UNIVERSIDAD SAN FRANCISCO DE QUITO
LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR
Fecha de Entrega del Informe: 24/9/2018
1. TEMA: Enzimas de Restricción y Electroforesis
2. Introducción:
Las enzimas de restricción son también conocidas como endonucleasas, lo cual quiere
decir que su función es cortar la secuencia del ADN (Denizard, 2014). Este corte lo
logran ya que reconoces secuencias específicas de ADN llamados sitios de restricción y
se unen a ellos rompiendo los enlaces fosfodiester; son extraídas de bacterias u otros
organismos procariontes en los cuales sirven como mecanismo de defensa ante extraños
como virus (Denizard, 2014). Al momento de separar las hebras de la doble hélice del
ADN quedan extremos monocatenarios sobresalientes que pueden unirse por
complementariedad con su misma hebra de ADN o también con otra hebra que contenga
su secuencia complementaria, a esto se llama extremos cohesivos; la unión se realiza por
la acción de la ADN ligasa cuya función es unir fragmentos complementarios
(KhanAcademy, s/d).
Existen tres tipos de enzimas de restricción los cuales son:
Tipo 1: Tienen actividad de restricción y modificación. El corte no se realiza
en el sitio de restricción sino a cierta distancia de este. Necesitan ATP para
movilizarse desde el sitio de restricción hasta el lugar de corte (Herveg,
2006).
Tipo 2: Hay una enzima que es la encargada de la restricción y otra de la
modificación. Son predecibles en cuanto al lugar en el que realizarán el
corte. No necesitan ATP y su único cofactor es Magnesio (Herveg,
2006).
Tipo 3: Son muy similares a las del tipo 1. Realizan los cortes alejados del sitio
de restricción (Herveg, 2006).
La electroforesis es obligar a moléculas cargadas a pasar por una matriz con ayuda de una
carga eléctrica, las secuencias de ADN separadas por electroforesis por ejemplo son
separadas por su tamaño gracias a un gel de electroforesis hecho a base de agarosa o
poliacrilamida (Denizard, 2014). Los fragmentos de ADN migran dependiendo su
tamaño, a mayor peso menos migración y a menor peso mayor migración, esto se da
debido al tamaño de los poros que se forman en el gel, si el fragmento es muy grande no
pasará fácilmente por los poros; el paso de fragmentos dará lugar a bandas, las cuales
serán indicadores del tamaño del fragmento, se emplea una escalera de ADN como base
para predecir exactamente el tamaño de los fragmentos (Morales, s/d). Para observar los
fragmentos en el gel es necesario usar un colorante, bromofenol azúl, y fotografiarlo
contra una luz UV (Denizard, 2014).
El gel no es la única manera de realizar este procedimiento, también se lo puede realizar
mediante:
En disolución libre (CZE): Utiliza buffers.
Electrocinética micelar (MEKC): Utiliza iones
Isoelectroenfoque capilar (CIEF): Utiliza pH.
3. RESULTADOS:
pB
Electroforesis de ADN del fago 𝝀 digerido con enzimas de restricción
E 1 2 3 4 5
10000
8000
6000
5000
4000
3000 0
2500 0
2000
01500
0
1500
1000
750
500
250
Fuente 1 - Laboratorio Biología Molecular USFQ – Transiluminador de luz UV
Figura 1. Electroforesis de ADN del fago Lambda digerido con enzimas de restricción.
E: Escalera de ADN de 1 Kb Marca Promega. 1: Restricción del ADN del fago Lambda
con EcoRI. 2: Restricción del ADN del fago Lambda con HindIII. 3: Restricción del ADN
del fago Lambda con EcoRI y HindIII. 4: Control negativo (-). 5: Control positivo (+). A
la izquierda se encuentra rotulada la guía del peso respectivo de cada fragmento de ADN
en pares de bases (pB)
4. Discusión
El experimento tuvo varios errores que lograron alterar los resultados finales obtenidos,
tanto el ADN suministrado en el carril 2 de la enzima “EcoRl” como en el Carril 3 de la
enzima “Hindlll” no logro escindirse, sin embargo, el carril 4 que contenía ADN con
ambas enzimas (EcoRl + Hindll) si logro escindirse y dejar rastro a lo largo del gel. Que
en el carril 4 haya existido ADN escindido demuestra que el ADN contenía sitios de
reconocimiento y restricción y que las enzimas suministradas actuaban sobre dichos
sitios. No obstante, se puede determinar que la razón por la cual el carril 2 y 3 no muestra
cortes ni desplazamiento se debe a un fallo de los practicantes del laboratorio. El error
mas probable es que no se haya suministrado la cantidad recomendad de enzimas en las
muestras lo cual causo que no exista ruptura del ADN y por ende no hubo desplazamiento.
Tanto el carril 5 y 6 mostraron los resultados esperados, ya que en el carril 5 se colocó el
“control –“el cual carecía de ADN y por esto no se ve reflejado en la electroforesis. Por
otro lado, el carril 6 donde se encontraba el “Control +” ilustra la presencia de ADN no
escindido debido a que a esta muestra contenía ADN, pero no Enzimas de restricción por
lo que se esperaba que no existiría desplazamiento, pero si existencia de ADN.
Debido a que no logro obtenerse información con el carril 2 y 3 el resto de la discusión
se basara en el carril 4 donde si hubo desplazamiento del ADN.
Según Thermofisher scientist la electroforesis en gel debio dar resultados parecidos a la
imagen que se colocara acontinucaion.
Ilustración 1: Resultados de la electroforesis del Fago Lambda por Thermofisher.
Fuente: Thermofisher scientist . (19 de Abril de 2017). Lambda, Phage & Plasmid DNA
Markers. Obtenido de Thermofisher scientist :
https://www.thermofisher.com/ec/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-
biology/thermo-scientific-nucleic-acid-electrophoresis-purification/dna-electrophoresis-
thermo-scientific/dna-ladders-thermo-scientific/lambda-phage-plasmid-dna-
markers.html
Existen ciertas discrepancias con la electroforesis obtenida en el laboratorio, pero existen
fuertes similitudes como la existencia de fragmentos de ADN con alrededor de 5000 Pares
de bases y en la región cerca de los 2000 pares de bases y 1500. Lo cual demuestra cierto
grado de confiabilidad sobre estos datos obtenidos. De igual manera se reafirma que si
existe escisión por parte de las enzimas empleadas por separado, reafirmando el hecho de
que existieron errores en la práctica.
Al sumar los fragmentos obtenidos en él experimento y visualizados en el ADN se puede
determinar que el fago lambda tiene aproximadamente 42550 pares de bases. Según
Bioted el número de extensión de pares de bases de este virus es de 48502 (BioTed, 2018).
Los resultados son menores a los de referencia lo cual podría considerarse “normal”
teniendo en cuenta varios errores practicados en la práctica.
Bibliography
BioTed. (2018, Enero 24). DIGESTIÓN DEL FAGO LAMBDA. Retrieved from BioTed.es:
http://bioted.es/protocolos/DIGESTION-FAGO-LAMBDA-(ENZ-RESTRICCION).pdf
Thermofisher scientist . (2017, Abril 19). Lambda, Phage & Plasmid DNA Markers. Retrieved
from Thermofisher scientist :
https://www.thermofisher.com/ec/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-
biology/thermo-scientific-nucleic-acid-electrophoresis-purification/dna-
electrophoresis-thermo-scientific/dna-ladders-thermo-scientific/lambda-phage-
plasmid-dna-markers.html
KhanAcademy. (s/d). Las enzimas de restricción y la ADN ligasa. Recuperado de:
https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-cloning-
tutorial/a/restriction-enzymes-dna-ligase. (23/9/18)
Denizard, O y Maldonado, J. (2014). Enzimas de Restricción y Electroforesis de DNA. Recuperado
de: http://academic.uprm.edu/~jvelezg/EnzimasDNA.htm. (23/9/18)
Herveg, J. y Barcia-Macay, M. (2006). Enzimas de restricción. Recuperado de:
http://genemol.org/biomolespa/Enzimas/enzimas-de-restricc.html. (23/9/18)
Morales, I. (s/d). Electroforesis. Recuperado de.
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Exposicion_electroforesis_5087.pdf.
(23/9/18)
Bibliography
BioTed. (24 de Enero de 2018). DIGESTIÓN DEL FAGO LAMBDA. Obtenido de BioTed.es:
http://bioted.es/protocolos/DIGESTION-FAGO-LAMBDA-(ENZ-RESTRICCION).pdf
Thermofisher scientist . (19 de Abril de 2017). Lambda, Phage & Plasmid DNA Markers.
Obtenido de Thermofisher scientist :
https://www.thermofisher.com/ec/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-
biology/thermo-scientific-nucleic-acid-electrophoresis-purification/dna-
electrophoresis-thermo-scientific/dna-ladders-thermo-scientific/lambda-phage-
plasmid-dna-markers.html
