EVALUACIÓN DEL ESPECTRO DE ABSORCIÓN DE TRES COLORANTES
CON SU RESPECTIVO BARRIDO ESPECTAL
Karen Yanitsa Gómez-Betancourt, María Alejandra Collazos-Molina, Christian Andrés
Viuche-Madroñero, Eduard Barragán-Montealegre
Programa de Biología. Facultad de ciencias básicas. Universidad de la Amazonia
RESUMEN
INTRODUCCIÓN
La espectrofotometría se encuentra entre las tantas técnicas, sistemas, o modelos
científicos dando como enfoque o principio fundamental la detección y cuantificación de
sustancias de origen químico o biológico. La expresión hace alusión a como la incidencia
de la luz puede ser aplicada con el ánimo de determinar la concentración en una solución
determinada. Lo estudiado por Girón & Valea se concluyó que la ley de Bourguer-Lamber
Beer confiere el pilar para hallar las concentraciones de las sustancias calculando la
absorción por parte de esta misma. Al reconocer cierta luz incidente sobre la materia y la
luz que esta transmite, es factible calcular cierta cantidad absorbida, con la siguiente
fórmula A=ecl donde ‘a’ representa la absorbancia, la ‘e’ es un coeficiente que se define
de acuerdo con su molaridad y ‘l’ es una distancia que se comprende como longitud de
onda (Toral, Orellana, & Saldías, 2009).
De acuerdo con lo anterior, en la práctica se trabajó con concentraciones de Azul de
Metileno, Verde Malaquita y Rojo Congo. El término concentración parte del tema de
disoluciones. Una disolución es simplemente una mezcla de tipo homogénea. La
concentración se puede evidenciar como la correlación entre componentes que
conocemos como soluto y disolvente. En el laboratorio se trabajo con concentraciones
molares la cual es específica definirla como la cantidad de un soluto divido por los litros
de cierta disolución (Landau, Ricchi, & Torres, 2014).
El Azul de metileno es una coloración química muy fundamental para la biología, para el
análisis e investigación de ciertas muestras. Su función principal es la de tinturar ciertos
tejidos para mejorar observaciones dentro el microscopio, por ende, también se puede
diluir fácilmente con el alcohol lo que permite un ahorro de esta solución (Huitle,
Fernandez, & Reyes, 2010). El Verde Malaquita es muy fundamental para teñir elementos
microscópicos como el caso de las esporas en organismos más que todo unicelulares
como las bacterias (Upasjbosco, 2017). Por último, el Rojo Congo es especial para frotis
sanguíneos y tiene muchos fundamentos en estudios de bacteriología para observar
sustancias como los amiloides para entrar a distinguir ciertas enfermedades (Moreno &
Velez, 2011). Fue importante trabajar con estos colorantes porque son fundamentales en
la universidad donde se requiere conocer si existe alguna contaminación en ellos.
RESULTADOS
Barrido espectral
Lo primero que se realizó fue el barrido espectral de los tres colorantes mediante el
espectrofotómetro, las longitudes de onda fueron:
Figura 1. Barrido espectral del colorante Verde Malaquita con sus respectivas longitudes
de onda
Figura 2. Barrido espectral del colorante Azul de Metileno expresando su longitud de
onda
Figura 3. Barrido espectral del colorante Rojo Congo con su respectiva longitud de onda
El primer colorante que se sometió al espectrofotómetro fue el Verde Malaquita y reflejo
tres picos. Su mayor longitud de onda fue de 644 nm. El azul de metileno solo expreso
un pico y su longitud de onda fue de 649 nm y el rojo congo tuvo dos picos, pero, la
mayor longitud de onda fue de 506 nm. En la tabla 2 se resume los datos observados.
Colorantes Longitud de onda teórica Longitud de onda experimental
Verde Malaquita 615 nm 644 nm
Azul de Metileno 660 nm 649 nm
Rojo Congo 540 nm 506 nm
Tabla 1. Datos finales de la longitud de onda teórica y experimental de los diferentes
colorantes.
Curva de calibración
Se determinó la curva de calibración para los tres colorantes partiendo de sus respectivas
longitudes de onda y de ella conocer la absorbancia de cada concentración, así:
Verde Malaquita
Muestras Concentración Absorbancia
1 0,00001 0,003
2 0,0001 0,005
3 0,001 0,045
4 0,01 0,428
5 0,1 3,606
Tabla 2. Absorbancias obtenidas por el espectrofotómetro del colorante Verde Malaquita
a una longitud de onda de
Curva de Calibración del colorante Verde Maliquita
4
3.5
3
2.5
2
y = 35.915x + 0.0193
1.5
R² = 0.9997
1
0.5
0
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1
Figura 4. Curva de calibración del colorante Verde Malaquita de acuerdo con las
diferentes absorbancias
Cálculos
Los cálculos a continuación derivan de la fórmula de línea recta: y = mx + b
Y2−Y1
Lo primero es hallar la pendiente de la recta, su fórmula es: m = X2−X1
m= 35.91
Lo segundo es hallar la intersección en el eje, su fórmula es: b= y – m(x)
b= y – m(x)= 0.0193
Con estos dos datos se va a hallar la concentración de la solución problema, con la
fórmula: x = y − b/m
x= y – m/b= 0,858 – 0.0193/35.91 = 0.023
Azul de Metileno
Muestras Concentración Absorbancia
1 0,00001 0.014
2 0,0001 0.087
3 0,001 0.057
4 0,01 0.488
5 0,1 3.490
Tabla 3. Absorbancias obtenidas por el espectrofotómetro del colorante Azul de Metileno
a una longitud de onda de 649 nm.
Curva de Calibración del colorante Azul de Metileno
4
3.5
3
2.5
2 y = 34.334x + 0.0642
1.5 R² = 0.9988
1
0.5
0
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1
Figura 5. Curva de calibración del colorante Azul de Metileno de acuerdo con las
diferentes absorbancias
Cálculos
Los cálculos a continuación derivan de la fórmula de línea recta: y = mx + b
Y2−Y1
Lo primero es hallar la pendiente de la recta, su fórmula es: m = X2−X1
m= 34.33
Lo segundo es hallar la intersección en el eje, su fórmula es: b= y – m(x)
b= y – m(x) = 0.0642
Con estos dos datos se va a hallar la concentración de la solución problema, con la
fórmula: x = y − b/m
x= y – m/b= 0.907 – 0.0642/34.33= 0.024
Rojo Congo
Muestras Concentración Absorbancia
1 0,00001 0,001
2 0,0001 0,007
3 0,001 0,077
4 0,01 0,318
5 0,1 3,031
Tabla 4. Absorbancias obtenidas por el espectrofotómetro del colorante Rojo Congo a
una longitud de onda de 506 nm
Curva de Calibración del colorante Rojo Congo
3.5
3
2.5
2
1.5 y = 30.143x + 0.017
R² = 0.9998
1
0.5
0
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1
Figura 6. Curva de calibración del colorante Rojo Congo de acuerdo con las diferentes
absorbancias
Cálculos
Los cálculos a continuación derivan de la fórmula de línea recta: y = mx + b
Y2−Y1
Lo primero es hallar la pendiente de la recta, su fórmula es: m = X2−X1
m= 30.14
Lo segundo es hallar la intersección en el eje, su fórmula es: b= y – m(x)
b= y – m(x)= 0.017
Con estos dos datos se va a hallar la concentración de la solución problema, con la
fórmula: x = y − b/m
x= y – m/b= 0.740 – 0.017/30.14= 0.023
DISCUSIÓN
Los tres colorantes: Verde Malaquita, Rojo Congo y Azul de metileno son muy
importantes para la Universidad en materia de microscopia para poder llegar a tejidos o
demás componentes celulares cuando ser realizan contables tinciones. La idea
fundamental era evaluar sus barridos espectrales para lograr conocer su respectiva
longitud de onda y a partir de ella reconocer sus absorbancias y por último construir sus
curvas de calibración para denotar en pocas palabras que tan efectivo está siendo el
colorante. La utilización de estos tres colorantes es que ellos en su composición conservan
un pH bastante acido lo que implica que son muy efectivos para pigmentar pH opuestos;
es decir, básicos (Castellar, Angulo, Zambrano, & Charris, 2013). Los colorantes se
sometieron al espectrofotómetro para medir sus longitudes de onda. El Verde Malaquita
que actualmente tiene un gran fundamento en colorear esporas; tuvo varios picos, lo que
deduce que tiene una gran contaminación respecto a varios estudios que ya se han
realizado. La longitud de onda de este colorante en revisión bibliográfica se sitúa entre
615 a 618 nm, en el experimento denoto a 644 nm, lo que es cierto que tiene una
contaminación no tan alta, pero, que es cierto que la metodología de utilización del Verde
Malaquita no está siendo muy eficaz. El azul de metileno tuvo la mayor longitud de onda
a 649 nm y los estudios lo sitúan a 660 nm, probablemente este margen de error radica en
el momento de hacer la disolución, es decir, en el pipeteo, Otro factor de tener una
longitud de onda menor a la propuesta puede ser las moléculas que están en el ambiente
provocando cierta perturbación de este compuesto. El Rojo Congo fue el colorante con
mas diferencia significativa con su longitud de onda, en el experimento logro ubicarse a
506 nm y los estudios establecen su longitud a 540 nm. Se deduce que la longitud fue
baja por muchos factores; no manipular bien las cubetas que entraran al
espectrofotómetro, hablar cerca de la solución provocando una entrada externa de
sustancias o probablemente el movimiento de moléculas por el aire acondicionado que
ingieren en el estudio.
Una vez se conoció las longitudes de onda de cada colorante, se realizó la curva de
calibración evaluando las cinco soluciones, más una solución problema. Para cada curva
se denoto la regresión lineal para poder llegar a conocer la concentración de cierta
solución problema (mirar resultados). La regresión lineal señala la dependencia de una
variable respecto a otra. Ahora, aplicando lo anterior a la experiencia realizada se puede
apreciar como a mayor concentración de la solución, se presenta una mayor absorbancia
por parte de esta y por ende un menor porcentaje de transmitancia a una determinada
longitud de onda conocida, esto se corrobora mediante el coeficiente de correlación el
cual es superior a 0.9 para las tres muestras. Las absorbancias son proporcionales a la
concentración del colorante para el rango de longitud de onda analizado. Las
concentraciones se determinaron a 1 cm de longitud con intervalos de diluciones. la
absorbancia depende de factores tales como la concentración y la longitud de onda.
Ahora, el barrido espectral realizado es único para cada compuesto permitiendo reconocer
la pureza de compuestos. La absorbancia y la concentración son directamente
proporcionales. Por otro lado, nótese que la concentración puede variar de acuerdo con el
solvente (Atencio, Condori De Zegarra, Quea, & Rivera, 2010). Ahora, la ley de Beer
señala que la absorbancia equivale a la constante de extinción molar de la sustancia en
estudio por la concentración de esta y la longitud de onda; lo anterior es comparable con
la ecuación y=mx+b, donde la pendiente (m) es equivalente a la constante de extinción
molar (ley de Beer), es decir que la constante equivale a la pendiente en la curva de
calibración.
CONCLUSIONES
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
Atencio, H. B., Condori De Zegarra, Y., Quea, J. T., & Rivera, K. M. (2010). Evaluación
de los parámetros de rendimiento del método espectrofotométrico para la
determinación de NO2 en el medio ambiente. Rev Soc Quím Perú, 12. Retrieved
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Castellar, G., Angulo, E., Zambrano, A., & Charris, D. (2013). Adsorption equilibrium
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Huitle, B., Fernandez, A., & Reyes, M. (2010). Adsorption studies of methylene blue and
phenol onto pecan and castile nutshells prepared by chemical activation. Revista
Mexicana de Ingeniería Química, Vol. 9, 10. Retrieved from
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Landau, L., Ricchi, G., & Torres, N. (2014). Disoluciones: ¿Contribuye la
experimentación a un aprendizaje significativo? / Solutions: Does experimentation
contributes to meaningful learning? Educ. Quím, 25, 21–29. Retrieved from
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Moreno, M., & Velez, D. (2011). A new method for quantifying endoglucanase activity
based on Congo red-carboxymethyl cellulosecomplex depolymerisation. Revista
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Toral, I., Orellana, S., & Saldías, M. (2009). Estrategias en el desarrollo de métodos
analíticos para la determinación simultánea de compuestos orgánicos por
espectrofotometría derivada. Quim. Nova, Vol. 32(No. 1, 257-262, 2009), 8.
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