Microbiología General
Facultad de Ciencias Exactas
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ANEXO-Laboratorio Nº 1
OBSERVACION MICROSCOPICA DE BACTERIAS.
El examen microscópico de microorganismos constituye una de las técnicas
características de la microbiología y aunque es posible observar ciertos microorganismos
sin colorear (Ej. protozoarios), en el caso de las bacterias se hace necesaria la coloración
de los preparados para aumentar el contraste con el fondo.
Para obtener el máximo aprovechamiento de la observación microscópica, debe
poder relacionarse el comportamiento tintorial con la estructura y composición química de
las diferentes partes de la anatomía bacteriana.
Colorantes y mordientes.
Los colorantes utilizados en Microbiología son compuestos orgánicos que contienen
grupos cromóforos y auxocromos unidos a anillos aromáticos1.
La presencia de grupos cromóforos en una molécula (grupos azo, nitro, etc.) no es
suficiente para que ésta actúe como colorante, esto es que se fije a las estructuras a
colorear. Para ser colorante debe poseer grupos que sean capaces de disociarse llamados
auxocromos. Por ejemplo el 1,3,5 trinitrobenceno, es un compuesto coloreado pero no es un
colorante. Sin embargo, si se reemplaza un H por un OH en el anillo bencénico, se obtiene
el ácido pícrico que también es coloreado pero al poseer un grupo disociable (auxocromo)
actúa como colorante.
La distinción entre colorantes ácidos y básicos depende de la carga de la parte de la
molécula responsable del color. Si es negativa se trata de un colorante ácido y si es positiva
se trata de un colorante básico. Esta diferencia es importante debido a que, según sean
ácidos o básicos, los colorantes tendrán afinidad por diferentes zonas de la anatomía
celular.
Algunos colorantes utilizados comúnmente en Microbiología son fucsina básica,
cristal violeta, safranina, azul de metileno, etc.
1Salle, A. J. 1967. Fundamental Principles of Bacteriology. Mc Graw-Hill. Book Company. N. Y.
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En algunas coloraciones se
utilizan sustancias capaces de formar
complejos insolubles con los colorantes
y que ayudan al proceso de coloración:
los mordientes. Ejemplos de
mordientes comúnmente usados son el
Lugol, el ácido tánico y algunas sales.
Lógicamente, es de esperar que el colorante imparta su color a las estructuras
celulares, sin embargo hay un fenómeno llamado metacromacia en el cual se observa un color
diferente. Por ejemplo, pueden visualizarse corpúsculos metacromáticos rojos en ciertos
preparados teñidos con azul de metileno. Una explicación que da cuenta de este fenómeno se
muestra en la figura. El colorante, al interaccionar con ciertas estructuras polianiónicas como
los polifosfatos, se dispone de tal manera que cambia la longitud de onda de absorción 2.
Pueden observarse corpúsculos metacromáticos (gránulos de volutina) en varios géneros
microbianos y en general, su presencia denota algún déficit nutricional en el medio de cultivo.
PREPARADOS PARA MICROSCOPIA OPTICA. PROCEDIMIENTO GENERAL.
Los pasos fundamentales previos a una coloración son: extendido, secado y fijado.
a) Extendido: se coloca una pequeña porción de la muestra en un portaobjetos y se extiende
con el ansa en forma de óvalo. Para muestras provenientes de medios sólidos, debe colocarse
previamente una gota de agua sobre el portaobajetos.
b) Secado: puede dejarse secar el extendido a temperatura ambiente, o colocar a 30-40 cm
sobre la llama del mechero.
c) Fijado: la fijación tiene como finalidades evitar el desprendimiento del preparado durante la
coloración así como también preservar la forma original de los microorganismos.
El procedimiento más común es pasar el preparado 3 veces por la llama del mechero.
Sin embargo, esta técnica no es conveniente para ciertas coloraciones para las cuales deben
utilizarse procedimientos más suaves. Algunos agentes fijadores utilizados son etanol, metanol,
formol, sales de mercurio, tetróxido de osmio, ácido pícrico, etc.
Debe tenerse en cuenta que, luego del procedimiento de coloración, los preparados
pueden contener microorganismos viables, en especial si hay esporos. Por consiguiente
siempre deben considerarse como potencialmente riesgosos y manejarse con precaución.
2Geneser, F. 1986. Histología. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires.
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Observación en fresco y coloración vital.
Cuando se desea observar bacterias sin afectar su viabilidad, puede realizarse una
observación en fresco (sin colorear) o utilizar colorantes diluídos como por ejemplo cristal
violeta 1/5000. Con esta técnica podrá observarse la morfología y agrupación de las
bacterias así como también la movilidad.
Observación en fresco.
Técnica.
1- Sobre un portaobjetos colocar con el ansa una gota de agua y realizar una suspensión
de la muestra en estudio. No extender.
2- Colocar un cubreobjetos.
3- Observar con poca luz.
Coloración vital.
El procedimiento es similar al de la observación en fresco pero en el paso 1, se
coloca una gota de solución diluída de colorante en lugar del agua.
Existen portaobjetos especiales para realizar estas observaciones en los cuales es
posible colocar una mayor cantidad de líquido. Son los portaobjetos de Boettcher y de
Ranvier.
Coloración simple.
Esta coloración permite la observación de la morfología y agrupación de los
microorganismos. Se realiza con un solo colorante. Entre los colorantes más utilizados
para realizar coloraciones simples podemos nombrar el cristal violeta y el azul de
metileno. En general se utilizan en soluciones acuosas al 1 %.
Técnica.
1- Extender, secar y fijar por calor.
2- Aplicar solución de colorante durante alrededor de 2 minutos. En general, el tiempo de
la coloración depende de la concentración y del colorante utilizado.
3- Lavar con agua corriente.
4- Secar entre papeles de filtro y observar con objetivo de inmersión.
Tinción negativa.
Para esta coloración, se utilizan sustancias que no penetran en la célula y por lo
tanto se tiñe el fondo quedando los microorganismos incoloros. Normalmente el tamaño
de las bacterias observadas por esta técnica es mayor que el real y no debe utilizarse
para la medición de microorganismos.
Los agentes más utilizados son la nigrosina y la tinta china y los microorganismos
quedan incluidos en el colorante que forma una capa relativamente gruesa.
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Con este método pueden observarse morfología y agrupación así como también
estraucturas extracelulares como la cápsula.
Técnica.
1- Colocar sobre un portaobjetos, con la ayuda de un ansa, una gota de una solución
acuosa de nigrosina al 10 %.
2- Tomar una porción del cultivo, suspender en la gota de nigrosina y extender en forma
de óvalo.
3- Dejar secar (no exponer al calor) y observar con objetivo de inmersión.
COLORACIONES ESPECÍFICAS.
Coloración de Gram.
Esta coloración fue ideada por el bacteriólogo danés Christian Gram en el año
18833 y ha demostrado ser de suma utilidad. Permite separar los microorganismos en
Gram (+) y Gram (-) lo cual reviste especial importancia taxonómica.
En esta técnica, el preparado fijado por calor se trata primeramente con cristal
violeta, luego se agrega Lugol como mordiente, se decolora con alcohol-acetona y
finalmente se contracolorea con fucsina o safranina. Las bacterias Gram(+) serán las que
resulten violetas luego del procedimiento de coloración de Gram mientras que las Gram (-)
se verán rojas.
La explicación de las diferencias en el comportamiento tintorial entre bacterias
G(+) y G(-), debe buscarse en la estructura y composición de la pared celular bacteriana4.
La pared de las bacterias Gram (+) está constituída fundamentalmente por una
gruesa capa de peptidoglicano (20-30 nm), que es un polímero de N- acetil glucosamina y
ácido N-acetil murámico. Las cadenas de peptidoglicano, se unen a través de puentes
formados por aminoácidos, en arreglos que varían de una especie bacteriana a otra. En
esta capa podemos también encontrar ácidos teicoicos, formados por ésteres fosfato de
glicerol o ribitol, y ácidos lipoteicoicos cuya estructura es similar a los ácidos teicoicos
pero se hallan anclados a la membrana citoplasmática.
En las bacterias Gram (-), la capa de peptidoglicano es mucho más delgada (3-5
nm) y poseen una membrana externa de estructura compleja en cuya composición
intervienen fosfolípidos, proteínas y lipopolisacáridos. En la figura puede observarse una
representación de las paredes celulares de organismos G(+) y G(-).
3Bartholomew, J. and Mittwer, T. 1952. The Gram Stain. Bact. Rev. 16: 1-16.
4Poxton I. R. 1993. Procaryote envelope diversity. J. Appl. Bacteriol. (Symposium Supplement) 74: 1 S-
11 S.
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Al tratar los preparados con cristal
violeta y Lugol, se forman agregados entre el
colorante y el mordiente5 que durante el proceso
de decoloración, no pueden ser extraídos de las
bacterias Gram (+) debido a la gruesa capa de
peptidoglicano. En las bacterias Gram (-), la
mezcla decolorante puede atravesar fácilmente
la capa de lípidos de la membrana externa y la
delgadez de la capa de peptidoglicano presente,
permite la extracción de los agregados y, por
consiguiente, del color violeta. Al ser tratadas
con fucsina o safranina, las bacterias Gram (-)
tomarán el color del contracolorante.
En esta coloración, el paso crítico es la decoloración, ya que si se prolonga
demasiado resultarán decoloradas aún las bacterias Gram (+). Debe tenerse en cuenta
asimismo, que como la integridad de las envolturas celulares resulta fundamental para
lograr una buena diferenciación, debe trabajarse en lo posible con cultivos jóvenes.
Es importante mencionar, que la clasificación en Gram (+) y Gram (-) no puede
aplicarse a todas las bacterias ya que hay algunas que no pueden colorearse con esta
técnica o para las cuales no tiene sentido esta clasificación.
Técnica.
1- Extender, secar y fijar a la llama.
2- Cubrir durante 2 minutos con solución de cristal violeta al 1%.
3- Escurrir y cubrir con solución de Lugol* durante 30 segundos.
4- Escurrir y cubrir nuevamente con Lugol durante 30 segundos.
5- Decolorar con alcohol acetona y lavar con abundante agua.
6- Cubrir con solución diluída de fucsina 0,1 % o safranina 0,5 % durante 2 minutos.
7- Dejar secar o secar entre papeles de filtro y observar con objetivo de inmersión.
*Lugol: Iodo, 1g; KI, 2g; agua, 300 ml.
Bacilos ácido alcohol resistentes. Coloración de Ziehl - Neelsen.
5Beveridge, T. J. 1993. Currents trends and future prospects in prokariotic envelope research: a
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La pared celular de los bacilos ácido alcohol resistentes (BAAR) está compuesta
por una gran cantidad de lípidos tanto libres como covalentemente unidos: los ácidos
micólicos y los micósidos6. La alta proporción lipídica otorga a estas bacterias una gran
hidrofobicidad, con la consiguiente tendencia a formar agregados y la dificultad para
captar colorantes que hace necesaria la utilización de métodos drásticos 7. Se utiliza
fucsina fenicada en caliente, luego un paso de decoloración con ácido-alcohol y una
contracoloración con azul de metileno. La mezcla decolorante no podrá extraer el
colorante de los BAAR que permanecerán rojas mientras que las demás bacterias se
verán azules.
Entre las bacterias ácido-alcohol resistentes más representativas se encuentran las
pertenecientes al género Mycobacterium, al cual pertenecen los agentes etiológicos de la
tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis) y de la lepra (Mycobacterium leprae). Esta
coloración es de suma importancia diagnóstica. Otro género de bacterias que se colorean
mediante esta técnica es Actinomyces.
Técnica.
1- Extender, secar y fijar a la llama.
2- Cubrir con solución de fucsina fenicada (solución acuosa de fucsina 1 % y fenol 5 %).
3- Pasar un hisopo de algodón embebido en alcohol por debajo del preparado hasta lograr
la emisión de vapores. El preparado debe mantenerse caliente durante 5 minutos pero
6Poxton I. R. 1993. Procaryote envelope diversity. J. Appl. Bacteriol. (Symposium Supplement) 74: 1 S-
11 S.
7Davis, B. D.; Dulbecco, R.; Eisen, H. N.; Ginsberg, H. S.; Wood, W. B y Mc Carty, M. 1983. Tratado de
Microbiología. Editorial Salvat. Buenos Aires.
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evitando que se produzca la ebullición del colorante. Por consiguiente, no debe
mantenerse el hisopo debajo del preparado sino colocarlo en los momentos en que cese
la emisión de vapores.
4- Escurrir y lavar con agua.
5- Decolorar con ácido nítrico diluído 1/3 y luego con alcohol.
6- Lavar, escurrir y cubrir con solución de azul de metileno durante 2 minutos.
7- Lavar con agua, dejar secar o secar entre papeles de filtro y observar con objetivo de
inmersión.
Coloración de esporos.
Algunas bacterias, son capaces de producir formas de resistencia a través de un proceso
llamado esporulación. Este proceso de diferenciación, está codificado genéticamente y
permite a los microorganismos sobrevivir hasta que las condiciones exteriores sean
favorables para el desarrollo8. Los géneros de bacterias capaces de esporular hasta
ahora descriptos son Bacillus, Clostridium y Sporosarcina por lo cual la presencia de
esporos en una bacteria es de gran utilidad taxonómica. Estructuralmente, los esporos
bacterianos están rodeados por gruesas envolturas y tienen muy bajo contenido de agua.
El córtex o corteza, está compuesto por un peptidoglicano que contiene menos enlaces
cruzados que el correspondiente a la pared celular. La cubierta está formada por una
proteína del tipo de la queratina con gran cantidad de puentes disulfuro. Esta capa es
fundamental para la resistencia del esporo a los agentes físicos y químicos. El
exosporium es de naturaleza lipoproteica. Asimismo poseen en su composición química,
una alta concentración de dipicolinato de calcio, que es una sustancia que no se
encuentra en las células vegetativas, y que estaría involucrada en la eliminación de agua
durante el proceso de esporulación9.
8Stanier, R. Y.; Ingraham, J. L.; Wheelis, M. L y Painter, P. R. 1991. Microbiología. Editorial Reverté.
9Joklik, W. K.; Willet, H. P. y Amos, D. B. 1983. Zinsser Microbiología. Editorial Médica Panamericana.
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Las características antes apuntadas, dan cuenta de la resistencia de los esporos a
los agentes físicos y químicos y de la dificultad que presentan para ser coloreados. Cabe
aclarar que una vez coloreados son difíciles de decolorar.
En todas las técnicas para colorear esporos se utilizan procedimientos drásticos.
Describiremos las técnicas de Dorner y de Moeller.
Para la coloración de esporos según Dorner, se sensibiliza y colorea al esporo con
fucsina fenicada en caliente y luego se extiende sobre nigrosina. La nigrosina extraerá el
colorante de todas las estructuras celulares excepto de los esporos y por consiguiente, se
verán los esporos rojos, el resto de la bacteria incolora y el fondo oscuro. La técnica de
Moeller utiliza ácido crómico y fucsina fenicada en caliente para sensibilizar y colorear al
esporo. La decoloración se realiza con ácido-alcohol y se contracolorea con azul de
metileno. Se observan los esporos rojos y el resto de la bacteria azul.
Si bien es cierto que con otras coloraciones los esporos se verán incoloros, en
algunos casos las bacterias pueden
presentar zonas sin colorear que no
corresponden a esporos y debe confirmarse
su presencia mediante una coloración
específica.
Otro aspecto que debe tenerse en cuenta al observar esporos es su posición:
terminal, subterminal o central, y si deforman o no a la bacteria ya que serán
características que ayudarán en la clasificación.
Técnica.
a) Método de Dorner.
1- Preparar una suspensión del cultivo a analizar en 1 ml de agua destilada.
2- Añadir 1 ml de fucsina fenicada (solución acuosa de fucsina 1 % y fenol 5 %) y colocar
la mezcla en un baño de agua hirviendo durante 10 minutos.
3- Tomar una ansada del material y colocar en un portaobjetos. Añadir una ansada de una
solución acuosa, saturada, fresca y filtrada de nigrosina (10 %). Mezclar bien y extender
en forma de óvalo.
4- Dejar secar y observar con objetivo de inmersión.
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b) Método de Moeller.
1-Hacer un extendido del material a examinar. Secar y fijar cubriendo con alcohol,
encendiendo y dejando apagar.
2-Cubrir el preparado con solución de ácido crómico al 5% durante 5 minutos para
sensibilizar.
3-Lavar y cubrir luego con solución de fucsina fenicada en caliente durante 10
minutos ( calentar pasando un hisopo embebido en alcohol hasta emisión de vapores
y volver a calentar ocasionalmente para mantener la temperatura).
4-Lavar con agua corriente.
5-Decolorar con ácido sulfúrico al 5 % o ácido nítrico al 10 %. Puede terminarse la
decoloración con alcohol.
6-Lavar y colorear con azul de metileno (1 %) durante 3 minutos.
7-Lavar, secar y observar con objetivo de inmersión.
Coloración de flagelos.
Los flagelos bacterianos son apéndices celulares que están asociados a
funciones de locomoción. En cuanto a su estructura y composición química, son
similares en una gran variedad de bacterias.
Estos apéndices, están unidos a la célula a través de un cuerpo basal
conectado a un gancho, que se continúa con un filamento helicoidal. El cuerpo basal
está constituido por un cilindro central y 2 ó 4 anillos según se trate de bacterias
Gram (+) o Gram (-) respectivamente. Químicamente, el cuerpo basal y el gancho
están compuestos por una variedad de polipéptidos pero el filamento está formado
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por subunidades proteicas de flagelina que se disponen formando una helice
alrededor de un centro hueco10.
La coloración de flagelos se realiza fundamentalmente en los casos de bacterias
móviles para las cuales la determinación del número y posición de estos apéndices
contribuya a su identificación. En la figura se ilustran las diferentes disposiciones
encontradas.
Técnica.
1-Colocar todo el material y las soluciones que se van a emplear en la estufa a 37°C por
lo menos 90 minutos antes de usarlos.
2-Hacer una suspensión del germen en estudio en agua estéril termostatizada.
3-Hacer el extendido dejando correr una gota de la suspensión a lo largo de un
portaobjetos limpio y desengrasado. Hacer por lo menos 3 preparados y dejarlos secar
en la estufa.
4-Mezclar dentro del cuarto estufa: 5 ml de alumbre de potasio, 2 ml de solución de ácido
tánico y 2 ml de cloruro mercúrico*.
5-Agitar bien y agregar 1- 1.5 ml de Verde de Malaquita 5 %. Mezclar bien y mantener en
estufa 2 minutos con agitaciones periódicas.
6-Filtrar de inmediato con papel de filtro plegado y dejar otros 2 minutos.
010Saunders, J. R.; O'Sullivan, H.; Wakeman, J.; Sims, G.; Hart, C. A.; Virji, M.; Heckels, J. E.;
Winstanley, C.; Morgan, J. A. W. and Pickup, R. W. 1993. Flagella and pilli as antigenically variable
structures on the bacterial surface. J. Appl. Bacteriol. (Symposium Supplement) 74: 33 S-42 S.
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7-Agitar y colocar sobre los extendidos a razón de alrededor de 2,5 ml por portaobjetos.
8-Dejar actuar la mezcla colorante. Como el tiempo varía según el germen, dejar actuar
de 5 a 9 minutos.
9-Lavar con agua destilada termostatizada. Puede utilizarse azul de Loeffler** para
colorear el resto de la bacteria. Escurrir, dejar secar y observar con objetivo de
inmersión.
* alumbre de potasio (.24 H2 O) 10,5 %; HgCl2 6 %; ácido tánico 20 %.
** azul de metileno 0,3 g, etanol 30 ml, KOH 0,01 g y H2O 100 ml.
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Coloración de espirilos.
Existen bacterias de forma espiralada que son llamadas en forma general espirilos aunque
debe hacerse una aclaración: los espirilos son bacterias con morfología helicoidal y un cuerpo
bastante rígido, que se mueven mediante flagelos, pero existe otro tipo de microorganismos con la
misma morfología que se llaman espiroquetas cuyo cuerpo es flexible y tienen flagelos internos 12 .
Las espiroquetas están formadas por un cilindro protoplasmático constituido por el citoplasma, la
región nuclear, la membrana citoplasmática y la pared celular. El cilindro protoplasmático se halla
rodeado a su vez por una membrana multilaminar llamada capa externa en cuya composición
intervienen proteínas, lipoproteínas, polisacáridos y fosfolípidos13.
Alrededor del cilindro protoplasmático se encuentran un número variable de flagelos
periplásmicos que, según la especie, puede variar entre 2 y más de 100. La composición química
de los flagelos es similar a la de otros flagelos bacterianos.
A diferencia de otras bacterias móviles, las espiroquetas pueden desplazarse en medios de
alta viscosidad a través de un movimiento de sacacorchos. Entre los géneros de bacterias
espiraladas del tipo de las espiroquetas, podemos nombrar Treponema (el Treponema palidum es
el agente etiológico de la sífilis), Borrelia y Leptospira.
En general, estos microorganismos son demasiado delgados para poder ser visualizados
mediante microscopía óptica y por lo tanto deben engrosarse. En la técnica de Fontana-
Tribondeau, se usa ácido tánico como mordiente y luego se realiza una impregnación argéntica con
nitrato de plata amoniacal (solución de Fontana). Es importante que los lavados se realicen con
agua destilada libre de cloruros ya que de otra manera precipitaría cloruro de plata. En los casos
en que la muestra contenga sangre, debe deshemoglobinizarse con líquido de Rouge (ácido
acético- formaldehído-agua). Al aplicar esta técnica de coloración, se verán los microorganismos
marrón oscuro sobre fondo amarillento.
Técnica.
1- Extender la muestra a examinar sobre un portaobjetos.
2- Deshemoglobinizar con líquido de Rouge (ácido acético glacial 1 ml, formol 2 ml y agua 100 ml).
3- Lavar con agua corriente.
4- Fijar vertiendo alcohol sobre el preparado, dejando escurrir y encendiendo el alcohol. Apagar
inmediatamente.
5- Cubrir con la solución de ácido tánico (5 %) y calentar con hisopo encendido hasta emisión de
vapores. Mantener la emisión de vapores durante 30 segundos cuidando que no hierva la
solución. 6-Lavar con abundante agua destilada.
7- Cubrir con solución de Fontana* en frío, mover el preparado hasta que tome color castaño
claro. Calentar y mantener emisión de vapores durante 15 segundos.
8- Lavar con agua destilada, secar entre papeles de filtro y observar con objetivo de inmersión.
*Preparación de la solución de Fontana:
Colocar solución de nitrato de plata al 5 % y agregar, gota a gota, una solución de amoníaco al 5 %
hasta opalescencia. Seguir agregando amoníaco hasta clarificación de la solución y finalmente
agregar solución de nitrato de plata hasta ligera opalescencia. La solución debe prepararse en el
momento de usarse.
212Tortora, G. J.; Funke, B. R. y Case, C. L. 1993. Introducción a la Microbiología. Editorial Acribia S.A.
313Basualdo, J. A.; Coto, C. E. y de Torres, R. A. 1996. Microbiología Biomédica. Editorial Atlante Argentina S. R.
L.
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Coloración de cápsulas. Técnica de Novelli modificada.
Algunas bacterias son capaces de formar por fuera de la pared celular, una envoltura
polimérica llamada cápsula que las protege de la fagocitosis e interviene en fenómenos de
adherencia a diversos sustratos. Pueden encontrarse cápsulas de variada composición química:
polímeros de glucosa y ácido glucurónico ( Streptococcus pneumoniae), polímeros de ácido D-
glutámico (Bacillus anthracis) y polímeros mixtos de proteínas y carbohidratos (Bacillus
megaterium)14.
Las cápsulas pueden observarse como un halo alrededor de las bacterias cuando se
realizan tinciones negativas con nigrosina o tinta china pero pueden colorearse específicamente.
La técnica de Novelli, utiliza un colorante específico para las cápsulas glucídicas que es el Azul
Alcián. Para teñir la bacteria se utiliza fucsina. Se verán bacterias teñidas de rojo rodeadas de la
zona capsular azul.
Técnica.
1- Hacer un extendido del material sobre un portaobjetos, secar y fijar a la llama.
2- Cubrir con solución de Azul Alcián* durante 2,5 minutos.
3- Lavar y escurrir completamente el agua o, mejor aún, dejar que se seque.
4- Cubrir con solución de fucsina diluida (0,1 %) durante 1 minuto.
5- Lavar y secar.
* Azul Alcián: dilución 1/10 en agua de una solución al 1 % en alcohol.
Coloración de la zona nuclear. Técnica según Robinow.
En las células procarióticas, que no poseen membrana nuclear, el cromosoma constituye la
llamada zona nuclear o nucleoide. Al no existir un núcleo propiamente dicho, la basofilia del ARN
es tan marcada como la del ADN pues se hallan en idéntico estado de condensación; por lo tanto
es necesario eliminar el ARN con la ayuda de una ribonucleasa o aprovechando las diferencias de
sensibilidad a la hidrólisis ácida, debidas a las distintas estructuras de estos ácidos nucleicos. Una
hidrólisis controlada con ácido clorhídrico 1 N a 60ºC da buenos resultados pero debe evitarse
tratamientos muy enérgicos ya que de otra manera se hidrolizaría también el ADN15.
Es conveniente utilizar células en activa división para una mejor visualización.
El extendido se realiza mediante una técnica especial llamada impresión y la fijación se
lleva a cabo con vapores de ácido ósmico o sumergiendo el preparado en metanol. El colorante
utilizado es el Giemsa y la zona nuclear se ve rojo violáceo.
Técnica.
1- Diseminar sobre la superficie de una caja de Petri con ágar nutritivo, 0,1 ml de un cultivo en
caldo de 2 a 8 horas de desarrollo. Este tiempo de incubación depende de la bacteria.
2- Inmediatamente o incubando 3 ó 4 horas en estufa a 37ºC, cortar con un bisturí trozos de ágar
de aproximadamente 1 cm2 .
3- Invertir el trozo de ágar sobre un portaobjetos bien limpio y hacer la impronta
deslizándolo sobre el mismo. Dejar secar a temperatura ambiente.
414Davis, B. D.; Dulbecco, R.; Eisen, H. N.; Ginsberg, H. S.; Wood, W. B y Mc Carty, M. 1983. Tratado de
Microbiología. Editorial Salvat. Buenos Aires.
515Robinow, C. and Kellenberger, E. 1994. The bacterial nucleoid revisited. Microb. Rev. 58: 211-232.
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4- Fijar el preparado sumergiéndolo en metanol durante 10 minutos o bien sometiéndolo a la acción
de vapores de ácido ósmico durante 5 minutos.
5- Hidrolizar el ARN introduciendo el preparado en ácido clorhídrico 1 N a 60ºC durante 8-10
minutos. Sumergir inmediatamente en agua destilada 4 ó 5 veces para evitar que continúe la
hidrólisis.
6- Escurrir el agua y cubrir el preparado con una solución de Giemsa diluída 1/100 en buffer
fosfato pH 7 . Dejar actuar 15 - 30 minutos (el tiempo depende de la bacteria).
7- Lavar con abundante agua corriente, secar entre dos papeles de filtro y observar con objetivo de
inmersión.
EL MICROSCOPIO OPTICO.
El tamaño de los organismos objeto de la Microbiología, hace necesaria la utilización de
instrumentos apropiados llamados microscopios. Los instrumentos comúnmente empleados son los
microscopios ópticos compuestos que constan de un sistema mecánico y un sistema óptico16.
El sistema mecánico está compuesto por diferentes tornillos de ajuste que sirven para
enfocar la imagen y obtener una adecuada iluminación.
El sistema óptico está formado por tres series de lentes: condensador, objetivo y ocular.
El condensador hace que la fuente de iluminación proyecte sobre el objeto, un haz de luz
adecuado; el objetivo forma una imagen aumentada del objeto que es captada por el ocular que, a
su vez, presenta la imagen al ojo del observador. Existen dos características importantes de los
sistemas ópticos: el aumento y la resolución.
Se entiende por aumento, a la relación entre el tamaño de la imagen y el del objeto. Para
obtener el aumento total, debe multiplicarse el aumento del objetivo por el del ocular.
La resolución es la distancia mínima que debe existir entre dos puntos del objeto para que
se distingan separados y está relacionada con la capacidad del sistema óptico de visualizar
detalles.
La resolución puede calcularse con la ecuación:
616Geneser, F. 1986. Métodos histológicos. Capítulo 2 en Histología. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires.
14
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k.
d=
[Link]
donde k es una constante que depende de la
estructura del objeto y de la naturaleza de la
luz que lo ilumina. Sus valores oscilan entre
0,5 y 0,8 pero suele tomarse un valor de 0,65,
es la longitud de onda de la luz, n es el
índice de refracción del medio en contacto
con el objetivo y es la mitad del ángulo del
haz de luz captado por el objetivo.
Obviamente para observar detalles deben
lograrse pequeños valores de d.
El producto [Link], se denomina apertura numérica y queda claro que en el aire (n=1), no
podrá ser mayor que la unidad. Con el objeto de lograr mejores resoluciones pueden colocarse,
entre el objetivo y el objeto, sustancias con índices de refracción mayores que el aire como por
ejemplo aceite de cedro.
La resolución quedará determinada entonces no sólo por el objetivo, sino también por el
condensador y el diafragma que debe ajustarse de manera de cubrir con luz el campo visual.
Es importante aclarar, que el ocular contribuye al aumento pero no a la resolución ya que es
incapaz de mejorar la imagen que le presenta el objetivo.
La iluminación es uno de los puntos claves de toda observación microscópica y debe
prestarse atención a su correcto ajuste. El sistema de iluminación que se utiliza actualmente es el
de Köhler y consta de una lámpara, una lente frente a la lámpara y un diafragma. También el
condensador es parte del sistema de ajuste de la iluminación y posee una lente y un diafragma
para regular el paso de luz. En realidad lo importante de este sistema es que, si se regula
adecuadamente, se obtiene un campo de observación homogéneamente iluminado aunque sea
pequeña e irregular la fuente de luz..
Para regular la iluminación17, primeramente debe enfocarse el diafragma de la lámpara
sobre el plano del objeto. Para esto se enfoca un preparado cualquiera y luego se cierra casi
totalmente el diafragma de la lámpara manteniendo totalmente abierto el diafragma del
condensador. En estas condiciones, se regula la altura del condensador de manera de enfocar
nítidamente la imagen de los bordes del diafragma de la lámpara. La posición del condensador así
fijada, no debe modificarse a partir de este momento.
Para regular la apertura del diafragma del condensador debe abrirse totalmente el
diafragma de la lámpara y cerrarse el del condensador. Posteriormente se quita el ocular y,
observando por el tubo del microscopio, se regula la apertura del diafragma del condensador de
manera que la lente del objetivo quede cubierta de luz en un 90 %. Finalmente, se coloca el ocular
y se cierra el diafragma de la lámpara hasta que la imagen de sus bordes llegue justo hasta el
borde del campo visual.
Siguiendo los pasos mencionados, se logrará una correcta iluminación para cada par
objetivo-ocular utilizado y se conseguirá un máximo aprovechamiento de la capacidad de
resolución de cada objetivo.
Es una práctica muy común, utilizar la altura del condensador y los diferentes diafragmas
para regular la intensidad lumínica, sin tener en cuenta que una vez ubicados en la posición
correcta no deben moverse pues se modificaría la apertura numérica y por consiguiente la
717Meynell, G. G. y Meynell, E. 1969. Bacteriología Experimental. Teoría y Práctica. Ediciones Omega. Barcelona.
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Microbiología General
Facultad de Ciencias Exactas
UNLP
resolución. La intensidad de la luz se debe regular a través de filtros o modificando la potencia de
la lámpara.
Enfoque de preparados.
Para la observación de preparados microbiológicos se utilizan normalmente objetivos de
inmersión. Los pasos a seguir para enfocar un preparado con este tipo de objetivos son los
siguientes:
1) Colocar una gota de aceite de cedro (n=1,5) sobre el preparado.
2) Acercar el objetivo al preparado lo más lo más posible pero observando desde afuera, es decir
sin observar por el ocular.
3) Con el tornillo macrométrico y mirando por el ocular, alejar el objetivo del preparado lentamente
hasta lograr un enfoque aproximado.
4) Realizar un ajuste fino con el tornillo micrométrico.
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