TRANSCRIPCIÓN REVERSA Y APLICACIONES

Cubas, Sharon1 Montenegro, Andrés2 Morales, Marín3

Universidad Autónoma de Chiriquí, Facultad de Ciencias Naturales y Exactas, Escuela de Química,

Bioquímica (código: Qm 382), Ciudad universitaria-El cabrero, David, Chiriquí, Panamá,
ID: 4-782-20721, 4-742-9122, 4-748-11363; E-mail: [email protected], [email protected],
[email protected]

Resumen:
La transcripción reversa (RTPCR) es una técnica que permite sintetizar DNA complementario (cDNA)
a moléculas de RNA usando para ello la enzima transcriptasa reversa. Por medio de esta experiencia
se buscaba obtener por medio de una transcripción reversa DNA complementario, utilizando como
molde RNA extraído de hojas de Cajanus cajan. Para llevar a cabo esta experiencia se utilizó el kit
High Capacity cDNA Reverse Transcription de la casa comercial Applied Biosystems utiliza una mezcla
de cebadores de ocho nucleótidos con secuencias generadas al azar, en donde por medio de una RT-
PCR utilizando el termociclador 2720 de Applied Biosystems se realizaba la retrotranscripción.
Posterior a este proceso, los cDNA obtenidos en la síntesis fueron cuantificados con la ayuda del
espectrofotómetro Genova nano de JENWAY obteniendo las siguientes concentraciones: 1 755.7, 1
743. 7, 1 687.0, 1760.7; para el grupo 1, 2, 3, 4 respectivamente, cabe señalar que las relaciones
260nm/280nm y 260/230nm fueron de 2.42 y 1.756 respectivamente. Con los resultados obtenidos
podemos decir que la transcripción reversa se llevó a cabo correctamente y que a pesar que se utilizó
la misma muestra en los 4 grupos se obtuvieron variaciones en la concentración resultante que puede
adjudicarse a errores en la manipulación de las micropipetas.

Palabras claves: Retrotranscripción, ADN, de la casa comercial Applied Biosystems utiliza

ARN, cuantificación, reacción de una mezcla de cebadores de ocho nucleótidos
retrotranscripción, amplificación de ADN. con secuencias generadas al azar (random
Objetivos: primers, en lugar del oligo oligo dT que se
 Estudiar el principio de la técnica de muestra en la figura) para iniciar la síntesis de
transcripción reversa en muestras de la hebra de DNA complementario. El Kit permite
ARNm genómico. retro transcribir entre 0.02 y 2 µg de RNA total
 Cuantificar la concentración de ARNm en en un volumen final de 20µl utilizando la enzima
muestras de extraídas de la planta Cajanus Multiscribe. Los random primers aseguran que
cajan sometidas a ataques de insectos. la primera hebra de síntesis se produzca
 Identificar el equipamiento requerido para eficientemente a partir de todas las moléculas
llevar a cabo a la técnica. de RNA presentes, tanto RNAm (mensajero)
 Reconocer las principales similitudes y como RNAr (ribosómico). (Rodríguez, 2014).
diferencias de la transcripción reversa y
una PCR convencional. La amplificación exponencial mediante PCR en
transcripción reversa supone una técnica
Marco teórico: altamente sensible, que puede detectar un
La transcripción reversa (RTPCR) es una
número de copias de ARN muy bajo. Los
técnica que permite sintetizar DNA
principales usos de la RT-PCR están
complementario (cDNA) a moléculas de RNA
relacionados con el campo del diagnóstico
usando para ello la enzima transcriptasa
molecular y con la investigación científica.
reversa y el resultado se amplifica mediante
Puede utilizarse como método de detección
una PCR. El cDNA obtenido es la cadena
molecular de genes, para estudiar el genoma
complementaria de la cadena molde de RNA. El
de virus de ARN como los retrovirus. Una de las
kit High Capacity cDNA Reverse Transcription
características más importantes es que en el
proceso de RT-PCR, el ADNc generado ya no Resultados:
lleva los intrones que sí tendría el ADN original.
Cuadro 3. Datos obtenidos de la cuantificación de
De este modo, al expresar el ADNc producto de
ADN de las muestras de la planta Cajanus cajan.
la RT-PCR, se generará un ARNm formado Muestra de grupo Concentración ng/µL
exclusivamente por exones. Esto ha permitido 1 1755.7
darle a esta técnica uno de sus usos más 2 1743.7
importantes: insertar genes eucariota en 3 1687.0
organismos procariota (Giraldo et al, 2010). 4 1760.7
(2 horas)
Materiales y reactivos Duración de la reacción de
Inicio:10:39am
Cuadro 1. Materiales. transcripción
Final:12:39md
Instrumento Capacidad Cantidad
Termociclador 96 tubos 1 RNA muestra
Mezcla de reacción
Centrífuga 1 spin 1 Mix = 10 µL
Vortex - 1
Cuantificador 0.5-5 µL 1
Micropipetas 5-10 µL 2
Puntillas 5-10 µL 6

Cuadro 2. Reactivos.
Reactivo Cantidad Toxicidad
Buffer 10x 20µL Los reactivos
empleados en la
Mezcla dNTP 8µL experiencia no poseen
Cebadores efectos adversos para Figura 1. Muestras de reacción: RNA + Mezcla de
aleatorios 20µL la salud del ser
RT10x
componentes.
humano, sin embargo
Transcriptasa al contacto con los ojos
reversa 10µL o mucosidades podrían
multiScribe
llegar causar una leve
Agua ultra
irritación. Se
pura (libre de 42µL
nucleasas) recomienda en todo
Solución stock caso manejarlos con
2.5µL cautela.
de RNA

Fase Experimental:
Se cuantificó la concentración de la Figura 2. Centrífuga (izquierda) y Vortex (derecha)
muestra de ARNm proporcionada, empleadas para la homogenización de las
utilizando 2 μL de la misma. muestras.

Se siguió el procedimiento descrito por

el kit high capacity Applied Biosystem
instrucciones y facilidades
proporcionados por CIBQUIA.

Se programó el termociclador para

efectuar la reacción de
retrotranscripción, por un tiempo de Figura 3. Termociclador 2720, Applied Biosystems
dos horas. de Thermo Fisher Scientific.
 De manera experimental se puedo llevar la
aplicación de la técnica de transcripción reversa
principalmente en tres aplicaciones que son
para la obtención de la expresión de genes,
para la clonación de genes y para la
cuantificación de los mismos. En este caso se
realizó fue la cuantificación de ARN presente en
una muestra vegetal, planta Cajanus cajan,
para la cuantificación primeramente se debió
preparar una mezcla de reacción la cual dará
Figura 4. Cuantificador Genova Nano de Jenway lugar a la activación de la enzima y de los
componentes que requiere para llevar a cabo el
Discusión:
proceso de transcripción.
La transcripción reversa o retrotranscripción es
un proceso de la biología molecular que implica En el mercado existe un sin número de kit para
la generación de una cadena de ácido llevar a cabo el proceso de transcripción reversa
desoxirribonucleico (ADN) de doble cadena a que no son más que sistemas de RT-PCR en
partir de un ácido ribonucleico (ARN) de cadena tiempo real para la cuantificación de secuencias
simple. Es una actividad que está mediada por especificas de muestras de ARN o bien de
varias enzimas e incluso proteínas estructurales moldes de ARN explica (, 2013). En nuestro
de la cápside de algunos virus, generalmente se caso se utilizó el kit high capacity cDNA
emplea la transcriptasa inversa. El fundamento Reverse Transcription de la línea Applied
molecular de la retrotranscripción en retrovirus Biosystems que se muestra en la figura 5. Este
implica la conversión de dos ARN simple de kit contiene la mezcla dNTP, cebadores
cadena simple con sentido positivo en aleatorios RT10x, transcriptasa reversa
una molécula de ADN ligeramente más larga multiScribe y la solución stock de RNA. Para
que el ARN original (Cann, 2005), debido a la esta experiencia se preparó una mezcla de
repetición directa de las secuencias colindantes reacción colocando 10 µL del RNA primero y
a los fragmentos originales. seguido 10 µL del mix (que es lo contenido en
La transcriptasa inversa, transcriptasa reversa o el kit), realizándolo por cada grupo de
retrotranscriptasa es una enzima de tipo ADN- laboratorio (figura 1). Para llevar a cabo el
polimerasa, que tiene como función sintetizar proceso en si se introduce las muestras (figura
ADN de doble cadena utilizando como molde 1) en un termociclador que es en el cual se
ARN monocatenario, es decir, catalizar la realiza la reacción por un tiempo determinado a
retrotranscripción o transcripción inversa temperaturas determinadas con el fin de
(Bauman & Hughes, 2010). Esta enzima se optimizar el buen funcionamiento
encuentra presente en los retrovirus. Su principalmente de la enzima y demás
nombre obedece a que el proceso normal de la componentes.
transcripción, la que se puede llamar "directa",
codifica el ARN a partir de la secuencia inicial
de ADN, y no al revés.
De acuerdo con (Gaffney, 2017) la transcriptasa
inversa, también conocida como ADN
polimerasa dependiente de ARN, es una
enzima ADN polimerasa que transcribe una
sola cadena de ARN en una sola cadena de
ADN. También ayuda en la formación de una
doble hélice de ADN una vez que el ARN ha
experimentado una transcripción inversa en una
sola cadena de ADN. De manera resumida la Figura 5. Kit High capacity cDNA Reverse
transcripción inversa implica la síntesis de ADN Transcription de la línea Applied Biosystems por
a partir del ARN. Thermo Fisher Scientific.
Como resultado de la cuantificación se obtuvo https://www.iib.uam.es/portal/documents/76122
que aproximadamente se tenía entre 1690- /76162/retrotranscripcion+de+arn+v2.pdf/4e93
1760 ng/µL de RNA esta propiedad se midió en a2a0-de61-40c1-9d93-d20d73b5df30
el cuantificador Genova nano que ilustra la -Tesauro, K. (2013). Biotools PCR. Recuperado
figura 4. Este equipo también da la relación para el 13 de septiembre de 2017 de
proteínas y carbohidratos presente en las http://biotools.eu/es/7-transcripcion-reversa
muestras para así brindar una idea de si la
muestra aun presenta impurezas en ella; la Cuestionario:
relación 260/280 (proteínas) debe de rondar en 1. ¿En qué consiste la transcripción reversa?
los 1.7 como mínimo y dos como lo óptimo y la R: es una variante de la PCR, una técnica de
relación 260/230 (carbohidratos, glúcidos) debe laboratorio comúnmente usada en biología
presentarse en aproximadamente uno como lo molecular para generar una gran cantidad de
más óptimo. Un aspecto que se debe tomar en copias de ADN se retrotranscribe una hebra de
cuenta en la cuantificación es que la muestra ARN en ADN complementario (ADNc) usando
debe estar homogenizada no contener burbujas una enzima llamada transcriptasa inversa o
o sedimentos del material molecular, para transcriptasa reversa, y el resultado se amplifica
evitarlo se emplea equipos como la centrífuga y mediante una PCR.
el vortex (figura 2).
2. ¿Cuáles pueden ser las aplicaciones de la
Conclusiones: transcripción reversa?
 Por medio de la experiencia se logró R: Los principales usos de la RT-PCR están
observar que al tratarse de experimentos relacionados con el campo del diagnóstico
que se desarrollan utilizando niveles micro molecular y con la investigación científica.
Puede utilizarse como método de detección
de muestra hay probabilidades que un
molecular de genes, para estudiar el genoma de
pequeño error en la manipulación de las
virus de ARN como los retrovirus (por ejemplo,
micropipetas ocasione errores elevados en el VIH) o el virus de la gripe (el virus de la
las concentraciones obtenidas por medio de influenza).
la retrotranscripción.
 La retrotranscripción es una técnica que por 3. ¿Qué puede inferir sobre la respuesta de la
sí sola pareciera no tener utilidad, sin expresión de IP 1 en planta de Cajanus
embargo es una técnica con diversas Cajan con relación al estímulo de daño por
aplicaciones, como en estudios de el insecto?
expresión de genes y otra gran gama de R: Estos compuestos, llamados inhibidores de
aplicaciones. proteasas (IP), inhiben a las enzimas que tienen
las larvas en el intestino, las proteasas, y que
Bibliografía: son indispensables para la digestión de
-Bauman, J. & Hughes, S. (2010). Structural proteínas, lo cual ofrece una barrera natural de
basis of HIV-1 resistance to AZT by excision. defensa contra insectos.
Journal of nature structural molecular biology.
(10), 17. 4. Establezca similitudes (4) y diferencias (4)
-Cann, A. (2005). Principles of Molecular de la transcripción reversa y una PCR
Virology. Burlington, USA: Elsevier. convencional.
-Gaffney, B. (2017). Reverse transcriptase R: Entre las similitudes están que ambos
jumps and gaps. Journal of general virology requieren del uso de un termociclador, producto
(77). Gran Bretaña, Inglaterra. final es la obtención de ADN, requieren del uso
-Giraldo, G. & Chamorro, L. (2010). Laboratorio de primers
de bioquímica. Universidad de Quindío, Las diferencias recaen en que en la PCR
Colombia. utilizan la enzima ADN polimerasa y parte de un
-Rodríguez, G. (2014). Retrotranscripción de molde de ADN y en la retrotranscripción la
RNA [Universidad de Madrid]. Recuperado el 11 enzima transcriptasa inversa y se parte de un
de septiembre de 2017 de molde de ARN. En la RT-PCR en cada
finalización de un ciclo se realiza una lectura longitud de onda determinada 522nm. De
automatizada en la PCR debe de terminar el manera que por medio de esta fluorescencia
ciclo general primero para luego hacer la utilizando un parámetro conocido como Ct (ciclo
lectura. umbral), esta técnica permite cuantificar la
expresión absoluta y relativa de genes y
5. ¿Cómo se calcula la concentración de ADN y estudios de otro tipo como mutaciones entre
ARN a partir de la lectura 260nm? otros.
R: Los ácidos nucleicos absorben eficientemente
luz ultravioleta debido a la presencia de bases
aromáticas nitrogenadas a lo largo de las cadenas
de DNA. La absorción de UV de DNA es una
característica de la molécula, que es usada
eficientemente para determinar su concentración.
De manera que utilizando como referencia que
una O.D. (Densidad Óptica), medida a 260 nm,
corresponde aproximadamente a: 50 µg/mL de
ADN de doble cadena, 40 µg/mL de ARN o de
ADN de cadena sencilla, se aplica la siguiente
ecuación: ADN (ng/µL).

6. ¿A qué atribuye el cambio de concentración

de la muestra después de la transcripción
con respecto a la de la reacción?
R: la concentración aumenta por la acción de la
acción de la transcriptasa reversa, que permite
obtener productos que pueden alcanzar hasta
5kb según lo establece el manual del kit High
Capacity cDNA Reverse Transcription de la
casa comercial Applied Biosystems.

7. De la técnica de aplicación presentada en el

laboratorio, cual es el principio por el cual se
puede detectar una amplificación de ADN en
tiempo real, explique.
R: La PCR cuantitativa se realiza en
un termociclador con capacidad de hacer incidir
sobre cada muestra un haz de luz de
una longitud de onda determinada y de detectar
la fluorescencia emitida por
el fluoroforo excitado. Este termociclador es un
aparato con capacidad para calentar y enfriar
rápidamente las muestras, de modo que se
aprovechen las cualidades fisicoquímicas de
los ácidos nucleicos y las enzimáticas del ADN
polimerasa. En el laboratorio se presentó la
PCR en tiempo real utilizando un fluoroforo
llamado Sybr Green que es un agente
intercalante que se une a la doble hebra de
cDNA de manera que cuando el cDNA es
irradiado por una longitud de onda determinada
498nm permite que se dé una emisión a otra