Cibertorio 2017 Polimorfismo de celiaquía p.
Análisis de adulteración en productos lácteos mediante ensayo
de PCR múltiplex sobre marcadores de DNA mitocondrial
(Práctica en laboratorio virtual Cibertorio)
Fundamento:
Las distintas especies de animales poseen secuencias diferentes en una buena parte de su genoma. Esta
diferencia puede aprovecharse para realizar un análisis molecular que demuestre el origen de una muestra. En
este ensayo se detecta la presencia de leche de vaca o de oveja añadida a muestras supuestamente de cabra,
utilizando PCR con cebadores específicos para regiones del DNA mitocondrial diferentes en esas tres
especies. A continuación, los segmentos amplificados se analizarán mediante electroforesis. Es posible así
detectar la adulteración de la leche de cabra con leche de oveja o de vaca.
Cómo comenzar:
El laboratorio virtual funciona dentro de una página web, por lo que debes comenzar abriendo el navegador
de internet en tu ordenador o tableta. Cualquier navegador moderno debería funcionar, siempre que tenga
activado JavaScript (se recomienda Firefox o Chrome).
Visita la página de Cibertorio en [Link]
Ensayo:
amplificación PCR múltiplex para determinar los alelos de HLA DQA1 y HLA DQB1
Objetivo:
Empleando cebadores específicos para el DNA mitocondrial de las tres especies (Bos taurus, Ovis aries,
Capra hircus), analizar el material de varias muestras. Se parte de varias muestras de DNA de productos
lácteos, se realiza la amplificación por PCR múltiplex y se separan los segmentos amplificados mediante
electroforesis, comparando sus resultados con los de muestras de DNA de referencia.
Pondremos en un tubo diferente cada muestra de DNA (3 controles, 3 muestras) y a todos ellos añadiremos
los cebadores deseados (cebadores directo, F, e inverso, R, diseñados para cada especie). Así podemos
detectar la presencia de mezclas de DNA en cada muestra problema.
Materiales virtuales:
Software:
• Laboratorio virtual de biología molecular “Cibertorio”, [Link]/lab/cibertorio/
Reactivos virtuales:
TM
• Muestras para análisis de productos lácteos (compradas en CygnusLab ), que contiene DNA mitocondrial de
referencia de cada especie y muestras procedentes de 3 quesos supuestamente de cabra.
TM
• Mezcla maestra para PCR 10x (CygnusLab PCR master mix ), que contiene
• DNA polimerasa Taq, 250 U/mL
• nucleótidos dATP, dGTP, dTTP, cCTP, 2 mM de cada uno
• MgCl2 15 mM
• tampón TAPS 125 mM de pH=8.5
• Parejas de cebadores o iniciadores de PCR, específicas para las tres especies: mtBosTaurus, mtOvisAries
mtCapraHircus.
TM
• Marcador de masa molecular de DNA Ladder2™ (de CygnusLab )
• Agua libre de nucleasas
• Puntas de pipeta amarillas, capacidad de 1 a 100 µL
• Acrilamida, bisacrilamida, TEMED, persulfato amónico, urea (para preparar el gel de poliacrilamida)
• Tampón de electroforesis TBE 0.5x (Tris-Borato-EDTA)
• Bromuro de etidio
• Colorante de carga de muestras en el gel (contiene azul de bromofenol, xileno-cianol y glicerol)
Instrumentación virtual:
• Micropipeta variable hasta 100 µL
TM
• Incubador con regulación de temperatura CygnusLab TempeMatic
TM
• Cubeta de electroforesis CygnusLab GelMatic Plus
TM
• Fuente de corriente continua CygnusLab 1000ZX (de 10 a 1000 V)
• Transiluminador ultravioleta (acoplado a la cubeta)
• Pantalla y gafas de seguridad protectoras contra UV
Angel Herráez doi:10.5281/zenodo.400581
Cibertorio 2017 Polimorfismo de celiaquía p.2
Procedimiento:
Comienza pulsando en el botón “Iniciar Cibertorio”. Tras unos segundos, aparecerá un aviso requiriendo que se
haga un pedido de muestras y cebadores; acéptalo.
1) Investiga la página del Catálogo en línea.
2) Pulsa el botón “Realizar un pedido”.
3) Selecciona las “Muestras para análisis de productos lácteos” y los 3 cebadores.
4) Al pie de página necesitarás proporcionar unos datos. (Esto es una simulación de una situación real, no es
importante lo que escribas en nombre y apellido pero sí es importante que la contraseña corresponda al centro).
5) Pulsa el botón “Enviar el pedido” y luego “Confirmar el pedido”. Espera a que se actualice
la pantalla y aparezca el laboratorio simulado (tubos, pipeta, etc.).
Uso de la micropipeta virtual
Para seleccionar el tubo sobre el que quieres actuar
debes pulsar sobre él con el ratón (no sobre la tapa ni
la etiqueta); se abrirá su tapa y la pipeta se desplazará
a él. Haciendo clic en el pulsador superior del émbolo
consigues que se desplace, expulsando o aspirando
alternativamente el contenido de la punta. El volumen
que se quiere pipetear se establece pulsando con el
ratón sobre la rueda de ajuste (mitad izquierda
disminuye, mitad derecha aumenta) o escribiendo en la
casilla del indicador de volumen (no pulses la tecla
Enter).
El intervalo de trabajo de la micropipeta es de 1 a
100 μL, en pasos de 1 μL.
Para evitar contaminación, se deben cambiar las
puntas cada vez que se cambia de muestra. La punta
se expulsa haciendo clic con el ratón sobre la palanca
expulsora de puntas o sobre el cubo de basura.
Se consigue una punta nueva haciendo clic sobre la
caja de puntas.
Posibles problemas:
Si, por algún error, necesitas empezar de nuevo con tubos limpios, pulsa sobre la imagen del recipiente a la
izquierda de la caja de puntas.
Tras pulsar con el ratón sobre un tubo, pipeta, etc., deja tiempo para que ocurra lo que sea. No seas
impaciente.
Al pulsar el émbolo de la pipeta, el cursor-mano no desaparece: mueve el puntero del ratón fuera de la pipeta.
Si quieres ver mejor el líquido que hay dentro de un tubo, puedes hacer que la pipeta salga del tubo pulsando
de nuevo en el tubo.
6) Dado que disponemos de muestras de DNA de referencia de cada especie con las que comparar,
realizaremos un experimento de tipo múltiplex. Esto quiere decir que en cada tubo de ensayo se
amplificarán por PCR simultáneamente todos los marcadores. Prepara las mezclas de reacción de este
modo:
• en los tubos 1 a 3, respectivamente, 10 µL de una de las muestras de DNA de referencia (diferente
en cada tubo: Bos, Ovis, Cap);
• en los tubos 4 a 6, 10 µL de DNA de una de las muestras de queso (distinta en cada tubo: m1, m2,
m3);
• en todos los tubos, 3 µL de la mezcla de reactivos para PCR (“PCR Mix”);
• en todos los tubos, 1 µL de cada una de las parejas de cebadores (es decir, las tres mezcladas en
todos los tubos):
• completa con agua el volumen en cada tubo hasta un total de 30 µL.
Antes de empezar a pipetear es conveniente que hagas una tabla en la que planifiques los reactivos y los
volúmenes que vas a poner en cada tubo.
7) Pon en marcha la reacción de PCR pulsando en el botón “incubar” (está en la parte central inferior, bajo
el cronómetro). Transcurrido el tiempo virtual requerido, se habrán completado las reacciones.
Dependiendo de la configuración del laboratorio, puede que aparezca un mensaje que te informa de lo que se ha
añadido en cada tubo; verifica que coincide con lo que pretendías.
8) En el menú principal de Cibertorio, selecciona el módulo “Laboratorio de
electroforesis”. Elige el gel de tipo poliacrilamida 5%. Pulsa el
botón “autocarga”, que hará que las muestras preparadas en la digestión
anterior se transfieran a los pocillos del gel virtual. En el pocillo nº 13 se
cargará automáticamente una mezcla de patrones de tamaño.
Angel Herráez doi:10.5281/zenodo.400581
Cibertorio 2017 Polimorfismo de celiaquía p.3
Los pocillos tras la carga se ven azules debido a los colorantes añadidos rutinariamente a las
muestras (azul de bromofenol y xileno-cianol), para facilitar que se vean primero éstas y luego
el frente de avance. También se ha añadido un agente denso ([Link]. glicerol, sacarosa o ficoll)
que hace que la muestra se deposite al fondo del pocillo.
TM
La “autocarga” es una característica única de los geles CygnusLab ; en la vida real las
muestras se deben transferir laboriosamente a mano desde los tubos a los pocillos con una
micropipeta.
9) Ajusta en la fuente de corriente el voltaje a 200 voltios y el tiempo a 2 horas virtuales. Conecta la
corriente para comenzar la electroforesis. Mientras progresa, puedes encender la luz UV (asegúrate de
tener puestas tus gafas o careta virtuales de protección) y apagar las luces de la habitación virtual para ver
cómo va avanzando el DNA y separándose las bandas.
En cualquier electroforesis, si la fuente de corriente de la que dispones no indica la intensidad
(miliamperios), es importante que te asegures de que está circulando la corriente. Observa cómo de ambos
electrodos se desprenden burbujas, efecto de la electrólisis del tampón. También verás que las bandas
azules de ambos colorantes avanzan por el gel (al igual que lo hacen las del DNA, si enciendes la luz UV).
Si se usan voltajes superiores, las muestras avanzarán más rápido por el gel, pero los voltajes elevados
producen corriente de alta intensidad y un calentamiento excesivo del gel que, aparte de afectar a la
muestra (por ej., desnaturalizando el DNA), puede llegar a fundir la agarosa o alterar la estructura de la
TM
poliacrilamida. A diferencia de los geles reales, los geles CygnusLab nunca se funden, por lo que el
único inconveniente de usar un voltaje muy alto puede ser que las muestras se pierdan por la parte inferior
del gel antes de que puedas reaccionar.
10) Una vez completada la electroforesis, dibuja un esquema de cómo han quedado las bandas (puedes
capturar una imagen usando la cámara digital incluida en la cubeta). Interpreta los resultados obtenidos: ¿cuál
es la procedencia de la leche de cada muestra? ¿Es leche de cabra o se detecta la adulteración con
algo de vaca u oveja?
Angel Herráez doi:10.5281/zenodo.400581
