UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERU

FACULTAD DE ZOOTECNIA

MANUAL DE PRACTICAS DE
MICROBIOLOGÍA

BIOLOGA MICROBIOLOGA
Noemí A. Mayorga Sánchez
C.B.P. Nº 0967

HUANCAYO – PERU

2015
Manual de Microbiología [Link]. Noemí A. Mayorga sánchez

INDICE

Prólogo………………………………………………………………..………………. 03

Normas para las prácticas de laboratorio……………………………………………… 04

Práctica No 1: Materiales de uso frecuente en Microbiología........................................ 06

Práctica No 2: Métodos de Esterilización, acondicionamiento de material....................11

Práctica No 3: Medios de cultivo....................................................................................13

Práctica No 4: Métodos de siembra, detección de movilidad bacteriana.......................16

Práctica No 5: Morfología bacteriana. Tinción simple, tinción Gram y

Tincion negativa……….………………………………...………..…...….22

Práctica No 6: Características culturales.........................................................................24

Práctica No 7: Recuento de colonias: Diluciones Sucesivas...........................................25

Práctica No 8: Acción de los Agentes Físicos sobre el crecimiento bacteriano…......…28

Práctica No 9: Investigación de Staphylococcus aureus en aguas…………………...30

Práctica No 10: Aislamiento de Enterobacterias ……………………………………..31

Práctica No 11: Hemocultivo, Coprocultivo y Urocultivo…...……………………...…32

Práctica No 12: Pruebas Bioquímicas.............................................................................33

Práctica No 13: Antibiograma.........................................................................................37

Práctica No 14: Cultivo de Hongos: Observación macroscópica y microscópica..........38

Práctica No 15: Reacción antígeno –anticuerpo………………………………………..40

ANEXOS ........................................................................................................................41

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS............................................................................46

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Manual de Microbiología [Link]. Noemí A. Mayorga sánchez

PROLOGO

El manual de Microbiología se elaboró con la finalidad de proporcionar un material

ordenado y de fácil acceso al trabajo académico el cual se complementa con la actividad
científica en el laboratorio.

El presente manual consta de quince prácticas, habiéndose incorporado una práctica sobre
entero bacterias. La elaboración del manual se realizó mediante la recopilación de las
prácticas que se vienen haciendo rutinariamente en el Laboratorio de Microbiología de la
Facultad de Zootecnia de la UNCP.

La introducción es el fundamento teórico de cada una de las prácticas, tomada de

diversas referencias bibliográficas. En la parte experimental el procedimiento se tomó
de diversos manuales, adaptándolas a las condiciones de trabajo de nuestro Laboratorio.

Los alumnos deben lograr los objetivos trazados, al final de los experimentos, buscando
que interpreten sus resultados. El cuestionario al final de cada práctica, tiene la finalidad
de que el alumno demuestra sus logros al final de la secuencia de aprendizaje se elaboró
en base a los resultados experimentales que se esperan de cada práctica, debidamente
refrendado con la búsqueda de información. Así mismo se complementa con las
observaciones que el alumno realizará mediante dibujos o esquemas y finalizará con
conclusiones personales del mismo.

La autora.

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Manual de Microbiología [Link]. Noemí A. Mayorga sánchez

NORMAS ESPECIALES DEL LABORATORIO DE

MICROBIOLOGÍA.
El laboratorio de Microbiología es un lugar convenientemente habilitado donde con las
debidas precauciones se pueden manejar y examinar microorganismos. Cuando
manejamos cualquier tipo de muestra debemos tener en cuenta la posibilidad de riesgos,
estos pueden ser biológicos, del ambiente del Laboratorio o riesgos asociados como el
manejo substancias químicas, eléctricos, fugas de gas.

Todos los microorganismos que se manipulen deben ser manejados con precaución por
su potencial patogenicidad.

Normas de laboratorio
1.- Es obligatorio el uso de un guardapolvo, destinado exclusivamente para el Laboratorio
de Microbiología. NO PODRÁ USARSE EN OTRAS ÁREAS DE LA
FACULTAD. Solo podrá retirarse para su aseo protegiéndola en una bolsa de
plástico. Se recomienda lavar individualmente con jabón y lejía.

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Manual de Microbiología [Link]. Noemí A. Mayorga sánchez

2.- En caso que el profesor lo indique se deberá usar guantes y/o mascarilla.

3.- Al iniciar y finalizar la práctica el estudiante lavara sus manos escrupulosamente con
agua y jabón.

4.- El lugar de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado. Al inicio y al finalizar cada
práctica es conveniente desinfectar la superficie de trabajo con alcohol de 70,
solución de fenol o benzol.

5.- Se deben evitar los desplazamientos innecesarios por el Laboratorio. Los

microorganismos deben manejarse cerca de la flama del mechero.

6.- Está prohibido comer, beber, fumar y maquillarse. Cuando se manipulen

microorganismos evite hablar sin necesidad o llevarse las manos a la nariz, boca, ojos
etc.

7.- Utilice los recipientes adecuados para depositar los residuos peligrosos, biológico
infecciosos que se generen en la realización de la práctica. No tirar nada en los
lavabos. El material de desecho no contaminado como papeles de envoltura
depositarlos en los recipientes de basura común.

8.- Cuando se utilice luz ultravioleta debe tomarse en cuenta que la exposición a esta
radiación es peligrosa.
9.-Los productos inflamables (gases, alcohol, éter, etc.) deben mantenerse alejados de la
llama de los mecheros. Si se usa mecheros de gas se debe tener mucho cuidado al
cerrar las llaves de paso.

10.- En caso de contaminación bacteriología o accidentes en el Laboratorio notificar

inmediatamente al profesor o al personal técnico para tomar las medidas higiénicas y
de seguridad apropiadas, así como su registro.

11.- Incubar el material el tiempo que se indique, en caso contrario este será desechado.

12.- No almacenar material en el refrigerador. Esta estrictamente prohibido retirar del

laboratorio cultivos o cepas a menos que así lo indique el profesor. Al finalizar la
práctica entregar el material empleado debidamente separado.

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Manual de Microbiología [Link]. Noemí A. Mayorga sánchez

PRACTICA Nº 1
MATERIAL Y EQUIPO DE LABORATORIO EN MICROBIOLOGIA

Bomba de Vacío Incubadora

Autoclave Microscopio Desecador

Placas Petri Balanza

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Manual de Microbiología [Link]. Noemí A. Mayorga sánchez

Vaso de Precipitado Matraz Erlenmeyer

Embudo Tubos de Ensayo

Asas de Kolle Portaobjetos

OBJETIVOS
 Reconocer los diversos materiales y equipos de uso más frecuente en
experimentos microbiológicos.
 Conocer la utilidad de los materiales y equipos de laboratorio, en Microbiología.

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Manual de Microbiología [Link]. Noemí A. Mayorga sánchez

MATERIAL Y PROCEDIMIENTO
3.1. MATERIAL
Microscopio
El microscopio es una pieza esencial entre los aparatos microbiológicos. Es el
instrumento que mediante amplificaciones permite observar organismos y estructuras que
son invisibles a simple vista. Hay varios tipos de microscopios, los de uso más frecuente
son los microscopios compuestos.

Estufas
Se hallan en el comercio estufas de varios tamaños. Son necesarias cuando se desea
esterilizar con calor seco y cuando se incuban cultivos a temperaturas diferentes durante
longitudes de tiempo variables.

Hornos e incubadoras
Gabinetes provistos de un calentador interconstruido que nos permite obtener
temperaturas más elevadas y es controlada mediante un termostato. La diferencia entre
horno e incubadora radica en la temperatura que puede obtenerse en el interior. Los
hornos soportan temperaturas de 100ºC o mayores.

Refrigerador y congelador
Son útiles para almacenar y conservar medios de cultivo, sueros y reactivos perecederos.
Centrífuga
La centrífuga ordinaria de laboratorio es capaz de ejercer una fuerza de hasta 3000 g y
esta fuerza se necesita para que se depositen las bacterias en un tiempo razonable.

Baño María
El contenido de un tubo de ensayo introducido en un baño maría alcanza la temperatura
deseada mucho más rápidamente que en una estufa. Por esto, dichos instrumentos se
utilizan en incubaciones de corta duración. Si el nivel de agua en el baño alcanza la mitad
o los dos tercios de la altura de la columna de líquido en el tubo, se producen corrientes
de convención que mantienen perfectamente mezclado el contenido del tubo y aceleran
algunas reacciones, como la aglutinación.

Autoclave
Es una cámara de vapor de doble pared equipada con dispositivos que permiten que la
cámara se llene a saturación de vapor y se mantenga a la temperatura y presión deseadas
durante cualquier periodo.
El autoclave es un aparato indispensable en todo laboratorio de Microbiología. Muchos
medios de cultivo, diluciones, soluciones y cultivos descartados, se esterilizan
rutinariamente con este aparato.

Tubos de prueba
Los tubos de prueba deben ser de vidrio neutro con o sin reborde. Los tubos de prueba
sin reborde, están hechos para trabajos bacteriológicos. Las medidas son variables y se
dan en mm, considerando el largo del tubo por el diámetro de la boca.

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Manual de Microbiología [Link]. Noemí A. Mayorga sánchez

Placas de Petri
Las placas de petri están compuestas de dos cristalizadores; de los cuales el más grande
hace de tapa. Las más usadas son las de 150 x 100 mm de diámetro, se emplean para
aislamiento y cultivo de microorganismos.

Pipetas graduadas
Se emplean pipetas rectas de vidrio soplado, de 1 –10 ml de capacidad. Deben taponarse
con algodón no absorbente en el extremo en donde se aplica la succión para impedir la
penetración de bacterias procedentes de pipeteador o de la tetina que contaminen el
material de la pipeta. Las pipetas pueden ser terminales o subterminales.
Pipetas Pasteur
Se utilizan con tetinas de goma para transferir cultivos líquidos, diluciones de suero, etc.
Se confeccionan de varillas de vidrio, de diámetro de 0,5 – 0,8 mm. La calidad de vidrio
debe facilitar reblandecimiento a la acción directa de la llama del mechero, para conseguir
por estiramiento la capilaridad deseada, es decir una pipeta con porción capilar.

Matraces y Erlenmeyer
Son recipientes volumétricos de gran utilidad para la preparación de soluciones,
colorantes, reactivos, medios de cultivo, etc. Los matraces se diferencian de los
Erlenmeyer, por tener una base esférica con fondo plano. En ambos, el cuello termina en
un discreto reborde. Son de diferentes capacidades de 100 a 1000 ml.

Beaker o vasos de precipitación

Son recipientes cilíndricos y cortos, con una depresión en el margen de la boca. Se utilizan
para facilitar la mezcla de una solución dada. Son de diversas capacidades.
Fiolas
Son recipientes aforados a medidas exactas. Se emplean en la preparación de reactivos y
soluciones de concentraciones conocidas.
Varillas de virio macizo
Los fragmentos de 30 a 60 mm sirven para la confección de agitadores o baguetas.

Kitasato
Erlenmeyer de paredes gruesas, que además de la boca tiene una tubulación corta lateral
para hacer el vacío. Se utiliza como el complemento del equipo de filtración
(esterilización en frío). Tienen la misma capacidad de los Erlenmeyer.

Espatula de Digralsky
Se confeccionan a partir de varillas de vidrio. La fracción recta facilita la siembra y
aislamiento de bacterias por diseminación. Se usan para la siembra directa en superficie.

Jeringas hipodérmicas
Compuesta por n tubo de vidrio provistos de un pivot central o marginal y un émbolo.
Son graduadas y existen en varias medidas. En microbiología se emplean para
inoculaciones de todo tipo, las de mayor capacidad se emplean para sangría.

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Manual de Microbiología [Link]. Noemí A. Mayorga sánchez

Frascos viales
Son recipientes de vidrio neutro, resistentes al calor, transparentes y con tapa rosca. Son
de diversa capacidad, de 50, 100 y 150 ml. Se emplean para preparar vacunas y cultivos
de tejidos.

Perlas de vidrio neutro

Son de 4 a 6 mm de diámetro. Se emplean para desfibrinar sangre y pulverizar en la
preparación de antígenos.

Placas y frascos Roux

Son recipientes de gran capacidad, aplanados, que presentan a la altura del cuello una
pequeña escotadura la misma que se continua con con una superficien sobre la que
descansa el recipiente. Se emplea cuando se desea obtener grandes cosechas de
microorganismos.

Frascos goteros
Son frascos de vidrio de color transparente o de color caramelo. Presentan en la boca dos
canales, uno frente al otro; por uno de los cuales, sale el líquido almacenado gota a gota.
La tapa también presenta un canal y termina en un pico por donde cae el líquido. Se
emplean para el almacenamiento de diversos líquidos de uso frecuente y en pequeñas
cantidades.

Embudos
Existen de diferentes tamaños. Pueden ser de vidrio, porcelana o plástico. Se usan para
trasvasar líquidos en frascos de boca angosta.

Otros materiales de vidrio

El material de vidrio restante por ser muy conocido en variedad y uso en todo trabajo
microbiológico sólo lo citaremos: mortero con pilón de vidrio o porcelana, Láminas
portaobjetos, laminillas cubreobjetos, lunas de reloj de diversos diámetros, termómetros
clínicos y de ambiente, cápsulas de porcelana con fondo redondo y plano, cámara y
pipetas cuentaglóbulos, etc.

Otros materiales (de metal o madera)

Mangos de kolle, espátulas de metal con mangos de madera, trípodes, mechero de
Bunsen, canastillas o cestos de metal, soportes universales, gradilla de madera, rejilla de
asbesto, hilos de platino, etc.

PRÁCTICA Nº 2

MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN EN EL LABORATORIO DE

MICROBIOLOGÍA.

Definición de esterilización: Es el proceso de destruir todas las formas de vida

microbiana. Por tanto, genera una situación en la que la probabilidad de que el objeto
tratado contenga siquiera un superviviente es infinitamente pequeña.
Así, un objeto esterilizado, en sentido microbiológico, está libre de microorganismos

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Manual de Microbiología [Link]. Noemí A. Mayorga sánchez

vivos. El único criterio válido de muerte en el caso de un microorganismo es la pérdida

irreversible de la capacidad de reproducirse.

OBJETIVO

El objetivo es conocer los métodos de esterilización de uso más común en un

laboratorio de Microbiología y sus aplicaciones.
Tipos de agentes esterilizantes :

Agentes físicos:
a) Calor Seco: se recomienda cuando no se desea o no se quiere que el vapor a presión
tenga contacto completo y directo con el material a esterilizar. Nos encontramos con:
- Flameado
- Incineración: este método se emplea para destruir materiales de desecho infectados.
- Horno Pasteur: 170ºC durante 90 minutos, para objetos termorresistentes.
b) Calor Húmedo: consiste en esterilizar en disoluciones acuosas. Distinguimos: el
Autoclave que mantiene los elementos a esterilizar a una presión de 1 atm. superior a la
presión normal (ambiental) y a una temperatura de 120ºC; además, el aire es reemplazado
completamente por vapor.
c) Radiaciones:
- No ionizantes: LUV. Tiene poca capacidad para penetrar en la materia. La zona
bactericida más efectiva es la de longitudes de onda de entre 2600-2700 A. Solo los
microorganismos que se encuentran en la superficie de los objetos que se exponen
directamente a la acción de la luz UV son susceptibles de ser destruidos. La luz
ultravioleta actúa sobre las pirimidinas, formando dímeros de timina, impidiendo la
duplicación del DNA y, por tanto, la división celular.
-Ionizantes: rayos alfa, beta, gamma y X. Los rayos gamma tienen gran capacidad de
penetración, y son letales para todas las formas de vida. Los rayos X tienen considerable
energía y capacidad de penetración.

Agentes químicos (agentes alquilantes):

- Óxido de etileno: compuesto orgánico relativamente simple. Es líquido a temperaturas
inferiores a 10,8ºC. A temperaturas superiores se evapora. Su inconveniente es el ser
tóxico e inflamable. Tiene gran poder de penetración. Se utiliza para esterilizar materiales
sensibles al calor y a la humedad.
- Glutaraldehido: dialdehido que, en solución al 2% presenta una amplia actividad
antimicrobiana.
- "beta"- propiolactona: de elevado punto de fusión (155ºC), es un bactericida y
esporocida. También es fungicida y virucida. Es un líquido no inflamable, pero
lacrimógeno y poco penetrante.

PROTOCOLO
a) Esterilización de material de vidrio (pipetas y placas de Petri):
- Acondicionar las pipetas y las placas de Petri envolviendo con papel kraft (el material
ha de estar limpio y seco).
- Colocar el material a esterilizar en el horno regulado a 170ºC durante 1 hora o esterilizar
en autoclave a 121º C por 15 min.
b) Esterilización de medios de cultivo:
- Introducir los recipientes con el medio de cultivo (previamente acondicionados) en el
autoclave regulando la temperatura a 121º C y el tiempo de esterilización a 15 min.

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Manual de Microbiología [Link]. Noemí A. Mayorga sánchez

c) Esterilización de material plástico no termorresistente (placas de Petri de poliestireno):

- Colocar las placas de Petri abiertas en el interior de la cabina de esterilización, debajo
de la lámpara germicida (luz ultravioleta).
- Encender la lámpara y dejar actuar durante 2 horas.
- Apagar la lámpara y cerrar las placas antes de sacarlas de la cabina.
d) Esterilización de asas, espátulas, boca de los tubos de prueba, de los matraces, etc:
- Flamear a la llama del mechero (llevar al rojo vivo, las ansas)
e) Esterilización de materiales que se alteran por el calor seco (guantes de goma, tubos
de goma, tapones de goma):
- Colocar bien acondicionado en el autoclave, esterilizar a 121ºC por 15 min.
f) Esterilización de la leche, caldo selenito, medios azucarados y productos poco
contaminados:
-Colocar estos materiales en el autoclave, esterilizar con vapor de agua sin presión, vapor
fluente (espita abierta)
g) Esterilización de sustancias que se descomponen a elevadas temperaturas como el
suero sanguíneo:
-Llevar el material a esterilizar por tindalización; calentamiento a 100ºC por 30 min,
(para eliminar la forma vegetativa) después de 24 horas se lleva a un segundo
calentamiento (para eliminar la forma esporulada) y repetimos la operación por tercera
vez, y se obtiene una esterilización perfecta.
h) Esterilización de líquido ascítico, extractos de tejidos, sueros y soluciones de hidratos
de carbono:
-Hacer pasar los materiales a través de membranas filtrantes, para retener y eliminar
principalmente a las bacterias.

CUESTIONARIO:

1.- Qué material se puede esterilizar por calor seco y qué no. ¿Por qué?
2.- Que tipo de material se puede esterilizar por calor húmedo?
3.- A qué condiciones de temperatura y presión se destruyen todas las formas
vegetativas?
4.- A qué condiciones de temperatura y presión se destruyen las esporas?
5.- Cuáles son las condiciones necesarias de tiempo y temperatura para esterilizar por
calor seco?
6.- Cuales son las condiciones necesarias de tiempo y temperatura para esterilizar por
calor húmedo?
7.-Como actúa la esterilización por calor seco en los microorganismos?
8.- Cómo actúa la esterilización por calor húmedo en los microorganismos?

PRÁCTICA Nº 3

MEDIOS DE CULTIVO

Un método fundamental para estudiar las bacterias es cultivarlas en un medio líquido o

en la superficie de un medio sólido de agar. Los medios de cultivo contienen distintos
nutrientes que van, desde azúcares simples hasta sustancias complejas como la sangre o
el extracto de caldo de carne. Para aislar o purificar una especie bacteriana a partir de una
muestra formada por muchos tipos de bacterias, se siembra en un medio de cultivo sólido
donde las células que se multiplican no cambian de localización; tras muchos ciclos

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Manual de Microbiología [Link]. Noemí A. Mayorga sánchez

reproductivos, cada bacteria individual genera por escisión binaria una colonia
macroscópica compuesta por decenas de millones de células similares a la original. Si
esta colonia individual se siembra a su vez en un nuevo medio crecerá como cultivo puro
de un solo tipo de bacteria.

Muchas especies bacterianas son tan parecidas morfológicamente que es imposible

diferenciarlas sólo con el uso del microscopio; en este caso, para identificar cada tipo de
bacteria, se estudian sus características bioquímicas sembrándolas en medios de cultivo
especiales. Así, algunos medios contienen un producto que inhibe el crecimiento de la
mayoría de las especies bacterianas, pero no la de un tipo que deseamos averiguar si está
presente. Otras veces el medio de cultivo contiene determinados azúcares especiales que
sólo pueden utilizar algunas bacterias. En algunos medios se añaden indicadores de pH
que cambian de color cuando uno de los nutrientes del medio es fermentado y se generan
catabolitos ácidos. Si las bacterias son capaces de producir fermentación, generan gases
que pueden ser apreciados cuando el cultivo se realiza en un tubo cerrado.

Con otros medios de cultivo se identifica si las bacterias producen determinadas enzimas
que digieren los nutrientes: así, algunas bacterias con enzimas hemolíticas (capaces de
romper los glóbulos rojos) producen hemólisis y cambios apreciables macroscópicamente
en las placas de agar-sangre. Los diferentes medios y técnicas de cultivo son esenciales
en el laboratorio de microbiología de un hospital, pues sirven para identificar las bacterias
causantes de las enfermedades infecciosas y los antibióticos a los que son sensibles esas
bacterias.

Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que en concentraciones adecuadas y
en condiciones físicas óptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos. Estos
medios son esenciales en el Laboratorio de Microbiología por lo que un control en su
fabricación, preparación, conservación y uso, asegura la exactitud, confiabilidad y
reproducibilidad de los resultados obtenidos. En los laboratorios de microbiología se
utilizan diferentes tipos de medios de cultivo que pueden ser preparados en forma líquida
o en forma sólida. Usualmente para preparar un medio sólido se parte de un medio líquido
al que se le añade un agente solidificante como el agar, la gelatina o la sílicagel.

CLASIFICACIONES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.-

1.- Por su composición química.-

1.1. Medios químicamente definidos o sintéticos: aquellos que ofrecen los elementos
nutritivos en forma de productos químicos relativamente puros y a una
concentración conocida.
1.2. Medios complejos o empíricos: contienen lo necesario para el crecimiento en forma
cruda, es decir, no se conocen todos los componentes de los ingredientes, ni se saben
las cantidades exactas en que están presentes, por ejemplo: la leche, extracto de
tejidos vegetales, carne, levaduras, etc.

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Manual de Microbiología [Link]. Noemí A. Mayorga sánchez

2.- Por su estado físico.-

2.1. Sólido.
2.2. Semisólido.
2.3. Líquido.
Dependiendo cada uno de ellos de la presencia o ausencia de determinada cantidad de
sustancia denominada agar o gelatina que actúa como solidificante.

3.- Por su fina1idad.-

3.1. Medios Comunes: destinados al cultivo de la mayoría de bacterias.
3.2. Medios Enriquecidos: aquellos a los que se les adiciona sustancias de mayor poder
nutritivo, tales como sangre, líquidos ascíticos, huevo, etc., permitiendo el cultivo
de gérmenes exigentes en sus requerimientos nutricionales.
3.3. Medios Selectivos: aquellos que contienen sustancias que impiden el desarrollo de
algunos grupos bacterianos, favoreciendo a su vez el desarrollo de otros.
3.4. Medios Diferenciales: aquellos que ponen de manifiesto la actividad bioquímica de
un germen frente a determinado sustrato, lo cual permite diferenciarlo de otro
parecido.
Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir de cada uno de sus
constituyentes básicos o por simple rehidratación de productos asequibles
comercialmente (medios de cultivo deshidratados). Generalmente se prefiere el uso de los
medios de cultivo deshidratados porque, además de simplificar el trabajo, con ellos se
tiene mayor probabilidad de obtener resultados reproducibles.
Para su preparación se deben tener en cuenta los siguientes aspectos:
- Prepararlos sólo a partir de productos que provengan de fabricantes o proveedores que
suministren productos de calidad.
- Utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad microbiológica y
fisicoquímica adecuada.
- Utilizar materiales de vidrio bien lavado y enjuagado con agua destilada o
desmineralizada.
- Controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su esterilización.
Nunca se deben exceder las condiciones señaladas por el fabricante.

ALMACENAMIENTO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo deshidratados se deben almacenar en envases sellados bajo las
condiciones que señale el fabricante. Generalmente se almacenan en un lugar fresco (entre
15 y 25_), con poca humedad y protegidos de la luz solar directa. Nunca se deben
almacenar cerca de autoclaves, hornos, ni otra fuente de calor o vapor.
Los medios de cultivo deshidratados se deben descartar cuando se hidraten o decoloren.
Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y esterilizado se debe almacenar entre
2 y 8_C, a menos que el medio requiera alguna condición diferente. Se deben mantener
en recipientes bien cerrados para evitar su deshidratación. Cuando se usa tapón de
algodón se debe colocar por encima una envoltura de papel (kraft).
OBJETIVO
Al finalizar el trabajo práctico el estudiante estará en capacidad de:
Preparar adecuadamente medios de cultivo a partir de sus ingredientes y a partir de
medios de cultivo deshidratados.
Indicar el método de esterilización apropiado.

FUNDAMENTO

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La preparación adecuada de un medio de cultivo nos permite disponer de los nutrientes

y condiciones necesarias para favorecer el crecimiento de los microorganismos en el
laboratorio.

MATERIALES:
- Balanza
-Diferentes medios de cultivo.
- Probetas y vasos de precipitado.
- "Peachímetro" digital
- Agitador magnético (con placa calefactora)
- Matraces o tubos de ensayo.
- Algodón.
- Placas de Petri estériles.
- Los medios de cultivo a preparar son el caldo nutritivo y el agar nutritivo, cuya
composición es la siguiente:

PROCEDIMIENTO
1. Leer cuidadosamente las instrucciones de preparación del medio de cultivo asignado.
2. Pesar la cantidad exacta del medio deshidratado o las porciones correctas de cada uno
de los ingredientes. Cerrar inmediatamente el frasco de medio de cultivo.
3. Disolver la porción pesada de acuerdo con las indicaciones del fabricante. Si es
necesario calentar se debe tener cuidado de no sobrecalentar.
4. Ajustar el pH final de cada lote de medio preparado, preferiblemente a temperatura
ambiente (25_C).
5. Distribuir el medio de cultivo de acuerdo a las indicaciones señaladas por el profesor.
6. Identificar el medio de cultivo preparado indicando su nombre, distribución y fecha
de preparación.
7. Esterilizar de inmediato el medio de cultivo en el autoclave durante 15 minutos
a121ºC. siguiendo las instrucciones señaladas en el frasco.

Si se presenta algún inconveniente, antes de su esterilización, el medio se puede

almacenar por un periodo máximo de 12 horas bajo refrigeración.
Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y esterilizado es esencial que se
efectúen controles para confirmar que el medio es satisfactorio y cumple con el propósito
de uso deseado. Por ello se deben realizar pruebas para verificar la esterilidad.

RESULTADOS

MEDIO DE CULTIVO:
CANTIDAD PREPARADA:
CANTIDAD PESADA:
CÁLCULOS:
pH final:
CUESTIONARIO

1.- ¿Que es un medio de cultivo?

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Manual de Microbiología [Link]. Noemí A. Mayorga sánchez

2.- ¿Que es un cultivo de microorganismos?.

3.- ¿Que finalidad tiene utilizar medios de cultivo sólidos?
4.- Escribe el nombre de 5 medios de cultivo que pueden ser empleados en el
laboratorio de microbiología.
5.- ¿De dónde es obtenido el extracto Agar- Agar para la preparación de medios de
cultivos?
6.- ¿Porque es necesario esterilizar la mesa entes de realizar el vaciado del medio de
cultivo en las placas de Petri ?
7.- ¿Por qué la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y
peptona?
8.- Escribe la composición química para cada medio de cultivo que utilizaste.

PRACTICA Nº 4

METODOS DE SIEMBRA

Una de las razones más importantes por los cuales se inoculan los medios de cultivo, es
para realizar el aislamiento de un microorganismo. También se puede hacer la
inocu1ación para perpetuar una especie bacteriana.

Objetivos

- Familiarizarse con el manejo de microorganismos y con las técnicas de aislamiento en

placa de Petri.
-Obtener colonias separadas, utilizando uno o más métodos.
- Estudiar la morfología de cada colonia.

Material
Asa de siembra, aguja de kolle, espátula de Drigalsky, pipeta graduada, placas de Petri
con medio de cultivo sólido, tubos con medios sólidos y tubos con caldo nutritivo y
cultivo de microorganismos.

MÉTODOS DE_SIEMBRA.

1. Siembra en medio sólido en placa

Se entiende por siembra, la operación que consiste en colocar los microorganismos en un
medio adecuado para que se desarrollen y multipliquen en óptimas condiciones. Esta
operación se realiza teniendo en cuenta las precauciones del caso.

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Manual de Microbiología [Link]. Noemí A. Mayorga sánchez

2. Siembra en Medio Sólido en tubo:

- Con el lápiz de cera rotular la placa o tubo poniendo el número correspondiente de

1a muestra y fecha y nombre del alumno o grupo.
- Esteri1izar el ansa que se tiene en la mano derecha, tomar el frasco o tubo que contiene
la muestra con la mano izquierda, destapar éste con el meñique de la mano derecha,
tomar una ansada de inóculo estérilmente cerca de1 mechero.
- Cerrar el frasco y coger con la mano izquierda la placa que se abrirá con la ayuda de los
dedos pulgar o índice, sembrar cerca del mechero, cerrar la placa y colocarla en
posición invertida en la estufa a 37°C por 24 horas.

3. Siembra en Medios Líquidos:

Se procede a tomar el inóculo como en el caso anterior, co1ocando éste en el tubo que
contenga el medio líquido correspondiente, se tapa y se lleva a la estufa a 37° C por 24
horas.

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4 Siembra en Medios Semisólidos:

La siembra se hará por puntura, se usará el ansa en aguja, se tomará el inóculo y se

introduce en el medio hasta las ¾ partes de éste; se tapona y se deja al medio ambiente.

REPICAJE.
- Esterilizar el ansa, enfriarla.
- Tomar una colonia de una placa sembrada anteriormente o una cantidad de inóculo
suficiente si se trata de un cu1tivo 1íquido.
- Sembrar esta colonia o la cantidad de inóculo en otra placa.
- Incubar según procedimiento adecuado.

AISLAMIENTO POR AGOTAMIENTO EN SUPERFICIE.- Puede realizarse:

1.- Utilizando asa de Kolle.

2.- Utilizando aguja de Kolle.
3.- Con espátula de vidrio o de Drigalsky.
4.- Con "trompa de mosca".

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Manual de Microbiología [Link]. Noemí A. Mayorga sánchez

PROCEDIMIENTO.

1.- Aislamiento haciendo uso del Asa de Kolle o de la “Trompa de Mosca”: con el asa
cargada de material trazar estrías sobre la superficie del medio conforme lo indican los
esquemas:

2.- Aislamiento haciendo uso de la Aguja de Kolle:

- Con la aguja de Kolle cargada de material, hacer cinco estrías paralelas (A).

- Esterilizar la aguja a la llama.

- Enfriar en el agar y sin tomar nuevo ínóculo hacer una segunda serie de estrías (B).

- Repetir cuatro veces esta operación haciendo solamente una estría la última vez (E).

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Manual de Microbiología [Link]. Noemí A. Mayorga sánchez

3.- Aislamiento haciendo uso de la Espátula de Drigalsky:

- Tomar la placa con el agar nutritivo, colocar una gota de la suspensión bacteriana y
extenderla sobre el medio con ayuda de la espátula de Drigalsky estéril.
- Se puede repetir 1a operación en otras placas de agar nutritivo, pero esta vez sin
esterilizar 1a espátula.
- Incubar las placas durante 24 horas a 37° C .

RESULTADOS.

- Realizar la esquematización de la distribución de las colonias en cada una de las

placas.
- Describir las características de las colonias.
- Rea1iza r un a coloración Gram de cada tipo de co1onia.
- Anote sus resu1tados e interprete.

DETECCIÓN DE MOVILIDAD
La movilidad bacteriana se debe a órganos filamentosos que reciben el nombre de
flagelos. Existen bacterias que no obstante carecer de flagelos, pueden trasladarse aunque
muy lentamente, por variaciones en las concentraciones de su citoplasma. La movilidad
puede ser demostrada por métodos especiales de coloración o puede ser determinada
indirectamente inoculando el germen en un agar semisólido distribuido en tubos en U
como también por el método clásico.

MATERIALES.-

-Agar semisólido en tubos en U.

-Agar semisólido en tubos simples.
-Aguja de Kolle.
-Cepas: Proteus vulgaris, Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Shigella sonnei.

PROCEDIMIENTO.
SIEMBRA EN AGAR SEMISOLIDO:

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Manual de Microbiología [Link]. Noemí A. Mayorga sánchez

- Tomar los tubos en U con medio de cultivo.

- Sembrar por puntura (5 mm. de profundidad) en uno de los extremos del tubo en U, la
cepa problema.
- Incubar a 37 ºC por 24-48 horas.

RESULTADOS.
Después del período de incubación, observar la ausencia o presencia de desarrollo que en
forma de nebulosa se extiende hasta el otro extremo.

SIEMBRA POR EL METODO CLÁSICO.-

-Tomar los tubos simples conteniendo el agar semisólido.

-Sembrar por puntura la cepa problema.
-Incubar a 37ºC por 24-48 horas.

RESULTADOS.-

Se tendrá que observar nebulosidad alrededor de la puntura de inoculación, para

considerar la movilidad como positiva.

CUESTIONARIO.-

¿Cuál de los métodos para detectar la movilidad bacteriana presenta mayores ventajas y
por qué?

PRÁCTICA Nº 5

MORFOLOGÍA BACTERIANA:

COLORACIÓN SIMPLE
OBJETIVO: Estudiar las características de los microorganismos en cultivo como
forma, tamaño y agrupación.
MATERIALES:
-Asa de kolle
-Láminas portaobjetos
-Cultivos bacterianos (Escherichia coli , Staphylococcus aureus)
-Colorante: azul de metileno
-Aceite de inmersión
-Microscopio

PROTOCOLO:
-Preparar la extensión de los cultivos bacterianos en láminas portaobjetos.
-Fijar al medio ambiente o a la llama del mechero.
-Aplicar el colorante azul de metileno sobre la extensión y dejar actuar por 3 min.
-Lavar con agua.
-Secar y colocar una gota de aceite de inmersión.
-Examinar al microscopio con objetivo de inmersión.
-Observar la forma y disposición de los microorganismos teñidos con el colorante.

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Manual de Microbiología [Link]. Noemí A. Mayorga sánchez

COLORACION GRAM

La coloración más empleada en Bacteriología es la tinción Gram propuesta por el danés

Christian Gram en 1884. Las bacterias debido a sus diferencias en la constitución celular
se comportan de manera diferente frente a determinados colorantes. En el proceso de la
coloración Gram algunas bacterias retienen el complejo cristal violeta – lugol
(carbohidrato-proteína-ribonucleato de magnesio) que al ser tratado con alcohol acetona,
no cede el colorante, quedando teñida de violeta designándolas como Gram positivas.
Otras que con el alcohol acetona se decoloran y con el colorante de contraste, la safranina,
se tiñen de rojo y se les llama Gram negativas.
La morfología de las bacterias es difícil de observar en preparaciones en fresco, sin teñir
y estas preparaciones no son permanentes. Es un método usual teñir las extensiones de
gérmenes. Algunas especies de bacterias poseen también apéndices que se ponen de
manifiesto gracias a las técnicas especiales de tinción

FUNDAMENTO.-
La diferencia estructural y química de las paredes de las células bacterianas determinan
un comportamiento distinto durante los pasos sucesivos de la coloración Gram; esto dá
como resultado que unas bacterias se tiñan con el cristal violeta y otras con la safranina.

OBJETIVOS:
1.- Reconocer las bacterias Gram positivas y Gram negativas, asociándolas con otras
diferencias.
2.- Reconocer si se encuentra frente a cultivos puros o mixtos de bacterias.

MATERIALES:
-Soluciones colorantes: cristal-violeta y safranina.
-Fijador: Lugol.
-Alcohol-cetona.
-Cepas bacterianas: Bacillus subtilis, Escherichia coli y Staphylococcus aureus.
-Microscopio compuesto.
-Láminas portaobjeto.
-Aceite de inmersión.

PROTOCOLO
1.- En un portaobjetos limpio hacer una extensión de la cepa.
2.- Fijar la muestra a la llama del mechero en forma suave.
3.- Cubrir la preparación con Cristal-Violeta y dejar actuar por un minuto.
4.- Lavar con agua.
5.- Cubrir el preparado con lugol y hacer actuar por un minuto.
6.- Lavar con agua.
7.- Decolorar con alcohol-cetona hasta que no desprenda más colorante. Poner cuidado
en esta operación.
8.- Lavar con agua
9.- Cubrir la preparación con safranina y dejar actuar por 30 segundos.
10.- Lavar con agua.
11.- Secar al medio ambiente o a la llama suave del mechero.

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Manual de Microbiología [Link]. Noemí A. Mayorga sánchez

12.- Observar al microscopio con objetivo de inmersión.

COLORACION NEGATIVA

OBJETIVO:
Conocer la morfología de los microorganismos, realizando una coloración del fondo, sin
que se coloreen las bacterias o las estructuras que se tratan de observar.
MATERIALES:
-Asa de kolle
-Láminas portaobjetos
-Cultivos bacterianos (Escherichia coli , Staphylococcus aureus)
-Nigrosina al 10%
-Aceite de inmersión
-Microscopio
PROTOCOLO:
-Preparar la extensión de los cultivos bacterianos en láminas portaobjetos.
-Añadir una gota de la solución de Nigrosina al 10%
-Mezclar totalmente y dejar secar al ambiente.
- Examinar al microscopio con objetivo de inmersión.
-Los microorganismos aparecerán sin teñir en contraste con el fondo oscuro, pudiéndose
apreciar su forma y agrupación característica.
RESULTADOS.-

Observar las láminas preparadas y ver el color retenido por cada una de las especies
bacterianas.
Esquematizar las observaciones microscópicas y describir la morfología bacteriana y
agrupamientos de bacterias.

PRACTICA Nº 6

CARACTERISTICAS CULTURALES

Toda especie bacteriana desarrolla en un medio de cultivo de manera característica. El

tipo y forma de crecimiento en la superficie y en el interior de los medios, es útil para
diferenciar y clasificar en forma adecuada grupos taxonómicos de bacterias. Efectuada la
siembra y establecidas las condiciones físicas favorables para el desarrol1o óptimo de
los gérmenes, como temperatura adecuada y necesidades gaseosas entre otras, salvo
excepciones, el crecimiento bacteriano se manifiesta entre las 12 y 48 horas y es cuando
comienzan las observaciones del cultivo.
Para determinar las características de crecimiento es preciso hacer las observaciones en
los siguientes tipos de cultivo:
- En placas: forma, borde, elevación de las colonias, olor, color, tamaño, superficie,
consistencia y grado de opacidad.
- En agar inclinado: forma, olor, color, superficie, consistencia y grado de opacidad.
- En caldo: enturbiamiento, formación de velo y sedimento.
- Picadura en gelatina: forma característica.

FUNDAMENTO.-

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Manual de Microbiología [Link]. Noemí A. Mayorga sánchez

Un cultivo bacteriano puro presenta, determinadas características de crecimiento, de

acuerdo al medio en el que ha sido sembrado, utilizándose estas características como parte
de su identificación.

OBJETIVOS.
- Obtener un cultivo puro mediante una resiembra.
- Describir las características culturales de crecimiento bacteriano en los diferentes
medios de cultivo.

MATERIALES.-
- Placas con cultivo de bacterias.
- Cepas bacterianas.
- Tubos con agar y caldo nutritivo.
- Asa bacteriológica en aguja.
- Mechero.
- Estufa.
- Lápiz marcador de vidrio.

PROTOCOLO
1.- De la placa con cultivo bacteriano, seleccione una colonia claramente diferente y
separada de las demás.
2.- Flamear el ansa, dejar enfriar unos instantes y levantando la cubierta de la placa,
toque la colonia que quiere aislar con el ansa, cierre la placa y con 1a, mano izquierda
tome el tubo con el medio nutritivo. Con los dedos de la mano derecha, sin soltar el
ansa y siempre junto a la llama del mechero, saque el tapón del tubo.
3.- Flamear la boca del tubo y proceda a 1a transferencia de 1a co1onia sobre la
superficie del medio.
4.- Terminada la transferencia flamear nuevamente la boca del tubo, tapándolo y
quemando el ansa.
5.- Usando el ansa, inocular las cepas en el resto de los medíos de cultivo en la siguiente
forma:
- En el agar inclinado, una estría en el centro y a lo largo de la superficie inclinada.
- En el caldo de nutritivo, agitar la aguja inoculada en el medio líquido.
- En 1a ge1atina nutritiva sembrar por picadura profunda.
6.- Incubar los tubos con gelatina nutritiva a 20 ºC y los otros medios a 37 ºC , por 24
horas.
NOTA: Se debe flamear la boca de los tubos antes y después de la siembra.

RESULTADOS.-

Tome nota de los resultados obtenidos y describa las características culturales de las
colonias. Haga esquemas de sus observaciones.

CUESTIONARIO.-

1.- ¿Qué es un cultivo puro?

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Manual de Microbiología [Link]. Noemí A. Mayorga sánchez

2.- ¿Se puede saber, según el aspecto de los cultivos líquidos, si se ha obtenido un cultivo
puro?

3.- ¿Al describir las características de la colonia, porqué se debe indicar el medio y las
condiciones físicas de incubación?

PRACTICA Nº 7

RECUENTO DE COLONIAS: DILUCIONES SUCESIVAS

La determinación del número de microorganismos presentes en una determinada cantidad

de muestra es posible efectuando una serie de diluciones de ésta, de tal manera que
sembrándolas en un medio, se obtenga un número adecuado de colonias para el contaje,
las que darán una idea aproximada de la cantidad de microorganismos que existen en
dicha muestra.
El número de colonias se determina multiplicando el número de éstas por el factor de
dilución de la placa en que se está haciendo el recuento.

FUNDAMENTO.-

La determinación del número de bacterias que hay en una muestra, está basada en la
relación teórica en que una colonia es el producto de la multiplicación de una sola célula
bacteriana. Conociendo la magnitud de la muestra original y de las diluciones usadas,
podemos, mediante cálculos matemáticos, deducir la cantidad de células bacterianas
presentes en la muestra.

OBJETIVOS.-

Determinar el número de células bacterianas presentes en una muestra dada.

MATERIALES.-

-Muestra de 1eche.
-Tres tubos conteniendo nueve ml. de agua peptonada estéri1.
-Seis placas Petri estériles.
-Pipetas estéri1es de un ml.
-Agar Plate Count.
-Contador de colonias de Quebec.

PROTOCOLO

1. Marque los tres tubos que contienen 9 ml. de agua peptonada estéril con las letras A,
B y C sucesivamente.
[Link] una pipeta estéril tome 1 ml. de muestra problema y viértalo en el tubo A, agite el
tubo hasta obtener una mezcla uniforme, luego con otra pipeta tome 1 ml de esta
mezcla y añádala al tubo B y de éste al tubo C, procediendo de la misma forma que
con el tubo A.
[Link] 3 placas Petri por duplicado con 1os números 10-1, 10-2 y 10-3 .

25
Manual de Microbiología [Link]. Noemí A. Mayorga sánchez

4. Deposite en cada una de las placas marcadas con 10-1 ,1 ml de la dilución A, proceda
de la misma manera con las diluciones B y C, empleando las otras placas.
5. Añada el Agar Plate Count fundido y enfriado a 45 °C a cada una de las placas,
mezclando de este modo; hacer circular la placa en dirección de las agujas del reloj,
repetir en dirección contraria y luego mover adelante y atrás, en ambos casos unas
tres veces, para obtener una diseminación uniforme de bacterias.

6. Cuando este solidificado el medio de cultivo, coloque las placas invertidas en la estufa
a 35°C por 24 horas.

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Manual de Microbiología [Link]. Noemí A. Mayorga sánchez

RESULTADOS.-

Elija para el contaje de placas las que contengan entre 30 y 300 co1onias; uti1izamos para
e1lo el Contador de colonias de Quebec y marcando cada colonia sobre el vidrio para
evitar volver a contarlas. Diga cuantas células bacterianas hay en su muestra.
El número de bacterias por ml. de la muestra original se obtiene mu1tiplicando e1 número
de colonias que hay sobre la placa, por el factor de dilución invertido. Por ejemplo, si
usted a contado 170 colonias en la p1aca de di1ución 10-3 , puede ca1cular:

170 x 1 000 = 17 x 104 UFC (Unidades Formadoras de Colonias)

Se aconseja preparar placas por duplicado por cada dilución para hallar la media del
número de colonias contenidas en cada placa.
Esta técnica de siembra, además de permitir que se distingan las colonias por su
morfología, permite el recuento de microorganismos viables. La expresión de este
recuento se hace en "unidades formadoras de colonias" (UFC) ya que cada una procede
de un sólo microorganismo. A partir de las colonias aisladas, los microorganismos
pueden transferirse a otros medios de cultivo para su estudio.

CUESTIONARIO.-

1.- ¿Por qué se cambian las pipetas al pasar de una di1ución a otra ?.
2.- ¿Por qué se cuentan las placas que contienen de 30 a 300 colonias?
3.- ¿Qué tipo de técnica empleaste para la siembra de microorganismos?
4.- ¿Cómo podemos controlar la contaminación microbiana?

PRACTICA Nº 8

ACCION DE LOS AGENTES FISICOS SOBRE EL CRECIMIENTO

BACTERIANO

La actividad de los microorganismos es afectada intensamente por las condiciones físicas

y químicas del medio ambiente en e1 que se desenvuelven. El conocimiento de esta
inf1uencia hace posib1e idear métodos para su control y manejo.

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Manual de Microbiología [Link]. Noemí A. Mayorga sánchez

No todos los microorganismos responden igualmente a un factor ambiental dado, siendo

para algunos beneficioso y para otros perjudicia1es.

Entre los agentes físicos que pueden afectar el crecimiento microbiano tenemos la
temperatura, presión osmótica, concentración de microorganismos, etc. Igualmente
existen sustancias químicas que pueden interferir o eliminar el desarrollo bacteriano,
tales como desinfectantes, colorantes, antibióticos, etc.

EFECTO DE LA TEMPERATURA.-

La temperatura es uno de los factores ambientales importantes que influyen en el

crecimiento y supervivencia de la célula.
Todas las bacterias tienen una temperatura óptima de desarrollo. Las variaciones de ésta
pueden originar una inhibición ó muerte de las células, al afectar en menor o mayor
grado las reacciones enzimáticas indispensables para su supervivencia.

FUNDAMENTO.-

Las variaciones de temperatura se manifiestan por un determinado grado de desarrollo,

el máximo del cual responde a. lo que se llama como temperatura óptima: rangos mayores
o menores determinan ausencia o menor crecimiento.

OBJETIVO.-

Demostrar el efecto de la temperatura, sobre el crecimiento bacteriano.

MATERIALES.-

- Caldo nutritivo en 14 tubos.

- 2 cepas bacterianas en caldo nutritivo.
- Baño María.
- Termómetro.
- Estufa.

PROTOCOLO
1.- Inocular una asada de cada cultivo bacteriano en 7 tubos con caldo nutritivo.
2.- Colocar un tubo de cada cultivo inoculado en Baño María regulada a 30 ºC por espacio
de 10 minutos, 1uego enfría r 1os tubos rápidamente a chorro de agua fría.
3.- Repetir el procedimiento con los otros tubos inoculados a las temperaturas de 40 ºC,
50 ºC, 60 ºC, 70 ºC y 80 ºC; los tubos restantes servirán de control.
4.- Rotular los tubos e incubar a 37 ºC por 24 horas.
RESULTADOS.-

Comparar los tubos expuestos a varias temperaturas con el tubo patrón; anotar los
resultados en un cuadro.

Nota: Calificar con una cruz (+) el enturbiamiento. Aumentar el número de cruces de
acuerdo al grado de turbidez del cultivo.

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Manual de Microbiología [Link]. Noemí A. Mayorga sánchez

0 = crecimiento negativo
+ = crecimiento escaso
++ = crecimiento moderado
+++ = crecimiento abundante

CEPA TEMPERATURA
BACTERIANA 30 ºC 40 ºC 50 ºC 60 ºC 70 ºC 80 ºC

CUESTIONARIO.-

1.- ¿Qué es un organismo termorresistente?

2.- ¿A partir de qué fuente natural aislaría un microorganismo termófilo, un mesófilo y

un psicrófilo?

PRACTICA Nº 9
INVESTIGACIÓN DE Staphylococcus aureus EN AGUAS

FUNDAMENTO
S. aureus es un microorganismo patógeno capaz de producir una gran diversidad de
síndromes clínicos. Posee enzimas que hidrolizan un amplio espectro de sustratos y
produce diversas toxinas: hemolisinas, exfoliatina y enterotoxinas. La presencia de

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Manual de Microbiología [Link]. Noemí A. Mayorga sánchez

cepas toxigénicas en aguas envasadas y de recreo puede ser causa de infecciones.

OBJETIVOS:
Reconocer bacterias potencialmente patógenas en el agua.

Material
- 1 matraz con 100 ml de caseína-soja a concentración doble
- 1 placa de agar Baird - Parker
- Agua oxigenada de 30 volúmenes
- Reactivos para técnica de identificación

Procedimiento:
- Cultivo y aislamiento
En el matraz con 100 ml de caldo caseína-soja se siembran 100 ml del agua. Incubar a
35-37ºC durante 24-48 horas. Después de la incubación se observa el crecimiento por
la turbidez.
Para confirmar la presencia de S. aureus sembrar con el cultivo anterior las placas de
agar Baird-Parker sobre la superficie con el asa bacteriológica.
Incubar a 37ºC durante 24-48 horas.
Las colonias de S. aureus son muy típicas, negras brillantes, rodeadas de un halo
opaco. Con las colonias que presentan estas características realiza las pruebas de
identificación.

Identificación
- Morfología y tinción:

A partir de una colonia característica hacer un frotis sobre un portaobjetos y teñir

por tinción de Gram. Observar al microscopio con objetivo de inmersión, cocos
Gram positivos agrupados en parejas y masas semejantes a racimos.

- Catalasa:
Poner en un portaobjetos una gota de agua oxigenada de 30 volúmenes e
introducir el asa con las bacterias. En caso positivo se desprenden burbujas.

-Prueba de la coagulasa:
Se puede usar sangre de humano o de conejo, se trabaja con plasma citratado a partir de
sangre total, tomada con anticoagulante y centrifugada a gran velocidad durante 10
minutos; el plasma así obtenido se diluye al medio o al cuarto (l para 1 ó 1 para 3) en
suero fisiológico estéril. Poner 0,5 ml. de plasma diluido en un tubo estéril. Añadir una
asada del germen a ensayar y mezclarlo con el plasma. Incubar a 37 °C. La coagulación
se hace evidente en dos a tres horas, chequear cada 30 minutos, considerar la última
lectura a las 24 horas.

Lectura: Positivo: cuando el germen ensayado produce coagulación. Negativo: cuando

no presenta coagulación.

RESULTADOS:

Anotar las observaciones y graficarlas.

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Manual de Microbiología [Link]. Noemí A. Mayorga sánchez

PRACTICA Nº 10

AISLAMIENTO DE ENTEROBACTERIAS

Para aislar un microorganismo de la naturaleza, se debe conocer previamente los

requerimientos nutricionales y las condiciones ambientales óptimas para su crecimiento.
Muchas enterobacterias son responsables de múltiples infecciones; pero algunas se les
puede considerar como benéficas. Habitan en el tracto intestinal de los animales y el
hombre.

OBJETIVO: Aislamiento y posterior identificación de Enterobacterias a partir de

diferentes muestras.
MATERIALES Y PROTOCOLO
MATERIALES:
-Muestras de agua en pomos estériles.
-Tubos con campana de Durhan conteniendo 10 ml. de caldo Mac Conkey (doble
concentración)
-Placas con agar EMB o Agar Mac Conkey
-Asa de Kolle
-Pipetas estériles de 10 ml

PROTOCOLO

1- Tomar 10 ml. de muestra de agua y sembrar en caldo Mac Conkey.

2- Incubar durante 48 hs. a 370C.
3-Observar crecimiento (la formación de gas y viraje del indicador Azul de Bromocresol
a amarillo indica probable presencia de E. coli).
4- Tomar una muestra con el ansa y estriar sobre placas con agar EMB o Mac Conkey.
5- Incubar durante 24 hs. a 37 0C.
6- Observar colonias con distinta morfología y color.
RESULTADOS:
1. Interpretar los resultados obtenidos.
2. Esquematizar sus observaciones.

PRACTICA Nº 11
HEMOCULTIVO – UROCULTIVO - COPROCULTIVO
A. HEMOCULTIVO.-

Se denomina así a los cultivos de sangre. En casos de que existan bacterias en la sangre,
su número no es elevado y por ello se recomienda cultivar de 5 a 10 ml de sangre.
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Manual de Microbiología [Link]. Noemí A. Mayorga sánchez

MATERIAL.-

- Muestras de sangre con anticoagulante y obtenida estéri1mente.

- Frasco con medio apropiado para la siembra (caldo tioglicolato) .

PROCEDIMIENTO.-

1.- La muestra de sangre obtenida estérilmente se inocula en el frasco que contiene el

medio, en cantidad suficiente (5 a 10 ml), trabajando con cuidado y junto al mechero.
2.- Incubar a 37 ºC y observar el desarrollo, si lo hubiera, luego de 48 a 72 horas; en
algunos casos hasta 7 ó más días.

RESULTADOS.-

Anote sus resultados y evalúe el crecimiento microbiano en el medio de cultivo.

Interprete.

B.- UROCULTIVO.-

Se denomina así a los exámenes bacteriológicos de muestras de orina obtenidas

estérilmente. Para ello se puede disponer de sondas uretrales especiales para cada especie
animal. Se aconseja remitir la muestra inmediatamente al laboratorio, porque es
un medio de cu1tivo excelente para muchas bacterias. En caso contrario debe
mantenerse la muestra bajo refrigeración.

MATERIAL.-

- Muestra de orina obtenida estérilmente.

- Centrifuga.
- Placas de agar sangre y agar Mac Conkey.
- Colorantes para Tinción Gram.
- Cuentacolonias de Québec.

PROCEDIMIENTO.-

1.- Centrifugar la muestra de orina a 1000 rpm durante 15 minutos.

2.- Eliminar el sobrenadante y sembrar el sedimento obtenido, por agotamiento, en
las placas de agar sangre y de agar Mac Conkey.
3.- Hacer frotices del sedimento para colorear por el método de Gram.
4.- Incubar en estufa a 37 ºC durante 24 - 48 horas.
5. Si se quiere hacer un recuento de bacterias por ml de orina, realizar el método de
diluciones sucesivas.

RESULTADOS.-

- Interprete los resultados obtenidos con la tinción Gram. Grafique.

- Interprete el crecimiento bacteriano en las placas anotando las características culturales.
- Si ha realizado el método de siembra por el método de diluciones sucesivas, determine
el número de bacterias por ml de muestra.

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Manual de Microbiología [Link]. Noemí A. Mayorga sánchez

C.-COPROCULTIVO.-

Se refiere al examen bacteriológico de las muestras de heces. La siembra suele realizarse

en medios líquidos y sólidos.

MATERIAL.-
- Placas con agar Mac Conkey.
- Caldo tetrationato .
- Asa de Kolle.
- Muestra problema.

PROCEDIMIENTO.-
1.- Siembra en Medio Líquido:
- Esterilizar el ansa.
- Tomar una pequeña cantidad de la muestra y sembrarla en el caldo tetrationato.
- Incubar a 37 ºC durante 24 a 48 horas.
- Hacer frotices y coloración Gram de la muestra.

2.- Siembra en Medio Sólido:

- Esterilizar el ansa.
- Tomar una ansada del cultivo en medio líquido.
- Sembrarla por agotamiento en placa de agar Mac Conkey.
- Incubar a 37ºC por 24 a 48 horas.
- Luego de realizar la lectura anote y grafique el crecimiento bacteriano, en cada uno de
los medios de cultivo, a fin de interpretar adecuadamente el desarrol1o.

CUESTIONARIO.-

1.- ¿Qué procedimiento debería de realizar en caso de que la muestra de heces sea muy
dura?
2.- ¿Solo se pueden encontrar microorganismos patógenos en las muestras de heces?
Explique.
3.- ¿Cómo podría obtener las muestras de sangre en forma estéril?
4.- ¿De qué otros f1uídos o secreciones corporales podrían hacerse cultivos especiales y
cuáles serían los procedimientos y medios de cultivo que podrían recomendarse? .

PRACTICA Nº 12

PRUEBAS BIOQUIMICAS

FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS

Para esta prueba se puede usar el agar Kligler inclinado en tubo, que tiene lactosa,
sacarosa y glucosa, tiene como indicador el rojo de fenol. La siembra se hace por picadura
hasta el fondo y también en la superficie.
Lectura: tanto la lactosa como la glucosa se leerá acidez (amarillo) o no acidez (rojo)
por viración del indicador. Para la lactosa se hará la lectura en la superficie del medio y
para la glucosa se hará en el interior del medio. La formación de Hidrógeno sulfurado se

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Manual de Microbiología [Link]. Noemí A. Mayorga sánchez

verá en el interior del medio (ennegrecimiento del medio). La formación de gas

(desplazamiento o rotura del medio) también se leerá en el interior del medio.

UTILIZACIÓN DE CITRATO:mkm

Para esta prueba se usa el medio Agar Citrato de

Simmons inclinado en tubo. Únicamente crecen en
este medio los gérmenes capaces de utilizar el citrato
como fuente de Carbono y como fuente de Nitrógeno
al amoniaco; lleva como indicador el azul de
bromotimol. Sembrar en la masa por picadura, y en
la superficie inclinada en estrías.
Lectura:
Positivo: aparición de crecimiento visible con
modificación alcalina (azul) por viraje del
indicador. Negativo: cuando mantiene su color
verde y no muestra crecimiento en 4 días de
incubación a 37 ºC.
REACCION DEL ROJO DE METILO.
Sembrar en un tubo que contiene caldo MR-VP con el germen a investigar e incubar
durante 48 horas a 37 ºC.
Lectura: añadir 5 gotas de la solución alcohólica de Rojo de Metilo al 1% y agitar
violentamente. Positivo. Formación de un color rojo. Negativo: formación de un color
amarillo.

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Manual de Microbiología [Link]. Noemí A. Mayorga sánchez

REACCIÓN DE VOGES-PROSKAUER.-

Sembrar en un tubo conteniendo caldo MR-VP con el

germen a investigar e incubar durante 48 horas a 37°
C.

Lectura: añadir 10 gotas de una solución al 5% de

alfa-naftol en alcohol etílico absoluto más 5 gotas de
una solución de creatina al 3% en KOH al 40%.Agitar
y dejar en reposo de 5-10 minutos. Positivo: coloración
naranja brillante rojiza (indica la formación de
acetilmetil-carbinol por el germen). Negativo: no hay
cambio de color.

VOGESPROSKAUER +

VOGESPROSKAUER-
PRUEBA DE MOTILIDAD

Para esta prueba se puede usar el medio SIM en tubo, la siembra se hace por picadura
profunda .Incubar a 37°C durante 24-48 horas.

Lectura: Positivo: cuando el desarrollo se propaga por todo el medio. Negativo: cuando
el desarrollo es únicamente a lo largo de la línea de siembra.

Hidrógeno sulfurado: es positivo cuando se produce ennegrecimiento del medio, y

negativo cuando no se produce ennegrecimiento.

Indol: para hacer esta lectura se le agrega 5 gotas del reactivo de Kovacs. Es positivo,
cuando se forma un anillo rojo en la superficie del medio, y negativo cuando el medio
permanece amarillo.

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Manual de Microbiología [Link]. Noemí A. Mayorga sánchez

PRODUCCIÓN DE UREASA.-

Se puede usar el Agar Urea. Sembrar densamente

en la superficie inclinada, sin picar en la masa del
fondo. Incubar a 37°C.

Lectura: Positivo: color rojo en la superficie del

agar, debido a que el germen es capaz de
desdoblar la urea, liberar amoniaco y por tanto,
alcalinizar el medio haciendo virar de color.
Negativo no hay ningún cambio.
PRUEBA DE LA COAGULASA.-

Se puede usar sangre de humano o de conejo, se trabaja con plasma citratado a partir de
sangre total, tomada con anticoagulante y centrifugada a gran velocidad durante 10
minutos; el plasma así obtenido se diluye al medio o al cuarto (l para 1 ó 1 para 3) en
suero fisiológico estéril. Poner 0,5 ml. de plasma diluido en un tubo estéril. Añadir una
asada del germen a ensayar y mezclarlo con el plasma. Incubar a 37 °C. La coagulación
se hace evidente en dos a tres horas, chequear cada 30 minutos, considerar la última
lectura a las 24 horas.

Lectura: Positivo: cuando el germen ensayado produce coagulación. Negativo: cuando

no presenta coagulación.

PRUEBA DE LA CATALASA.-

Añadir aproximadamente 1 ml. de peróxido de hidrógeno al 3% a un buen cultivo sobre

un tubo inclinado con medio TSI (Triple Sugar Iron).

Lectura:
Positivo: una clara formación de burbujas.
Negativo: no hay formación de burbujas.

PRUEBA DE CAMP.-

Sembrar en estrías un cultivo de Staphylococcus beta hemolítico; una única estría ancha
a lo largo del diámetro de una placa de agar sangre. Sembrar el Streptococcus a determinar
en una línea recta perpendicular a la línea de siembra del Staphylococcus. La siembra del
Streptococcus debe aproximarse a 0,3 mm de la línea de inoculación del Staphylococcus.
Pueden ensayarse a la vez 8 a 10 muestras de Streptococcus. Incubar a 37°C durante 24
horas.

Lectura:
Positivo: en la confluencia de las líneas aparece una amplia zona semicircular de
hemólisis.
Negativo: las zonas hemolíticas son discretas en la confluencia de las líneas.

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PRACTICA Nº 13

ANTIBIOGRAMA

Los antibióticos son sustancias químicas segregadas por organismos y que a

concentraciones mínimas tienen la capacidad de matar e inhibir el crecimiento de células
bacterianas.
La determinación de la sensibilidad in vitro de un microorganismo dado frente a la acción
de los antibióticos es realizada mediante el método del antibiograma, que constituye un
medio de selección de la efectividad de éstos para el tratamiento de las enfermedades.
La técnica más usada es la difusión en agar utilizando los discos de sensibilidad, por las
ventajas que ofrece. Los resultados están condicionados por varios factores como la
concentración de los gérmenes, capacidad de difusión de la droga, tiempo, temperatura
de incubación, composición del medio y el pH.

FUNDAMENTO
La acción de un antibiótico frente a un microorganismo en placa, se evidencia por la
presencia de un halo de inhibición de crecimiento de un diámetro cuyo tamaño depende
de la eficacia de dicho antibiótico.

MATERIALES
- Cepas bacterianas en caldo.
- 2 placas Petri estériles.
- Agar Mueller Hinton mantenido a 45 ºC.
- Pipeta estéril de 1 ml.
- Pinzas.
- Discos embebidos en antibióticos a concentración estándar.

PROTOCOLO
1.- Colocar 1 ml de cada uno de los cultivos bacterianos, a las dos placas estériles,
previamente marcadas.
2.- Agregar el agar Mueller Hinton mantenido a 45 ºC.
3.- Mezclar bien y dejar enfriar.
4.- Colocar con una pinza previamente flameada, los discos de sensibilidad sobre la
superficie del medio, procurando mantener una distancia equidistante entre los discos (no
menor de 3 centímetros).
5.-Rotular las placas e incubar a 37 ºC por 24 horas.

RESULTADOS
Con la ayuda de una regla medir el diámetro de la zona de inhibición. Esquematice sus
resultados e indique el antibiótico más eficaz en cada caso.
R = Resistente S = Sensible I = Intermedio

CUESTIONARIO
1.- ¿Cuáles son las diferencias entre sulfas y antibióticos?
2.- ¿Cómo interpreta el halo de inhibición en un antibiograma?
3.- ¿Cuándo se dice que un antibiótico es de amplio espectro y cuándo de espectro
reducido?

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PRACTICA Nº 14

CULTIVO DE HONGOS
Loe hongos están constituidos por tubos filamentosos llamados hifas. En muchas especies
las paredes perforadas, o septos, dividen las hifas en células que contienen uno o dos
núcleos. Los flujos protoplasmáticos a través de las aberturas de los septos proporcionan
nutrientes a las células que se almacenan en las paredes de las hifas en forma de
glucógeno. Las hifas crecen por alargamiento de las puntas. La masa completa de hifas
se llama micelio, primero se desarrolla por debajo de la tierra y después por encima.
Los hongos a diferencia de las bacterias son mucho mayores y contienen un núcleo,
vacuolas y mitocondrias, típicas de las células eucarióticas.

Los hongos son muy diversos, algunos son acuáticos, sin embargo la mayor parte de
hongos tienen hábitat terrestre, sea en la tierra o en materia vegetal muerta. Desempeñan
una función vital en la mineralización del carbono orgánico en la Naturaleza.

Algunos hongos son saprofíticos mientras que otros son parásitos de plantas, animales y
e1 hombre. Todos los hongos son órgano tróficos. Tienen requerimientos nutricionales
mucho más simples.

OBJETIVOS
- Evidenciar la existencia de hongos ambientales.
- Familiarizar al estudiante con las estructuras fúngicas.

MATERIALES
- Placas Petri con medio Sabouraud estériles.
- Colorantes: Azul de Tripán, o Azul de Lactofenol, y otros.
- Láminas portaobjetos.
- Lamini1las cubreobjetos.
- Asa micológica y estilete
- Microscopio.

PROTOCOLO
1.- Colocar las placas Petri a exposición al medio ambiente durante 5 a 10 minutos (quitar
la tapa).
2.- Incubar las placas a temperatura ambiente (22 ºC) por espacio de 7 a 10 dias.
3.- Elegir las colonias características de hongos para poder evaluarlas.
4.- Para el estudio macroscópico, anotar los siguientes aspectos:
- Tamaño de la colonia (en milímetros).
- Color de la colonia (en el anverso y en el reverso).
- Aspecto del Micelio: pulverulento, algodonoso, terroso, aterciopelado, glabro.
5.- Para el estudio Microscópico:
- Hacer un preparado con una porción de muestra y unas gotas de Azul de Tripán o Azul
de lactofenol.
- Cubrir con una laminilla y observar al microscopio con objetivos de menor y mayor
aumento.

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RESULTADOS
-Anotar las características culturales de las colonias de hongos.
- Distinguir los elementos constituyentes de los hongos, tales como micelio, órganos de
fructificación, etc.

CUESTIONARIO.-

1.- Señale que elementos estructurales permiten diferenciar un hongo de una bacteria.
2.- Señale algunas aplicaciones industriales de los hongos.

PRACTICA Nº 15
REACCION ANTIGENO-ANTICUERPO
PRUEBA DE AGLUTINACION EN PLACA DE ROSA DE BENGALA

El diagnóstico serológico se basa en la demostración de la presencia de anticuerpos

dirigidos frente a antígenos de la pared de la Brucella. Entre la segunda y la tercera
semana después del inóculo aparecen anticuerpos aglutinantes dirigidos frente al antígeno
lipopolisacárido, que son detectados mediante las pruebas de seroaglutinación y Rosa de
Bengala.
Posteriormente, aparecen anticuerpos con poca o nula capacidad aglutinante que son
detectados por la prueba de Coombs antibrucela. Su principal limitación es la incapacidad
para diferenciar con la suficiente sensibilidad y especificidad entre infección activa y
curada, ya que los anticuerpos suelen persistir durante un periodo prolongado tras la
recuperación clínica.
Esta prueba se trata de una Aglutinación en porta, utilizada como un método rápido de
SCREENING. Es muy sensible, siendo positiva en un 95-99% de los casos, guarda una
buena correlación con la Seroaglutinación.

Varios investigadores han señalado la alta sensibilidad y especificidad de la Rosa de

Bengala lo que unido a su fácil manipulación y rápida lectura hacen que la misma sea de
gran utilidad en el diagnóstico masivo de la brucelosis. De este modo se recomienda su
utilización en el programa de control y erradicación de la brucelosis por ser simple, fiel y
económica.

PROTOCOLO

Centrifugue las muestras de suero (1500 rpm x 5 min.), si es necesario.

Deposite en el centro del primer cuadrado superior izquierdo de la placa 30 ul de la
primera muestra.
Ocupe cuadrados de la placa en orden horizontal de izquierda a derecha para las muestras
siguientes.

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Coloque 30 ul del antígeno RB al lado de cada muestra de suero, evitando la mezcla.

Mezclar bien el antígeno y el suero, ocupando una superficie circular de 23 a 24 mm.
Girar la lámina durante 4 min., en un ángulo que no signifique desplazamiento de la
mezcla. Cuidar que todas las preparaciones logren rápidamente una mezcla homogénea.
Proceda a la lectura a los 4 min. exactos sobre el aglutinoscopio.
Se considerará negativa, una prueba que no presente aglutinación y la preparación tenga
un color rosa uniforme y translúcido al paso de la luz.
Se considerará como positiva, desde una prueba que presente aglutinación débilmente
perceptible con grumos muy finos, hasta aquellas de gruesos grumos, claras bien
definidas.

RESULTADOS
Los casos positivos se denotará con una cruz en caso de una débil aglutinación; dos o más
cruces si es que presenta grumos cada vez más gruesos y definidos

ANEXOS

MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

Agar nutritivo: Medio sólido, que se usa para cultivo de la mayoría de bacterias.
- Extracto de carne (3 g)
- Peptona (5 g)
- Agar (15 g)

Agar MacConkey: Medio sólido, selectivo para Gram (-) y diferencial entre bacterias
que utilizan lactosa y las que no.
- Peptona (17 g) fuente de nitrógeno
- Peptona proteosa (3 g) fuente de nitrógeno
- Lactosa (10 g) sustrato de prueba y selectivizante (medio diferencial)
- Sales biliares nº 3 (1,5g.) agente selectivo para Gram(-) (medio selectivo)
- Cloruro sódico (5 g) concentración normal, solo para el mantenimiento de la presión
osmótica
- Rojo neutro (0,03 g) indicador de pH
- Cristal violeta (0,001 g) inhibe enterobacterias (medio selectivo)
- Agar (13,5 g)
- Agua destilada (1000 ml)
pH final: 7,1

Agar SS (Salmonella-Shigella).
- Peptona (10 g)
- Lactosa (10 g) sustrato de prueba (medio diferencial)
- Sales biliares (8,5 g) agente selectivo (medio selectivo)
- Citrato sódico (10 g) sustancia protector
- Tiosulfato sódico (8,5 g) diferencia colonias que utilizan sulfato con los que utilizan
sulfhídrico (medio diferencial)
- Citrato férrico (1 g) indicador redox
- Verde brillante (0,0003 g) agente selectivo (medio selectivo)

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- Rojo neutro (0,025 g)

- Agar (12 g)
- Agua destilada (1000 ml)
pH final: 7,0

Agar Enterococcus.
- Triptosa (20 g) suplemento
- Extracto de levadura (5 g)
- Dextrosa (2g.) fuente de carbono
- Fosfato dipotásico (4 g) tampón
- Azida sódica (0,4 g) agente selectivo
- Cloruro trifenil tetrazólico (0,1 g) indicador redox (diferencial)
- Agar (10 g)
- Agua destilada (1000 ml)
pH final: 7,2

Agar Mueller Hinton.

- Infusión de carne (300 g) aporte de carbohidratos, aminoácidos, sales minerales... por
tanto, de similar función al extracto de levaduras
- Casaminoácidos (17,5 g) aminoácidos obtenidos a través de la hidrólisis de caseína
- Almidón (1,5 g) fuente de carbono
- Agar (17 g)
- Agua destilada (1000 ml)
pH final: 7,3

Medio Tres azúcares hierro (TSI). Triple Sugar Iron

- Extracto de carne (3 g)
- Extracto de levadura (3 g)
- Peptona (15 g)
- Cloruro sódico (5 g)
- Glucosa (1 g)
- Lactosa (10 g)
-Sacarosa (10 g)
- Sulfato ferroso (0,2 g)
- Tiosulfato sódico (0,3 g)
- Rojo fenol (0,024 g)
- Agar (20 g)
- Agua destilada (1000 ml)
pH final: 7,4

Agar Citrato de Simmons:

- Citrato sódico (2 g)
- NaCl (5 g)
- MgSO4 (0,2 g)
- NH4H2PO4 (1 g)
- K2HPO4 (1 g)
- Azul de bromotimol (0,08 g)
- Agar (15 g)

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- Agua destilada (1000 ml)

pH final: 6,9

Kligler Agar:
-Estracto de carne (3 g )
-Estracto de levadura (3 g )
-Peptona (15 g)
-Proteosa peptona (5 g )
-Lactosa (10 g )
-Dextrosa (1 g )
-Sulfato ferroso (0,2 g)
-Cloruro de sodio ( 5g )
-Tiosulfato de sódio ( 0,3 g)
-Agar ( !2 g)
-Rojo de Fenol ( 0,024 g )

PREPARACIÓN DE COLORANTES

1. Acido-Alcohol: (decolorante para tinción Ziehl-Neelsen)

o Ácido clorhídrico concentrado ...........................................................3 ml
o Etanol 95% .......................................................................................97 ml

2. Azul de metileno: Colorante de contraste para tinción de flagelos.

o Azul de metileno....................................................................................1 g
o Agua destilada..................................................................................100 ml

3. Azul de metileno de Loeffler: Tinciones simples.

o Solución de hidróxido potásico al 1%.................................................1 ml
o Azul de metileno, sol. saturada en etanol al 95%...............................30 ml
o Agua destilada..................................................................................100 ml

4. Colorante para esporas:

o Solución acuosa saturada de verde malaquita

5. Colorante para flagelos de Leifson:

o Solución A
 Fucsina básica ..............................................................................1,2 g
 Etanol 95%.................................................................................100 ml
o Solución B
 Ácido tánico.....................................................................................3 g
 Agua destilada............................................................................100 ml
o Solución C
 Cloruro sódico...............................................................................1,5 g
 Agua destilada............................................................................100 ml
Para preparar la solución de uso, se mezclan cantidades iguales de las soluciones A, B y
C y se guarda en frasco cerrado herméticamente en la nevera donde es estable durante
varias semanas.

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6. Eosina: Para observación de células sanguíneas.

o Eosina..................................................................................................0,3 g
o Ácido acético glacial.....................................................................0,025 ml
o Agua destilada..................................................................................100 ml

7. Fucsina diluida: Para tinción Gram y tinción simple.

o Fucsina fenicada de Ziehl-Neelsen.....................................................10 ml
o Agua destilada..................................................................................100 ml

8. Fucsina fenicada de Ziehl-Neelsen: Para tinción ácido-alcohol resistente.

o Fucsina básica........................................................................................1 g
o Etanol 95%.........................................................................................10 ml
o Fenol 5% en solución acuosa...........................................................100 ml

9. Hematoxilina: Para observación de células sanguíneas.

o Hematoxilina..........................................................................................2 g
o Agua destilada........................................................................................1 l

10. Lactofenol: Para preparaciones microscópicas en fresco de mohos.

o Ácido láctico.....................................................................................100 ml
o Fenol..................................................................................................100 g
o Glicerol.............................................................................................200 ml
o Agua..................................................................................................100 ml

11. Lactofenol al Azul Algodón: Para preparaciones en fresco y tinciones de mohos.

o Solución de azul algodón
 Sol. saturada de azul algodón (azul anilina soluble)..........................10 ml
 Glicerol...............................................................................................10 ml
 Agua...................................................................................................80 ml
Mezclar esta solución con lactofenol a partes iguales

12. Orceína A: Tinción de cromosomas.

o Orceína................................................................................................2 g
o Ácido acético...................................................................................45,8 ml
o Ácido clorhídrico 1 mol/l...................................................................8,3ml
o Agua................................................................................................45,8 ml

13. Orceína B: Tinción de cromosomas.

o Orceína................................................................................................2 g
o Ácido acético.....................................................................................55 ml
o Agua..................................................................................................55 ml

14. Safranina: Col. de contraste para tinción Gram (preferible a la fucsina) y esporas.
o Safranina.........................................................................................0,25 g
o Agua destilada..................................................................................100 m

15. Sudán III: Tinción específica de grasas.

o Alcohol etílico..................................................................................100 ml
o Sudán III.............................................................................hasta saturación

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Manual de Microbiología [Link]. Noemí A. Mayorga sánchez

16. Verde de metilo acético: Igual composición que la eosina (num. 6)

FORMULA Y PREPARACIÓN DE REACTIVOS USADOS EN LAS

DIFERENTES PRÁCTICAS DE LABORATORIO
1.- SOLUCIÓN DE AGUA OXIGENADA AL 10%
PREP.: Preparar antes de usarse. Colocar 1 ml de H2O2 en 9 ml de H2O destilada
2.- COLORANTE DE AZUL DE METILENO AL 5%. PREPARACIÓN:
Azul de metileno…………………………………………………………….. 5,0 g
Agua destilada……………………………………………………………….100 ml
3.- REACTIVOS DE LA TÉCNICA DE GRAM
A) COLORANTE CRISTAL VIOLETA. FÓRMULA:
Cristal violeta……………………………………………………………….. 2,0 g
Etanol al 95% ………………………………………………………………20,0 ml
Oxalato de amonio…………………………………………………………...0,8 g
Agua destilada……………………………………………………………... 80,0 ml
PREPARACIÓN: Disolver el cristal violeta en el etanol. Disolver el oxalato en el
agua. Mezclar las dos soluciones
B) SOLUCION DE LUGOL. FORMULA
Yoduro de potasio………………………………………………………….. 10,0 g
Agua destilada……………………………………………………………….20,0 ml
Yodo metálico……………………………………………………………….. 5,0 g
Etanol, c.s.p. ………………………………………………………………..100,0 ml
PREPARACIÓN: Disolver el yoduro de potasio en el agua. Agregar el yodo
metálico y disolver. Aforar a 100 ml con etanol
C) SOLUCIÓN DE ALCOHOL ACETONA. FORMULA
Acetona ………………………………………………………………….1 volumen
Etanol al 95%........................................................................................... 2 volúmenes
D) COLORANTE SAFRANINA. FORMULA
Safranina ……………………………………………………………………… 0,5 g
Agua destilada……………………………………………………………… 100,0 ml
PREPARACIÓN: Disolver la safranina en aproximadamente 20 ml de agua, luego
aforar a 100 ml con más agua.
4.- REACTIVOS DE LA TÉCNICA DE ZIEHL- NEELSEN
A) COLORANTE FUCSINA FENICADA. FORMULA:
Fucsina básica…………………………………………………………………….5,0 g

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Manual de Microbiología [Link]. Noemí A. Mayorga sánchez

Fenol ……………………………………………………………………………25,0 g
Etanol al 95%...................................................................................................... 50 ml
Agua destilada c.s.p. …………………………………………………………..500 ml
PREPARACIÓN: Colocar el fenol en 100 ml de agua destilada y calentar en baño a
ebullición. Añadir la fucsina básica y disolver. Añadir el etanol y mezclar. Aforar la
solución a 500 ml con agua destilada.
B) SOLUCIÓN DE ALCOHOL ÁCIDO. FORMULA
Ácido clorhídrico concentrado…………………………………………………3,0 ml
Etanol al 95% c.s.p………………………………………………………… 100,0 ml
PREPARACIÓN: Adicionar el ácido clorhídrico al etanol, lentamente y agitando
C) COLORANTE AZUL DE METILENO. FORMULA
Azul de metileno……………………………………………………………….. 5,0 g
Agua destilada ………………………………………………………….…… 100,0 ml
5.- MEZCLA SULFOCRÓMICA
Dicromato de potasio…………………………………………………………….20.0 g
Ácido sulfúrico concentrado…………………………………………………… 20,0 ml
Agua destilada c.s.p. ……………………………………………………….…..250,0 ml

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Manual de Microbiología [Link]. Noemí A. Mayorga sánchez

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