Observación e identificación de bacterias, coloración de Gram.
OBSERVACIÓN E IDENTIFICACIÓN MICROSCÓPICA DE BACTERIAS
COLORACION DE GRAM.
Amorocho G. Edie 0751895 Universidad del Valle - Facultad de
Urrego Juan Gabriel 0740473 Ingeniería
Urrego María Ángela 0531794 Escuela de Recursos Naturales y del
Ambiente Área de Ingeniería Sanitaria y
Ambiental.
1. RESULTADOS.
Esquema de los resultados observados en la coloración de gram.
Bacilos Gram. Negativos: coloración de Gram.
Los microorganismos que se observaron al microscopio fueron bacilos Gram. Negativos
ya que su coloración obtenida fue roja, además se encontraban en algunos casos muchas
agrupaciones de estos microorganismos.
En las tres pruebas realizadas para la identificación de la forma y pared celular de los
microorganismos aislados se obtuvo la misma información, es decir, bacilos
Gramnegativos.
Observación e identificación de bacterias, coloración de Gram.
PREGUNTAS
1 ♦ ¿Para qué se emplea el objetivo de inmersión?
2. ♦ ¿Se pueden cambiar los colorantes inicial y de contraste?
3. ♦ ¿En qué se diferencian los colorantes básicos de los colorantes ácidos, con
respecto a su aplicación en microbiología?
1. DISCUSION.
La tinción diferencial requiere más de un tipo de colorante y se utiliza para distinguir entre
varios tipos de células bacterianas. Una tinción diferencial típicamente consiste de tres
pasos principales: primero un colorante primario, el cual se utiliza para teñir a todas las
células en la tinción; enseguida un paso de decoloración, el cual remueve el colorante
solo de ciertos tipos de células y finalmente un colorante de contraste, el cual tiñe las
células recién decoloradas pero no tiene efecto sobre las células que aún retienen el
colorante primario. (Instituto de ecología UNAM, 2009)
La tinción propuesta por el médico danés Christian Gram en 1884, es una de las tinciones
diferenciales más utilizadas en bacteriología, que clasifica los cultivos bacterianos de
menos de 24 horas en Gram positivas y Gram negativas. La reacción de la tinción de
Gram se basa en la cantidad de peptidoglucano que se encuentra en las paredes
celulares de estas bacterias. Las bacterias Gram positivas tienen muchas capas de
peptidoglucano, las cuales a su vez, sostienen moléculas de ácido teicoico. . (Instituto de
ecología UNAM, 2009)
El cristal violeta (colorante catiónico) penetra en todas las células bacterianas (tanto Gram
positivas como Gram negativas). (Aulton Michael E.,2004)
El lugol está formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio), el cual está
presente para solubilizar el yodo. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble
en solución acuosa con el cristal violeta. (Aulton Michael E., 2004)
La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloración, ya que
en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se
decoloran, mientras que los Gram negativos sí lo hacen. (Aulton Michael E., 2004)
Para poner de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una coloración de
contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina.
Después de la coloración de contraste las células Gram negativas son rojas, mientras que
las Gram positivas permanecen azules. (Aulton Michael E., 2004)
La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la técnica. Sirve para hacer una
tinción de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas., las Gram
positivas se verán azul-violáceas y las Gram negativas, se verán rosas (si no se hizo la
tinción de contraste) o rojas (si se usó, por ejemplo, safranina) (Aulton Michael E.,2004)
Observación e identificación de bacterias, coloración de Gram.
Cuando otro colorante, usualmente safranina, se añade, las células Gram positivas siguen
de color azul-violeta mientras que las Gram negativas absorben el color rojizo de la
safranina. Al final del procedimiento de tinción, las células Gram positivas serán del color
del cristal violeta, o colorante primario, y las células Gram negativas serán del color de la
safranina que es el colorante de contraste. (Aulton Michael E., 2004)
La facultad de las células para tomar la coloración Gram no es propia de toda sustancia
viviente, sino que se limita casi en absoluto a hongos y bacterias. Así vemos que las
células de plantas y animales superiores no conservan la primera coloración; los mohos
se tiñen con cierta irregularidad; los gránulos de micelios propenden retener el colorante.
La reacción de Gram no es infalible ni constante; puede variar con el tiempo del cultivo y
el pH del medio, y quizá por otras causas. (Aulton Michael E., 2004)
Las siguientes bacterias de naturaleza Gram positiva, tiñen como Gram negativas:
Mycobacterias (están encapsuladas)
Mycoplasmas (no tienen pared)
Formas L (pérdida ocasional de la pared)
Protoplastos y esferoplastos (eliminación total y parcial de la pared,
respectivamente)
Algunos variables que pueden pueden ocasionar que se obtengan resultados no
deseables cuando se realiza una tinción de Gram:
I: Edad de la bacteria.
II: Errores del operador.
III: Uso de antibióticos
A pesar de la gran utilidad del la tinción de Gram, este método debe ser valorado con
precaución, ya que la reacción puede variar según la edad de las células y la técnica
empleada, por ella junto a la muestra deben tenerse controles con Gram positivas y Gram
negativas. (Aulton Michael E., 2004)
Microscopio óptico
Es un microscopio basado en lentes ópticas. También se le conoce como microscopio de
luz, microscopio fotónico (que utiliza luz o "fotones") o microscopio de campo claro. El
desarrollo de este aparato suele asociarse con los trabajos de Anton van Leeuwenhoek.
Los microscopios de Leeuwenhoek constaban de una única lente pequeña y convexa,
montada sobre una plancha, con un mecanismo para sujetar el material que se iba a
examinar (la muestra o espécimen). Este uso de una única lente convexa se conoce como
microscopio simple, en el que se incluye la lupa, entre otros aparatos ópticos.
Partes de un microscopio:
1. Ocular: lente situada cerca del ojo del observador. Capta y amplia la imagen
formada en los objetivos.
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2. Objetivo: lente situada cerca de la preparación. Amplía la imagen de ésta. lo que
significa que es muy importante este elemento del microscopio, es un elemento
vital que permite ver a través de los oculares
3. Condensador: lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación.
4. Diafragma: regula la cantidad de luz que entra en el condensador.
5. Foco: dirige los rayos luminosos hacia el condensador.
6. Tubo: es una cámara oscura unida al brazo mediante una cremallera.
7. Revólver: Es un sistema que coge los objetivos, y que rota para utilizar un objetivo
u otro.
8. Tornillos macro y micrométrico: Son tornillos de enfoque, mueven la platina hacia
arriba y hacia abajo. El micrométrico lo hace de forma rápida y el micrométrico de
forma lenta. Llevan incorporado un mando de bloqueo que fija la platina a una
determinada altura.
9. Platina: Es una plataforma horizontal con un orificio central, sobre el que se coloca
la preparación, que permite el paso de los rayos procedentes de la fuente de
iluminación situada por debajo. Dos pinzas sirven para retener el portaobjetos
sobre la platina y un sistema de cremallera guiado por dos tornillos de
desplazamiento permite mover la preparación de delante hacia atrás o de izquierda
a derecha y viceversa.
3. CONCLUSIONES.
1. ¿En qué se diferencian los colorantes básicos de los colorantes ácidos, con
respecto a su aplicación en microbiología?
Los colorantes básicos son aquellos en los cuales el agente que tiñe es el ion
cargado positivamente (el cromóforo) y se combinan con los componentes ácidos
como ADN y ARN, mientras que en los ácidos, el colorante es el ion cargado
negativamente y se combinan con los componentes básicos de la célula, como el
citoplasma; por lo tanto, los factores como fuerza iónica, composición del medio,
temperatura y pH afectan las tinciones.
Los colorantes más utilizados son los de tipo básico, ya que la mayor parte de las
células microbianas poseen cargas débilmente negativas en su superficie, lo cual
facilita su unión. Entre los colorantes básicos más comunes se encuentran la
safranina, la fucsina básica, el cristal violeta y el azul de metileno. Los colorantes
ácidos se unen a las partes de las células cargadas positivamente. Se utilizan para
teñir tejidos de animales infectados con microorganismos. Entre los más frecuentes
están la eosina, la fucsina acida y el rojo Congo. (ref.
[Link]
Microorganismos)
2. ¿Se pueden cambiar los colorantes inicial y de contraste?
Las células fijadas al calor sobre un portaobjetos se tiñen, primero con una solución
de cristal violeta (otros colorantes básicos no son tan efectivos) y son lavadas
después para quitar el exceso de colorante. En este estado, todas las células, tanto
las grampositivas como las gramnegativas, están teñidas de azul.
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El portaobjetos se cubre entonces con una solución de yodo-yoduro potásico. El
ingrediente activo es aquí el I2; el KI simplemente hace soluble el I2 en agua. El I2
entra en las células y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De
nuevo tanto las células grampositivas como las gramnegativas se encuentran en la
misma situación.
Se lleva a cabo después la decoloración, usando una mezcla de alcohol-acetona,
sustancias en las que es soluble el complejo I2-cristal violeta. Algunos organismos
(grampositivos) no se decoloran, mientras que otros (gramnegativos) lo hacen. La
diferencia esencial entre esos dos tipos de células está por tanto en su resistencia
a la decoloración; esta resistencia se debe probablemente al hecho de que en el
caso de bacterias gram-negativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente
lipídico y disuelve la membrana exterior de la pared de la célula (y también puede
dañar la membrana citoplásmica a la que se une peptidoglicano). La delgada capa
de peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la
célula se decolora. Las células grampositivas, a causa de sus paredes celulares
más espesas (tienen más peptidoglicano y menos lípido), no son permeables al
disolvente ya que éste deshidrata la pared celular y cierra los poros, disminuyendo
así el espacio entre las moléculas y provocando que el de complejo cristal violeta-
yodo quede atrapado dentro de la pared celular. Después de la decoloración las
células grampositivas son todavía azules, pero las gramnegativas son incoloras.
Para poner de manifiesto las células gramnegativas se utiliza una coloración de
contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la
fucsina básica. Después de la coloración de contraste las células gramnegativas
son rojas, mientras que las grampositivas permanecen azules.
(ref. [Link]
De acuerdo a lo anterior podemos concluir que no se puede cambiar el orden los
colorantes ya que tanto las grampositivas como las gramnegativas se verían del
mismo color inicialmente, en la decoloración puede que los colores queden
diferentes de los esperados y al aplicarle el colorante que debía ser inicial
obtendríamos colores deferentes a los esperados y no lograríamos una clara
diferenciación.
3. ¿la imagen se obtiene recta o invertida?
Invertida
4. Derecha a izquierda ¿en qué dirección se mueve la imagen?
Derecha
5. Hacia adelante ¿en qué dirección se mueve la imagen?
Hacia atrás.
6. ¿es el campo de observación mayor o menor?
Menor
7. ¿Es la iluminación más o menos brillante con el objetivo de menor aumento?
Más brillante
Observación e identificación de bacterias, coloración de Gram.
4. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
Aulton Michael E., Ciencia y diseño de formas farmacéuticas, 2° edición, Ed.
Elsevier España, 2004.
Instituto de ecología UNAM, Tinción diferencial de Gram, (2009), Disponible en:
[Link]
ariontes/alejandra/pr%c3%a1ctica%203%20tinci%c3%b3n%20de%[Link].
Visitado: 29 de octubre de 2009, hora: 5:00pm.
HTTP://[Link]/WIKI/MICROSCOPIO_%C3%B3PTICO Visitado: 29
de octubre de 2009, hora: 6:00pm.
