ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DE CHIMBORAZO

FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA AMBIENTAL

INFORME DE LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

PRÁCTICA #6
TEMA. EXTRACCIÓN DE ADN
1.- INTEGRANTES

Paola Moreira
Jenny Erazo
Diego Silva

2.- CURSO:

 QUINTO “B”

3.- FECHA DE REALIZACIÓN DE LAPRÁCTICA:

 23/01/2018

4.-FECHA DE ENTREGA DEL INFORME:

 30/01/2018

RIOBAMBA – ECUADOR
1. OBJETIVOS

1.1 OBJETIVO GENERAL.

 Extraer ADN de un tejido animal.

1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.

 El objetivo fundamental de esta práctica es utilizar unas sencillas

técnicas para poder extraer ADN de un tejido animal y por el aspecto
que presenta, confirmar su estructura fibrilar.

 Comprobar que a partir de la longitud enorme de las fibras también

se confirma que en el núcleo el ADN se encuentra replegado.

2. MARCO TEÓRICO

ADN

Ácido desoxirribonucleico (ADN), material genético de todos los organismos celulares y casi
todos los virus. El ADN lleva la información necesaria para dirigir la síntesis de proteínas y la
replicación. Se llama síntesis de proteínas a la producción de las proteínas que necesita la célula
o el virus para realizar sus actividades y desarrollarse.

Los Ácidos nucleicos son biopolímeros de elevado peso molecular, formados por otras
subunidades estructurales o monómeros, denominados nucleótidos.

El descubrimiento de los ácidos nucleicos se debe a Meischer (1869), el cual trabajando con
leucocitos y espermatozoides de salmón, obtuvo una sustancia rica en carbono, hidrógeno,
oxígeno, nitrógeno y un porcentaje elevado de fósforo. A esta sustancia se le llamó en un
principio nucleina, por encontrarse en el núcleo. (Universidad de Murcia, 2012)

Los nucleótidos están formados por la unión de:

a) Una pentosa, que puede ser la D-ribosa en el ARN; o la D-2- desoxirribosa en el ADN

b) Una base nitrogenada, que puede ser:

- Púrica, como la Guanina (G) y la Adenina (A)

- Pirimidínica, como la Timina (T), Citosina (C) y Uracilo (U)

c) Ácido fosfórico, que en la cadena de ácido nucleico une dos pentosas a través de una unión
fosfodiester. Esta unión se hace entre el C-3´ de la pentosa, con el C-5´ de la segunda.

A la unión de una pentosa con una base nitrogenada se le llama nucleósido Esta unión se hace
mediante un enlace β -glucosídico.

- Si la pentosa es una ribosa, tenemos un ribonucleósido. Estos tienen como bases nitrogenadas
la adenina, guanina, citosina y uracilo.
- Si la pentosa es un desoxirribosa, tenemos un desoxirribonucleósido. Estos tienen como bases
nitrogenadas la adenina, citosina, guanina y timina.

ADN
Está formado por la unión de muchos
desoxirribonucleótidos. La mayoría de las
moléculas de ADN poseen dos cadenas anti
paralelas (una 5´-3´y la otra 3´-5´) unidas
entre sí mediante las bases nitrogenadas,
por medio de puentes de hidrógeno.

La adenina enlaza con la timina, mediante dos puentes de hidrógeno, mientras que la citosina
enlaza con la guanina, mediante tres puentes de hidrógeno.

El ADN es el portador de la información genética, se puede decir por tanto, que los genes están
compuestos por ADN

Cuando la temperatura alcanza el punto de fusión del ADN, la agitación térmica es capaz de
separar las dos hebras y producir una desnaturalización. Este es un proceso reversible, ya que al
bajar la temperatura se puede producir una renaturalización. En este proceso se rompen los
puentes de hidrógeno que unen las cadenas y se produce la separación de las mismas, pero no
se rompen los enlaces fosfodiester covalentes que forman la secuencia de la cadena.

La desnaturalización del ADN puede ocurrir, también, por variaciones en el pH.

ESTRUCTURAS DEL ADN

Se pueden definir distintas estructuras que adopta el ADN: primaria, secundaria y terciaria,
haciendo una analogía con las estructuras de las proteínas.
Estructura primaria: La estructura primaria del ADN está determinada por la secuencia en que
se encuentran ordenadas las cuatro bases sobre la "columna" formada por los nucleósidos:
azúcar + fosfato. Este orden es lo que se transmite de generación en generación (herencia).

Estructura secundaria: corresponde al modelo postulado por Watson y Crick: la doble hélice. Las
dos hebras de ADN se mantienen unidas por los puentes hidrógenos entre las bases. Los pares
de bases están formados siempre por una purina y una pirimidina, que adoptan una disposición
helicoidal en el núcleo central de la molécula. En cada extremo de una doble hélice lineal de
ADN, el extremo 3'-OH de una de las hebras es adyacente al extremo 5'-P (fosfato) de la otra. En
otras palabras, las dos hebras son anti paralelas es decir, tienen una orientación diferente.

Estructura terciaria: es la forma en que se organiza la doble hélice. En Procariotas, así como en
las mitocondrias y cloroplastos eucariotas el ADN se presenta como una doble cadena (de cerca
de 1 mm de longitud), circular y cerrada, que toma el nombre de cromosoma bacteriano. El
cromosoma bacteriano se encuentra altamente condensado y ordenado (superenrollado).

En los virus, el ADN puede presentarse como una doble hélice cerrada, como una doble hélice
abierta o simplemente como una única hebra lineal. En los Eucariotas el ADN se encuentra
localizado en el núcleo, apareciendo súper enrollado y asociado con proteínas llamadas
histonas. Durante la mitosis, en las células eucariotas la cromatina se enrolla formando
cromosomas, que son complejas asociaciones de ADN y proteínas. (Argenbio, 2007).

EL ADN COMO ALMACÉN DE INFORMACIÓN

La molécula de ADN es un almacén de información que se trasmite de generación en generación,

conteniendo toda la información necesaria para construir y sostener el organismo en el que se
encuentra.
Las principales implicadas en este proceso son las proteínas. Estas pueden ser estructurales
como las proteínas de los músculos, cartílagos y pelo o bien funcionales como las de la
hemoglobina, o la gran cantidad de enzimas del organismo.

La función principal de la herencia es la transmisión del ADN, una especie de receta para la
fabricación de proteínas. En ocasiones, la modificación del ADN (mutaciones) provoca un cambio
en el funcionamiento de la proteína, que puede resultar beneficioso, perjudicial o
intrascendente.

El ADN de un organismo podría clasificarse en dos: el que codifica las proteínas y el que no
codifica. En muchas especies de organismos, sólo una pequeña fracción del total de la secuencia
del genoma codifica proteínas. Por ejemplo, sólo un 3% del genoma humano consiste en
secuencias (conocidas como exones) que codifican proteínas. La función del resto no se conoce
con certeza hasta el momento, aunque se sabe que algunas secuencias se unen a ciertas
proteínas que tienen un papel importante en el control de los mecanismos de transcripción y
replicación.
Estas secuencias se llaman frecuentemente reguladoras, y se están desarrollando muchas
investigaciones en esta área ya que sólo se ha identificado una pequeña fracción de ellas. La
presencia de esa gran cantidad de ADN no codificante en genomas eucarióticos y las diferencias
en tamaño de los genomas representan aún una incógnita que hay que resolver. (Murriel, 2012).

3. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS

MATERIALES REACTIVOS EQUIPOS

 1 varilla de vidrio  Alcohol del 96 %

 1 mortero  Cloruro sódico 2M ------------------
 1 vaso de  SDS
precipitación de  Arena
250 mL
 1 pipeta
 1 probeta
 gasas

4. GRÁFICOS.
5. PROCEDIMIENTO

1. Se tritura medio higadito de pollo en un mortero. Se añade arena para que al triturar se
pueda romper las membranas y queden los núcleos sueltos.
2. Se añade al triturado, 50 centímetros cúbicos de agua. Se remueve hasta hacer una
especie de papilla o puré.
3. Se filtra varias veces sobre una tela (o gasa) para separar los restos de tejidos que hayan
quedado por romper.
4. Se mide el volumen del filtrado con una probeta.
5. Se añade un filtrado un volumen igual de cloruro sódico 2M. Con esto conseguimos
producir el estallido de los núcleos para que queden libres las fibras de cromatina.
6. A continuación se añade un centímetro cubico de SDS. (Nota: si no se dispone de este
producto puede sustituirse por un detergente de vajillas, tipo MISTOL o similar). La
acción de este detergente es formar un complejo con las proteínas y separarlas del ADN.
Así nos quedara el ADN libre de las proteínas que tiene asociadas.
7. Se añade mediante una pipeta 50 centímetros cúbicos de alcohol de 96 %. Hay que
hacerlo de forma que el alcohol resbale por las paredes del vaso y se formen dos capas.
En la interface, precipita el ADN.
8. Se introduce una varilla de vidrio e ir removiendo en la misma dirección. Sobre la varilla
se van adhiriendo unas fibras blancas, visibles a simple vista, que son el resultado de la
agrupación de muchas fibras de ADN.

6. OBSERVACIONES

 En la práctica de laboratorio extracción del ADN animal, se identificó y se obtuvo lo

siguiente:

 Al extraer el DN del tejido animal, del hígado de pollo el cual se encuentra en el

interior del núcleo celular, disperso y muy replegado, unido a proteínas para formar
la cromatina, donde fue necesario homogenizar el tejido y romper las células para
separar el núcleo además de la envoltura nuclear para liberar su contenido.

 Se separó el ADN DE LAS proteínas que lo protegen Y SE PRECIPITO PARA ETRAELO

DE LA SOLUCIÓN. Una vez realizado esto el ADN iba apareciendo poco a poco en la
interface agua-alcohol e forma de grumos blancos. Es así que se obtuvieron
finalmente hebras blancas que corresponden a miles de fibras de ADN.
Mortero de cerámica con triturado de
hígado de pollo con arena y un volumen de
agua de 25 mL, se puede ver que se trituro
hasta tener una mescla pastosa a manera de
puré, la mescla presenta color vino.

Al triturar el hígado del pollo se vio que es

más fácil hacerlo agregando arena de rio
para que ayude estabilizar el material. Luego
de eso se agrega el agua y se filtra en un vaso
de precipitación se mide el volumen y se
agrega un equivalente de solución de NaCl
2M, también SDS y alcohol al 96%.

Gasa colocada sobre el vaso de precipitación

que hace la función de tamiz por donde se
filtra la mescla y con ayuda de la varilla de
vidrio se remueve para acelerar el filtrado, la
gasa se mancha con el color característico de
la mescla y retiene los trozos de hígado

Vaso de precipitación resultado de haber

terminado la práctica, se puede observar la
separación en capas, la parte coloreada y
sólida se precipita, mientras que en la
superficie se ve una soluciona algo
gelatinosa con fibras blanquecinas

Varilla de vidrio cubierta con finas fibras de

ADN que se adhirieron al remover la mescla,
presentan color blanco cremoso.
7. CONCLUSIONES

 Se utilizó una sencilla técnica para poder extraer el ADN como es mediante la
trituración del Hígado de pollo, se añadió sustancias que después nos
permitieron observar la estructura fibrilar que presenta.

 Se confirmó que en el núcleo el ADN se encuentra replegado a partir de la

observación de las fibras enormes que se lograron diferenciar al final de la
práctica.

8. CUESTIONARIO

1. ¿Cuál es el objetivo de añadir arena al hígado triturado?

Se añade arena para triturar el tejido de mejor manera y romper las células del tejido así como
liberar otras, para que de esta manera estén expuestas a la acción del detergente y se dé la
ruptura de las membranas liberando los núcleos a la solución. (Schlötterer 2004).

2. ¿Qué se produce al añadir cloruro sódico?

Sé añade un volumen de solución salina para producir el estallido de los núcleos libres,
quedando libres las fibras de cromatina, esto se justifica porque las cadenas de ADN están
cargadas negativamente, la función de los iones salinos es minimizar la repulsión entre hebras
de DNA, generando un efecto de apantallamiento frente a estas cargas, permite así la disolución
del ADN y extracción de la célula. (Nasón 2009, Travaglini 2012, Sambrook et al. 2013, Sinden
2009).

3. ¿Cuál es la acción el detergente?

La función de detergente tiene que ver con la destrucción de las membranas celulares del tejido
que estamos manipulando, en nuestro caso el hígado de pollo, el detergente disuelve las grasas,
que son sustancias que están en gran cantidad constituyendo la membrana plasmática y nuclear
de las células. Al romperse las membranas celulares, la cadena de ADN es liberado al exterior
donde el detergente formara un complejo con las proteínas, separándolas del ADN. Este mismo
efecto lleva a cabo el SDS. (Guinn 2000, Dundass et al. 2008).

4. ¿Cómo comprobamos que el ADN se encuentra replegado?

Al finalizar la práctica se puede visualizar una interface donde el ADN se encuentra en la

superficie con un aspecto viscoso, con una barrila de vidrio se enrolla las hebras del ADN y se
puede visualizar a simple vista largas cadenas de ADN lo que nos dice que en el núcleo, estas
cadenas deben estar muy compactadas o replegadas. (Stulnig y Amberger 2006).
9. RECOMENDACIONES

 Triturar el hígado lo más que se pueda para que al final se puedan ver de mejor
manera las fibras.

 Utilizar la arena para facilitar la triturada.

 El momento del filtrado asegurarse de que no pase la arena, de ser necesario

filtrar varias veces.

10. BIBLIOGRAFÍA

1. B.R. Glick y J.J. Pasternak ( 2013). Molecular Biotechnology: principles and applications of recombinant
DNA. 3ª Edición. ASM Press. Pag: 123 – 150.

2. J. Perera, A. Tormo Garrido, J.L. Garcia.(2015). Ingenieria genetica vol.I. Preparacion, analisis,
manipulacion y clonaje de DNA. 2da. Ed. Blackwell Science. Pag: 23 – 60.

3. L.G. Davis, M.K. Dibner, J.F. Battey. (2011) Basic Methods in Molecular Biology. 1ra Ed. Editorial
[Link]: 3004 -319.

REFERENCIAS:

1. Argenbio. (20 de Julio de 2007). PQ Bio. Nature Reviews 5: 63-69.

2. Murriel, V. (Abril de 2012). Universidad de Valencia . Journal of Clinical

Microbiology 43: 4830-4833.

3. Universidad de Murcia. (03 de Enero de 2012). Universidad de Murcia . Sinauer

Associates, Inc. Publishers. Massachusetts, [Link].

4. Schlötterer. (29 de Enero de 2004). Evaluación de cuatro métodos de extracción del

ADN. European Molecular Biology Organization 18: 4689–4699.

5. Nasón, Travaglini, Sambrook et al, Sinden. (23 de Febrero de 2013). Principios de

Bioquímica, Nucleic Acids Research 3: 2303-2308.

6. Guinn, Dundass et al. (01 de Marzo de 2008).Técnicas de bioquímica aplicada.

Revista Cubana de Medicina Tropical 56: 208-13

7. Stulnig y Amberger.(2006). (09 de Octubre de 2011). Comparación entre 5 métodos

para la extracción de ADN de triatomíneos: su utilización en la técnica de ADN
polimórfico amplificado al azar. Plant Physiology 41: 689-695.