PROYECTO MEJORA DE LAS ECONOMÍAS

REGIONALES Y DESARROLLO LOCAL

TÉCNICAS Y PRÁCTICAS
DE LABORATORIO PARA
EL ANÁLISIS DE ACEITE
DE OLIVA VIRGEN

CUADERNO TECNOLÓGICO Nº 23
Autor:
María Luisa Ruiz Domínguez
Experto en análisis físico-químico y
sensorial
en Aceite de oliva virgen

Diciembre de 2015
PROYECTO MEJORA DE LAS ECONOMÍAS PROYECTO MEJORA DE LAS ECONOMÍAS
REGIONALES Y DESARROLLO LOCAL REGIONALES Y DESARROLLO LOCAL

Delegación de la Comisión Europea en Argentina

Ayacucho 1537
Ciudad de Buenos Aires
Teléfono (54-11) 4805-3759 TÉCNICAS Y PRÁCTICAS
Fax (54-11) 4801-1594
DE LABORATORIO PARA
Instituto Nacional de Tecnología Industrial
EL ANÁLISIS DE ACEITE
Gerencia de Cooperación Económica e Institucional
Avenida General Paz 5445 - Edificio 2 oficina 212
DE OLIVA VIRGEN
Teléfono (54 11) 4724 6253 | 6490
Fax (54 11) 4752 5919
CUADERNO TECNOLÓGICO Nº 23
Autor:
María Luisa Ruiz Domínguez
Experto en análisis físico-químico y sensorial
en Aceite de oliva virgen

Diciembre de 2015

www.ue-inti.gob.ar
CONTACTO
Información y Visibilidad: Lic. Gabriela Sánchez
[email protected]
ÍNDICE 4.3 Otros métodos analíticos..................................................................................................... 64
4.3.1 Determinación de la estabilidad oxidativa mediante Rancimat
4.3.2 Determinación del contenido en polifenoles totales
4.3.3 Determinación de biofenoles de los aceites de oliva por HPLC
1. PRESENTACIÓN................................................................................................................................. 7
5. PARÁMETROS DE CALIDAD DE LOS MÉTODOS DE ENSAYO DE ACUERDO
2. RESUMEN.......................................................................................................................................... 9
A LA NORMA ISO 17025............................................................................................................... 68
3. INTRODUCCIÓN............................................................................................................................... 10 5.1 Estudio de validación de un método de ensayo............................................................... 68
3.1 La olivicultura......................................................................................................................... 10 5.2 Control de calidad de un método de ensayo..................................................................... 69
3.1.1 Origen y distribución
3.1.2 La olivicultura en Argentina 6. DOCUMETACIÓN DE REFERENCIA............................................................................................... 71
3.2 La aceituna, el aceite y su composición................................................................................13
3.3 La calidad del aceite de oliva..................................................................................................16
3.3.1 Clasificación de los aceites de oliva en función de la calidad
3.3.2 Control de calidad de los aceites de oliva
3.4 Factores que influyen en la calidad del aceite de oliva.......................................................18
3.4.1 Influencia de los factores agronómicos sobre la calidad del aceite de oliva
3.4.2 Influencia de los factores relacionados con el proceso de elaboración sobre la
calidad del aceite de oliva
3.4.3 Influencia de los factores relacionados con el almacenamiento en bodega, el
envasado y la comercialización sobre la calidad de los aceites de oliva
4. METODOLOGÍA DE ANÁLISIS DE LOS ACEITES DE OLIVA Y ORUJO DE OLIVA.......................... 26
4.1 Parámetros de calidad.......................................................................................................... 26
4.1.1 Determinación de los ácidos grasos libres
4.1.2 Determinación del Índice de Peróxidos
4.1.3 Prueba espectrofotométrica en el UV
4.1.4 Análisis sensorial del aceite de oliva virgen
4.1.5 Determinación del contenido en los esteres etílicos y ceras
4.2 Parámetros de pureza.......................................................................................................... 40
4.2.1 Determinación de la composición de esteres metílicos de los ácidos grasos
y los isómeros trans mediante cromatografía de gases con columna capilar.
4.2.2 Determinación de la composición y del contenido de esteroles y dialcoholes
triterpénicos mediante cromatografía de gases con columna capilar.
4.2.3 Determinación del contenido de alcoholes alifáticos mediante cromatografía de
gases con columna capilar.
4.2.4 Determinación de los estigmastadienos en los aceites vegetales
4.2.5 Determinación de la diferencia entre el contenido real y el contenido teórico en
triglicéridos con ECN 42.
INDICE DE TABLAS Y FIGURAS ABREVIATURAS

Figura 1 - Distribución porcentual de la superficie mundial de olivar.

Figura 2 - Distribución porcentual de la composición de la aceituna. CG Cromatografía de Gases
Figura 3 - Valor porcentual de los factores condicionantes de las características HPLC Cromatografía de Líquidos de alta resolución
cualitativas del aceite de oliva. PA Calidad para análisis
Figura 4 - Diagrama de flujo en la obtención de aceites de oliva. HMDS Hexametildisilazano
Figura 5 - Esquema decisiones Aceite virgen extra. TMCS Trimetilclorosilano
Figura 6 - Esquema decisiones Aceite virgen.
Figura 7 - Inicio reacción de neutralización de los ácidos grasos libres.
Figura 8 - Final reacción de neutralización de los ácidos grasos libres.
Figura 9 - Exceso en la adición de solución de KOH 0.1N.
Figura 10 - Fases de la valoración con Tiosulfato sódico 0.01N.
Figura 11 - Sala de cata y cabina individual preparada para la cata.
Figura 12 - Cromatografía de Gases Bruker.
Figura 13 - Esquema de decisiones para determinar la pureza de aceites de
oliva vírgenes.
Figura 14 - Capsulador, microvial y vial de cromatografía. Matraces.
Figura 15 - Batería de mantas calefactoras.
Figura 16 - Batería de embudos de decantación.
Figura 17 - Aplicador de placa Linomat.
Figura 18 - Rotavapor y desecador.
Figura 19 - Campana de vacio con Tª.
Figura 20 - Cromatógrafo de Gases Varian.
Figura 21 - Elución al vacio y elución manual .
Figura 22 - Equipo Rancimat para determinación de la estabilidad oxidativa.
Figura 23 - Cromatógrafo de Líquidos (HPLC).

Tabla 1 - Composición mayoritaria de la aceituna en función de la parte del fruto.

Tabla 2 - Composición de ácidos grasos del aceite de oliva.
Tabla 3 - Valores límites para los parámetros químicos que clasifican los aceites
por categorías de calidad.
Tabla 4 - Tiempos de retención relativos de los esteroles del aceite de oliva.
1. PRESENTACIÓN

La Unión Europea y el INTI firmaron un convenio de financiación destinado a mejorar

la competitividad de las miPyMEs del norte argentino acercando respuestas tecnológicas
apropiadas al nuevo entorno productivo industrial. Los responsables de la ejecución del
Proyecto “Mejora de las Economías Regionales y Desarrollo Local” son el Instituto Nacio-
nal de Tecnología Industrial (INTI), en representación del Gobierno Nacional, y la Delegación
de la Unión Europea en Argentina.

Durante más de medio siglo, el INTI ha construido capacidades profesionales e in-

fraestructura tecnológica de relevancia, que lo posicionan hoy como actor importante para
aportar innovación tecnológica aplicada a los procesos productivos de toda la economía y
para el desarrollo de soluciones industriales, que incrementen la productividad y la com-
petitividad de la industria nacional.

Con la ejecución de este proyecto, se busca acercar la tecnología y las capacidades

técnicas a las regiones de menor desarrollo relativo del país, poniendo a disposición de
las miPyMEs y Pymes los medios para satisfacer las demandas de mejora de eficiencia
y calidad de sus productos y/o servicios, para dar un salto cualitativo en cada una de las
provincias del NOA y NEA.

Por tanto, a través de un diagnóstico y evaluación de necesidades tecnológicas, hecho

en articulación con los gobiernos provinciales, se diseñó un plan de acción sectorial que
se implementó entre el 2011 y el 2015, en cinco sectores industriales determinados como
prioritarios: industrialización de alimentos, curtiembre, textil, y metalmecánica junto a la
gestión medioambiental, como eje transversal a los sectores industriales anteriores.

El proyecto Mejora de las Economías Regionales y Desarrollo Local surgió como par-
te de las acciones de vinculación internacional del INTI, en donde la cooperación técnica
con organismos públicos y privados del mundo -presentes en el campo tecnológico- fa-
vorecen el intercambio de conocimientos como elemento fundamental para el desarrollo
industrial local.

En esa dirección, uno de los componentes de este proyecto fue la convocatoria de es-
pecialistas en diversas temáticas, para cumplir con misiones de trabajo en nuestro país. El
objetivo de cada misión es brindar capacitaciones específicas a técnicos de las provincias
norteñas, de acuerdo con la especialidad de cada experto, a grupos de trabajo de Centros
Regionales de Investigación y Desarrollo, así como a Unidades Operativas que conforman
la red INTI, y brindar asistencia técnica a las miPyMEs que acompañen el desarrollo de
las actividades del proyecto. Además, mantienen entrevistas con actores locales, quienes
constituyen un recurso esencial y estratégico para alcanzar los objetivos planteados.

TÉCNICAS Y PRÁCTICAS DE LABORATORIO PARA 9

EL ANÁLISIS DE ACEITE DE OLIVA VIRGEN
 2. RESUMEN
La publicación que se dispone a conocer ha sido concebida como resultado de una
misión técnica de uno de los expertos intervinientes intervinientes en este proyecto. Los
expertos, al finalizar su trabajo en el país, elaboran un informe técnico con recomenda- Este Cuaderno Tecnológico trata de recopilar la información presentada durante la
ciones para el fortalecimiento del sector para el cual fue convocado y que da lugar a la misión realizada en Argentina dentro del Proyecto "Mejora de las Economías Regionales y
presente producción, publicada con el propósito de divulgar los conocimientos a partir de Desarrollo local en la República Argentina" financiado por la Unión Europea, como comple-
las necesidades detectadas y los resultados del intercambio efectivo hecho en territorio, mento al informe final realizado.
conjugando los basamentos teóricos con la realidad local.
Pretende ser un manual de consulta para los técnicos del INTI, de forma particular
Dra. Graciela Muset para los técnicos del centro INTI La Rioja, en su misión de puesta en marcha de un labora-
Directora del Proyecto Mejora de las Economías Regionales y Desarrollo Local torio para análisis de aceite de oliva, cuyo objetivo es ser centro de referencia de la zona,
realizando labores de asesoramiento y apoyo técnico al sector olivícola de la región.

En este cuaderno se presenta información de los métodos de análisis del Consejo

Oleícola Internacional y la Unión Europea, tanto para el control de calidad del aceite de
oliva como para la determinación de genuinidad del mismo, que se han trabajado durante
la misión. Se pretende dar pautas concretas y concisas que faciliten su puesta a punto
en el laboratorio y la elaboración de los correspondientes procedimientos normalizados
de trabajo, incluyendo información de referencias comerciales y material de laboratorio
a emplear.

Asimismo, el cuaderno incluye la información que se ha transmitido al personal de

INTI, las empresas, instituciones y miembros del sector, con objeto de profundizar en el
conocimiento del aceite de oliva virgen, tratando no solo los aspectos relacionados con la
metodología analítica y su aplicación sino también todos aquellos factores del cultivo y la
elaboración que van a ser determinantes de la obtención de un producto de alta calidad.

Este documento ha sido realizado con la ayuda financiera de la Comunidad Europea. Su contenido es
responsabilidad exclusiva del autor y, en ningún caso, se debe considerar que refleja opinión oficial de la Unión
Europea.

10 INTI PROYECTO MEJORA DE LAS ECONOMÍAS TÉCNICAS Y PRÁCTICAS DE LABORATORIO PARA 11

UE REGIONALES Y DESARROLLO LOCAL EL ANÁLISIS DE ACEITE DE OLIVA VIRGEN
 3. INTRODUCCIÓN Marruecos Grecia
8,9 % 8,9 %

Turquía Tunez
8,8 % 17,5 %

3.1 LA OLIVICULTURA Siria

6,9 %

3.1.1 Origen y distribución Argelia

3,4 %
El origen del olivo se remonta al 3000-4000 a.C., en Asia Menor y el Oriente Próximo, su Italia
12,7 %
cultivo dio lugar a una de las primeras actividades postrecolectoras de la humanidad, que Resto
11,7 %
estableció lo que se denominó centros de domesticación del olivo al este de Siria e Irán y
en Nubia. En un principio fue introducido en la Península Ibérica por los fenicios, en el siglo España
IX a.C., que comerciaban en diversos puertos del Mediterráneo. La difusión del cultivo se 22,3 %
realizó de oriente a occidente a través de las dos orillas del Mediterráneo, llegando a ser Figura 1. Distribución porcentual de la superficie mundial de olivar
el árbol más representativo de dicha cuenca. En la actualidad, el olivo está extendido por
todo el mundo, mayoritariamente en la Unión Europea, pero también se cultiva en otras
zonas como América, Australia y Sudáfrica.

3.1.2 La olivicultura en Argentina

El olivo (Olea europaea L.) es una especie arbórea originaria del Mediterráneo oriental
(Asia Menor), expandiéndose posteriormente por todas las riberas mediterráneas. En la
La cultura del olivo se introdujo en la Argentina en la época colonial. Los conquistado-
actualidad, el cultivo del olivo está presente en cerca de cuarenta países de todo el mundo,
res españoles que provenían del Alto Perú realizaron las primeras plantaciones en lo que
teniendo especial relevancia en todo el arco mediterráneo. En general, su extensión al res-
hoy es la provincia de La Rioja, más precisamente en Arauco. Esta localidad dio su nombre
to del planeta coincide con zonas en las que se dan condiciones similares a este biotopo.
a la variedad homónima, resultado de la selección realizada por sus habitantes.
La superficie de cultivo en la Unión Europea es de 4.4 millones de hectáreas, lo que
El desarrollo de la olivicultura ha sido lento y ha seguido de manera paralela el desa-
supone el 47% de la superficie dedicada al olivar en todo el mundo. España es el país que
rrollo de la población, en particular en la zona de la cordillera, sobre los actuales territorios
más superficie dedica a este cultivo, suponiendo el 48% de la superficie de la UE y el 22%
de las provincias de La Rioja, Catamarca, Salta, Mendoza y San Juan.
de la mundial. Sólo Italia y Túnez superan ampliamente el millón de hectáreas de olivar.

La guerra civil española (1936/1939) originó en Argentina problemas para la impor-

La evolución de las superficies de cultivo de olivar en los últimos años ha sido clara-
tación de aceite de oliva y aceitunas de mesa lo que llevó al gobierno argentino a promover
mente positiva, con aumentos significativos a nivel mundial de casi el 21% en los últimos
un programa de promoción del sector oleícola, a partir del cual las provincias en las que
veinte años, excepto para los países de la UE, donde o se ha mantenido o incluso ha des-
las precipitaciones fueran inferiores a 400 mm por año y que presentaran posibilidades de
cendido (6-8%) la superficie en los últimos 6 años, dependiendo del período de tiempo
irrigación fueron favorecidas y reconvertidas al sector oleícola.
analizado.

Hacia 1965 la Argentina contaba con casi cinco millones de plantas de olivo distribui-
En cuanto a la producción de aceite de oliva la más alta corresponde a España (60.3%
das en distintas provincias caracterizadas por diferencias agrarias y climáticas singulares,
del total), seguida de Italia (23.9%), Grecia (13.6%), Portugal (1.8%), y de otros países como
entre ellas las zonas de Mendoza, San Juan, San Luis, Catamarca, La Rioja y otras como
Francia, Chipre, Eslovenia y Malta que aportan el 0.4% de la producción en la Unión Euro-
Buenos Aires, Córdoba y Entre Ríos.
pea. España es el primer país productor de aceite de oliva en la UE y del mundo.

12 INTI PROYECTO MEJORA DE LAS ECONOMÍAS TÉCNICAS Y PRÁCTICAS DE LABORATORIO PARA 13

UE REGIONALES Y DESARROLLO LOCAL EL ANÁLISIS DE ACEITE DE OLIVA VIRGEN
 La superficie cultivada en la actualidad es de alrededor de 110.000 ha, estimándose 3.2 LA ACEITUNA, EL ACEITE Y SU COMPOSICIÓN
un promedio de 350 plantas por ha. Argentina es el décimo productor mundial de aceites
de oliva, ocupando el primer lugar en el continente americano. La producción nacional El fruto del olivo, la aceituna, es una drupa de forma ovalada de tamaño variable en
representa casi el 1% del total mundial. función de las variedades, suelos, climatologías, etc. En la aceituna se distinguen princi-
palmente dos partes bien diferenciadas, el pericarpio y el endocarpio.
Las principales provincias productoras son:
El pericarpio está compuesto por el epicarpio que es un tejido superficial que sirve de
• Catamarca: La producción olivícola en esta provincia es muy reciente pero la pro- envoltura, que representa entre el 2 y el 2.5% del peso del fruto y el mesocarpio que es la
vincia es la principal productora de aceite de oliva del país. Alrededor del 80% de las parte carnosa de la aceituna al que corresponde la mayor parte del peso del fruto, entre el
variedades cultivadas son aceiteras, entre las que se destacan Arbequina, Frantoio, 70% y el 80%. El endocarpio, también llamado hueso, supone entre 17% y el 23% de la acei-
Barnea y Coratina. El 20% restante corresponde a las de doble propósito, como Man- tuna y encierra a la semilla con el embrión (2% a 5.5% de peso del fruto).
zanilla y Empeltre.
• La Rioja: La olivicultura se desarrolla principalmente en el departamento de Arauco,
lugar de origen de la variedad de este nombre, que es una de las de mayor difusión
en el país, y el resto de la producción se concentra en los alrededores de la capital y
en los valles de Chilecito y Famatina. La principal variedad en toda la provincia es la
Arauco, con 70% de la superficie plantada siendo el resto variedades aceiteras como
Arbequina, Manzanilla, Frantoio, Empeltre, Picual, Barnea y Farga.
• Mendoza: El olivo es uno de los cultivos más destacados de la provincia. Se elabo-
ran conservas y aceites de oliva de reconocida calidad. Solo el 40% se destina a la
fabricación de aceites de oliva, principalmente de las variedades Arbequina, Farga,
Empeltre y Frantoio.
• San Juan: Posee un 60% de variedades aceiteras como Arbequina, Picual, Frantoio y
Empeltre, 22% de aceitunas de mesa de la variedad Changlot Real y 19% de varieda-
des de doble propósito como Arauco y Manzanilla.
• Córdoba: En la provincia, la superficie cultivada alcanza las 6.000 hectáreas. En
general, se trata de plantaciones de más de 25 años que mayormente producen Figura 2. Distribución porcentual de la composición de la aceituna.
aceituna para conserva y aceites de oliva orgánicos. Las principales variedades de-
dicadas a la producción de aceites son Arbequina y Frantoio
• Buenos Aires: La zona olivícola se encuentra en el sudeste de la provincia, donde la
superficie cultivada supera las 3.000 hectáreas, con olivos de más de 40 años en la Para la elaboración de aceite, la composición que debe tener el fruto en el momento de
zona de Coronel Dorrego donde se elabora aceite de oliva orgánico certificado. El la recolección es entre un 40 y 55% de agua de vegetación, de 18 a 32% de aceite, de 14 a
80% de dicho aceite se destina a exportación y el resto se comercializa en el mercado 22% de hueso, de 1 a 3% de semilla y del 8 al 10% el epicarpio y resto de la pulpa.
interno. La variedad Arbequina es la más abundante, y también hay presencia de
Frantoio y Nevadillo. En las aceitunas maduras, además del agua y el aceite, se encuentran otros compo-
nentes químicos como azúcares, proteínas, pectinas, ácidos orgánicos, taninos, oleuro-
peína y componentes inorgánicos, entre otros (tabla 1), cuyas proporciones varían con los
cultivares, con las circunstancias climáticas, con el grado de madurez, etc.

14 INTI PROYECTO MEJORA DE LAS ECONOMÍAS TÉCNICAS Y PRÁCTICAS DE LABORATORIO PARA 15

UE REGIONALES Y DESARROLLO LOCAL EL ANÁLISIS DE ACEITE DE OLIVA VIRGEN
 Tabla 1. Composición mayoritaria de la aceituna en función de la parte del fruto. Tabla 2. Composición de ácidos grasos del aceite de oliva

Parte Materia Materia Celulosa Extracto no Materia ÁCIDOS GRASOS

nitrogenada grasa bruta nitrogenado mineral

Ácidos grasos saturados Mirístico C 14:0

Epicarpio 9.8 3.4 2.4 82.2 1.6

Mesocarpio 9.6 51.8 12.0 24.2 2.3 Palmítico C 16:0

Endocarpio 1.2 0.8 74.1 22.7 1.2 Heptadecanoico C 17:0

Esteárico C 18:0

Araquídico C 20:0
La práctica totalidad del aceite está contenido en el mesocarpio, mientras que en el
Behénico C 22:0
endocarpio predomina la celulosa bruta.
Lignocérico C 24:0
El aceite de oliva está compuesto principalmente por triglicéridos o ésteres de glicerina
con ácidos grasos y en menor proporción (entre 0.5 y 1.5%) por constituyentes no glicéridos Ácidos grasos Palmitoleico C 16:1
monoinsaturados
entre los que destacan: fosfolípidos, alcoholes de cadena larga, esteroles, hidrocarburos y Heptadecenoico C17:1
ceras. Los componentes minoritarios son importantes para la estabilidad, sabor y aroma
del aceite de oliva, así como para su tipificación. Oleico C 18:1

Eicosenoico C 20:1
Todos los compuestos de los que está constituido el aceite de oliva se pueden dividir
en dos grandes grupos de sustancias químicas, la fracción saponificable y la insaponifi- Ácidos grasos Linoleico C18:2
cable. El equilibrio y la armonía entre estas dos fracciones serán de gran influencia en las poliinsaturados
Linolénico C18:3
cualidades del aceite.

• Fracción saponificable: representa entre el 98.5 y el 99.5% del peso del aceite de • Fracción insaponificable: supone entre el 1.5% y el 0.5% del peso del aceite de oliva.
oliva. Esta fracción está formada por triglicéridos, ácidos grasos libres, ésteres de Encierra una gran cantidad de componentes menores que son muy importantes
ácidos grasos con alcoholes grasos saturados de cadena lineal que se conocen para el comportamiento y la calidad de los aceites. Esta fracción ha sido muy útil en
como ceras, ésteres de esteroles y, finalmente, alcoholes terpénicos. la autentificación del aceite de oliva o la caracterización de aceites de oliva vírgenes
monovarietales. Por otra parte estos compuestos le añaden propiedades senso-
Los ácidos grasos suelen ser los componentes fundamentales y mayoritarios de un
riales y biológicas únicas. Los constituyentes principales de esta fracción son hi-
aceite o grasa. No se encuentran normalmente como ácidos grasos libres, cuando lo están
drocarburos, tocoferoles, alcoholes con estructura triterpénica, 4,4-metil-esteroles,
es tan sólo en pequeñas cantidades, comunicando a la grasa cierta acidez. Normalmente
esteroles, dialcoholes terpénicos, compuestos fenólicos y flavonoides, pigmentos y
los ácidos grasos están formando ésteres, habitualmente con la glicerina, para dar lugar a
compuestos volátiles.
los glicéridos (mono, di y triglicéridos) y fosfátidos.
En el aceite de oliva hay presentes más de cuarenta hidrocarburos diferentes cuyas con-
.
centraciones en más del 50% de los casos es inferior a 1 ppm, excepto el escualeno que apa-
rece entre 800-12000 ppm que es el principal constituyente de la materia insaponificable.

Los tocoferoles contribuyen de forma importante a dar estabilidad al aceite de oliva,

y tienen un papel biológico beneficioso como antioxidantes siendo el α-tocoferol el que
tiene mayor actividad vitamínica (vitamina E).

16 INTI PROYECTO MEJORA DE LAS ECONOMÍAS TÉCNICAS Y PRÁCTICAS DE LABORATORIO PARA 17

UE REGIONALES Y DESARROLLO LOCAL EL ANÁLISIS DE ACEITE DE OLIVA VIRGEN
 Los esteroles son alcoholes superiores monovalentes, entre los que predomina el El análisis sensorial del aceite de oliva es de mucha importancia puesto que muestra
β-sitosterol. Constituyen la huella analítica que permite la autentificación del aceite de los atributos fácilmente apreciados por los consumidores, a la vez que clasifica la catego-
oliva. Dentro de los dialcoholes triterpénicos destacan el eritrodiol y uvaol. Las cantidades ría comercial en aceite de oliva virgen extra, aceite de oliva virgen, aceite de oliva virgen
totales de eritrodiol más uvaol en el aceite de oliva, varían de 1 a 20 mg/100 g de aceite. corriente o aceite de oliva lampante.

El aceite de oliva virgen contiene sustancias fenólicas que afectan a su estabilidad, Los parámetros analíticos más importantes que proporcionan información sobre la
sabor y aroma. Los compuestos fenólicos encontrados en el aceite de oliva pueden ser calidad del aceite o su degradación, son entre otros, el grado de acidez, el índice de pe-
ligeramente diferentes a los presentes en las aceitunas. La oleuropeina es la responsable róxidos y la absorción de luz en la región ultravioleta del espectro. Es importante resaltar
del sabor amargo de las aceitunas y es el principal glicósido presente en el aceite de oliva. que estos parámetros están relacionados con el estado de la materia prima, el proceso de
elaboración, así como el sistema y tiempo de almacenamiento y envasado.
La concentración de los compuestos fenólicos en la que se encuentra en los aceites
depende fundamentalmente de tres factores, la variedad de la aceituna, la madurez de la
misma y la tecnología y condiciones de la extracción del aceite. La concentración de feno- 3.3.1 Clasificación de los aceites de oliva en función de la calidad
les totales, varía normalmente entre 50 y 200 mg L-1, pero se pueden encontrar aceites
con contenidos de hasta 1000 mg L-1. Según el Consejo Oleícola Internacional, el aceite de oliva es el producto procedente
exclusivamente del fruto del olivo, con exclusión de los aceites obtenidos utilizando di-
En el aceite de oliva aparecen dos clases de pigmentos naturales, las clorofilas y feofi- solventes o por procedimientos de reesterificación y de toda mezcla con aceites de otra
tinas, y los carotenoides. Las clorofilas a y b, y las feofitinas a y b, son las responsables del naturaleza.
color. Su contenido en el aceite de oliva varía entre 1 y 20 mg L-1.Las clorofilas y feofitinas
tienen un efecto prooxidante sobre los lípidos en presencia de luz, mientras en la oscuri- La Norma COI, COI/T.15/NC nº 3/Rev. 7 " Norma comercial aplicable a los aceites
dad actúan como antioxidantes. de oliva y los aceites de orujo de oliva", así como el Reglamento CEE 2568/1991 (ultima
mod,RCE 1348/2013) relativo a las características de los aceites de oliva y orujo de oliva
Los compuestos volátiles son responsables del aroma del aceite de oliva y los forman y a sus métodos de análisis, establecen las siguientes denominaciones y clasificación de
alcoholes, cetonas, ésteres, derivados furánicos, etc. La variedad de olivo es de gran im- los aceites de oliva:
portancia en la composición de compuestos volátiles del aceite de oliva así como el grado
de madurez. - Aceite de oliva virgen: es el obtenido del fruto del olivo únicamente por procedimien-
tos mecánicos o por otros medios físicos, en condiciones, especialmente térmicas,
que no produzcan alteración del aceite. Para este tipo de aceites, la aceituna sólo
soportará los tratamientos de lavado, decantación, centrifugación y filtrado. El acei-
3.3 LA CALIDAD DEL ACEITE DE OLIVA te de oliva virgen puede a su vez clasificarse en:

Una de las definiciones clásicas de calidad pertenece a Kramer y Twigg (1973): “La • Aceite de oliva virgen extra es aquel cuya evaluación organoléptica presenta una
calidad es el conjunto de aquellas características de atributos individuales de un producto mediana del atributo frutado (Mf) mayor de cero, la mediana del defecto (Md) igual
que son significativos para determinar el grado de aceptación que aprecia el consumidor”. a cero y la acidez libre expresada en ácido oleico no superior a 0.8%, además de
Según estos autores, los atributos se clasifican en dos posibles grupos, los atributos sen- respetar los otros criterios fijados en la norma (tabla 3).
soriales y los atributos ocultos. Los atributos ocultos son los relacionados con:
• Aceite de oliva virgen es aquel en el que la evaluación organoléptica presenta
– Valor nutricional. una mediana del atributo frutado (Mf) mayor a cero, la mediana de defecto (Md)
– Toxicidad. es menor o igual a 3.5, y la acidez libre como máximo será del 2.0%, además de
– Ausencia de adulterantes. respetar los criterios fijados en la norma (tabla 3).

18 INTI PROYECTO MEJORA DE LAS ECONOMÍAS TÉCNICAS Y PRÁCTICAS DE LABORATORIO PARA 19

UE REGIONALES Y DESARROLLO LOCAL EL ANÁLISIS DE ACEITE DE OLIVA VIRGEN
 • Aceite de oliva corriente es aquel cuya evaluación organoléptica presenta una Tabla 3. Valores límites para los parámetros químicos que clasifican los aceites por
mediana de defecto (Md) mayor a 3.5 y menor de 6.0, o bien aquel cuya mediana
categorías de calidad.
de defecto (Md) es menor a 3.5 pero con una (Mf) de cero y la acidez libre como
máximo será del 3.3%. Nota: Esta categoría no se contempla en la Unión Europea.
Denominación Acidez (%) Índice de K 232 K270 ∆K Esteres Evaluación
• Aceite de oliva lampante es aquel cuya evaluación organoléptica presenta una Peróxidos Etílicos sensorial
mediana de defecto (Md) mayor a 6 o una la acidez libre mayor del 3.3%. Es el (meqO/kg) (mg/kg)
aceite de oliva virgen no apto para el consumo en la forma en que se obtiene. Oliva Virgen Extra ≤0.8 ≤2.50 ≤0.22 ≤0.01
≤20 ≤30 Md = 0 Mf>0

- Aceite de oliva refinado: es aquel obtenido en refinería a partir de aceites de oliva Oliva Virgen ≤2.0 ≤2.60 ≤0.25 ≤0.01
≤20 - Md≤3.5Mf>0
virgen lampante por procesos de decoloración, desodorización, neutralización y
filtración. Oliva Corriente ≤3.3 - ≤0.30 ≤0.01
- - 3.5<Md≤6.0

- Aceite de oliva: es el aceite compuesto por la mezcla de aceite de oliva refinado y Oliva Lampante >3.3 - - -
- - Md>6.0
aceite de oliva virgen cuya acidez libre será menor o igual a 1% además de cumplir
los requisitos establecidos en la norma (tabla 4). Oliva Refinado ≤0.3 - ≤1.10 ≤0.16
≤5 - -

- Aceite de orujo de oliva crudo: obtenido a partir del orujo de aceituna, mediante la Oliva ≤1.0 - ≤0.90 ≤0.15
≤15 - -
extracción con disolventes.
Orujo de Oliva Refinado ≤0.3 ≤5 - ≤2.00 ≤0.20 - -
- Aceite de orujo de oliva refinado: obtenido a partir de aceites de orujo de oliva crudo
tras ser sometido al proceso de refinado. Siendo su acidez como máximo de 0.3%. Orujo de Oliva ≤1.0 ≤1.70 ≤0.18
≤15 - -

- Aceite de orujo de oliva: mezcla de aceites de orujo de oliva refinados y aceite de

oliva virgen, su acidez libre no será superior al 1% y debe cumplir los requisitos esta-
blecidos en la norma (tabla 3).
3.3.2 Control de calidad de los aceites de oliva
Dentro de esta clasificación sólo son aptos para el consumo humano el aceite de oliva
virgen extra, el aceite de oliva virgen, el aceite de oliva y el aceite de orujo de oliva.
El control de calidad del aceite de oliva comprende la realización de una serie de de-
terminaciones que se refieren directamente a la evaluación de la calidad por un lado y por
otro al control de cualquier posible adulteración. Por lo tanto, en el control de calidad de los
aceites de oliva se puede distinguir entre parámetros de calidad y parámetros de pureza.

- Parámetros de calidad: hacen referencia a los parámetros que más influyen en

el deterioro del aceite, y dependen de tres causas fundamentales; el mal estado de
la materia prima, el proceso de extracción y el proceso de conservación. Asimismo,
desde el punto de vista químico, la alteración del aceite se puede sintetizar en dos
procesos reactivos degenerativos; los procesos hidrolíticos y los procesos oxidativos.

Los procesos hidrolíticos son los que afectan al grado de acidez mientras que los
oxidativos se reflejan en el índice de peróxidos y en la absorbancia en el ultravioleta.

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 • Grado de acidez: indica el porcentaje de ácidos libres presentes en el aceite, ex- Análisis sensorial: el aceite de oliva virgen es uno de los pocos alimentos en cuya re-
presado como porcentaje de ácido oleico ya que este es el mayoritario en el aceite glamentación se incluye el análisis organoléptico, siendo el único que posee un método de
de oliva. Los triglicéridos, que constituyen el 98% del aceite, están formados por valoración organoléptica oficial (Reglamento 2568/1991 modificado por el reglamento CE
los ésteres de los ácidos grasos y la glicerina. La glicerina reacciona con moléculas 1348/2013) (COI, 2015). El método solo es aplicable a los aceites de oliva vírgenes, en fun-
de ácidos grasos dando lugar a monoglicéridos, diglicéridos o triglicéridos en el ción de la intensidad de los defectos percibidos y del frutado, determinados por un grupo
proceso de esterificación. Este proceso es reversible y por ello, en determinadas de catadores seleccionados, entrenados y cualificados, constituidos en panel.
condiciones van apareciendo ácidos grasos libres, enriqueciéndose el medio en es-
tos compuestos. El análisis organoléptico permite medir sensaciones. Las sensaciones son las res-
puestas que da el cerebro de una persona ante un estímulo percibido por los sentidos.
• Índice de peróxidos: es la cantidad de peróxidos, expresada en miliequivalentes También permite juzgar elementos que son difícilmente detectables de forma instrumen-
de oxígeno activo por kg de aceite, presentes en un aceite. La oxidación de los áci- tal o analítica clásica, como algunas sustancias responsables de olores y sabores desa-
dos grasos insaturados, por el oxígeno del aire, es un proceso complejo con reac- gradables que están presentes en cantidades muy pequeñas y son difíciles de detectar
ciones que llevan la aparición de radicales libres, dando lugar a nuevas reacciones por métodos físico-químicos. Por todo ello, el análisis organoléptico tiene unas caracterís-
y multitud de compuestos, muchos de ellos responsables del característico olor a ticas que lo hacen hoy por hoy, insustituible.
rancio. Los peróxidos son los primeros compuestos en formarse una vez empe-
zado el proceso oxidativo, también se les llama productos de la oxidación primaria. - Parámetros de pureza: además de los parámetros analíticos que determinan la
calidad del aceite de oliva virgen existe otra serie de análisis cuyo fin es poder
• Absorbancia en el ultravioleta: la prueba espectofotométrica en el ultravioleta detectar una posible adulteración en los aceites. Entre los parámetros de pureza
proporciona indicaciones sobre la calidad del aceite y su estado de conservación. destaca la determinación de la composición de los ácidos grasos, la composición de
la fracción de esteroles y el contenido en dialcoholes triterpenicos, la determinación
Los compuestos resultantes de la oxidación secundaria, absorben luz en la región del contenido en estigmaestadienos, del contenido en ceras y la diferencia entre
del ultravioleta del espectro. Los cromóforos formados por las α-dicetonas y las cetonas valor teórico y determinado de triglicéridos con número de carbono 42 (ΔECN42).
α-insaturadas absorben en la región de los 270 nm. Mientras que los de tipo peróxido,
procedentes del ácido linoleico, absorben en la región de los 230-235 nm. La composición de la fracción de ácidos grasos varía mucho según variedades, en
cuanto a los ácidos grasos mayoritarios (palmítico, oleico y linoleico). Sin embargo los áci-
La determinación del contenido en esteres alquílicos ha sido el último parámetro le- dos grasos minoritarios (miristico, hexadeanoico, hexadecenoico, linolenico, araquidico, ei-
gislado. Esta determinación pretende detectar aceites de oliva virgen de baja calidad por cosenoico, behenico y lignocerico) son los que atestiguan la posible adulteración o adición
lo que puede indicar por ejemplo la presencia de aceites que han sufrido un proceso de de otro tipo de aceite.
desodorización en condiciones controladas.
Igualmente la composición de la fracción esterólica indica la posible presencia de otras
Además de los parámetros descritos, que son los utilizados por el Consejo Oleícola grasas o aceites tanto vegetales como animales, encontrándose legislados los límites
Internacional y la Unión Europea para la clasificación de los aceites de oliva por calidades, mínimos para el esterol mayoritario del aceite de oliva, β-sitosterol, como β-sitosterol
el COI establece el control de otros parámetros, como son la determinación de humedad aparente y los límites máximos para los esteroles minoritarios (colesterol, brasicasterol,
y materias volátiles, la determinación de impurezas insolubles en éter y la presencia de campesterol, estigmasterol y Δ-7-estigmastenol).
trazas metálicas. Asimismo existen otros parámetros también utilizados para valorar la
calidad, como el contenido en polifenoles, la determinación de biofenoles y la estabilidad El contenido en estigmastadienos es un claro indicador de la presencia de aceite que ha
oxidativa. La estabilidad oxidativa está relacionada con la resistencia a la oxidación depen- sufrido proceso de refinado, pudiendo corresponder tanto a la presencia de aceite de oliva
diente de la cantidad de antioxidantes naturales y la composición del aceite. Los polifeno- refinado como a otro aceite de semillas (girasol, maíz, soja, etc.) refinado.
les, antioxidantes naturales, contribuyen a dar estabilidad al aceite y están relacionados
con el amargor de los mismos. Otras determinaciones, como el contenido en ceras y el contenido en eritrodiol y uvaol
sirven para detectar el aceite de repaso y la presencia de aceite de orujo.

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 3.4 FACTORES QUE INFLUYEN EN LA CALIDAD DEL ACEITE DE OLIVA La variedad es la responsable de la composición de ácidos grasos y del contenido
en polifenoles. Existen variedades de alto contenido en acido oleico como Picual y
variedades con alto contenido en linoleico como la Arbequina, asimismo los aceites
Se puede decir que la calidad de un aceite depende fundamentalmente de la variedad de Cornicabra y Picual presentan un alto contenido en polifenoles.
y de las técnicas de cultivo empleadas, así como del medio donde se desarrolla el olivar. El origen geográfico de los aceites juega un papel fundamental en la definición de
Todas las etapas del proceso de obtención del aceite de oliva virgen influyen de una forma los componentes del perfil volátil de los aceites de oliva y por lo tanto en la contribu-
u otra en la calidad final del producto que llega al consumidor. Los factores que inciden so- ción a la calidad de los mismos. Al comparar aceites de las mismas variedades pro-
bre la calidad están relacionados con las prácticas agronómicas, el proceso de elaboración, cedentes de distintas ecologías, también se observan diferencias en el contenido
el almacenamiento o conservación, el envasado y la comercialización. de los principales ácidos grasos. Así, en el caso de Arbequina cultivada en Argentina
y en España se aprecia un descenso del contenido en el ácido oleico y aumento en
método de linolénico y palmítico, dando una baja relación monoinsaturados/poliinsaturados.
recolección
medios de 5%
transporte conservación - Factores extrínsecos: son aquellos factores que pueden ser controlados por el ma-
5% 10 %
nejo. Dentro de este grupo se pueden incluir las técnicas culturales, los tratamien-
tos fitosanitarios, la recolección y el transporte.

Las técnicas culturales influyen directamente sobre la producción del árbol y por
Sistema de variedad
extracción 20 % tanto sobre la producción de aceite. Las técnicas culturales que más influyen en la
30 % obtención de un buen aceite de oliva son la protección contra plagas y enfermeda-
des y la recolección.

• Influencia del riego en la calidad del aceite de oliva: el contenido en humedad

del suelo es muy importante, ya que las épocas secas retrasan la maduración del
Grado de maduración fruto. Los componentes químicos más influenciados por el riego son los fenoles,
30 %
los cuales afectan tanto a la estabilidad oxidativa como a las características sen-
Figura 3. Valor porcentual de los factores condicionantes de las características cualitativas del soriales, especialmente al atributo del amargo, mostrando en ambos casos una
aceite de oliva. relación inversa con la cantidad de agua aplicada en los árboles.

• Influencia de la sanidad vegetal sobre la calidad del aceite de oliva: la sanidad

3.4.1 Influencia de los factores agronómicos sobre la calidad del aceite de oliva vegetal es una de las prácticas de cultivo que más influencia puede tener en la
calidad del producto final. Es imposible obtener aceites de calidad si no se parte
de frutos perfectamente sanos y que hayan permanecido en el árbol hasta el mo-
Los factores agronómicos son los que afectan directamente sobre la aceituna y según mento de la recolección.
la facilidad con que pueden ser controlados, se clasifican en factores intrínsecos, que son
aquellos que difícilmente pueden modificarse, y factores extrínsecos, que serían los fácil- • Influencia de la poda en la calidad del aceite de oliva: la poda actúa de forma
mente controlables por las prácticas agronómicas. directa en la maduración de los frutos ya que cuanta más luz llegue a todas las
zonas del árbol más rápida y homogénea será la maduración y por tanto habrá
- Factores intrínsecos: son los factores vinculados principalmente a la variabilidad una influencia en las características organolépticas del aceite obtenido.
genética de la aceituna. En principio las aceitunas de cualquier variedad cultivada
en cualquier medio agronómico pueden dar aceites de oliva virgen extra de buena • Influencia de las técnicas de producción sostenibles sobre la calidad del aceite
calidad siempre que los frutos estén sanos y recolectados en el momento óptimo de de oliva: las técnicas de producción integrada y de agricultura ecológica también
maduración de forma adecuada, sin dañar el fruto. A pesar de esto existen grandes influyen en la calidad final de los aceites. Las técnicas de producción integrada
diferencias entre la calidad de los aceites procedentes de aceitunas de las distintas
variedades y cultivadas en distintos medios.

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 han demostrado que aportan concentraciones más altas de esteroles totales y 3.4.2 Influencia de los factores relacionados con el proceso de elaboración sobre la
tocoferoles y mayor estabilidad, a la par que menor contenido de fenoles totales calidad del aceite de oliva
en los aceites de oliva. Los resultados de estudios realizados con técnicas de pro-
ducción ecológica confirman que el aceite de oliva virgen ecológico tiene mayor El aceite de oliva es el zumo oleoso de las aceitunas separado de los demás compo-
cantidad de compuestos fenólicos individuales (hidroxitirosol, ácidos fenólicos y nentes de este fruto. Cuando se obtiene por sistemas de elaboración adecuados y procede
flavonoides) de frutos de buena calidad, sin defectos ni alteraciones, y con la adecuada madurez, el
aceite de oliva posee excepcionales características de aspecto, fragancia y sabor delicado,
• Influencia de la maduración sobre la calidad del aceite de oliva: se considera y es prácticamente el único entre los aceites vegetales que puede consumirse crudo, con-
como periodo de maduración el tiempo transcurrido desde la aparición de las servando su contenido de vitaminas, ácidos grasos esenciales y otros productos naturales
manchas violáceas hasta la coloración definitiva de la piel de la aceituna .El peri- de importancia dietética.
odo de maduración es variable, estando afectado por las condiciones climáticas
y las características varietales. Durante el periodo de maduración se producen El deterioro del aceite se produce casi exclusivamente como consecuencia de una
variaciones en las características de los aceites obtenidos. Así, la composición manipulación defectuosa de los frutos, y de un proceso de elaboración mal conducido. La
acídica de los aceites evoluciona. se observa una disminución de la proporción de técnica de extracción tiene por objeto separar el aceite de oliva, en forma de fase oleosa
ácido palmítico y un aumento del porcentaje en ácido linoleico, permaneciendo continua, sin alteraciones de su composición y de sus características organolépticas, de
sensiblemente constante la proporción de ácido oleico, por lo que la relación entre los demás componentes de la aceituna, para ello es necesario realizar diferentes procesos
monoinsaturados y poliinsaturados tiende a disminuir a medida que avanza la y cada uno de ellos es importante para obtener aceite de calidad.
maduración.
ACEITUNAS
• Influencia de la recolección sobre la calidad del aceite de oliva: el momento más
apropiado para la recolección de las aceitunas destinadas a la extracción de aceite, Limpieza de hojas
es cuando el fruto alcanza su maduración óptima, en ese momento, el contenido
en aceite y la calidad el mismo, se encuentran a su nivel más alto. Las cosechas Lavado
muy tempranas o muy tardías tienen efectos negativos tanto sobre la calidad
como sobre la cantidad Las características organolépticas del fruto empeoran a Molienda Molienda Molienda
medida que la recolección se retrasa, obteniéndose los aceites más afrutados y
aromáticos al comienzo del período de maduración, incluso con un apreciable por- Batido Batido Batido
centaje de frutos verdes.
Prensado Orujo Centrifugación Agua Centrifugación
• Influencia del transporte, recepción y almacenamiento en la almazara sobre la de la pasta Orujo de la pasta
calidad del aceite de oliva: las aceitunas deben ser transportadas hasta la almaz-
ara en condiciones tales que sufran el menor daño físico posible, los golpes, las Aceite y agua Aceite y fase Fase líquida Aceite de
de vegetación líquida y aceite oliva
magulladuras y aplastamientos producidos por manipulaciones violentas, con-
tenedores inapropiados o excesiva altura de carga, generan en los frutos trans- Pulpa y aguas
Decantación Centrifugación Centrifugación
formaciones enzimáticas inadecuadas que producen alteraciones organolépticas, de vegetación
como la pérdida del aroma. (alperujo)
Aceite de Aceite de
oliva oliva Aguas de
Durante el almacenamiento, como consecuencia del grado de humedad propio vegetación
y de la evolución biológica del fruto, da comienzo el proceso fermentativo de la Aguas de
y agua de proceso
materia orgánica y como resultado la desintegración de la estructura celular, pro- vegetación
duciéndose durante este tiempo una serie de reacciones hidrolíticas, lipolíticas,
enzimáticas endógenas y microbianas, motivadas principalmente por la acción de TRADICIONAL TRES FASES DOS FASES
mohos y levaduras que se desarrollan conjuntamente y que afectan considerable-
Figura 4. Diagrama de flujo en la obtención de aceites de oliva
mente a la calidad y a las características organolépticas del aceite.

26 INTI PROYECTO MEJORA DE LAS ECONOMÍAS TÉCNICAS Y PRÁCTICAS DE LABORATORIO PARA 27

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 • Influencia del lavado de frutos sobre la calidad del aceite de oliva: el lavado de Aunque hoy en día está en desuso, la extracción por presión ha sido el proced-
las aceitunas, tiene por finalidad limpiar los frutos de impurezas de origen vegetal, imiento más antiguo y tradicionalmente empleado para obtener el aceite de oliva.
como hojas y ramillas, y las de origen mineral, como polvo, tierra, piedras, además Prácticamente la totalidad de las almazaras utilizan sistema de extracción en con-
de posibles restos de sustancias indeseables procedentes de la producción. El la- tinuo, bien en dos o en tres fases. El sistema se denomina en tres fases cuando
vado puede resultar inadecuado en el caso de aceitunas recogidas en avanzado disponen de dos salidas para líquidos (una para aceite y otra para alpechín) y otra
estado de maduración, porque la acción mecánica podría arrancar trozos de pulpa, para sólidos (orujo). El sistema es de dos fases cuando se dispone sólo de una
con la consiguiente pérdida de aceite. El proceso de lavado con agua tiene cierta salida para líquidos (aceite) y otra por donde se desvía la fase intermedia (alpechín)
influencia, en función del estado físico de los frutos, del grado de escurrido, y fun- y el sólido (orujo), llamada alperujo.
damentalmente del estado de limpieza del agua. Esta operación suele producir
una ligera elevación de la acidez y sobre todo un fondo organoléptico a humedad. Respecto a la calidad del aceite obtenido no existen diferencias notables. La ma-
quinaria puede influir en las características organolépticas del aceite, en función
• Influencia de la molienda sobre la calidad del aceite de oliva: la molienda con- del caudal y temperatura del agua de fluidificación, del ritmo de inyección y del
siste en la molturación de las aceitunas para destruir la estructura de los tejidos grado de aireación que provocan en el aceite, como consecuencia de la elevada
vegetales que la forman. El cizallamiento aplicado durante la molturación, des- velocidad de rotación de la centrífuga. En el sistema de dos fases el contenido
garra las membranas celulares y va dejando en libertad a los glóbulos de aceite. en polifenoles es mayor al precisar menor adicción de agua que solubiliza estos
Estos glóbulos libres van reuniéndose entre sí, formando gotas de tamaño vari- compuestos, sin embargo presenta valores de acidez e índice de peróxidos lig-
able, las cuales entran en contacto directo con la fase acuosa presente en la pasta, eramente superiores. En el análisis sensorial los aceites de dos fases presentan
procedente del agua de vegetación y de los residuos de agua con que los frutos se una mayor puntuación en el amargor mientras que en los de tres fases se dan
han tratado previamente a su molienda. puntuaciones superiores en el dulce.

En función del tipo de aceituna debe regularse el grado de molienda, si la aceituna • Influencia de la separación líquido-líquido sobre la calidad del aceite de oliva:
es de principio de campaña estará más dura por lo que la molienda debe ser más tras el proceso de extracción los líquidos obtenidos necesitan una rápida separa-
fina con objeto de garantizar la rotura de las celdillas donde se aloja la materia ción de la fase acuosa o separación líquido-líquido. Esta separación puede reali-
oleosa. En el caso de aceituna más madura la molienda debe ser más gruesa ya zarse por decantación o por centrifugación.
que si no se forman sistemas coloidales y emulsiones que pueden dar lugar a una
alteración de la calidad organoléptica por exceso de contacto del aceite con el agua Los factores a tener en cuenta para conseguir buenos resultados en esta oper-
de vegetación. ación son la temperatura, limpieza, adición de agua y tiempo. El tiempo de con-
tacto entre alpechín y aceite y una mala limpieza de los decantadores durante
• Influencia del batido sobre la calidad del aceite de oliva: la operación de batido el proceso, son las causas fundamentales por las que se suelen deteriorar los
de la pasta de aceitunas consiste en un removido lento y continúo de la misma aceites, anulando y enmascarando los atributos positivos de un aceite de calidad
que se efectúa en recipientes de acero inoxidable o batidoras de forma semicilín- y apareciendo aromas no deseables en el aceite (borras).
drica o semiesférica, provistos de un sistema de calentamiento apropiado. Su
función es reunir las gotas líquidas dispersas con el fin de facilitar la separación
sólido–líquido en las siguientes operaciones de elaboración. En este proceso, no 3.4.3 Influencia de los factores relacionados con el almacenamiento en bodega, el
conviene sobrepasar los 30 ºC ya que temperaturas más elevadas pueden provo- envasado y la comercialización sobre la calidad de los aceites de oliva
car pérdida de aromas. La duración del batido debe ser suficiente para conseguir
el mayor rendimiento de aceite, pero si este tiempo se alarga se pueden producir El aceite producido debe pasar a unos receptores para su clasificación, y en función de
pérdidas de componentes volátiles. su composición y características organolépticas, almacenarse en los depósitos correspon-
dientes a su calidad, para su posterior expedición. Las condiciones de almacenamiento de
• Influencia de la separación sólido-líquido sobre la calidad del aceite de oliva: la aceite son esenciales para mantener sus características de calidad. Hay tres factores fun-
etapa de separación o extracción constituye la parte fundamental de la obtención damentales que favorecen el proceso de deterioro de aceites durante el almacenamiento,
del aceite y está basada en la separación de los líquidos contenidos en la pasta de la luz, el aire y las altas temperaturas.
aceitunas.

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 La causa principal del deterioro de aceite de oliva durante el almacenamiento son las 4. METODOLOGIA DE ANÁLISIS DE LOS ACEITES DE OLIVA Y
reacciones de oxidación e hidrólisis y los productos resultantes son la pérdida de antio- ORUJO DE OLIVA
xidantes naturales, una variación en el contenido de pigmentos naturales (fundamental-
mente clorofila y carotenos), un incremento de estado oxidativo, así como de impurezas,
etc. Esta pérdida de la calidad del aceite se acentúa en los primeros tres meses de alma-
cenamiento, y poco después permanece casi constante. Para reducir o eliminar el contacto
con el aire es recomendable tapar todos los depósitos, inertizarlos y realizar los trasiegos 4.1 PARÁMETROS DE CALIDAD
por las bocas inferiores de los depósitos. Aunque en el aceite almacenado, tienen poca
importancia los procesos hidrolíticos si se ha eliminado el agua de vegetación antes de Con objeto de poder comprobar la conformidad de una muestra de aceite de oliva con
enviar el aceite a bodega, pueden producirse fermentaciones de partículas solidas, ricas la categoría declarada se aplicará el siguiente esquema de decisiones
en azúcares, que no se han separado en la centrifugación y decantación; es por tanto muy
importante que los aceites lleguen a bodega lo más limpios posible. ACEITE DE OLIVA VIRGEN EXTRA ACEITE DE OLIVA VIRGEN

Para eliminar impurezas del aceite se pude realizar un proceso de filtrado. Actualmen-
te se comercializan aceites sin filtrar o en rama, debiendo cuidar en extremo la higiene en
el envasado y permitiendo una decantación adecuada en el almacenamiento. La dificultad Acidez % Acidez %
que lleva consigo envasar estos aceites radica en los largos periodos de caducidad que exi-
≤0.8 >0.8 No cumple ≤2.0 >2.0 No cumple
gen las cadenas de distribución. Sin embargo el consumo de estos aceites debe ser muy
rápido, antes de que aparezcan los sedimentos, para garantizar así la calidad del producto.

Indice de Peróxidos meq O2/kg Indice de Peróxidos meq O2/kg

El material del envase debe ser inalterable e inerte. Es preferible que el vidrio sea de
color oscuro. Los envases de cartón laminados de plástico y los de hojalata son, posible- ≤20 >20 No cumple ≤20 >20 No cumple
mente, los de menor uso actualmente en la comercialización. Sin embargo, serían los más
apropiados para mantener la calidad del aceite de oliva, por lo menos durante seis meses.
Ambos protegen contra la luz y los gases. Prueba Espectrofotométrica Prueba Espectrofotométrica
K270≤0.22 K270>0.22 K270≤0.25 K270>0.25
En el llenado de los envases es muy importante evitar los espacios de cabeza ya que No cumple No cumple
el oxígeno del aire favorece la oxidación. El aceite envasado se almacenará en lugar fresco,
aislado de la luz. La conservación del aceite envasado es fundamental para garantizar que
mantenga sus características de calidad hasta su consumo. Prueba Espectrofotométrica Prueba Espectrofotométrica
K232≤2.50 K232>2.50 K232≤2.60 K232>2.60
No cumple No cumple

Valoración organoleptica Valoración organoleptica

Md=0 Mf>0 Md>0 No cumple Mf>0 y Md≤3.5 Mf=0 y Md≤3.5
o Md>3.5

Esteres etílicos mg/kg

≤30 >30 No cumple

Figura 5. Esquema decisiones Figura 6. Esquema decisiones

Aceite virgen extra Aceite virgen

30 INTI PROYECTO MEJORA DE LAS ECONOMÍAS TÉCNICAS Y PRÁCTICAS DE LABORATORIO PARA 31

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 4.1.1 Determinación de los ácidos grasos libres. Método en frio – Colocar en el agitador y añadir unas gotas de la solución de fenolftaleína.
– Añadir gota a gota la solución de KOH 0,1 N desde la bureta hasta viraje del indicador
Principio del método: la grasa biológicamente sintetizada es neutra, por lo que la pre- (el color rosado debe permanecer unos 10 segundos).
sencia de ácidos grasos libres es una anomalía, resultante del mal estado de los frutos, de
un proceso incorrecto de elaboración o de una mala conservación. El aceite de oliva, como Nota: Si se produce turbidez durante la valoración se recomienda repetirla añadiendo
el resto de grasas, está compuesto mayoritariamente por triglicéridos. Los triglicéridos es- un volumen mayor de la mezcla éter etílico / etanol (1:1)
tán formados por los ésteres de los ácidos grasos y la glicerina. El proceso de esterificación
es reversible, por ello en determinadas condiciones van apareciendo ácidos grasos libres, Nota: La solución etanólica valorada de hidróxido potásico puede sustituirse por una
enriqueciéndose el medio en estos compuestos. Los ácidos grasos se liberan por ruptura solución acuosa de hidróxido potásico o sódico siempre que el volumen de agua añadido
de las moléculas de los triglicéridos a través de sus enlaces esteres. no provoque una separación de las fases.

El índice de acidez o grado de acidez permite determinar, mediante valoración ácido-

base, el contenido en ácidos grasos libres en los aceites de oliva, expresándolo en porcenta-
je de ácido oleico. La muestra se disuelve en una mezcla de eter-etílico/etanol neutralizada
y se valora con una solución etanólica de hidróxido potásico 0.1 N en presencia de fenolf-
taleína como indicador.

CH3-(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-COOH + KOH CH3-(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-COOK +H2O

Material y reactivos
Figura 7: Inicio Figura 8: Punto final Figura 9: Exceso de KOH 0.1N
Reactivos
– Solución de éter etílico / etanol (95%-96%) en proporción 1:1.
– Solución etanólica de fenolftaleína de ~ 10 g/l.
– Solución etanólica de hidróxido potásico 0,1N (0,1M) (solución valorada comercial) Cálculos y expresión de resultados
– Solución valorada de ácido clorhidrico 0.1N (0.1M) (solución valorada comercial para
factorizar periódicamente el Hidróxido potásico). El cálculo de la acidez se realiza mediante la fórmula:

Materiales VxCxM
% acidez =
– Balanza-granatario capaz de pesar con precisión de 0,01g. 10 x P
– Matraces erlenmeyer de 250 ml.
– Agitador magnético Donde:
– Bureta de 10 ml. (con divisiones de 0.05 ml) Clase A. V: volumen en ml de KOH consumidos
– Pipetas Pasteur. C: concentración de la solución de KOH
M: peso molecular del ácido oleico (M=282)
Procedimiento analítico P: peso de muestra utilizada
– Tomar ≈ 10 g de muestra exactamente pesada en un matraz erlenmeyer.
– En el caso especial de aceites con una acidez superior a 2%, se repetirá el ensayo La acidez se expresa en % de ácido oleico y el resultado se dará con dos cifras
con un peso de muestra inferior a 5 g. (con esto se mantiene la proporción peso de decimales para valores ≤1.00% y con una sola cifra decimal para valores superiores.
muestra/volumen de solución valorante descrita en la norma).
– Disolverla añadiendo aproximadamente 50 ml de la mezcla de éter etílico / etanol
(1:1) previamente neutralizada con KOH 0,1N (utilizando unas gotas de la solución
de fenolftaleína como indicador).

32 INTI PROYECTO MEJORA DE LAS ECONOMÍAS TÉCNICAS Y PRÁCTICAS DE LABORATORIO PARA 33

UE REGIONALES Y DESARROLLO LOCAL EL ANÁLISIS DE ACEITE DE OLIVA VIRGEN
 4.1.2 Determinación del Índice de Peróxidos – Solución acuosa de tiosulfato sódico 0,01N. La solución se prepara a partir de ampo-
llas Titrisol Merck (llevar el contenido de la ampolla a un litro con agua destilada en
Principio del método : el proceso de oxidación del aceite es un proceso natural e irre- aforado clase A de 1000 ml.) y se guarda en frasco topacio.
versible, la oxidación de los ácidos grasos insaturados, por el oxígeno del aire, es un pro- – Iodo 0,02N (solución valorada comercial, para factorizar periódicamente el tiosulfato)
ceso complejo con reacciones que llevan la aparición de radicales libres, dando lugar a
nuevas reacciones y multitud de compuestos. El proceso oxidativo tiene tres fases di- Materiales
ferenciadas, la iniciación, propagación y terminación siendo los peróxidos los primeros – Balanza-granatario capaz de pesar con precisión de 0,01 g.
compuestos en formarse una vez empezado el proceso oxidativo, también se les llama – Matraces con cuello y tapón esmerilados de 250 ml.
productos de la oxidación primaria. La característica que se utiliza para la determinación – Bureta de 10 ml. clase A.
de estos productos es ser oxidantes. – Pipetas Pasteur
– Agitador magnético.
El índice de peróxidos es la cantidad (expresada en miliequivalentes de oxígeno activo – Matraz aforado de 1000 ml.
por kg. de grasa) de peróxidos presentes en una muestra, que ocasionan la oxidación del
yoduro potásico, en unas condiciones determinadas. Este índice permite estimar el grado Procedimiento analítico
de oxidación y, por tanto, la alteración del aceite. Para ello, la muestra problema, disuelta – Tomar aproximadamente 2 g. de muestra exactamente pesada (con precisión de
en ácido acético y cloroformo, se trata con disolución de yoduro potásico. El yodo liberado 0,01 g) en un matraz con tapón.
se valora con disolución de concentración conocida de tiosulfato sódico. – Añadir aproximadamente 25 ml. de la solución cloroformo/acético (1/1,5) para di-
solver la muestra.
– Añadir aproximadamente 1 ml. de solución saturada de ioduro potásico.
– Cerrar rápidamente el matraz, agitar durante 1 minuto y mantenerlo en la oscuridad
5 minutos a temperatura ambiente.
– Añadir 75 ml. aproximadamente de agua destilada.
– Valorar con tiosulfato 0,01N, tras añadir unas gotas de la solución de almidón como
indicador, hasta viraje del indicador (el color debe ser blanco lechoso, no apareciendo
tonalidades violáceas o azuladas).
– En cada serie de muestras se realizará un ensayo en blanco. Cuando el ensayo en
blanco supera 0,05 ml. de tiosulfato 0,01N se sustituirán los reactivos.

Material y reactivos

Reactivos
– Cloroformo (calidad P.A.)
– Acido Acético glacial (calidad P.A.)
– Solución cloroformo / Acético (1/1,5)
– Solución acuosa saturada de yoduro potásico que se guardará en frasco topacio.
– Solución acuosa de almidón de ≈10 g/l.
Figura 10: Fases de la valoración con tiosulfato sódico 0.01N

34 INTI PROYECTO MEJORA DE LAS ECONOMÍAS TÉCNICAS Y PRÁCTICAS DE LABORATORIO PARA 35

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 Cálculos y expresión de resultados Material y reactivos

El cálculo del índice de peróxido se realiza mediante la fórmula: Reactivos

– Ciclohexano (calidad para espectrofotometría)

V x N x 1000 Materiales
Indice de peróxidos =
P – Gradilla y tubos de ensayo.
– Embudos.
Donde: – Matraces aforados de 10 y 50 ml Clase A
V= Volumen de tiosulfato sódico (0,01N S.V.) empleados en el ensayo y – Filtros de papel de pliegues.
corregidos con los ml. consumidos en el ensayo en blanco. – Cubetas de cuarzo con paso óptico de 1 cm.
N= Normalidad exacta de la solución de tiosulfato sódico. – Pipetas Pasteur.
P= Peso en gramos de la muestra.
Instrumental
El índice de peróxidos se expresa en miliequivalentes de oxigeno activo por kg. – Balanza analítica capaz de pesar como mínimo ± 0’0001 mg.
– Espectrofotometro UV/Vis que permita medidas de extinción del ultravioleta entre
El resultado se expresa con una cifra decimal para valores ≤20 meq O 2 /kg y sin cifras 220 y 360 nm.
decimales para valores superiores.

Procedimiento analítico
4.1.3 Prueba espectrofotométrica en el UV
Operaciones previas
Principio del método: la prueba espectrofotométrica en el ultravioleta proporciona in- Comprobar que las cubetas que se van a emplear estén perfectamente limpias. Si no
dicaciones sobre la calidad del aceite, su estado de conservación y sobre las modificacio- es así se limpiarán empleando alcohol/acetona (1:1) y agua destilada para posteriormente
nes inducidas por los procesos tecnológicos. dejar secar.

Los compuestos resultantes de la oxidación secundaria, la mayoría de tipo carbonílico, Encender el espectrofotómetro como mínimo 15 minutos antes de efectuar las lectu-
absorben luz en la región del ultravioleta del espectro. En particular, los cromóforos for- ras para que la lámpara esté en régimen de trabajo.
mados por las α-dicetonas y las cetonas α-insaturadas absorben en la región de los 270
nm. La cuantificación de la luz absorbida es lo que se conoce como K270. La muestra debe estar exenta de impurezas en suspensión y ser perfectamente ho-
mogénea, para ello se filtrarán los aceites con papel de filtro sobre un tubo de ensayo
Los cromóforos o asociaciones moleculares, de tipo peróxido, procedentes del ácido empleando un embudo.
linoleico, absorben en la región de los 230-235 nm. Cuando se cuantifica la luz absorbida a
232 nm se obtiene la denominada K232. Proceso analítico
– Pesar con precisión de 0,20g ± 0,001g entre 0,10g - 0,20g de muestra en un matraz
La materia grasa se disuelve en ciclohexano y se determina la extinción de esta solu- aforado de 10 ml. Enrasar con ciclohexano y homogeneizar. Si presenta opalescen-
ción a las longitudes de onda requeridas (270, 232, 266 y 274 nm) respecto al ciclohexano. cia o turbidez filtrar con papel de filtro (Solución A).
A partir de los valores espectrofotométricos se calcula las extinciones específicas. – Repetir la operación pesando ≈ 0,10g en un matraz aforado de 50 ml. (Solución B).
Anotar los pesos.
– Seleccionar en el “menú” del equipo las longitudes de onda a las que queremos
determinar las extinciones (266, 270 y 274 nm.) .Hacer “zero” con la cubeta llena con
el ciclohexano empleado en la preparación de la muestra.

36 INTI PROYECTO MEJORA DE LAS ECONOMÍAS TÉCNICAS Y PRÁCTICAS DE LABORATORIO PARA 37

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 – Llenar la cubeta con la solución problema (solución A) e introducirla en el equipo y Donde: km = Estimación específica a la longitud de onda m, longitud de onda de
efectuar las correspondientes lecturas. máxima absorción (270nm).
– Limpiar la cubeta.
– Seleccionar la longitud de onda 232 nm y repetir el proceso con la “solución B”. Este resultado se expresara con tres cifras decimales
– Los valores de absorbancia deben estar comprendidos entre 0,1 y 0,8, de no ser así
se prepararán soluciones más concentradas o más diluidas según el caso.
4.1.4 Análisis sensorial
Nota: Para la determinación de K232 es conveniente trabajar con absorbancias supe-
riores a 0,3. Principio del método: el método de análisis se basa en la valoración de la percepción
de los estímulos olfativos-gustativos del aceite de oliva virgen. Cada catador valorará en
Nota: Es importante no disolver la muestra en ciclohexano hasta el momento de su una escala numérica la intensidad de percepción de los atributos positivos encontrados en
lectura en el espectrofotómetro. la muestra de aceite de oliva virgen, así como los negativos si los hubiera.

La clasificación de cada muestra se realizará con la medida de la intensidad de sus

Cálculos y expresión de resultados defectos y atributos percibidos por el conjunto de los catadores constituidos en panel.

Las extinciones específicas o coeficientes de extinción a las diversas longitudes de

onda se calcula según: Material y equipos

Eλ Material
Kλ = – Vidrios de reloj.
c.e
– Copas normalizadas de acuerdo a la norma COI/T.20/Doc.nº5
Siendo: – Rotulador inoloro e indeleble para marcar las copas de cata
Eλ
K λ == Extinción específica a la longitud de onda λ – Ficha de cata
c.e – Manzanas
E = Extinción medida a la longitud de onda λ
Kλ = λ – Botella de agua a temperatura ambiente
c = concentración de la disolución preparada en g/100 ml.
c.e
e = espesor de la cubeta en cm (e=1’0). Equipos
– Estufa de aire para atemperar las muestras
Los cálculos deben realizarse con tres cifras decimales y los resultados deben expre-
– Bloques de calefacción para copas de cata capaces de mantener la temperatura de
sarse con dos cifras decimales y son adimensionales.
la muestra a 28 + 2ºC
– Balanza-granatario de precisión +0.1g
La prueba espectrofotométrica del aceite de oliva requiere la determinación de la ex-
– Termómetro para control de temperatura ambiental
tinción específica a 232 y 270 nm y la determinación de ΔK definido como:
– Sonda termométrica para medida de temperatura de las muestras

Condiciones de ensayo
k +k – Temperatura: Las muestras de aceite se mantendrán a 28 + 2ºC colocadas en
ΔK = km − m−4 m+4 bloques de calefacción. La sala de cata se mantendrá a una temperatura de 20-
2 25ºC.
– Horario óptimo de cata: El período de óptima percepción para el gusto y el olfato es
por mañana por lo que las sesiones de cata se realizarán entre las nueve y las trece
horas.
– Tamaño de las muestras: Cada copa debe tener aproximadamente entre 12.8 y 14.6
gramos de muestra, que se pesarán en granatario, con una precisión de ± 0,1g

38 INTI PROYECTO MEJORA DE LAS ECONOMÍAS TÉCNICAS Y PRÁCTICAS DE LABORATORIO PARA 39

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 Proceso analítico El resultado se expresa con una sola cifra decimal, como la intensidad de los atributos
– Colocar las muestras en la estufa de aire como mínimo media hora antes de su positivos (mediana de frutado) y negativos (mediana de defecto de mayor intensidad) de
distribución en las copas de cata, a una temperatura aproximadamente de 30ºC. la muestra. Así como la clasificación correspondiente.
– Rotular las copas normalizadas de cata con códigos (formados por dos o tres letras
o números al azar). El valor del coeficiente de variación sólido para el atributo negativo de mayor intensi-
– Cada sesión consta de un máximo de cuatro muestras. Pudiéndose realizar hasta dad y para el frutado debe ser inferior o igual al 20%.
un máximo de tres sesiones en una misma jornada, con un descanso mínimo de
quince minutos entre ellas. En función de los resultados obtenidos el aceite se clasificará como virgen extra, vir-
– Poner entre 12.8 y 14.6 gramos de muestra en cada una de las copas pesados con gen, corriente o lampante, siguiendo los criterios establecidos en la Norma COI.
balanza (con una precisión de + 0.1g).
– Dejar en los bloques de calefacción para mantener la temperatura a 28 + 2ºC.
– Cada catador proceder a oler la muestra y después a degustarla y rellenara la ficha 4.1.5 Determinación del contenido en esteres alquílicos y ceras
de cata con la intensidad de los atributos positivos y negativos de la muestra a eva-
luar y clasificar. El catador utilizará los términos: atrojado/borras, moho-humedad, Principio del método: las ceras son esteres de alcoholes alifáticos con ácidos grasos.
avinado-avinagrado/ácido-agrio, madera-húmeda, rancio y otros: metálico, quema- Suelen encontrarse en el hueso y en la piel de la aceituna, esta localización hace que en los
do, heno, basto, lubricante, alpechín, salmuera, esparto, gusano, pepino. En el caso aceites vírgenes su contenido sea mínimo mientras que en orujos es muy alto.
de percibir el carácter verde o maduro del atributo frutado, el catador marcará la
casilla correspondiente de la ficha de cata.
R1-COOH + R2- CH2OH R1-COO-CH2-R2 + H2O

Ácido graso Alcohol Cera

Los esteres alquílicos pueden ser de dos tipos, etílicos y metílicos. Los esteres etílicos
se producen por la reacción de los ácidos grasos libres y el etanol que, a su vez, proviene
de la fermentación etílica de los hidratos de carbono de la aceituna.

Estos esteres son un excelente marcador puesto que su presencia en dosis considera-
bles implica que provienen de aceitunas que han sufrido fermentaciones.

R1-COOH + R2- CH2OH R1-COO-CH2-R2 + H2O

Figura 11: Sala de cata y cabina individual preparada para la cata
Ácido graso Etanol Ester etílico

R1-COOH + CH3- OH R1-COO-CH3 + H2O

Cálculos y expresión de resultados
Ácido graso Metanol Ester metílico
Los resultados se introducirán en un programa informático (Hoja excel) conforme al
método estadístico recogido en la Norma COI T20 Doc número 15.

La introducción de datos se hará en una matriz de nueve columnas correspondientes Este procedimiento permite determinar mediante cromatografía de gases el conteni-
a los atributos positivos y negativos de cada una de las muestras y n filas, que serán cada do en ceras y en esteres metílicos y etilicos de los ácidos grasos mediante fraccionamiento
uno de los catadores. de la grasa o aceite, a los que se habrá añadido los patrones internos adecuados, median-
te cromatografía en columna de gel de sílice hidratado. Recuperación de la fracción eluida

40 INTI PROYECTO MEJORA DE LAS ECONOMÍAS TÉCNICAS Y PRÁCTICAS DE LABORATORIO PARA 41

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 en las condiciones de ensayo (cuya polaridad es inferior a la de los triglicéridos) y, a conti- Patrones
nuación, análisis directo mediante cromatografía de gases en columna capilar empleando – Solución patrón de Laurilaraquidato en Heptano con una concentración aproximada
un sistema de inyección on-colum. de 500 mg/l (0.5 g /100 ml). Esta solución puede conservarse hasta dos meses en
nevera.
Puede utilizarse, para distinguir el aceite de oliva del obtenido mediante extracción – Solución patrón de Heptadecanoato de metilo en Heptano con una concentración
(aceite de orujo de oliva) y del obtenido por repasado de la pasta de aceituna, siendo útil aproximada de 200 mg/l (0.2 g/100 ml)
también para detectar mezclas fraudulentas de aceites de oliva virgen extra con aceites de
menor calidad así como para determinar una posible desodorización realizada a presión Instrumental
y baja temperatura con objeto de eliminar aromas anómalos en el aceite de oliva virgen. – Rotavapor
– Cromatografo de gases con detector FID y sistema de inyección on-colum
Material, reactivos y equipos – Horno mufla
– Balanza analítica capaz de pesar como mínimo ± 0’1 mg
Materiales
– Matraz Erlenmeyer de 25 ml. Procedimiento analítico
– Matraces de 250 ml. – Pesar ≈ 0.5 ± 0.001g de muestra en un matraz de 25 ml, añadir 0.2 a 0.5 ml de patrón
– Probetas de 250 ml. interno de ceras (según se trata de un aceite de oliva virgen o un orujo) y 0.25 de
– Columna de vidrio para cromatografía de 1,0 cm de diámetro interno por 40 cm de patrón interno de esteres.
longitud, provista de una llave de teflón. Para preparar la columna se añade un poco – Transferir la muestra preparada a la columna cromatografía, que se habrá prepa-
de lana de vidrio y se cubre con hexano, llenándose a continuación con una papilla rado como se indica en el punto anterior, con ayuda de dos porciones de 2 ml de
de gel de sílice en hexano (≈ 15g en 40 ml) mediante la ayuda de varias porciones de n-hexano. Añadir 0.1 ml de la solución de Sudan.
hexano. Se deja sedimentar la mezcla en reposo, completándose la sedimentación – Dejar fluir el disolvente hasta que se sitúe a ≈ 1 mm por encima del nivel superior
aplicando una ligera vibración. Finalmente eluir el exceso de hexano. del absorbente. A continuación, iniciar la elución cromatográfica con una mezcla de
– Columna capilar de sílice fundida (0,32 mm de diámetro interno), recubierta con una n-hexano y éter etílico en la proporción de 99:1.
película de 0,10 μm de espesor de la fase 5 %-difefenilmetilsilicona – Hacer pasar la mezcla de elución y recoger aproximadamente 220 ml de la mezcla
– Viales para cromatografía a un ritmo de 15 gotas aproximadamente cada diez segundos (2.1 ml/minuto). (La
elución de los esteres y las ceras concluye cuando la coloración roja del Sudan llega
Reactivos al fondo de la columna).
– Hexano para C.G. – Secar la fracción resultante en el rotavapor hasta que se haya eliminado casi todo
– Éter etílico para C.G. el disolvente. Eliminar las últimas gotas mediante una corriente débil de nitrógeno
– n-Heptano para C.G. y añadir a continuación 2ml de n-heptano en el caso de aceite de oliva y 4 ml en el
– Gel de sílice 60 extrapuro para columna de cromatografía, de 70-230 mallas (refe- caso de aceites de orujo y pasar a un vial de cromatografía.
rencia 7754 de Merck) .El gel de sílice debe mantenerse un mínimo de 4 horas en el
horno de mufla a 500 °C. Tras su enfriamiento, se añade un 2 % de agua respecto a Análisis cromatográfico de ceras
la cantidad de gel de sílice utilizada. Se agita bien para homogeneizar la masa. Se - Acondicionado de la columna de cromatografía: Cuando la columna se utiliza por pri-
mantiene en el desecador durante al menos 12 horas antes de su uso. mera vez es necesario acondicionarla, para ello se empleara un programa de tempe-
– Gas portador para cromatografía: helio de 99,9990 % de pureza. ratura lento, que partiendo de 50ºC suba la temperatura 1 grado por minuto hasta
– Gases auxiliares para el detector de ionización de llama: aire purificado e hidrógeno alcanzar 350º y mantener esta temperatura dos horas.
de 99,9990 % de pureza.
– Laurilaraquidato (SIGMA L-0506) Gases
– Rojo Sudan 1 (1-fenil-azo-2-naftol) . Preparar una solución de concentración ≈ 1% - Gas portador : Helio 1ml/min (si se utiliza Hidrogeno puede aumentarse el caudal a
en la mezcla de elución. 1,2 ml/min)
– Heptadecanoato de metilo (SIGMA) - Detector: Hidrogeno 30 ml/min / Aire 300 ml/min

42 INTI PROYECTO MEJORA DE LAS ECONOMÍAS TÉCNICAS Y PRÁCTICAS DE LABORATORIO PARA 43

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 Cálculos y expresión de resultados

El contenido de las ceras se determina aplicando la fórmula:

AS × M C
mg/Kg de ceras = ⋅1000
AC × M S

en la cual:
AS = área del pico de ceras.
AC = área del pico del patrón interno.
MC= peso de patrón añadido, en microgramos
Figura 12: Cromatografo de Gases Bruker MS= peso de aceite empleado, en gramos

Condiciones de análisis Se calculan los resultados de las distintas ceras agrupando el conjunto de isómeros de
– Horno de columna: cada una de ellas. El resultado final corresponde a la suma de C-40 , C-42 , C-44 y C-46. En
– Detector: 350º Inyector: 50º el caso de aceites de calidad virgen extra no se incluye C40. El contenido de esteres etílicos
– Volumen de muestra inyectada 1µl se determina aplicando la fórmula:

20º/min 5º/min
mg/Kg esteres etílicos
AS × M C
= ⋅1000
80º(1 min) 140º 340º(30 min)
AC × M S

Nota: Para poner a punto el método deben inyectarse los dos estándares internos por en la cual:
separado, con objeto de identificar sus respectivos tiempos de retención. AS = área del pico de ester.
AC = área del pico del patrón interno.
Con carácter orientativo el Lauril araquidato tendrá un tiempo de retención de ≈20±3 MC= peso de patrón añadido, en microgramos
min, si la columna es de 15 metros, o de ≈30±3 min si la columna es de 30 metros. MS= peso de aceite empleado, en gramos
Se cuantificaran los esteres etílicos de C16 y C18 (palmitato de etilo y oleato de etilo).
Deben identificarse los esteres metílicos y etílicos de los ácidos palmítico y oleico (C16
y C18), los esteres del acido palmítico tendrán tiempos de retención inferiores al Heptade-
canoato de metilo y los del acido oleico los tendrán superiores.
4.2 PARÁMETROS DE PUREZA
En el caso de las ceras el orden de elución será: Lauril araquidato, C34, C36, C38, C40,
C42, C44 y C46. Con objeto de poder comprobar la genuinidad de una muestra de aceite de oliva virgen
o virgen extra, y tras verificar el cumplimiento de los parámetros de calidad , se aplicara el
Nota: Dado el gradiente de temperatura que se utiliza es conveniente comenzar el siguiente esquema de decisiones
análisis con una inyección de heptano. Esta inyección se realizara con la opción "línea
base" , de forma que pueda sustraerse la deriva de línea base debida al gradiente de tem-
peratura y se facilite la correcta integración de los picos cromatográficos.

44 INTI PROYECTO MEJORA DE LAS ECONOMÍAS TÉCNICAS Y PRÁCTICAS DE LABORATORIO PARA 45

UE REGIONALES Y DESARROLLO LOCAL EL ANÁLISIS DE ACEITE DE OLIVA VIRGEN
 ACEITE DE OLIVA VIRGEN Y VIRGEN
EXTRA ( CRITERIOS DE PUREZA )
4.2.1 Determinación de la composición de esteres metílicos de los cidos grasos y los
isómeros trans mediante cromatografía de gases con columna capilar.

3,5OLIVA
ACEITE DE Estigmastadienos
VIRGEN Y VIRGEN Principio del método: este método analítico permite determinar, mediante cromato-
EXTRA ( CRITERIOS DE PUREZA ) grafía de gases con columna capilar, la composición cualitativa y cuantitativa de la mezcla
≤0.05mg/kg >0.05mg/kg
No conforme de esteres metílicos de ácidos grasos obtenidos mediante transesterificación en frío con
una solución metanólica de hidróxido potásico.

3,5 Estigmastadienos
%isomeros trans
≤0.05mg/kg
tC18:1≤0.05 >0.05mg/kg
tC18:1>0.05 CH2-COOR CH2-OH
tC18:2+tC18:3≤0.05NotC18:2+tC18:3>0.05
conforme
No conforme
CH-COOR + 3CH3-OH 3 ROOC-CH3 + CH-OH

%isomeros trans
CH2-COOR KOH (catalizador) CH2-OH
tC18:1≤0.05 tC18:1>0.05
Contenido de ácidos grasos
tC18:2+tC18:3≤0.05 tC18:2+tC18:3>0.05
Cumple conforme
No Cumple

Este método es aplicable a todo tipo de aceites con un contenido en ácidos grasos
libres (acidez) < 3,3%. En el caso de muestras con ácidos grasos libres ≥3,3% se empleará
∆ ECN
Contenido de 42 grasos
ácidos una solución metanólica de ácido clorhídrico en ampolla cerrada a ≈ 100ºC. Asimismo este
≤0.2
Cumple >0.2 No Cumple
No Cumple método analítico permite determinar también el contenido de isómeros trans de los áci-
dos grasos oleico, linoleico y linolenico.

Este método analítico es por tanto útil para detectar procesos de refinado o adición
∆ ECN
Composición 42
y contenido de esteroles de algún aceite refinado, ya que en este proceso se generan cantidades importantes de
≤0.2
≤0.2 >0.2 NoNo
>0.2 Cumple
Cumple ácidos grasos trans, además de para detectar presencia de aceites distintos de oliva, ya
que el perfil de ácidos grasos difiere significativamente según la grasa.

La muestra se encontrará a temperatura ambiente para que sea posible su manipu-

Composición y contenido
Eritrodiol+ de esteroles
Uvaol%
lación en condiciones óptimas.
≤2.0 ≤0.2 2.0≤E+U≤4.5
>0.2 No Cumple
>4.5 No Cumple

Material, reactivos y equipos

Se ajusta a la Eritrodiol+ Uvaol%
Ceras mg/kg
categoría (C42+C44+C46) Reactivos
≤2.0 2.0≤E+U≤4.5 >4.5 No Cumple
– Solución de ácido clorhídrico en metanol al 2%. Se prepara a partir de la solución
≤150 >150 No cumple
comercial del 4% diluyendo en metanol al 50% o bien puede emplearse solución co-
mercial al 2% (Panreac).
Se ajusta a la – Hexano para C.G.
de decisiones paraCeras
Figura 13: Esquema categoría mg/kgla pureza de aceites de oliva vírgenes
determinar
(C42+C44+C46) – Heptano para C.G.
≤150 >150 No cumple – Metanol con contenido en agua < 0,5%.
– Hidróxido potásico solución metanólica ≈ 2 N, ( disolver ≈ 11,2 g de KOH en 100 ml
de metanol)

46 INTI PROYECTO MEJORA DE LAS ECONOMÍAS TÉCNICAS Y PRÁCTICAS DE LABORATORIO PARA 47

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 Patrones Análisis cromatográfico
– Patrón mezcla de esteres metílicos de ácidos grasos: “Custom fame mix”. (Restek. - Acondicionado de la columna de cromatografía: Cuando la columna se utiliza por pri-
Ref 553985) mera vez es necesario acondicionarla, para ello se empleara un programa de tempe-
– Linoleic acid methyl ester cis/trans isomers SUPELCO (4-7791) ratura lento, que partiendo de 50ºC suba la temperatura 1 grado por minuto hasta
– Linolenic acid methyl ester isomer mix SUPELCO (4-7792) alcanzar 250º y mantener esta temperatura dos horas.
– Trans-9-Elaidic methyl ester SUPELCO (4-6903) - Gases:
• Gas portador : Helio 1ml/min (si se utiliza Hidrogeno puede aumentarse el
Materiales caudal a 1,2 ml/min)
– Tubos de vidrio de paredes gruesas con cierre hermético. • Detector: Hidrogeno 30 ml/min
– Pipetas Pasteur. Aire 300 ml/min
– Pipetas automáticas (volumen 200µl-1000µl) - Condiciones de análisis orientativas:
– Viales para cromatografía. de 2 ml. • Horno de columna:
– Columna capilar para cromatografía. Ejemplo Rtx-2330. (Restek) (10% ciano propil- 10º/min 10º/min
fenil polioxilano) longitud 60 m, 0’25 mm de diámetro y 0’2 μm de espesor de film. 190º (14min) ----> 220º (1min) ----> 240º (6min)
• Detector: 260º Inyector: 240º
Instrumental • Volumen de muestra inyectada 1µl
– Placa calefactora para tubos de vidrio capaz de superar los 100º C. • Relación de split: 1/100
– Agitador de tubos.
– Cromatógrafo de Gases con inyector split y detector FID.
– Balanza analítica de precisión 0.0001 g Nota (1): Para comenzar el análisis debe inyectarse el patrón que contiene todos los
ácidos grasos a cuantificar, con objeto de poder identificarlos correctamente. Estos ácidos
Procedimiento analítico son (por orden de elución): Miristico, Palmitico, Palmitoleico (deben sumarse los dos iso-
– Pesar aproximadamente 0,1 g de muestra en un tubo de metilación. meros), Heptadecanoico, Heptadecenoico, Estearico, Oleico, Linoleico, Araquidico, Linoleni-
– Añadir 2 ml de heptano y agitar. co, Eicosenoico, Behenico, Erucico y Lignocerico.
– Añadir 0,2 ml de solución metanólica ≈ 2 N de hidróxido potásico.
– Tapar y agitar enérgicamente durante ≈ 30 segundos. Nota (2): Las condiciones analíticas deben ajustarse de forma que exista una completa
– Dejar reposar hasta que la parte superior quede clara. separación entre los picos de los ácidos Esteárico y Oleico
– Con ayuda de una pipeta Pasteur tomar la capa superior que corresponderá al hep-
tano (contiene los esteres metílicos). Nota (3): Para poder identificar los correspondientes isómeros trans deben inyectarse
– Llevar a un vial de cromatografía y trasladar al cromatógrafo de gases. inicialmente los correspondientes patrones.

En el caso de muestras con acidez ≥ 3,3% se utilizará el siguiente procedimiento:

– Pesar aproximadamente 0,2 g de aceite en el tubo de metilación y añadir unos 2 ml Cálculos y expresión de resultados
de solución de clorhídrico en metanol al 2%.
– Cerrar herméticamente el tubo y mantener ≈ 40 minutos en la placa calefactora a Composición de ácidos grasos
una temperatura aproximada de 100ºC. El resultado viene expresado en % para cada éster metílico considerando que el total
– Dejar enfriar, abrir y añadir aproximadamente 2 ml de agua destilada y 1 ml de hexano.
– Agitar y dejar separar las fases extrayendo el hexano con ayuda de una pipeta Pasteur. A
– Llevar a un vial cromatográfico y trasladar al cromatógrafo de gases. % ac graso =
∑A

48 INTI PROYECTO MEJORA DE LAS ECONOMÍAS TÉCNICAS Y PRÁCTICAS DE LABORATORIO PARA 49

UE REGIONALES Y DESARROLLO LOCAL EL ANÁLISIS DE ACEITE DE OLIVA VIRGEN
 donde: El β-Sitosterol es el esterol mayoritario en el aceite de oliva.
A = área del pico de ester metílico del acido graso
∑A = suma de las áreas de todos los picos de los asidos grasos que se tienen en cuenta Es un claro indicativo de pureza ya que el aceite de oliva posee una composición espe-
para la normalización a 100% (todos los que se van a cuantificar). cífica muy distinta del resto de los aceites vegetales.

Nota (4): Cuando se está determinando la composición de ácidos grasos deben sumar- Este procedimiento permite determinar mediante cromatografía de gases con colum-
se los correspondientes isómeros para dar el porcentaje total de cada uno de ellos. na capilar el contenido total, la composición de la fracción de esteroles y el contenido en
dialcoholes terpenicos, obtenidos a partir de la saponificación de la materia grasa, a la que
Dado que el análisis debe reunir las características adecuadas de precisión, exactitud, se ha añadido α-colestanol como patrón interno, con una solución etanólica de hidróxido
y sensibilidad para permitir expresar el resultado del Ac.Miristico con dos cifras decimales, potásico y posterior separación del insaponificable con éter etílico. La fracción de esteroles
se expresarán el resto de los ácidos grasos con el mismo número de cifras decimales ya se separa del insaponificable mediante cromatografía en placa de gel de sílice básica. Los
que este es el número de cifras significativas que se deben tener en cuenta para la nor- esteroles recuperados del gel de sílice se transforma en trimetilsililesteres y se analiza por
malización a 100%. cromatografía de gases.

Cuantificación de isómeros trans

El resultado viene expresado en % para el isómero trans oleico y % para la suma de isó-
meros trans linoleicos y trans linolenicos considerando que el total de las áreas de picos
identificados representan el 100%.

Los resultados se expresan con dos cifras decimales.

Nota (5): Los isómeros trans eluyen delante de los correspondientes isómeros cis.

4.2.2 Determinación de la composición y del contenido de esteroles y dialcoholes Determinamos la cantidad total así como el % relativo de los esteroles que indica la
triterpénicos mediante cromatografía de gases con columna capilar. norma: Colesterol, Brasicasterol, 24 Metilencloesterol, Campesterol, Campestanol, Estig-
masterol, Δ-7- Campesterol, Δ-5, 23-Estigmastadienol, Clerosterol, β-Sitosterol, Sitosta-
Principio del método: los esteroles son derivados del ciclopentanoperhidrofenantreno nol, Δ-5 Avenastenol, Δ-5-24-Estigmastidienol, Δ-7- Estigmastenol, Δ-7 Avenasterol.

Material, reactivos y equipos

Reactivos
– Solución etanólica de hidróxido potásico aproximadamente 2 N: pesar ≈ 130 g. de
hidróxido potásico (≈ 85%) y disolver en ≈ 200 ml. de agua destilada, enfriar. Llevar a
1 litro con etanol. Preparar cuando se vaya a utilizar.
– Solución etanólica de hidróxido potásico aproximadamente 0.2N.
– Mezcla Hexano/Eter etílico 90:60 para el desarrollo de las placas de cromatografía
– Éter etílico calidad P.A
– Sulfato sódico anhidro calidad P.A.
– Hexano calidad CG

50 INTI PROYECTO MEJORA DE LAS ECONOMÍAS TÉCNICAS Y PRÁCTICAS DE LABORATORIO PARA 51

UE REGIONALES Y DESARROLLO LOCAL EL ANÁLISIS DE ACEITE DE OLIVA VIRGEN
 – Etanol calidad P.A. Instrumental
– Acetato de Etilo calidad P.A. – Batería de mantas calefactoras.
– Acetona calidad CG – Aplicador de placa de cromatografía Linomat-Camag.
– Solución de 2.7-diclorofluoresceina al 0,2% en etanol. – Rotavapor.
– Reactivo de silanización: HMDS + TMCS + Piridina (3/1/9). (Supelco. 33038). – Cromatografo de gases con inyector automático y detector FID.
– Gases de laboratorio: Helio, Aire e Hidrogeno.

Patrones
– Colesterol (sigma C-8667). Solución ≈ 5% en cloroformo.
– Patrón de esteroles “plant sterols Mixture” Ref. 119. “Matreya. INC”. Solución en
cloroformo de una mezcla de esteroles 25 mg/ml.
– α-Colestanol .Solución al 0.2% en acetato de etilo (Sigma D-6128)
– Uvaol. (Sigma U-6628) Solución al 0.2% en cloroformo.

Materiales
– Matraces redondos de 250 ml. provistos de refrigerante de reflujo con juntas esme-
riladas.
– Embudos de separación de 500 ml. con tapón. Figura 15: Batería de mantas calefactoras Figura 16: Batería de embudos de decantación
– Matraces de 250 ml.
– Matraces erlenmeyer de 50 ml. con refrigerantes de reflujo.
– Matraces corazón con junta esmerilada. Procedimiento analítico
– Placas básicas de gel de sílice. (Merkc ref. 105721 o similar)
– Embudos Preparación del insaponificable
– Filtros de papel de pliegues.
– Cubeta para desarrollo de placas de cromatografía de capa fina. Nota (1): Este procedimiento se utiliza para determinar la composición de la fracción
– Microviales para cromatografía. de esteroles, cuando se emplea para cuantificarlos se empleara α-colestanol como patrón
– Micro jeringa de vidrio de 1000 μl. interno. Simultáneamente puede determinarse el contenido en Eritrodiol y Uvaol reinte-
– Columna capilar de 30 m.de sílice fundida 0,25 mm de diámetro interno, recubierta grando el cromatograma obtenido para incluir estos dos picos.
con una película de 0,20 μm de espesor de la fase 5 %-difefenilmetilsilicona.
– Pesar en un matraz redondo aproximadamente 10 gramos de muestra seca y fil-
trada y añadir 50 ml. de solución etanólica de KOH ≈ 2N. En caso de realizarse la
determinación de esteroles totales añadir la solución de patrón interno adecuada
según el tipo de aceite, (1ml para aceites de oliva y 2 ml para aceites de orujo), de
forma previa a la pesada de la muestra y llevarlo a sequedad con corriente de aire.
– Adaptar el refrigerante de reflujo y calentar con manta calefactora hasta ligera ebu-
llición. Mantener en ebullición ≈ 60 minutos agitando periódicamente el matraz.
– Añadir aproximadamente 50 ml. de agua destilada por la parte superior del refri-
gerante.
– Separar y dejar enfriar a temperatura ambiente.
– Transvasar cuantitativamente el contenido del matraz a un embudo de decantación
de 500 ml. lavando con unos 50 ml. de agua destilada.
Figura 14: capsulador, microvial y vial de cromatografía. Matraces – Añadir aproximadamente 80 ml. de éter etílico, agitar y dejar reposar hasta separa-
ción de las dos fases.

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 – Separar la fase acuosa y recoger la fracción etérea sobre un matraz. (Nota: tener en – Tapar y dejar hasta que el frente de disolvente se sitúe aproximadamente a 1 cm.
cuenta que la fase etérea queda encima de la acuosa, ya que su densidad es menor). del borde
– Realizar dos nuevas extracciones de la fase acuosa con unos 60-80 ml. de éter etílico. – Sacar la placa de la cubeta y dejar secar.
– Reunir con la anterior fracción etérea en un embudo de decantación y lavarlas con – Pulverizar con 2,7-diclorofluoresceina y mirar la placa con luz ultravioleta, marcar la
unos 50 ml. de agua destilada al menos 3 veces. banda de esteroles con la ayuda de la solución de referencia, marcando los límites
– Eliminar las aguas de lavado, secar con sulfato sódico anhidro y filtrar con filtro de de la banda a lo largo de los márgenes de la fluoresceína
pliegues al que se ha añadido sulfato sódico anhidro. Nota: La banda de esteroles tiene un ancho de aproximadamente 1cm mientras que
– Destilar el éter en rotavapor hasta eliminar totalmente el disolvente, añadir unos ml si se quiere determinar eritrodiol y uvaol debe tener aproximadamente 2 cm.
de acetona para garantizar que se elimina la humedad. – Rascar con una espátula o similar la banda de esteroles y recoger el raspado en un
– Separación de la fracción de esteroles: matraz de 50 ml. con boca esmerilada. Añadir ≈ 10 ml. de cloroformo caliente, mez-
– Las placas empleadas no necesitan tratamiento básico, solo hay que activarlas y clar y filtrar, recogiendo el filtrado en el matraz corazón seco y tarado.
para ello se introducen en estufa a 105ºC ± 5ºC durante una hora. Las placas ac- – Lavar el residuo en el embudo tres veces con éter etílico (empleando cada vez unos
tivadas se conservan en un desecador. Se activarán únicamente las placas que se 10 ml), recogiendo cada vez el filtrado en el mismo matraz
prevea utilizar cada día. Si las placas no son básicas deberán tratarse previamente. – Evaporar el disolvente en rotavapor. Añadir unas gotas de acetona para completar
– Tratamiento de las placas: Sumergir las placas con gel de sílice unos 4 cm en la so- el secado.
lución etanólica 0,2 N de hidróxido potásico durante 10 segundos; dejar secar las
placas en una campana durante dos horas y, por último, llevarlas a estufa.
– Preparar la cubeta de desarrollo con una mezcla de Hexano/Eter etílico (90:60 v/v).
Dejar transcurrir media hora como mínimo antes de introducir la placa. Cambiar la
mezcla eluyente cada día que se vaya a utilizar.
– Preparar una solución del insaponificable con 300 μl. de acetato de etilo y colocar
100 μl. de esta solución en la microjeringa del Linomat.
– Colocar la placa de gel de sílice en el Linomat y apretar el botón de “Star” y “run”.
– Si no se dispone de aplicador de placa se realizara manualmente con ayuda de una
microjeringa, de forma que se obtenga una línea lo más fina y homogénea posible.

Figura 18: rotavapor y desecador

– Secar totalmente con corriente de nitrógeno y bajo campana a vacío y pesar para
determinar el peso de fracción esterolica .Nota: Si se utiliza estufa debe extremarse
la precaución con la temperatura y el tiempo de secado (10 min a 105º), ya que
pueden producirse alteraciones debido a la termolabilidad de estas moléculas. Es
recomendable emplear estufa o campana de vacio para poder secar a 70º.
– Las muestras quedaran en desecador hasta el momento de la silanización previa al
análisis cromatografico.
– Análisis cromatográfico de la composición de la fracción de esteroles.
Figura 17: Aplicador de placa Linomat – Para preparar los trimetilsililesteres se añade al matraz corazón ≈ 50 μl. del reactivo
de silanización por miligramo de esteroles. Se agita suavemente y se deja reposar a
– Colocar en el extremo de la placa 2-3 μl. de la solución de referencia, patrón de coles- temperatura ambiente al menos 15 minutos.
terol y patrón de uvaol , (caso de realizarse la determinación de dialcoles terpénicos), – Con ayuda de una pipeta Pasteur, trasvasar a un vial de cromatografía. Si la muestra
para poder así identificar la banda de esteroles una vez desarrollada la placa. queda turbia, filtrar con ayuda de una jeringuilla de 1 ml. desechable y un filtro de
– Introducir la placa en la cubeta de desarrollo. 0,45 μm adaptable a la jeringa.

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UE REGIONALES Y DESARROLLO LOCAL EL ANÁLISIS DE ACEITE DE OLIVA VIRGEN
 El contenido en esteroles totales se determina empleando la formula:

Axm
Esteroles totales mg/kg = x 1000
A.p
donde:
Ax = suma de áreas de todos los esteroles
A = área del patrón interno
m = peso de patrón interno añadido
Figura 19: Campana de vacio con Tª
p = peso de muestra

Análisis cromatográfico El porcentaje de dialcoholes terpénicos se determina de acuerdo a:

- Acondicionado de la columna de cromatografía: Cuando la columna se utiliza por pri-
mera vez es necesario acondicionarla, para ello se empleara un programa de tempe-
ratura lento, que partiendo de 50ºC suba la temperatura 1 grado por minuto hasta A1 + A2
% eritrodiol + uvaol= x 100
alcanzar 300º y mantener esta temperatura dos horas. A1 + A2 + ∑A esteroles
Nota: Si la columna comparte equipo con la determinación de ceras es recomenda-
ble acondicionarla hasta 350º
donde:
A1 = área del pico del eritrodiol
- Gases:
A2 = área del pico del uvaol
• Gas portador : Helio 1ml/min (si se utiliza Hidrogeno puede aumentarse el cau-
ΣAesteroles = suma de las áreas de los esteroles
dal a 1,2 ml/min)
• Detector: Hidrogeno 30 ml/min
Los resultados se expresan con una sola cifra decimal excepto en el caso de esteroles
Aire 300 ml/min
totales que no se emplean decimales.
- Condiciones de análisis orientativas:
• Horno de columna: 270º
En el caso de la composición de la fracción de esteroles se emiten resultados de: %
• Detector: 310 Inyector: 300º
Colesterol. % Brasicasterol, % Campesterol, % Estigmasterol, % β-Sitosterol, (ΣΔ.5.23-
• Volumen de muestra inyectada 1µl
Estigmastadienol, Clerosterol, β-Sitosterol, Sistostanol, Δ-5-Avenasterol y Δ.5.24 Estig-
• Relación de split: 1/50
mastadienol), % Δ-7-Estigmastenol y %Δ-7-Avenasterol.

Cálculos y expresión de resultados

Los tiempos de retención relativos de los esteroles estarán en función de la columna
El resultado viene expresado como porcentaje de cada uno de los esteroles.
empleada.
Ax
% esteroles x = x 100 A modo orientativo son:
∑A
donde:
Ax = área de pico del esterol x
ΣA = suma de las áreas de todos los picos

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UE REGIONALES Y DESARROLLO LOCAL EL ANÁLISIS DE ACEITE DE OLIVA VIRGEN
 ESTEROL TIEMPO DE RETENCIÓN mediante cromatografía en placa de gel de sílice básica. Los alcoholes recuperados de la
Colesterol 0,67 gel de sílice se transforman en trimetilsililesteres y se analizan por cromatografía de gases.
Colestanol 0,70
Material, reactivos y equipos
Brasicasterol 0,75
Campesterol 0,85 Reactivos
– Solución etanólica de hidróxido potásico aproximadamente 2 N: pesar ≈ 130 g. de
Estigmasterol 0,89
hidróxido potásico (≈ 85% ) y disolver en ≈ 200 ml. de agua destilada, enfriar. Llevar
Δ-7- Campesterol 0,94 a 1 litro con etanol. Preparar cuando se vaya a utilizar.
Δ-5, 23-Estigmastadienol 0,96 – Éter etílico calidad P.A.
Clerosterol 0,97 – Sulfato sódico anhidro calidad P.A.
– Hexano calidad cromatografía.
β-Sitosterol 1,00 – Acetona calidad cromatografía.
Sitostanol 1,02 – Cloroformo calidad P.A.
Δ-5 Avenastenol 1,03 – Mezcla Hexano/Éter etílico 65:35 para el desarrollo de las placas de cromatografía
– Solución de 2.7-diclorofluoresceina al 0,2% en etanol.
Δ-5-24-Estigmastidienol 1,08
– Reactivo de silanización: HMDS + TMCS + Piridina (3/1/9). (Supelco. 33038).
Δ-7- Estigmastenol 1,12 – Gases de laboratorio: Helio, Aire e Hidrogeno.
Δ-7 Avenasterol 1,16
Patrones
Eritrodiol 1.41
– Solución patrón de los alcoholes alifáticos de C20 a C28.
Uvaol 1.52 Es conveniente prepara una disolución al 0,1% en cloroformo de Docosanol (Sigma
Tabla 4. Tiempos de retención relativos de los esteroles del aceite de oliva B-4755), Tetracosanol (Sigma L-3507), Hexacosanol (Sigma H-2139), y Octacosanol
(Sigma O-3379) . Esta solución se utilizara como referencia en la placa de cromato-
4.2.3 Determinación del contenido de alcoholes alifáticos mediante cromatografía de grafía para identificar la banda de alcoholes y también como referencia en el análisis
gases con columna capilar. cromatografico para identificar los picos de cada uno de los alcoholes que se van a
cuantificar.
– 1-Eicosanol (Sigma A-8635), solución al 0.1% (m/v) en cloroformo (patrón interno)
Principio del método: los alcoholes alifáticos son compuestos lineales de C22 a C28,
normalmente los de número impar se encuentran en menores cantidades respecto a los Materiales
pares. Un alto contenido de los mismos indica la presencia de compuestos polares, inesta- – Matraces redondos de 250 ml. con juntas esmeriladas, provistos de refrigerante de
bles con el tiempo y las bajas temperaturas. Son los precursores de la formación de ceras. reflujo.
– Embudos de separación de 500 ml. con tapón.
Su formula seria: – Matraces de 250 ml.
CH3 - ( CH2 )n - CH2 OH – Matraces erlenmeyer de 50 ml. con refrigerantes de reflujo.
– Matraces corazón con junta esmerilada.
donde n=20 a 26 para los alcoholes mayoritarios que son objeto de cuantificación en – Placas de gel de sílice. Merck ref. 105721
este procedimiento. – Embudos
– Filtros de pliegues.
Este procedimiento permite determinar mediante cromatografía de gases con columna – Cubeta para desarrollo de placas de cromatografía de capa fina.
capilar el contenido de alcoholes alifáticos en las materias grasas obtenidos a partir de la – Microviales para cromatografía.
saponificación de la materia grasa, a la que se habrá añadido 1-eicosanol como patrón – Microjeringa de vidrio de 1000 μl.
interno, con una solución etanólica de hidróxido potásico y posterior separación del insa- – Columna capilar de 30 m.de sílice fundida 0,25 mm de diámetro interno, recubierta
ponificable con éter etílico. La fracción de alcoholes alifáticos se separa del insaponificable con una película de 0,20 μm de espesor de la fase 5 %-difefenilmetilsilicona

58 INTI PROYECTO MEJORA DE LAS ECONOMÍAS TÉCNICAS Y PRÁCTICAS DE LABORATORIO PARA 59

UE REGIONALES Y DESARROLLO LOCAL EL ANÁLISIS DE ACEITE DE OLIVA VIRGEN
 Instrumental – Lavar el residuo en el embudo tres veces con éter etílico (empleando cada vez unos
– Batería de mantas calefactoras. 10 ml), recogiendo cada vez el filtrado en el mismo matraz.
– Aplicador de placa de cromatografía Linomat-Camag. – Evaporar el disolvente en rotavapor, secar totalmente con corriente de nitrogeno y
– Rotavapor. en campana o estufa de vacío.
– Cromatografo de gases con inyector automático y detector FID – Pesar el matraz para determinar los mg de alcoholes alifáticos que se han extraído
– Las muestras quedaran en desecador hasta el momento de la silanización, previa al
análisis cromatografico.
Procedimiento analítico – Para preparar los trimetilsililesteres se añade al matraz corazón 50 μl. del reactivo
de silanización por mg de alcoholes, se agita suavemente y se deja reposar a tem-
Preparación del insaponificable peratura ambiente al menos 15 minutos.
– Con ayuda de una pipeta Pasteur, trasvasar a un microvial de cromatografía. Si la
Nota (1): Este procedimiento se utiliza para determinar el contenido en alcoholes ali- muestra queda turbia, filtrar con ayuda de una jeringuilla de 1 ml. desechable y un
fáticos, no obstantes puede realizarse de forma conjunta con la determinación de estero- filtro de 0,45 μm adaptable a la jeringa o centrifugar.
les, empleando el patrón o patrones internos correspondientes.
Análisis cromatográfico
– Introducir, en el matraz de 250 ml, 500µl de solución de 1-eicosanol al 0.1% en clo- – Acondicionado de la columna de cromatografía: Cuando la columna se utiliza por pri-
roformo , (en caso de aceite de orujo se emplearan 1500 µl ). mera vez es necesario acondicionarla, para ello se empleara un programa de tempe-
ratura lento, que partiendo de 50ºC suba la temperatura 1 grado por minuto hasta
Nota: Si se va a realizar conjuntamente la determinación del contenido en esteroles alcanzar 300º y mantener esta temperatura dos horas.
se introducirá también 1 ml de la solución de α-colestanol. Nota: Si la columna comparte equipo con la determinación de ceras es recomenda-
ble acondicionarla hasta 350º
– Evaporar en corriente de nitrógeno hasta sequedad y, a continuación, pesar con pre-
cisión, en el mismo matraz, 10 g de la muestra seca y filtrada ( 5 g en caso de aceite Gases
de orujo) y añadir 50 ml. de solución etanolica de KOH ≈ 2N. – Gas portador : Helio 1ml/min (si se utiliza Hidrogeno puede aumentarse el caudal
– Adaptar el refrigerante de reflujo y calentar con manta calefactora hasta ligera. ebu- a 1,2 ml/min)
llición. Mantener en ebullición ≈ 60 minutos, agitando periódicamente. – Detector: Hidrogeno 30 ml/min
– Seguir los pasos descrito en el procedimiento para la determinación de esteroles. Aire 300 ml/min
– Condiciones de análisis orientativas:
– Horno de columna:
Separación de la fracción de alcoholes 5º/min 10º/min
– Realizar la separación en placa de cromatografía siguiendo los pasos descritos en 190º (5min) --> 260º (15 min) --> 290º (5min)
el procedimiento para la determinación de esteroles teniendo en cuenta colocar en – Detector: 310 Inyector: 280º
el extremo de la placa 2-3 μl. de la solución de referencia, mezcla de alcoholes, para – Volumen de muestra inyectada 1µl
poder así identificar la banda de alcoholes alifáticos una vez desarrollada la placa. – Relación de split: 1/50

Nota: Se marcaran la banda de alcoholes alifáticos y la banda inmediatamente su-

perior que corresponde a los alcoholes triterpénicos, ya que esta incluye cantidades Cálculos y expresión de resultados
s significativas de alcoholes alifáticos. Calcular del modo siguiente el contenido de cada uno de los alcoholes alifáticos, expre-
sado en mg/Kg de materia grasa:
– Rascar con una espátula o similar la banda de alcoholes y recoger el raspado en un
Ax . ms . 1000
matraz de 50 ml. con boca esmerilada. Añadir ≈10 ml. de cloroformo caliente, mez- mg/kg alcoholx =
clar y filtrar , recogiendo el filtrado en el matraz corazón seco y tarado. As . m

60 INTI PROYECTO MEJORA DE LAS ECONOMÍAS TÉCNICAS Y PRÁCTICAS DE LABORATORIO PARA 61

UE REGIONALES Y DESARROLLO LOCAL EL ANÁLISIS DE ACEITE DE OLIVA VIRGEN
 Donde: – Solución alcohólica de hidróxido potásico al 10 %. Añadir 10 ml de agua a 50g de hi-
AX = área del pico del alcohol x dróxido potásico, agitar y diluir seguidamente la mezcla en etanol hasta un volumen
AS = área del pico del 1-eicosanol de 500 ml. Debe prepararse diariamente.
mS = peso de 1-eicosanol añadido, en mg – Gel de sílice 60 extrapuro para columna de cromatografía, de 70-230 mallas (refe-
m = peso de la muestra tomada para la determinación en g. rencia 7754 de Merck)
– Gas portador para cromatografía: helio de 99,9990 % de pureza.
Los resultados se expresan sin cifras decimales. – Gases auxiliares para el detector de ionización de llama: aire purificado e hidrógeno
de 99,9990 % de pureza.
Se expresa el contenido de cada uno de los alcoholes alifáticos en mg/Kg de materia – Colesta-3,5-dieno (SIGMA C-6012)
grasa y la suma de C22, C24, C26 y C28 como “alcoholes alifáticos totales”. – n-Nonacosano (SIGMA N-4254)

Patrones
4.2.4 Determinación de los estigmastadienos en los aceites vegetales por cromato- – Solución madre (200 ppm) de colesta-3,5-dieno en hexano (10 mg en 50 ml)
grafía de gases con columna capilar. – Solución patrón de colesta-3,5-dieno en hexano con una concentración de 20 ppm,
que se obtiene diluyendo la solución anterior. Duración en nevera 4 meses.
Principio del método: el estigmasta-3,5-dieno es un hidrocarburo esteroideo que se – Solución de n-nonacosano en hexano con una concentración aproximada de 100
forma en el proceso de refinación por deshidratación a partir del beta-sitosterol (principal ppm.
componente de la fracción de esteroles). Indica por tanto presencia de aceites refinados
Materiales
– Matraces redondos de 250 ml. provistos de refrigerante de reflujo con juntas esme-
riladas.
– Embudos de separación de 500 ml. con tapón.
– Matraces de 250 ml.
– Matraces corazón con junta esmerilada.
– Embudos
– Filtros de pliegues.
– Microviales para cromatografía.
– Columna de vidrio para cromatografía ,( 1,0 cm de diámetro interno por 40 cm de
longitud) provista de una llave de teflón. Para preparar la columna se añade un poco
Este procedimiento permite determinar mediante cromatografía de gases la presencia de lana de vidrio y se cubre con hexano, llenándose a continuación con una papilla
de estigmastadienos, obtenidos a partir de la saponificación de la materia grasa con una de gel de sílice en hexano ( ≈ 15g en 40 ml) mediante la ayuda de varias porciones de
solución etanólica de hidróxido potásico y posterior aislamiento de la materia insaponifi- hexano. Se deja sedimentar la mezcla en reposo, completándose la sedimentación
cable. Separación de la fracción de hidrocarburos esteroideos mediante cromatografía en aplicando una ligera vibración. Añadir sulfato sódico anhidro hasta una altura de
columna de gel de sílice y análisis mediante cromatografía de gases en columna capilar. aproximadamente 0,5 cm y finalmente eluir el exceso de hexano.
– Columna capilar de sílice fundida 30 m de longitud, recubierta con una película de la
fase 5 %-fenilmetilsilicona.
Material, reactivos y equipos
Instrumental
Reactivos – Batería de mantas calefactoras.
– Hexano para C.G. – Rotavapor.
– Etanol absoluto P.A. – Cromatografo de gases con inyector automático y detector FID.
– Sulfato sódico anhídro para C.G.
– Hidróxido potásico P.A.

62 INTI PROYECTO MEJORA DE LAS ECONOMÍAS TÉCNICAS Y PRÁCTICAS DE LABORATORIO PARA 63

UE REGIONALES Y DESARROLLO LOCAL EL ANÁLISIS DE ACEITE DE OLIVA VIRGEN
 Procedimiento analítico Análisis cromatográfico de estigmastadienos
– Acondicionado de la columna de cromatografía: Cuando la columna se utiliza por pri-
Preparación del insaponificable mera vez es necesario acondicionarla, para ello se empleara un programa de tempe-
– Pesar 20 ± 0.1g de aceite de oliva virgen en un matraz de 250 ml, añadir 1 ml de ratura lento, que partiendo de 50ºC suba la temperatura 1 grado por minuto hasta
solución patrón de colesta-3,5-dieno (20ppm) y 75 ml de potasa alcohólica al 10 %. alcanzar 300º y mantener esta temperatura dos horas.
En caso de aceites de cuya composición forme parte aceite refinado se pesarán 10 Nota: Si la columna comparte equipo con la determinación de ceras es recomenda-
± 0.1g. ble acondicionarla hasta 350º
– Adaptar el refrigerante de reflujo y calentar con manta calefactora hasta ligera ebu-
llición. Mantener en ebullición 30 minutos. – Gases
– Dejar enfriar y añadir aproximadamente 100 ml. de agua destilada por la parte supe- • Gas portador : Helio 1ml/min (si se utiliza Hidrogeno puede aumentarse el cau-
rior del refrigerante. Separar y dejar enfriar a temperatura ambiente. dal a 1,2 ml/min)
– Transvasar cuantitativamente el contenido del matraz a un embudo de decantación • Detector: Hidrogeno 30 ml/min
de 500 ml. Aire 300 ml/min
– Añadir 100 ml. de hexano, agitar y dejar reposar hasta separación de las dos fases.
– Separar la fase acuosa y recoger la fase orgánica sobre un matraz. Si se produce – Condiciones de análisis orientativas:
emulsión que no desaparece, añadir pequeñas cantidades de etanol. • Horno de columna:
– Realizar una nueva extracción de la fase acuosa con otros 100 ml. de hexano. 2º/min
– Reunir con la anterior fase orgánica en un embudo de decantación y lavarlas con 235º (10min) --> 285º (5 min)
unos 100 ml. de una mezcla de etanol-agua destilada (1:1) al menos 3 veces. • Detector: 310 Inyector: 300º
– Eliminar las aguas de lavado, secar con sulfato sódico anhidro y filtrar con filtro de • Volumen de muestra inyectada 1µl
pliegues al que se ha añadido sulfato sódico anhidro. • Relación de split: 1/20
– Destilar el hexano en rotavapor hasta eliminar totalmente el disolvente, ayudarse de
una corriente de nitrógeno si hace falta.
– Añadir 1 ml de hexano y guardar en la nevera hasta su utilización.

Separación de la fracción de hidrocarburos esteroideos

– Introducir el residuo en la columna de fraccionamiento con ayuda de 1 ml de hexano,
distribuir la muestra en la columna dejando que el nivel de solución descienda hasta
la parte superior del sulfato sódico.
– Comenzar la elución cromatográfica con hexano a un flujo aproximado de 1 ml/min.
– Desechar los primeros 25-30 ml de eluido y recoger la fracción siguiente de 40-50ml.
Nota: Debe comprobarse el volumen de eluido optimo para desechar ya que si no
Figura 20: Cromatografo de Gases Varian
se desecha el volumen adecuado pueden aparecer picos correspondientes a hidro-
carburos saturados que interferirán cm el patrón interno , impidiendo una adecuada Nota: Para poner a punto el método cromatografico es conveniente comenzar inyec-
cuantificación de estigmastadieno. tando el patrón interno y la solución de nonacosano para determinar sus tiempos de re-
– Evaporar esta fracción en el rotavapor hasta sequedad. tención y garantizar una buena separación del pico de estigmastadieno.
– Disolver inmediatamente el residuo en 0.2 ml de hexano y mantener la solución en
la nevera hasta el momento de su análisis.
Cálculos y expresión de resultados
El contenido de los estigmastadienos se determina aplicando la fórmula:
As . mc
mg/Kg de estigmastadieno =
Ac . ms

64 INTI PROYECTO MEJORA DE LAS ECONOMÍAS TÉCNICAS Y PRÁCTICAS DE LABORATORIO PARA 65

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 donde: – Acetonitrilo o Propionitrilo calidad HPLC.
– Fase móvil: 100% A : 40 ml de acetonitrilo + 60 ml de acetona
AS = área del pico de estigmastadienos.
AC = área del pico del patrón interno. Patrones
MC= peso de patrón añadido, en microgramos – Trilinoleina (T9517 SIGMA)
MS= peso de aceite empleado, en gramos
Materiales
Los resultados se expresan con dos cifras decimales. Los tiempos de retención relati- – Tubos de ensayo de 15 ml
vos en la columna empleada son: – Jeringas desechables de 20 ml
Colestadieno → 17.8 ± 0.1 – Agujas, grifos y adaptadores del aparato de elución al vacio.
Estigmastadienos → 22.9 ± 0.1 – Tubos de vidrio de paredes gruesas con cierre hermético.
– Pipeta Pasteur.
– Pipeta automática de volumen variable (200-1000µl)
– Viales para cromatografía. de 2 ml.
– Matraces corazón 25 ml
4.2.5 Determinación de la diferencia entre el contenido real y el contenido teórico en – Jeringas de desechables de 5 ml
triglicéridos con ECN 42. – Filtros 0.45 μm
– Botellas de vidrio Pirex de 1000ml

Principio del método: es un parámetro que nos da una idea de la distribución de ácidos
grasos en la formación de los triglicéridos, comparando la distribución esperada y la real.

El contenido teórico de triglicéridos con número de carbonos 42, ECN42, (calculado

sobre la base de la determinación de la composición de ácidos grasos mediante CG) y el
contenido de triglicéridos con ECN42 determinado mediante HPLC se corresponden den-
tro de unos límites en el caso de los aceites puros. Las diferencias superiores a los valores
establecidos en la Norma, respecto a cada tipo de aceite, indican que el aceite contiene
aceite de semillas.

Figura 21: elución al vacio y elución manual

Material, reactivos y equipos

Reactivos Instrumental
– Eter dietílico calidad P.A – Aparato de elución al vacío.
– Hexano calidad CG – Balanza analítica.
– Disolvente de elución para la purificación del aceite: hexano / éter dietílico 87/13 – Evaporador de rotación
(v/v) – Agitador de tubos.
– Cartucho de gel de sílice ( 1g / 6 ml) – Cromatógrafo de Gases con inyector automático y detector FID.
– Heptano calidad CG – Columna capilar Rtx-2330.(Restek)(10% ciano propilfenil polioxilano) 60 m, 0’25 mm
– Hidróxido potásico solución metanólica ≈ 2 N, disolver ≈ 11,2 g de KOH en 100 ml de diámetro y 0’2 μm de espesor de film.
de metanol. – Cromatografo de líquidos de alta resolución con control termostático de la tempera-
– Acetona calidad HPLC tura de la columna , sistema de inyección de volúmenes de 10 μl. y detector: Índice
de refracción ,

66 INTI PROYECTO MEJORA DE LAS ECONOMÍAS TÉCNICAS Y PRÁCTICAS DE LABORATORIO PARA 67

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 – Columna de acero inoxidable de 250 mm de longitud y 4.5 mm de diámetro interior, Cálculos y expresión de resultados
rellena de partículas de sílice de 5 μm de diámetro con un 22-23 % de carbono en Se comparan el contenido teórico calculado a partir de la composición de ácidos grasos
forma de octadecilsilano. (Rp 18) y el determinado por HPLC, que incluirá los picos correspondientes a los triglicéridos con
Nota: Si no se dispone de sistema de elución al vacio la operación puede realizarse ECN-42 (LLL+OLnL+PLnL).
manualmente con cartuchos de gel de sílice a los que se adaptan jeringas de plástico.
Para realizar estos cálculos se emplea la hoja de calculo: "Computer program excel file",
Procedimiento analítico disponible en http://www.internationaloliveoil.org/estaticos/view/224-testing-methods.
– Pesar aproximadamente 0,12 g de muestra en un tubo con tapa de rosca.
– Añadir 0.5 ml de hexano y agitar. Los ácidos grasos considerados para el cálculo son:
– Colocar las columnas en el aparato de elución al vacío (primero la aguja, luego la
llave y la columna). • Ácido palmítico ( P )
– Lavar la columna con 6 ml de hexano y desechar el hexano. • Ácido palmitoleico ( Po )
– Dejar de aplicar el vacío para evitar que se seque la columna. • Ácido esteárico ( S )
– Introducir en la columna la solución de la muestra y aplicar de nuevo el vacío. • Ácido oleico ( O )
– Colocar en la columna el adaptador y la jeringa. • Ácido linoleico ( L )
– Añadir 10 ml de eluyente (hexano/eter). • Ácido linolénico ( Ln )
– Homogeneizar la totalidad de los eluidos y dividirlo en dos alícuotas similares, cada
una se colocara en un matraz corazón de 25 ml. El resultado final se expresa con dos cifras decimales.
– Evaporar en el rotavapor las dos alícuotas.
– A una de ellas se le añade 1 ml de heptano y se trasvasa a un tubo de metilación
con ayuda de 1 ml de heptano, se agita para homogeneizar y se añade 0.2 ml de 4.3 OTROS MÉTODOS ANALÍTICOS
Hidróxido potasico metanólico, se agita durante 30 s y se deja reposar 30 min. Una
vez separadas las dos fases se coge la de arriba y se pasa a un vial de cromatografia Además de los métodos analíticos de control de calidad y genuinidad descritos en este
de 2 ml. La muestra esta lista para CG. cuaderno cabe reseñar otros métodos analíticos que son de interés ya que nos aportan
– A la otra se le añade 1 ml de acetona, se homogeneiza y se filtra por un filtro de 0.45 una información importante sobre el grado de estabilidad de un aceite de oliva virgen de
μm y se pasa a vial de 2 ml y queda lista para HPLC. calidad.

Análisis de los ácidos grasos por CG Estos métodos son: estabilidad oxidativa, contenido en polifenoles totales y la deter-
– Realizar el análisis de la composición de acidos grasos siguiendo el procedimiento minación de biofenoles.
descrito en el apartado correspondiente (2.2.1)
No se van a describir de forma exhaustiva estos métodos de análisis pero si que puede
Análisis de los triglicéridos mediante HPLC ser de interes conocer su fundamento y aplicación.
– Encender el equipo y comenzar a pasar la mezcla eluyente aumentando progresiva-
mente el caudal hasta alcanzar el flujo de trabajo .
– Esperar hasta que se estabilice el detector y se consiga una línea base estable. 4.3.1 Determinación de la estabilidad oxidativa mediante Rancimat.
– Inyectar la muestra.
Nota: Para identificar los trigliceridos con ECN-42 se recomienda comenzar con la
inyección del patrón de Trilinoleina. Principio del método: el Rancimat es un equipo que se basa en la detección conduc-
Para la puesta a punto de las condiciones cromatograficas se recomienda utilizar timétrica de los productos de descomposición de las grasas, y permite la determinación
una muestra de aceite de girasol. automática del tiempo de estabilidad a la oxidación de aceites y grasas.

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 La degradación de las grasas y de los aceites origina el enranciamiento de los mis- astrigencia y sabores amargos de los aceites de oliva. La cantidad de polifenoles varia sig-
mos. El término enranciamiento se aplica para describir el desarrollo de olores y sabores nificativamente entre distintos aceites de oliva, dependiendo de la variedad y del estado
indeseables como consecuencia de determinados cambios en la fracción grasa de los ali- de madurez de la aceituna , siendo la concentración más alta en el envero.
mentos.
La técnica para determinar los polifenoles en el aceite de oliva consiste en una extrac-
La oxidación comienza con una fase de iniciación, lenta y sin manifestaciones externas ción previa de los polifenoles contenidos en el aceite, con una mezcla metanol-agua y su
medibles y después pasa a una fase rápida de propagación y finaliza en la descomposición posterior cuantificación a partir de una reacción colorimétrica. Se emplea el reactivo de Fo-
en productos volátiles. lin-Ciocalteau que dará lugar a una coloración azul, debida a la reducción en medio alcalino
de la mezcla de los ácidos fosfomolibdico y fosfowolframico por los compuestos fenólicos
El procedimiento consiste en someter el aceite o grasa a condiciones extremas que extraídos. La intensidad de esta coloración dependerá de la concentración de polifenoles
inducen oxidación de forma rápida: elevadas temperaturas, y elevado caudal de aire. Las en la disolución. y se determina mediante la medida de la absorbancia a 725 nm .Las ab-
temperaturas habituales de medida son a 100ºC, 110ºC y 120ºC. Siendo la más utilizada sorbancias de las muestras deben estar dentro de la recta de calibrado, preparada a partir
a 120ºC y a un caudal de aire de 10 l/h. de acido cafeico. La concentración de polifenoles se expresa en mg/kg de ácido cafeico

Los gases liberados durante el proceso de oxidación, junto con el aire, circulan por un
tubo que contiene agua desmineralizada o destilada y un electrodo para medir la conduc-
tividad. El electrodo está conectado a un aparato de medición y registro. Un incremento
rápido de la conductividad indica el final del período de inducción, siendo la causa de este
incremento acelerado la acumulación de ácidos grasos volátiles, producidos durante la
oxidación. El rango habitual de trabajo a 120ºC es de 0,0h-48,0h.

4.3.3 Determinación de Biofenoles de los aceites de oliva por HPLC

Principio del método: cuando un aceite se oxida se produce una pérdida significativa de
polifenoles y un incremento de los productos de oxidación.

Los biofenoles del aceite de oliva virgen son un grupo de compuestos minoritarios
pero que tienen importante actividad biológica. Están presentes en distintas cantidades
según el tipo de aceite, pero mantienen un perfil característico y constante según la varie-
Figura 22. Equipo Rancimat para determinación de la estabilidad oxidativa dad, pero que desaparecen en el proceso de refinado.

La presencia de estructuras fenolicas y ortodifenolicas como el tirosol y el hidroxi-

4.3.2 Determinación del contenido en polifenoles totales tirosol tiene una acción antioxidante natural como secuestrantes de radicales libres. La
oleuropeina y el hidroxitirosol llegan a tener más capacidad antioxidante que la vitamina
Principio del método: los polifenoles son compuestos con propiedades antioxidantes C. El hidroxitirosol juega un papel importante en el control de la oxidación de compuestos
gracias al bloqueo de radicales libres. Estos compuestos forman parte de la fracción polar como el linoleato de metilo.
de los aceites de oliva vírgenes, y hay evidencias de que la estabilidad de los aceites a
la autoxidación es principalmente debida a los altos contenidos en estas sustancias, y
particularmente a los ortodifenoles. Los compuestos fenólicos contribuyen también a la

70 INTI PROYECTO MEJORA DE LAS ECONOMÍAS TÉCNICAS Y PRÁCTICAS DE LABORATORIO PARA 71

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 El procedimiento se basa en la extracción, mediante una solución metanólica, y la 5. PARAMETROS DE CALIDAD DE LOS MÉTODOS DE ENSAYO
cuantificación de los componentes polares, de naturaleza biofenólica, como son los deri- DE ACUERDO A LA NORMA ISO 17025.
vados naturales u oxidados de la oleuropeína y del ligustrósido, los lignanos, los flavonoi-
des y los ácidos fenólicos presentes en el aceite de oliva.

La cuantificación se realiza mediante HPLC provisto de bomba ternaria, con detector La Norma ISO/IEC 17025 "Requisitos generales para la competencia de los laborato-
de UV y DAD para el registro de espectros y su identificación. Se emplea una columna rios de ensayo y calibración" hace referencia en su apartado 5.4 a los métodos de ensayo y
de 25 cm C18. El contenido en derivados naturales y/o oxidados de la oleuropeína y del su validación y en el apartado 5.9 establece el Aseguramiento de la calidad de los ensayos.
ligustrósido, de los lignanos, de los flavonoides y de los ácidos fenólicos se determina a
280 nm ,empleando acido siríngico como patrón interno y el resultado se expresa en mg/ Estos dos apartados son de vital importancia en el momento de la puesta a punto de
kg de tirosol. un método analítico y deben considerarse como prioritarios en la puesta en marcha de un
laboratorio si se quiere integrar dentro de un sistema de gestión de calidad.

5.1 ESTUDIO DE VALIDACIÓN DE UN MÉTODO DE ENSAYO

El laboratorio debe utilizar métodos normalizados publicados como normas interna-

cionales, nacionales o regionales y siempre en su última versión. La puesta a punto de un
método analítico debe ser planificada,estableciendo a priori los requisitos que deben cum-
plirse y realizando una validación que permita garantizar que se cumplen los requisitos
establecidos en la norma de referencia, (norma COI T20/Doc 42-2."Valores de precisión de
los métodos adoptados por el COI).
Figura 23: Cromatógrafo de líquidos (HPLC)
Con carácter general la validación debe incluir :

– Estudio de la precisión del método: repetibilidad y reproducibilidad:

Para realizar este estudio se efectuarán análisis sucesivos en condiciones de re-
petibilidad (misma muestra, mismo analista, mismo día), y análisis sucesivos en
condiciones de reproducibilidad (misma muestra, analistas distintos, días distintos).
El estudio debe abarcar todo el rango de trabajo establecido, por lo que deben em-
plearse muestras representativas de estos rangos.
La evaluación estadística de los resultados de estos ensayos ( media , desviación
estandar y coeficiente de variación ) nos permite obtener va lores de r y R , calcu-
lados como 2√2 sr y
2√2 sR . Los valores de r y R obtenidos deben ser coherentes con los establecidos
en la Norma.

– Estudio de la exactitud:
Para realizar este estudio deben emplearse materiales de referencia, es decir mues-
tras que tienen un valor y una incertidumbre asignados. La exactitud se calculará a
partir de la fórmula

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 5.2 CONTROL DE CALIDAD DE UN MÉTODO DE ENSAYO
VRi - X̅i
E= .100
Vri
El laboratorio debe establecer un "plan de control de calidad de los ensayos" con objeto
de garantizar la validez de los mismos.
donde:
VRi = Valor de referencia de la muestra Este "plan de control de la calidad" debe incluir las operaciones de control de calidad
X̅ = Valor medio de la muestra analizada en el laboratorio interno y control de calidad externo.

Verificando previamente que se cumple El control de calidad interno debe incluir:

- Análisis de muestras por duplicado en condiciones de repetibilidad
- Análisis de muestras en condiciones de reproducibilidad.
- Análisis de materiales de referencia (o muestras control cuando no se disponga de ellos)
| VRi - X̅i |
≤1
t. Si 2 El control de calidad externo hace referencia a la participación en ensayos de inter-
U2VRI +
n comparación de forma programada y periódica.

Todos los resultados obtenidos en los distintos ensayos de control de calidad deben
ser recogidos y evaluados, con objeto de poder aplicar tratamientos estadísticos adecua-
donde: Uvri = incertidumbre del valor de referencia dos, que nos permitirán evaluar si se cumplen los criterios y tolerancias establecidas y si
t = t de Student para nR medidas con α = 0.05 existen "tendencias".

– Calculo de limite de detección y cuantificación: Los criterios de evaluación de los diferentes controles de calidad así como las toleran-
Con carácter general el límite de detección y cuantificación puede realizarse a partir cias establecidas deben quedar descritos en este "plan de control de calidad de los ensa-
del análisis en condiciones de repetibilidad de un blanco. yos" y deben ser coherentes con los resultados obtenidos en la validación de cada ensayo.
El límite de cuantificación se calculara como:
El objetivo final del control de calidad no es otro que evitar la emisión de resultados
L.C. = valor medio + 10*Sr incorrectos.

La validación de todo método analítico concluye con el cálculo de la incertidumbre

expandida que aunque normalmente se calcula y establece como porcentaje del
valor analítico obtenido, que para un mismo método de ensayo suele ser diferente
en función del rango de trabajo. En un informe de ensayo la incertidumbre de una
determinación se expresa como valor absoluto, es decir como el valor que corres-
ponde al resultado obtenido.

Normalmente la incertidumbre de los ensayos solo se incluye en los "Informes de

ensayo" a petición explicita del cliente.

74 INTI PROYECTO MEJORA DE LAS ECONOMÍAS TÉCNICAS Y PRÁCTICAS DE LABORATORIO PARA 75

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 6. DOCUMETACIÓN DE REFERENCIA • Cert, A.; Alba, J.; Pérez-Canimo, M.C.; Ruiz-Gómez, A.; Hidalgo, F.; Moreda, W.; Mo-
yano, M.J.; Martinez, F.; Tubaileh, R.; Olías, J.M. 1999. “Influencia de los sistemas de
extracción sobre las características y los componentes menores del aceite de oliva
virgen extra”. Ciencia y técnica, 79: 41-50.
• Norma COI/ T20/ Doc nº34 Nov-2015: "Determination of free fatty acids, cold • Di Vaio, C.; Nocerino, S.; Paduano, A.; Sacchi, R. 2013. “Influence of some enviromen-
method". tal factors on drupe maturation and olive oil composition”. Journal of the Science of
• Norma COI/ T20/ Doc nº33 Feb-2015 " Determination of fatty acid methyl esters by Food and Agriculture, 93: 1134–1139.
gas chromatography • Humanes, J. 1992. “Producción de aceite de oliva de calidad. Influencia del cultivo”.
• Norma COI/ T20/ Doc nº26 Feb-2015 "Determination of aliphatic and triterpenic Junta de Andalucía. Consejería de Agricultura y Pesca. Serie Apuntes. 21/92.
alcohols content by capillary gas chromatography
• Norma COI/ T20/ Doc nº29 Nov-2009 " Determinación de los biofenoles de los acei-
tes de oliva mediante HPLC"
• Norma COI/ T20/ Doc nº28- 2010 "Determination of the content of waxes, fatty acid
methyl esters and fatty acid ethyl esters by capillary gas chromatography"
• Norma COI/ T20/ Doc nº20- 2010 "Determination of the difference between actual
and theoretical content of triacyglycerols with ECN 42".
• Norma COI/ T20/ Doc nº30 Nov-2013 "Determination of the composition and con-
tent of sterols and triterpene dialcohols bycapillary column gas chromatography"
• Norma COI/ T20/ Doc nº11- 2001 "Determinación de los estigmastadienos en los
aceites vegetales"
• Norma COI/ T20/ Doc nº19 Feb-2015 " Spectrophotometric investigation in the
ultraviolet"
• Norma COI/ T15/ NC nº3 Mayo-2013 "Norma comercial aplicable a los aceites de
oliva y los aceites de orujo de oliva"
• Norma COI/ T20/ Doc nº42-2 Sep-2007 "Precision values of the methods of analysis
adopted by the International Olive Council"
• REGLAMENTO (CEE) N o 2568/91 de la comisión de 11 de julio de 1991 relativo a las
características de los aceites de oliva y de los aceites de orujo de oliva y sobre sus
métodos de análisis. (Texto consolidado )
• REGLAMENTO DE EJECUCIÓN (UE) N o 1348/2013 DE LA COMISIÓN de 16 de diciem-
bre de 2013 que modifica el Reglamento (CEE) n o 2568/91 relativo a las caracterís-
ticas de los aceites de oliva y de los aceites de orujo de oliva y sobre sus métodos
de análisis.
• Norma COI/ T20/ Doc nº14 Mayo-2013"Sensory analysis of olive oil standard guide
for the selection, training and monitoring of skilled virgin olive oil taster
• Norma COI/ T20/ Doc nº15 Nov-2015 " Sensory analysis of olive oil method for the
organoleptic assessment of virgin olive oil"
• Graciani, E. "Los aceites y grasas: composición y propiedades" (Ed. Mundiprensa)
• Barranco, D.; Fernanadez-Escobar, R.; Rallo, L. 2008. “El cultivo del olivo”. ( Ed. Mun-
diPrensa.)

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UE REGIONALES Y DESARROLLO LOCAL EL ANÁLISIS DE ACEITE DE OLIVA VIRGEN
NOTASNOTAS

Diseño Gráfico: INTI - Área de Comunicación

PROYECTO MEJORA DE LAS ECONOMÍAS
REGIONALES Y DESARROLLO LOCAL

TÉCNICAS Y PRÁCTICAS
DE LABORATORIO PARA
EL ANÁLISIS DE ACEITE
DE OLIVA VIRGEN

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