Tema 11.
EL DIAGNÓSTICO EN EL LABORATORIO DE LAS INTOXICACIONES CON
INTERÉS FORENSE PRODUCIDAS POR SETAS. RECOGIDA Y REMISIÓN
DE MUESTRAS. TÉCNICAS ANALÍTICAS DE ELECCIÓN EN EL
LABORATORIO FORENSE.
TÉCNICAS MOLECULARES DE IDENTIFICACIÓN DE SETAS
CON INTERÉS FORENSE
Introducción
A lo largo de los últimos 50 años las intoxicaciones por setas
presentan un crecimiento significativo en todo el mundo. Las causas de este
hecho se deben tanto a la mayor afición de recolectar y consumir setas
como al incremento del consumo voluntario de setas alucinógenas. En
cuanto a la etiología médico legal, la mayor parte son accidentales; le
siguen el uso intencionado de hongos psicoactivos siendo excepcional la
etiología homicida o suicida.
La importancia de los micetismos se encuentra, no tanto en la
frecuencia con que se presentan sino en que los pacientes pueden haber
ingerido setas con toxinas potencialmente mortales. El análisis de
laboratorio no sólo sirve para confirmar el diagnóstico de un micetismo y
aportar nuevos taxones al catálogo de especies tóxicas, sino también evita
tratamientos agresivos, hospitalizaciones innecesarias y diagnosticar
síndromes mixtos o micetismos cuyos períodos de incubación queden
solapados.
La identificación tradicional de las setas tóxicas se basa en criterios
morfológicos y en la detección de toxinas. Estos análisis en ejemplares muy
deteriorados e incluso triturados, cocinados y a veces en vómitos o heces
suelen ser muy difíciles. Por ello un método de identificación independiente
tanto de la calidad del material fúngico como de la cantidad sería
extremadamente útil. La determinación de especie mediante el estudio de
marcadores genéticos podría ser una buena herramienta.
Tabla [Link]ón de los micetismos en función del periodo de latencia y
del órgano sobre el que actúa la toxina.
Latencia Órgano diana Tipo de reacción
Toxinas Especies
Menor a 6 horas Sis. nervioso - Colinérgico Muscarina
Clitocybe/Inocybe
- Glutaminérgico Ac. iboténico
Amanita muscaria
Muscimol Amanita
pantherina
- Epileptogénico Hidracinas
Giromitra
- Alucinogénico Psilocina
Psilocybe
Psilocibina
Gastrointestinal - Reacción disulfiram Coprina
Coprinus atramentarius
- Miscelánea gastrointestinal
Boletuss p ; Entoloma sp,
Alérgico - Inmunohemolítico
Paxilus involutus
- Neumónico
Lycoperdon sp
Entre 6-24 horas Hígado - Hepototóxico
Amatoxinas Amanita phalloides
Lepiota sp;
Galerina sp
Riñón - Nefrotóxico
Amanita proxima
Amanita
smithiana
Otros - Eritromelalgia Acidos Clitocybe
acromelalga
acromélicos Clitocybe
amoenolens
Superior a 1 día Riñón - Nefrotóxico Orellanina
Cortinarius sp
Sis. nervioso - Neurotóxico
Hapalopilus rutilans
Músculo - Rabdomiolisis Tricholoma
equestre(*)
Russula
subnigricans
(*) Considerada gran comestible hasta el año 2001
Identificación de setas y plantas superiores en casos de
intoxicación: cuando se sospecha una intoxicación debida a setas o
plantas tóxicas es necesario la identificación del elemento tóxico para
confirmar si es el responsable de los síntomas observados. La confirmación
del origen de la intoxicación servirá para adecuar el tratamiento médico al
tóxico concreto en función de su naturaleza. A tal fin, deben enviarse al
laboratorio los especimenes completos responsables de la intoxicación, si se
cuenta con ellos, o restos cocinados o de contenido gástrico. Es posible
identificar restos de setas en contenido gástrico o en otras muestras
utilizando técnicas de ADN, como veremos a lo largo de este curso.
Regiones polimórficas del ADN en hongos. De los diferentes genes del
ADN que han sido investigados en micología, gen de la Beta-tubulina, gen
de la Orotidina descarboxilasa, gen de la Chitina sintetasa, gen de la Actina,
gen del Factor de elongación, son las regiones ITS-1 e ITS-2 (internal
transcribed spacer) del nrDNA las que más se han utilizado para la
identificación molecular de hongos.
Metodología de análisis del ADN. Basada en la Técnica de
Amplificación génica por PCR (Reacción en cadena de la polimerasa). Para
amplificar cada una de las regiones diana de interés en taxonomía se
diseñan cebadores específicos para ellas. Los productos amplificados
pueden ser caracterizados de diferentes maneras. Las técnicas más
utilizadas en micología son:
PCR/RAPD (Análisis del ADN amplificado al azar). Se trata de un método en
el que no se necesita tener conocimientos previos sobre el genoma de un
determinado organismo y se realiza a partir del genoma entero. Se utilizan
diferentes iniciadores de secuencia arbitraria. Los productos amplificados se
separan mediante electroforesis. Se obtiene un patrón de bandas PCR/RAPD
para cada especie.
PCR/RFLP (Análisis del polimorfismo de la longitud de los fragmentos de
restricción). Esta técnica permite obtener, para cada organismo, una serie
de fragmentos del ADN de diferentes tamaños que dan lugar a un patrón de
bandas PCR/RFLP. Ello se consigue fragmentando la región amplificada
mediante el uso de enzimas de restricción. Comentarios: técnicas rápidas
y económicas pero dan patrones difíciles de interpretar y poco
reproducibles.
PCR/SSCA (Análisis conformacionales del ADN de una sola cadena). Es un
método rápido y económico para detectar polimorfismos de secuencia sin
necesidad de secuenciar. Se basa en la movilidad de las cadenas sencillas
de ADN. Los cambios en la migración tienen un alto grado de sensibilidad,
de tal manera que dos cadenas del ADN que difieran en una sola base
migrarán de forma diferente. La región amplificada se desnaturaliza y se
realiza una separación electroforética en condiciones desnaturalizantes. El
patrón de bandas PCR/SSCA es propio para cada organismo. Comentarios:
Al igual que ocurre con las técnicas anteriores, el perfil que se obtiene no es
siempre reproducible pero puede utilizarse como método de screening
previo a la secuenciación.
PCR/Secuenciación. El método más fiable y sensible para detectar la
diversidad genética es la secuenciación directa de los productos de
amplificación de la región diana. La técnica más utilizada es la
secuenciación cíclica con terminadores de cadena marcados con
fluorocromos. Las secuencias de nucleótidos que se obtienen para la región
diana en cada organismo y en diferentes laboratorios pueden ser publicadas
en bases de datos electrónicas (GENBANK, EMBL, etc).Comentarios: en
ocasiones puede que el material de herbario no esté identificado
correctamente o que no se utilice la misma nomenclatura sin olvidar las
contaminaciones del laboratorio debido a una mala praxis. Estas situaciones
dan lugar a que existan secuencias erróneas en las bases de datos públicas.
Por ello sería conveniente disponer de bases de datos propias,
cuidadosamente generadas, de las especies tóxicas.
Análisis de las secuencias de la región ITS para la
identificación de hongos
El análisis comparativo de una secuencia desconocida con las bases
de datos públicas, EMBL o Gen Bank, puede ser un método útil de
identificación de especie. Estas bases de datos disponen, via Internet, de
programas de comparación de secuencias: FASTA y BLAST (Based Local
Alignment Search Tool).Comentarios: aunque existen muchas secuencias
publicadas de las regiones ITS todavía son insuficientes para identificar
algunos hongos. El constante aumento de secuencias permitirá ir
identificando las setas responsables de producir intoxicaciones.
Diseño de test rápidos para la identificación de especie
El alineamiento y comparación de las secuencias nucleotídicas de una
determinada región diana entre ejemplares de la misma y de distinta
especie, permite conocer la variabilidad de la región y si es apta para el
diseño de nuevos test. Cada vez se investiga más el diseño de iniciadores
específicos de especie o sondas TaqMan mediante Real-Time PCR (RT-
PCR).Comentarios: son sistemas de identificación menos problemáticos y
más rápidos que la secuenciación.
