENTEROBACTERIAS EN

PLACA

DOCENTE:
Dra. LOURDES VARGAS

MÉRIDA, YUCATÁN, MÉXICO A 03 DE ABRIL DEL 2019

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 Índice
Portada --------------------------------------------------------------- 1

Índice --------------------------------------------------------------- 2

Objetivo ---------------------------------------------------------------- 3

Introducción ----------------------------------------------------------------- 3

Correlación ----------------------------------------------------------------- 4

Material y equipo ---------------------------------------------------------------- 4-5

Metodología ----------------------------------------------------------------- 6-7

Sugerencias didácticas: ----------------------------------------------------------- 8

Reporte ------------------------------------------------------------------ 8

Bibliografía ------------------------------------------------------------------ 10

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3. Objetivo: Determinar la presencia de enterobacterias en un alimento mediante el
conteo en placa y petrifilm.

4. Introducción

Las Enterobacterias son de gran importancia, ya que son organismos involucrados

en la degradación de los alimentos; son indicadores de contaminación fecal en los
alimentos y algunos son patógenos de origen alimentario.

Actualmente se reconocen 29 géneros de enterobacterias, que incluyen más de 100

especies diferentes. El 99% de los aislamientos clínicos pertenecen únicamente a
23 especies. Atendiendo a su poder patógeno se dividen en dos grupos:

- Enterobacterias patógenas: Escherichia coli enteropatógeno, Shigella,

Salmonella, Yersinia.

- Enterobacterias oportunistas: E. coli, Citrobacter, Klebsiella, Serratia,

Proteus, Hafnia, Edwardsiella, Providencia, Morganella.

El recuento total de enterobacterias se utiliza como indicador de contaminación

fecal, y como uno de los indicadores de Buenas Prácticas de Fabricación. Se utiliza
como indicador de la calidad microbiológica de alimentos procesados, y recuentos
elevados señalan una elaboración inadecuada o una contaminación posterior, o
ambas cosas a la vez; siempre implica un riesgo higénico-sanitario.

La mayoría de los procesos para alimentos y bebidas poseen, al menos, un paso

que elimina efectivamente las bacterias patógenas. Sin embargo, prevenir la re
contaminación antes del empaque puede ser un reto. Las Placas PetrifilmMR para
recuento de Enterobacterias (PEB) son un método efectivo para controlar
ambientes, así como superficies de contacto de alimentos post proceso y para
ayudarle a revelar rápidamente las fuentes potenciales de contaminación.

Las Enterobacterias son de gran importancia, ya que son organismos involucrados

en la degradación de los alimentos; son indicadores de contaminación fecal en los

3
alimentos y algunos son patógenos de origen alimentario. Las Placas PetrifilmMR
para recuento de Enterobacterias enumera todos los organismos Coliformes,
además de los patógenos potenciales como:

Salmonella, Shigella y Yersinia,

lo que proporciona una figura más detallada de la contaminación potencial. Estos

organismos sensibles al calor y a la higienización deberían ser monitoreados, tanto
en ambientes secos como húmedos. La placas PetrifilmMR para Recuento de
Enterobacteriaceae es un sistema de medio de cultivo listo para ser usado, que
contiene los nutrientes de medio Agar Bilis Glucosa Rojo neutro Cristal Violeta
(VRBG) modificado, un agente gelificante soluble en agua fría y un indicador que
facilita la enumeración de colonias.

5. Correlación con el programa de microbiología alimentaria de Ing.

Bioquímica.

Tema: El análisis microbiológico de los alimentos

Subtema: Normas y criterios para el análisis microbiológico en alimentos.

6. Material y equipo necesario

- Muestra

- La muestra será la seleccionada en la práctica 3, se analizará por

duplicado.

- Cepas control de Escherichia coli y Staphilococcus aureus.

- Material y equipo necesario.

1. Utensilios estériles (cuchillo, tenedor, cuchara, pinzas, bolsas) para tomar

muestra (Los necesarios).

2. Diez tubos de ensayo 16 x 150 mm con tapón de rosca.

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3. Una espátula.

4. Un mechero Fisher.

5. Dos matraces Erlenmeyer de 250 mL.

6. Diez pipetas de 1 mL.

7. Dos pipetas de 10 mL.

8. una varilla de vidrio estéril (en escuadra o “L”).

9. Ocho a doce cajas de Petri estériles.

10. Una licuadora o dos morteros con pistillo estériles.

11. Un contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal.

12. Una balanza digital.

13. Un vortex.

14. Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de ±1.⁰C, a 35 a 37

⁰C ± 1 °C.

15. Un baño de agua a 45°C.

- Medio de cultivo y diluyente.

- 2 matraces Erlenmeyer de 250 mL de capacidad, con 90.0 mL de solución

amortiguadora de fosfatos o agua peptonada al 0.1%, o con solución salina isotónica
(SSI), al 0.85 %.

- 10 tubos de ensayo de 16 x 150 mm con tapón de rosca, conteniendo 9.0 mL de

solución amortiguadora de fosfatos o agua peptonada al 0. 1 % o con solución salina
isotónica (SSI),al 0.85 %.

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- Un matraz con 200 mL de Agar Bilis Glucosa Rojo neutro Cristal Violeta (VRBG).
Este debe ser preparado justo antes de usar.

- Placas petrifilm 3M para el recuento de enterobacterias (proporcionadas por el

profesor).

7. Metodología

a) Técnica Recuento en placa

- Preparar diluciones decimales de la muestra de alimento en el diluyente

seleccionado (10-1 a 10-5). Sembrar 1 mL en duplicado en placas Petri estériles de
las diluciones 10-1 a 10-5.

- Verter en cada placa Petri 15 mL de agar VRBG previamente fundido y enfriado a

45oC en baño de agua. El tiempo entre la dilución inicial y el vertido del medio no
debe ser superior a 15 minutos.

- Mezclar el inóculo con el agar siguiendo las siguientes instrucciones: mover la

placa con movimientos de vaivén 5 veces en una dirección, hacerla girar 5 veces en
el sentido de las agujas del reloj mover con movimientos de vaivén en una dirección
que forme ángulo recto con la primera y hacerla girar 5 veces en el sentido contrario
a las agujas del reloj.

- Esperar que se haya solidificado el agar con el inóculo y agregar una segunda
capa con 4 a 5 mL del mismo agar.

- Esperar que solidifique la segunda capa e incubar las placas invertidas a 35 a

37oC por 24 ± 2 hrs.

- Inocular una placa con una cepa de E. coli, otra con S. aureus. En paralelo incubar
una placa sin inocular como control de esterilidad del medio.

- Leer las placas que presenten entre 15 a 150 colonias. Contar aquellas que
contienen colonias de color púrpura.

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- Registrar el resultado de cada placa por dilución.

b) Técnica Petrifilm 3M

- Preparar diluciones decimales de la muestra en el diluyente seleccionado.

- Coloque la placa Petrifilm en una superficie plana y nivelada. Levante la lámina

semitransparente superior. Con la pipeta perpendicular a la placa Petrifilm coloque
1 ml de la muestra (previamente preparada con su correspondiente dilución).

- Con la cara lisa hacia abajo presionar el dispersor para repartir la muestra sobre
el área circular (Figuras 3, A, B, C y D).

- Levante el dispersor, espere un minuto a que se solidifique el gel y proceda a la

incubación.

- Incube las placas caras arriba durante 24 horas a 35°C.

- Retirar las placas una vez cumplido su tiempo de incubación y proceder al recuento
de colonias. Cuente todas las colonias rojas con halos amarillos o pálidos y que
estén asociadas o no a una burbuja de gas (Figura 4).

Ilustración 1Figura 3. Método del petrifilm

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 Ilustración 2Figura 4. Las colonias de enterobacterias tienen las siguientes características en las placas: Petrifilm para
Enterobacteriaceae: Las enterobacterias pueden producir colonias asociadas a burbujas de gas (ver figura 4, círculo 1).
Las enterobacterias pueden producir también colonias rojas con zonas ácidas solamente (ver figura 4, círculo 2). Por
último, las enterobacterias pueden producir colonias rojas asociadas a zona ácida y burbujas de gas (ver figura 1, círculo
3).

7. Sugerencias didácticas (desarrollo de competencias genéricas)

- Propiciar actividades de búsqueda, selección y análisis de información en distintas

fuentes incluyendo normatividad en el ámbito microbiológico de alimentos vigente.

- Llevar a cabo actividades prácticas de laboratorio que promuevan el desarrollo de

habilidades para el análisis de enterobacterias en un determinado tipo de alimento.

- Propiciar, en el estudiante, el desarrollo de actividades intelectuales de inducción-

deducción y análisis-síntesis, las cuales lo encaminan hacia la investigación, la
aplicación de conocimientos y la solución de problemas en el ámbito del control de
calidad en alimentos.

8. Reporte del alumno (resultados)

A) Reportar como se indica a continuación, con dos cifras significativas y potencias

de 10: Enterobacterias en placa en incubadas por 48 h. a 26 ⁰C: 2x10ˆ^12 UFC / g
(ó / mL) de muestra “valor estimado”.

El número de UFC es menor que 25 por lo cual el valor es estimado como lo indica
la norma.

8
Enterobacterias en petrifilm en incubadas por 48 h. a 26 ⁰C: 0 UFC/g (ó mL) de
muestra.

Las Enterobacterias no crecieron debido a que en la placa solamente crecieron

levaduras, lo cual al sembrarse en el los Petrifilm de Coliformes no creció nada

B) Responde el siguiente cuestionario:

- ¿Qué diferencias observaste en las dos técnicas utilizadas para el

análisis de entero bacterias? R= en la técnica tradicional el tiempo en esterilizar y

preparar los medios de cultivos es mayor al de cuando usamos petrifilm el cual ya

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está listo para sembrar. Y en los petrifilm solamente puede crecer un
microorganismo en específico a comparación de los medios de cultivos que pueden
crecer diferentes tipos.

- ¿Cuál es el campo de aplicación y el alcance de esta técnica?

La Las Placas Petrifilm tienen un tiempo de vida útil de 8 meses desde su fecha de
elaboración.

con colonias que son MNPC, tienen una o más de las siguientes características:
Muchas colonias pequeñas, muchas burbujas de gas y el oscurecimiento del gel de
un color rojo a un azul púrpura.

Cuando existen cifras altas de coliformes, algunos tipos de E. coli presuntiva pueden
producir menos gas y las colonias azules pueden ser menos definitivas. Cuente
todas las colonias azules sin gas y/o zonas azules como E. coli. Si es necesaria la
confirmación, aisle las colonias azules con gas para su posterior identificación.
Recuento actual aprox.

- ¿Por qué es importante la detección de entero bacterias en

alimentos? R= es importante debido a que son microorganismos patógenos los

cuales pueden causar un grave daño a nuestra salud.

-Señala dos ventajas y dos desventajas al usar las placas Petri film.

Ventajas desventajas
Es rápido a comparación del método Es más costoso
tradicional
Solo crece el cultivo que deseas Requiere temperaturas exactas para su
conservación

9. Bibliografía preliminar

10
-Enumeración de Enterobacteriaceae en alimentos. Técnica Recuento en
placa.PRT-712.03-040. Microbiología de Alimentos. Fecha de emisión 06/2002.
Fecha de revisión 08/05/ 2008. Instituto de Salud Pública. Gobierno de Chile. Pp.
16.

-General Guidance for the Enumeration of Enterobacteriaceae without

resuscitation.–MPN technique and colony -count technique-ISO 7402 punto 4.2.2.

- Recuento de Enterobacteriaceae. 3M Placa PetrifilmMR. Revisión 2003-06. 3M

Microbiology. 3M center, Bldg. 275-5W-05 St. Paul, MN 55144-1000. USA.
www.3M.com/microbiology.

- Secretaría de Salud. NOM-109-SSA1-1994. Bienes y Servicios.

Procedimiento para la Toma, Manejo y Transporte de Muestras de Alimentos para

su Análisis Microbiológico. Norma Oficial Mexicana. México.

- Secretaría de Salud. NOM-110-SSA1-1994. Bienes y Servicios.

Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico.

Norma Oficial Mexicana. México.

- Departmento de Microbiología e Immunología. University of South

Carolina.[1]
- Son estos patrones de fermentación los que se usan en el laboratorio para
distinguir una especie de la otra.

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