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Células troncales neurales

Chapter · September 2013

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4 authors, including:

Jose Angeles Chimal Victor Rodríguez-Molina

Universidad Autónoma del Estado de Morelos Universidad Nacional Autónoma de México
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Jesus Santa Olalla Tapia

Universidad Autónoma del Estado de Morelos
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 CELULAS TRONCALES
Y MEDICINA REGENERATIVA
 CELULAS TRONCALES
Y MEDICINA REGENERATIVA

EDITORES:

Rosana Pelayo
Investigadora
Unidad de Investigación Médica
en Enfermedades Oncológicas
Instituto Mexicano del Seguro Social

Jesús Santa-Olalla
Investigador
Facultad de Medicina
Universidad Autónoma del Estado de Morelos

Iván Velasco
Investigador
Instituto de Fisiología Celular
Universidad Nacional Autónoma de México
VI

Primera edición 2011

D.R. © 2011 Universidad Nacional Autónoma de México
Ciudad Universitaria, México,
Del. Coyoacán, 04510, D.F.

ISBN: 978-607-02-2568-0

Diseño de portada:
D.G. Betzabel Bojalil
Diseño y formación de interiores:
D.G. Viktor Manuel Sánchez Virgen

Prohibida la reproducción total o parcial por cualquier medio

sin la autorización escrita del titular de los derechos patrimoniales.
Impreso y hecho en México por Ediciones Buena Onda S.A. de C.V.
Printed and made in Mexico.
 AUTORES:

Juan José Acevedo Fernández

Cuerpo Académico de Fisiología y Fisiopatología de la Facultad de Medicina,
Universidad Autónoma del Estado de Morelos.

José Santos Angeles Chimal

Cuerpo Académico de Fisiología y Fisiopatología de la Facultad de Medicina,
Universidad Autónoma del Estado de Morelos. Unidad de Diagnóstico y Medicina
Molecular “Dr. Ruy Pérez Tamayo”, Facultad de Medicina-UAEM, Hospital del Niño
Morelense.

Martha Elena Castro

Laboratorio de Células Troncales Mesenquimales. Unidad de Investigación Médica
en Enfermedades Oncológicas, Hospital de Oncología. Centro Médico Nacional
Siglo XXI, Instituto Mexicano del Seguro Social.

María Antonieta Chávez-González

Laboratorio de Células Troncales Leucémicas. Unidad de Investigación Médica
VII
en Enfermedades Oncológicas, Hospital de Oncología. Centro Médico Nacional
Siglo XXI, Instituto Mexicano del Seguro Social.

Jesús Chimal-Monroy
Instituto de Investigaciones Biomédicas. Departamento de Medicina Genómica y
Toxicología Ambiental. Universidad Nacional Autónoma de México.

Donovan Correa Gallegos

Instituto de Investigaciones Biomédicas. Departamento de Medicina Genómica
y Toxicología Ambiental. Laboratorio Bases Moleculares de la Morfogénesis de la
Mano. Universidad Nacional Autónoma de México.

Verónica Díaz-Hernández
Departamento de Embriología, Facultad de Medicina, Universidad Nacional
Autónoma de México.

Emmanuel Díaz-Martínez
Instituto de Fisiología Celular - Neurociencias. Universidad Nacional Autónoma
de México.

Diana Escalante-Alcalde
División de Neurociencias, Departamento de Neurodesarrollo y Fisiología.
Instituto de Fisiología Celular. Universidad Nacional Autónoma de México.
 Verónica Fernández Sánchez
Laboratorio de Células Troncales y Progenitoras Hematopoyéticas. Unidad de
Investigación Médica en Enfermedades Oncológicas, Hospital de Oncología.
Centro Médico Nacional Siglo XXI, Instituto Mexicano del Seguro Social.

Patricia Flores Guzmán

Laboratorio de Células Troncales y Progenitoras Hematopoyéticas.
Unidad de Investigación Médica en Enfermedades Oncológicas, Hospital de
Oncología, Centro Médico Nacional Siglo XXI, Instituto Mexicano del Seguro Social.

Eugenia Flores Figueroa

Laboratorio de Microambiente Hematopoyético. Unidad de Investigación Médica
en Enfermedades Oncológicas. Hospital de Oncología. Centro Médico Nacional
Siglo XXI, Instituto Mexicano del Seguro Social.

Claudio Iván Galván-Hernández

Instituto de Investigaciones Biomédicas. Departamento de Medicina Genómica
y Toxicología Ambiental. Laboratorio Bases Moleculares de la Morfogénesis de la
Mano. Universidad Nacional Autónoma de México.

VIII Karlen Gazarian

Laboratorio de Genética Molecular, Departamento de Medicina Genómica
y Toxicología Ambiental, Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad
Nacional Autónoma de México.

Mónica Lamas
Departamento de Farmacobiología. Centro de Investigación y de Estudios Avanzados
del IPN (Cinvestav).

Rubén Lisker
Dirección de Investigación, Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición
Salvador Zubirán. Profesor Emérito de la UNAM.

Rodrigo López-González
Departamento de Neurociencias. Instituto de Fisiología Celular.
Universidad Nacional Autónoma de México.

Héctor Mayani
Laboratorio de Células Troncales y Progenitoras Hematopoyéticas. Unidad de
Investigación Médica en Enfermedades Oncológicas, Hospital de Oncología.
Centro Médico Nacional Siglo XXI, Instituto Mexicano del Seguro Social.

Horacio Merchant-Larios
Departamento de Biología Celular y Fisiología, Instituto de Investigaciones
Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México.
Juan José Montesinos
Laboratorio de Células Troncales Mesenquimales. Unidad de Investigación Médica
en Enfermedades Oncológicas, Hospital de Oncología. Centro Médico Nacional
Siglo XXI, Instituto Mexicano del Seguro Social.

Dafne Linda Moreno Lorenzana

Laboratorio de Células Troncales Leucémicas. Unidad de Investigación Médica
en Enfermedades Oncológicas, Hospital de Oncología. Centro Médico Nacional
Siglo XXI, Instituto Mexicano del Seguro Social.

Rosana Pelayo
Laboratorio de Linfopoyesis. Unidad de Investigación Médica en Enfermedades
Oncológicas, Hospital de Oncología. Centro Médico Nacional Siglo XXI, Instituto
Mexicano del Seguro Social.

Víctor Manuel Rodríguez Molina

Cuerpo Académico de Fisiología y Fisiopatología de la Facultad de Medicina,
Universidad Autónoma del Estado de Morelos.

Jesús Santa-Olalla Tapia

Cuerpo Académico de Fisiología y Fisiopatología de la Facultad de Medicina,
IX
Universidad Autónoma del Estado de Morelos. Unidad de Diagnóstico y Medicina
Molecular “Dr. Ruy Pérez Tamayo”, Facultad de Medicina-UAEM, Hospital del Niño
Morelense.

Eduardo Vadillo
Laboratorio de Linfopoyesis. Unidad de Investigación Médica en Enfermedades
Oncológicas, Hospital de Oncología. Centro Médico Nacional Siglo XXI, Instituto
Mexicano del Seguro Social.

Iván Velasco
Instituto de Fisiología Celular - Neurociencias. Universidad Nacional Autónoma de
México.
CONTENIDO:

Prólogo.................................................................................................... XXXIII

Capítulo I

Células troncales y medicina regenerativa:

conceptos básicos, estado actual y perspectivas futuras ....................35
Héctor Mayani

Resumen

Introducción

¿Qué son las células troncales?.....................................................................37

Células troncales durante el desarrollo.........................................................38

XI
Biología de las células troncales.....................................................................40

Frecuencia y localización espacial de las células troncales............. 41

¿Cómo se regulan las funciones de las células troncales?...............42

Cambios en la función de las células troncales

durante el desarrollo ..............................................................................45

Plasticidad.........................................................................................................46

Plasticidad de las HSC............................................................................48

Plasticidad de las NSC............................................................................48

Controversias en torno a la plasticidad...............................................49

Medicina regenerativa....................................................................................52

Conclusiones y perspectivas ..............................................................................53

Agradecimientos...................................................................................................54

Referencias............................................................................................................55
 Capítulo II

Células troncales embrionarias .....................................................................57

Ivan Velasco, Emmanuel Díaz-Martínez,
Rodrigo López-González & Diana Escalante-Alcalde

Resumen

Introducción

Células troncales en el embrión temprano...................................................58

Células troncales pluripotenciales.................................................................59

Células troncales embrionarias.......................................................................60

Derivación y caracterización

de las células troncales embrionarias .................................................60

Otras células pluripotenciales obtenidas

de fuentes naturales o artificiales......................................................... 61

XII Regulación intrínseca y extrínseca del estado pluripotencial...........63

Diferenciación de células troncales embrionarias.............................66

Conclusiones..........................................................................................................68

Agradecimientos...................................................................................................68

Referencias............................................................................................................69

Capítulo III

Gónadas, células germinales y células troncales .................................... 71

Horacio Merchant-Larios & Verónica Díaz-Hernández

Resumen

Introducción

El inicio del desarrollo.......................................................................................73

Determinación de la línea germinal.............................................................. 74

Aspectos embriológicos......................................................................... 74

Aspectos moleculares............................................................................ 75
 Interacciones entre la línea germinal y la somática....................................77

Las células precursoras germinales

como células troncales pluripotenciales.............................................78

De células germinales primordiales a células troncales pluripotenciales... 81

El camino inverso: de células troncales somáticas a células germinales....82

El trasplante de células troncales embrionarias y células troncales

pluripotenciales inducidas causa la formación de teratomas in vivo......85

Conclusiones..........................................................................................................85

Agradecimientos...................................................................................................86

Referencias............................................................................................................87

Capítulo IV

Células troncales neurales ..............................................................................89

XIII
Juan José Acevedo Fernández, José Santos Ángeles Chimal,
Víctor Manuel Rodríguez Molina & Jesús Santa-Olalla Tapia

Resumen

Introducción

Origen del sistema nervioso y  la célula troncal neural...............................90

Neurulación..............................................................................................90

Las células troncales neurales............................................................... 94

El linaje neural...................................................................................................97

Constituyentes del linaje neural............................................................98

Sistemas in vitro para el estudio del linaje neural..............................100

La diferenciación neural................................................................................103

La identidad posicional........................................................................103

Diferenciación neuronal.......................................................................106

Diferenciación glial...............................................................................108

Neurogénesis en el adulto.............................................................................109
 Métodos para la detección de la proliferación celular

y la neurogénesis en el cerebro humano..........................................109

Zonas con actividad de neurogénesis

en el cerebro adulto humano............................................................. 110

Proliferación, migración y neurogénesis

en la corriente migratoria rostral.........................................................111

Conclusiones........................................................................................................ 112

Agradecimientos................................................................................................. 113

Referencias.......................................................................................................... 114

Capítulo V

Células troncales mesenquimales .............................................................. 119

Juan José Montesinos & Marta Elena Castro
XIV
Resumen

Introducción

Biología de las células troncales mesenquimales...................................... 120

Plasticidad de las células troncales mesenquimales................................. 123

Capacidad de soporte hematopoyético

de las células troncales mesenquimales..................................................... 127

Inmunorregulación por las células troncales mesenquimales..................130

Células troncales mesenquimales y terapia celular..................................133

Soporte hematopoyético y enfermedad injerto contra hospedero .... 134

Enfermedades autoinmunes...............................................................135

Regeneración de tejidos...................................................................... 136

Conclusiones........................................................................................................ 137

Agradecimientos.................................................................................................138

Referencias.......................................................................................................... 139
Capítulo VI

El sistema hematopoyético a partir de células troncales..................... 143

Rosana Pelayo & Eduardo Vadillo

Resumen

Introducción

El descubrimiento de las células troncales hematopoyéticas

y la generación del sistema sanguíneo.......................................................144

Estructura jerárquica del sistema hematopoyético................................... 146

La diferenciación mieloide o mielopoyesis................................................. 150

Diferenciación eritroide-megacariocítica......................................... 151

Diferenciación granulo-monocítica................................................... 152

La diferenciación linfoide o linfopoyesis...................................................... 153

Los progenitores linfoides..................................................................... 153

Diferenciación de células B y NK........................................................ 154 XV

Diferenciación de células T.................................................................. 155

Factores intrínsecos y extrínsecos que regulan

la diferenciación hematopoyética ............................................................. 156

El ciclo celular de las células primitivas.............................................. 156

Redes de factores de transcripción ................................................... 157

Microambiente de la médula ósea ................................................... 161

Perturbación del microambiente hematopoyético......................... 163

Sistemas de estudio de las células troncales

y progenitores hematopoyéticos................................................................. 164

Citometría de flujo................................................................................. 164

Ensayos in vivo....................................................................................... 167

Ensayos in vitro....................................................................................... 169

Conclusiones........................................................................................................ 170

Agradecimientos................................................................................................. 170

Referencias.......................................................................................................... 171
 Capítulo VII

El nicho de las células troncales ................................................................. 175

Eugenia Flores Figueroa

Resumen

Introducción

El origen del concepto del nicho................................................................. 176

Mecanismos de regulación de las células troncales

por las células del nicho................................................................................ 177

El nicho de las células troncales de la línea germinal

en invertebrados............................................................................................ 179

El nicho de las células troncales de la línea germinal en C. elegans.... 179

El nicho de las células troncales de la línea germinal en Drosophila....180

El nicho de las células troncales en mamíferos.......................................... 182

XVI El nicho de las células troncales hematopoyéticas

como modelo de estudio.................................................................... 182

Componente hematopoyético..........................................................183

Componente vascular.........................................................................183

Componente estromal.........................................................................184

Componente nervioso..........................................................................185

Nicho Hematopoyético.................................................................................185

La identidad de las células del nicho.................................................185

Osteoblastos.......................................................................................... 186

Células endoteliales.............................................................................. 187

Células troncales mesenquimales.......................................................188

Conclusiones........................................................................................................ 191

Agradecimientos................................................................................................. 191

Referencias.......................................................................................................... 192
Capítulo VIII

Sangre de cordón umbilical: biología,

almacenamiento y trasplante clínico ....................................................... 195
Patricia Flores Guzmán & Verónica Fernández Sánchez

Resumen

Introducción

Historia

Tipos de células troncales presentes en la sangre de cordón umbilical... 196

Características biológicas de las células troncales hematopoyéticas

y células progenitoras hematopoyéticas.................................................... 197

Origen de las células troncales hematopoyéticas

en sangre de cordón umbilical........................................................... 198

Inmunofenotipo y morfología.............................................................. 199

Regulación del ciclo celular y la senescencia..................................200 XVII

Respuesta in vitro de las células troncales

y progenitoras de la sangre de cordón umbilical............................203

Almacenamiento de la sangre de cordón umbilical................................205

Experiencia clínica.........................................................................................209

Tipificación............................................................................................. 211

Dosis........................................................................................................ 211

Enfermedad injerto contra huésped.................................................. 212

Injerto de los diferentes linajes celulares............................................ 212

Experiencia en trasplantes no hematopoyéticos............................. 213

Conclusiones........................................................................................................ 214

Agradecimientos................................................................................................. 214

Referencias.......................................................................................................... 215
 Capítulo IX

Células troncales tumorales: el modelo de leucemias mieloides ...... 219

María Antonieta Chávez-González & Dafne Moreno Lorenzana

Resumen

Introducción

Célula troncal tumoral y su origen ..............................................................220

Definición de leucemias mieloides...............................................................223

Propiedades de las células troncales y progenitoras leucémicas ..........225

Fenotipo y organización jerárquica....................................................225

Alteraciones en el comportamiento celular......................................227

Ciclo celular vs quiescencia................................................................228

Diseño de fármacos y resistencia a terapia...............................................229

Nicho de las células troncales leucémicas.................................................232

XVIII Células troncales en tumores sólidos: mama, cerebro y colon................234

Conclusiones........................................................................................................235

Agradecimientos.................................................................................................236

Referencias..........................................................................................................237

Capítulo X

Trasplante de células hematopoyéticas ..................................................239

Héctor Mayani

Resumen

Introducción

Perspectiva histórica......................................................................................240

Fuentes de células hematopoyéticas.........................................................242

Médula ósea..........................................................................................242

Sangre periférica movilizada...............................................................243

Sangre de cordón umbilical................................................................245

 Tipos de trasplantes de células hematopoyéticas....................................246

Biología del trasplante hematopoyético....................................................249

Estado actual de los HCT en el mundo....................................................... 251

El trasplante hematopoyético en México................................................... 251

El futuro del HCT .............................................................................................252

Conclusiones........................................................................................................253

Agradecimientos.................................................................................................253

Referencias..........................................................................................................254

Capítulo XI

Regeneración ..................................................................................................255
Jesús Chimal-Monroy, Donovan Correa Gallegos
& Claudio Iván Galván-Hernández

Resumen XIX
Introducción

Qué es la regeneración.....................................................................................255

Mitología de la regeneración o de la inmortalidad.........................256

Historia de la regeneración.................................................................257

Definiendo el fenómeno................................................................................259

La regeneración mediada por células troncales.............................262

Regeneración por epimorfosis............................................................262

Regeneración de planarias.................................................................262

Regeneración de extremidades de urodelos...................................263

Regeneración de las aletas de peces...............................................264

Regeneración por morfalaxis..............................................................265

Regeneración de hidras.......................................................................265

Regeneración compensatoria............................................................266

Regeneración del hígado....................................................................266

Otros modelos de regeneración..................................................................266

 Regeneración de la punta de los dedos en mamíferos..................266

Regeneración de las astas..................................................................269

Regeneración en otros organismos....................................................269

Evolución y regeneración.............................................................................269

Medicina regenerativa..................................................................................271

Conclusiones...................................................................................................272

Agradecimientos............................................................................................272

Referencias......................................................................................................273

Capítulo XII

Las células troncales en el rescate de patologías

del sistema nervioso ........................................................................................ 275
Mónica Lamas & Iván Velasco
XX
Resumen

Introducción

Restauración de la visión............................................................................... 276

Estructura del ojo y el proceso de la visión........................................ 276

Medicina regenerativa ocular: estrategias y dificultades...............277

Medicina regenerativa ocular: la córnea.........................................278

Medicina regenerativa ocular: la retina............................................280

Perspectivas: una visión de futuro.......................................................283

Enfermedades del sistema nervioso central

y su tratamiento con células troncales:

Parkinson y esclerosis lateral amiotrófica como ejemplos........................283

Enfermedad de Parkinson....................................................................285

Modelos animales de la enfermedad de Parkinson.........................287

Diferenciación de células troncales a neuronas

que secretan dopamina y su trasplante en modelos

de la enfermedad de Parkinson..........................................................289
 Esclerosis lateral amiotrófica................................................................290

Modelos animales de la esclerosis lateral amiotrófica..................... 291

Diferenciación de células troncales a neuronas motoras...............292

Terapia celular en modelos animales

de la esclerosis lateral amiotrófica......................................................292

Células troncales pluripotentes inducidas de pacientes

con esclerosis lateral amiotrófica..........................................................293

Conclusiones........................................................................................................293

Agradecimientos................................................................................................. 294

Referencias..........................................................................................................295

Capítulo XIII

Reprogramación de células diferenciadas

XXI
al estado pluripotencial .....................................................................................299
Karlen Gazarian

Resumen

Introducción

Desarrollo de la metodología para la reprogramación de células

diferenciadas y la obtención de células troncales pluripotenciales

inducidas: reprogramación por transferencia nuclear..............................301

Identificación de los genes que determinan dos propiedades

de las células troncales embrionarias: autorrenovación

y pluripotencialidad.................................................................................302

La estrategia experimental utilizada en la primera reprogramación....304

Etapas de la reprogramación ........................................................................305

Mecanismos epigenéticos .............................................................................. 310

Potenciación de la reprogramación con moléculas orgánicas ............. 310

Deficiencias de la metodología para la reprogramación........................ 311

 Reprogramación sin el uso de vectores retrovirales.................................... 311
Potencial de las células troncales pluripotenciales inducidas
de generar células diferenciadas para estudios básicos
y de medicina regenerativa ........................................................................... 312
Conclusiones............................................................................................................ 314
Agradecimientos.................................................................................................... 314
Referencias.............................................................................................................. 315

Capítulo XIV

Manipulación genética para el estudio funcional

de células troncales .................................................................................... 317
Diana Escalante-Alcalde
Resumen
Introducción
XXII
El ratón como modelo de estudio.......................................................... 317
Cultivo y manipulación de embriones............................................. 318
Técnicas de modificación genética en mamíferos................................. 320
Ratones transgénicos....................................................................... 320
Modificación dirigida de un locus por recombinación
homóloga en células troncales embrionarias................................ 322
Generación de células troncales embrionarias
y animales con modificaciones genéticas diseñadas............................ 323
Recombinación homóloga en células troncales
embrionarias de ratón.......................................................................... 323
Generación de ratones quiméricos................................................. 325
Análisis fenotípico de las mutaciones diseñadas en animales...... 327
Mutaciones dirigidas de manera condicionada............................ 328
Algunas aplicaciones al estudio de células troncales............................ 330
Modificación genética dirigida en células troncales
embrionarias humanas..................................................................... 331
 Conclusión................................................................................................. 332
Referencias................................................................................................ 333

Capítulo XV

Aspectos bioéticos del estudio y uso de células troncales ..................335

Rubén Lisker
Resumen
Introducción
Clonación reproductiva y clonación terapeútica......................................336
Células troncales................................................................................................338
Células troncales pluripotenciales inducidas (iPSC)....................................339
Problemas éticos de las células troncales.................................................... 340
Postura conservadora............................................................................ 340
Postura no conservadora.......................................................................341
XXIII
Postura intermedia.................................................................................. 343
Conclusiones........................................................................................................... 343
Referencias..............................................................................................................345

Capítulo XVI

Células troncales y medicina regenerativa en México .........................347

Héctor Mayani, Mónica Lamas & Iván Velasco
Resumen
Introducción
La investigación sobre células troncales en México.................................. 348
Medicina regenerativa.....................................................................................351
Conclusiones.......................................................................................................354
Agradecimientos................................................................................................355
Referencias.........................................................................................................356
ABREVIATURAS

α-SMA: Actina alfa de músculo liso, del inglés Smooth Muscle Actin α

6-OHDA: 6-hidroxidopamina

AGM: Aorta-gónada-mesonefros

ALCAM: Molécula de adhesión celular de leucocitos activados, del inglés Leukocyte

Activated Cell Adhesion Molecule

ALS: Esclerosis lateral amiotrófica, del inglés Amyotrophic Lateral Sclerosis

Ang-1: Angiopoyetina 1

ANR: Cresta neural anterior, del inglés Anterior Neural Ridge

ANSC: Células troncales neurales del cerebro adulto, del inglés Adult Neural Stem
Cells

ASC: Células troncales de adulto, del inglés Adult Stem Cells

bFGF: Factor de Crecimiento Fibroblástico Básico, del inglés basic Fibroblast

Growth Factor
XXV
BFU-E: Unidades formadoras de brotes eritroides, del inglés Burst Forming
Units-Erythroid

BLBP: Proteína de unión a lípidos cerebrales, del inglés Brain Lipid Binding Protein

BM MSC: Células troncales mesenquimales derivadas de médula ósea, del inglés

Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

BMP: Proteínas morfogénicas de hueso, del inglés Bone Morphogenetic Proteins

BMP-4: Proteína morfogénica de hueso tipo 4, del inglés Bone Morphogenic

Protein-4

BSCU: Banco de sangre de cordón umbilical

cDC: Células dendríticas convencionales, del inglés Conventional Dendritic Cells

cDNA: DNA complementario

CFU: Unidades formadoras de colonias, del inglés Colony Forming Unit

CFU-E: Unidades formadoras de colonias eritroides, del inglés Colony Forming

Units-Erythroid

CFU-F: Unidades formadoras de colonias de fibroblastos, del inglés Cell-Forming

Units-Fibroblasts
 CFU-G: Unidades formadoras de colonias granulocíticas, del inglés Colony Forming
Units-Granulocyte

CFU-GM: Unidades formadoras de colonias de granulocitos y monocitos, del inglés

Colony Formin Units-Granulocyte Monocyte

CFU-M: Unidades formadoras de colonias monocíticas, del inglés Colony Forming

Units-Monocyte

CFU-S: Unidades formadoras de colonias en el bazo, del inglés Colony Forming

Units-Spleen

CGP: Células germinales primordiales

CLP: Progenitor linfoide común, del inglés Common Lymphoid Progenitor

CMN: Células mononucleares

CMP: Progenitor mieloide común, del inglés Common Myeloid Progenitor

CNS: Sistema nervioso central, del inglés Central Nervous System

CNT: Células nucleadas totales

CPH: Células progenitoras hematopoyéticas

XXVI
CSC: Célula troncal tumoral, del inglés Cancer Stem Cell

CSM: Células somáticas mesoteliales

DA: Dopamina

DC: Células dendríticas, del inglés Dendritic Cells

DMAE: Degeneración Macular Asociada con la Edad

DN: Doble negativa

DNA: Ácido desoxirribonucleíco, del inglés DeoxyriboNucleic Acid

dpc: Días post coito

DTC: Células de la punta distal, del inglés Distal Tip Cells

DP: Doble positiva

ECC: Células de carcinoma embrionario, del inglés Embryonal Carcinoma Cells

EGC: Células germinales embrionarias, del inglés Embryonic Germ Cells

EGF: Factor de crecimiento epidermal, del inglés Epidermal Growth Factor

EICH: Enfermedad injerto contra hospedero

 ELA: Esclerosis lateral amiotrófica

ELP: Progenitor linfoide temprano, del inglés Early Lymphoid Progenitor

EM: Esclerosis múltiple

EpiSC: Células troncales del epiblasto, de inglés Epiblast-derived Stem Cells

EPO: Eritropoyetina

EPR: Epitelio Pigmentario Retinal

ERK: Cinasas reguladas por mitógenos, del inglés Extracellular Signal-Regulated

Kinase

ESC: Células troncales embrionarias, del inglés Embryonic Stem Cells

ETP: Progenitor temprano de timocitos, del inglés Early Thymocyte Progenitor

FACS: Separación celular activada por fluorescencia, del inglés Fluorescense

Activated Cell Sorting

FALS: Esclerosis lateral amiotrófica familiar, del inglés Familial Amyotrophic Lateral
Sclerosis
XXVII
FDA: Administración de alimentos y medicamentos de los EUA, del inglés Food
and Drug Administration

FGF: Factor de crecimiento de fibroblastos, del inglés Fibroblast Growth Factor

FGF-2: Factor de crecimiento de fibroblastos básico tipo 2, del inglés Fibroblast

Growth Factor-2

FLT-3: Tirosina cinasa parecida a fms, del inglés Fms Like Tyrosine Kinase

FT: Factores de transcripción

GCL: Capa de células ganglionares de la retina, del inglés Ganglionar Cell Layer

G-CSF: Factor estimulador de colonias de granulocitos, del inglés Granulocyte-

Colony Stimulating Factor

GFP: Proteína fluorescente verde, del inglés Green Fluorescent Protein

GLAST: Transportador de glutamato específico de astrocitos, del inglés Glutamate

Aspartate Transporter

GM-CSF: Factor estimulador de colonias de granulocitos y monocitos, del inglés

Granulocyte and Monocyte-Colony Stimulating Factor

GMP: Progenitor de granulocitos y monocitos, del inglés Granulocytes and

Monocytes Progenitor
 GDNF: Factor neurotrófico derivado de la glía, del inglés Glial-Derived Neurotrophic
Factor

GSC: Células troncales de línea germinal, del inglés Germline Stem Cells

GSK: Cinasa de la glucógeno sintetasa, del inglés Glycogen Synthase Kinase

GVHD: Enfermedad injerto contra huésped, del inglés Graft Versus Host Disease

HCAM: Molécula asociada a la migración celular, del inglés Homing Cell Adhesion
Molecule

HCT: Trasplante de células hematopoyéticas, del inglés Hematopoietic Cell

Transplant

HDAC: Desacetilasas de Histonas, del inglés Histone Deacetylases

HGF: Factor de crecimiento hepático, del inglés Hepatocyte Growth Factor

HLA: Antígenos leucocitarios humanos, del inglés Human Leukocyte Antigen

HSC: Célula troncal hematopoyética, del inglés Hematopoietic Stem Cells

ICAM: Molécula de adhesión intercelular, del inglés Intercelular Adhesion

Molecule
XXVIII
ICM: Masa celular interna, del inglés Inner Cell Mass

IDO: indolamina-2,3-dioxigenasa

IFN: Interferón

IGF-1: Factor de crecimiento similar a la insulina, del inglés Insulin-like Growth

Factor

IL: Interleucina

IL-7R: Receptor para la interleucina 7, del inglés Interleukin 7 Receptor

INL: Capa nuclear interna de la retina, del inglés Inner Nuclear Layer

IPL: Capa plexiforme interna de la retina, del inglés Inner Plexiform Layer

iPSC: Células troncales pluripotenciales inducidas, del inglés Induced Pluripotent

Stem Cells

LESC: Células epiteliales limbales, del inglés Limbal Epithelial Stem Cells

LIF: Factor inhibidor de la leucemia, del inglés Leukemia Inhibitor Factor

LLA: Leucemia linfoblástica aguda

LLC: Leucemia linfocítica crónica

 LMA: Leucemia mieloide aguda

LMC: Leucemia mieloide crónica

LMPP: Progenitor multipotencial predispuesto al linaje linfoide, del inglés Lymphoid

Multipotent Primed Progenitor

LSC: Célula troncal leucémica, del inglés Leukemic Stem Cell

LSCD: Deficiencia de células troncales limbales, del inglés Limbal Stem Cell
Deficiency

LT: linfotoxina TNF-β

LT-HSC: Células troncales hematopoyéticas de largo plazo, del inglés Long Term-
Hematopoietic Stem Cells

LTC-IC: Células iniciadoras de cultivos a largo plazo, del inglés Long-Term Culture-
Initiating Cells

LTreg: Linfocitos T reguladores

M-CSF: Factor estimulador de colonias de monocitos, del inglés Monocytes-Colony

Stimulating Factor
XXIX
MDP: Progenitor de macrófagos y células dendríticas, del inglés Macrophages
and Dendritic Cell Progenitor

Meg-BFC: Células formadoras de brotes megacariocíticos, del inglés Megakaryocyte-

Burst Forming Cells

Meg-CFC: Células formadoras de colonias de megacariocitos, del inglés

Megakaryocyte-Colony Forming Cells

MEP: Progenitor de eritrocitos y megacariocitos, del inglés Megakaryocytes and

Erythrocytes Progenitor

MHC: Complejo principal de histocompatibilidad, del inglés Major

Histocompatibility Complex

MLP: Progenitor multi-linfoide, del inglés Multi-Lymphoid Progenitor

MO: Médula ósea

MPP: Progenitor multipotencial, del inglés Multi-Potent Progenitor

MPTP: 1-Metil-4-Fenil-1,2,3,6-Tetrahidropiridina

MRT: Mortalidad relacionada al trasplante

MSC: Células troncales mesenquimales, del inglés Mesenchymal Stem Cells

NCAM: Molécula de adhesión de células neurales, del inglés Neural Cell Adhesion
Molecule
 NDA: Neuronas Dopaminérgicas

NEO: Neomicina

NEP: Precursores neuroepiteliales, del inglés Neuroepitelial Precursors

NGF: Factor de crecimiento neuronal, del inglés Neural Growth Factor

NK: Células asesinas naturales, del inglés Natural Killer

NM: Neuronas Motoras

NPC: Células precursoras/progenitoras neurales, del inglés Neural Precursor/

Progenitor Cells

NSC: Célula troncal neural, del inglés Neural Stem Cells

ONL: Capa nuclear externa de la retina, del inglés Outer Nuclear Layer

ONU: Organización de las Naciones Unidas

OPL: Capa plexiforme externa de la retina, del inglés Outer Plexiform Layer

OSM: Oncostatina M
XXX
p.c.: Posteriores al coito

PAT: Progenitor de amplificación transitoria

PD: Enfermedad de Parkinson, del inglés Parkinson´s Disease

pDC: Células dendríticas plasmacitoides, del inglés plasmacytoid Dendritic Cells

PDGF: Factor de crecimiento derivado de plaquetas, del inglés Platelet Derived

Growth Factor

PECAM: Molécula de adhesión de plaquetas-endotelio, del inglés Platelets

Endothelium Cell Adhesion Molecule

PET: Tomografía por emisión de positrones, del inglés Positron Emission

Tomography

PGC: Células Germinales Primordiales, del inglés Primordial Germ Cells

PGE: Prostaglandina E

RA: Ácido retinoico, del inglés Retinoic Acid

RD: Retinopatía Diabética

RG: Glía radial, del inglés Radial Glia

RMS: Corriente migratoria rostral, del inglés Rostral Migratory Stream

 ROP: Retinopatía del Prematuro, del inglés Retinopathy of Prematurity

RP: Retinitis Pigmentosa

SC: Célula troncal, del inglés Stem Cell

SCF: Factor de células troncales, del inglés Stem Cell Factor

SCID: Inmunodeficiencia severa combinada, del inglés Severe Combined

ImmunoDeficiency

SCNT: Transferencia nuclear de célula somática, del inglés Somatic Cell Nuclear
Transfer

SCU: Sangre de cordón umbilical

SDF-1: Factor derivado del estroma, del inglés Stromal Derived Factor-1

SGZ: Zona subgranular, del inglés Sub-Granular Zone

shRNA: Silenciamiento de horquilla corta de RNA, del inglés Short Hairpin

Ribonucleic Acid

SLE: Sobrevida libre de enfermedad

XXXI
SL-IC: Células iniciadoras de leucemia en ratones SCID, del inglés SCID-Leukemia
Initiating Cells

SN: Substantia Nigra

SOD1: Superóxido Dismutasa 1

SPm: Sangre periférica movilizada

SRC: Células repobladoras de ratones SCID, del inglés SCID Repopulating Cells

SSEA: Antígeno embrionario de etapa específica, del inglés Stage-Specific

Embryonic Antigen

SVZ: Zona subventricular, del inglés SubVentricular Zone

TCR: Receptor de células T, del inglés T Cell Receptor

TGF-β: Factor de crecimiento transformante beta, del inglés Transforming Growth

Factor β

TLR: Receptor tipo Toll, del inglés Toll-Like Receptor

TH: Tirosina Hidroxilasa

TNAP: Fosfatasa alcalina tejido inespecífica, del inglés Tissue Non-specific Alkaline
Phosphatase
 TNF: Factor de necrosis tumoral, del inglés Tumor Necrosis Factor

TPO: Trombopoyetina

TRA: Antígeno de rechazo tumoral, del inglés Tumour Rejection Antigen

TSA: Tricostatina A

TSC: Células troncales del trofoblasto, del inglés Trophoblast Stem Cells

USSC: Célula troncal somática sin restricción, del inglés Unrestricted Somatic
Stem Cells

VCAM: Molécula de adhesión de células vasculares, del inglés Vascular Cell

Adhesion Molecule

VEGF: Factor de crecimiento vascular endotelial, del inglés Vascular Endothelial

Growth Factor

VEGFR1: Receptor para el factor de crecimiento del endotelio vascular-1, del inglés
Vascular Endothelial Growth Factor Receptor

VSELS: Célula troncal muy pequeña semejante a las embrionarias, del inglés Very
Small Embryonic-Like Stem Cells
XXXII
vWF: Factor von Willebrand, del inglés von Willebrand Factor

XEN: Células troncales del endodermo extraembrionario, del inglés Extra

Embryonic Endoderm

ZFN: Nucleasa de dedos de zinc, del inglés Zinc Finger Nuclease

 PRÓLOGO

El campo de la investigación biomédica que cubre este nuevo libro, el de las

Células Troncales y la Medicina Regenerativa, que actualmente se encuentra en
una etapa de crecimiento acelerado y vigoroso, en realidad se inicia hace 50
años, en 1961 en Toronto, con la demostración clásica de la existencia de células
troncales con capacidades multipotenciales, por Till y McCulloch (1). Estos auto-
res inyectaron células de médula ósea a ratones irradiados letalmente, que sobre-
vivieron y desarrollaron nódulos en el bazo. Cada uno de estos nódulos consistía
en una colonia de células de tipo eritroide y granulocítico, derivada de una sola
célula, la célula troncal formadora de colonias. Por otro lado, a principios de los
años 70, en Inglaterra, Edwards y Steptoe lograron el desarrollo normal de óvulos
humanos fecundados in vitro por espermatozoides también humanos y conser-
vados en esas condiciones hasta alcanzar una etapa compatible con su super-
vivencia y desarrollo normal, cuando se depositaban en un útero previamente
condicionado para permitir su implantación y crecimiento. El triunfo de esta tec-
nología, de fertilización in vitro, ideada para proporcionar una solución viable a
ciertos problemas de infertilidad que no podían resolverse de otra manera, fue el
nacimiento de Louise Brown, la primera “bebé de probeta”, en 1977 (2).

La euforia generada por el éxito científico de este maravilloso experimento

XXXIII
ocultó al principio un problema ético médico: cada vez que se logra la fertiliza-
ción in vitro y la implantación uterina del producto que finalmente se convertirá
en un ser humano, quedan en espera de este triunfo un número variable (entre
10 y 50) de óvulos fecundados y en principio con igual capacidad de conver-
tirse en miembros normales de nuestra especie Homo sapiens, si les hubiera to-
cado la lotería de ser seleccionados para participar en todo el proceso. ¿Qué
hacer con ellos?.

Una respuesta a esta pregunta es criopreservarlos para su posible uso futuro,

en caso de que la gestación fracase o que la pareja decida tener otros hijos;
otra respuesta es usarlos para diagnóstico genético pre-implantación, pero sólo
durante los primeros 14 días después de la fecundación, al cabo de los cuales
también deben congelarse. ¿Por cuánto tiempo? En 1998, Thompson et al (3)
dieron otra respuesta científica a la pregunta de qué hacer con los zigotes no
utilizados en protocolos de fecundación in vitro. A partir de embriones humanos
cultivados hasta alcanzar el estadio de blastocisto (96-120 horas) con propósitos
reproductivos, estos investigadores aislaron varias líneas celulares con propieda-
des características de elementos primitivos y totalmente indiferenciados, teóri-
camente capaces (dadas las condiciones necesarias) de dar origen a todos
los distintos fenotipos celulares que componen a un organismo adulto, que son
poco más de 200. En ese mismo año, Shamblott et al (4), trabajando en forma
independiente y a partir de tejidos derivados de abortos, obtuvieron los mis-
mos resultados. Este triunfo científico se logró en parte gracias a la experiencia
 adquirida con el cultivo de células de embriones de otros mamíferos, especial-
mente de ratón y primates. El trabajo con ratones permitió establecer las tres
características esenciales de las células troncales embrionarias, que son: 1) se
derivan de embriones en etapa de pre-implantación; 2) proliferan por tiempo
indefinido manteniéndose indiferenciadas; y 3) conservan en forma estable su
potencial para generar elementos de las tres capas germinales embrionarias,
aún después de cultivos prolongados (años).

La inclusión de Homo sapiens en la lista de especies de mamíferos en los que

se habían logrado mantener cultivos estables de células indiferenciadas embrio-
narias con las tres características mencionadas abrió la posibilidad de usarlas no
sólo para estudiar distintos aspectos del proceso de diferenciación celular, sino
también para aprovecharlas con fines terapéuticos en muy diferentes situacio-
nes patológicas, siempre y cuando se determinaran las condiciones necesarias
para lograr su diferenciación en tipos celulares específicos y estables (5). Tanto
el resto de la historia de este campo de la biología contemporánea como su
estado actual, no sólo en otros países sino en México, forman el contenido de
este volumen. Aquí encontrará el amable lector todo lo que quería saber sobre
células troncales y medicina regenerativa, y no se atrevía a preguntar…El primer
capítulo es un resumen muy completo del tema, y va seguido de presentaciones
XXXIV más amplias sobre aspectos más específicos como células troncales embriona-
rias, gónadas y células troncales, células troncales neurales, mesenquimatosas
y hematopoyéticas; también se incluyen el nicho de las células troncales, el uso
de la sangre del cordón umbilical para aislamiento y trasplante clínico, las célu-
las troncales tumorales y el trasplante de células hematopoyéticas. De especial
interés son las secciones sobre medicina regenerativa, sobre el rescate de pato-
logías del sistema nervioso, sobre la reprogramación de células diferenciadas a
células pluripotentes y sobre modelos animales para el estudio funcional de las
células troncales. El volumen se cierra con un excelente análisis de los aspectos
bioéticos del estudio y uso de células troncales.

Felicito a los autores de este libro, tanto por su idea como por su contenido,
porque cumple cabalmente con su objetivo, que es presentar una visión actua-
lizada y completa de un nuevo campo de las ciencias biomédicas de nuestro
tiempo. Y también felicito al amable lector que lo disfrute, porque es su tiempo.

Dr. Ruy Pérez Tamayo

Referencias
1 Till JE, McCulloch EA, Direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone
marrow. Radiat Res 14: 213-222, 1961.
2 Edwards RG, Steptoe PC, Cuestión de vida. Barcelona, 1980.
3 Thompson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS et al. Embrionic stem cell lines derived from human
blastocysts. Science 262: 1145-1147, 1998.
4 Shamblott MJ, Axelman J, Wang S, et al. Proc Nat Acad Sci USA 95: 13726-13731, 1998.
5 Weissmann H, Translating stem cell and progenitor cell biology to the clinic: barriers and oppor-
tunities. Science 287: 1442-1446, 2000.
Capítulo I

Células troncales y medicina regenerativa:

conceptos básicos, estado actual y perspectivas futuras

Héctor Mayani

RESUMEN

Las células troncales son células inmaduras, no diferenciadas, con una alta ca-
pacidad de autorreplicación y que pueden diferenciarse en uno o más tipos de
células especializadas con funciones específicas en el organismo. Estas células
están presentes a todo lo largo de la escala filogenética animal, organizando
y dirigiendo el desarrollo y la regeneración de tejidos y órganos, tanto en orga-
nismos relativamente simples, como en aquellos extremadamente complejos.
Diferentes tipos de células troncales han sido identificados; desde el cigoto de
un gusano microscópico, hasta las células troncales que regeneran las neuronas
del cerebro de un delfín. Durante los últimos diez años, las células troncales se
han convertido en centro de atención en la biología y la medicina. Por un lado,
su estudio ha ayudado a entender procesos biológicos fundamentales, como
la diferenciación celular y la regeneración tisular; por otro lado, su versatilidad
funcional, tanto in vivo como in vitro, y la capacidad de cultivarlas y manipu-
larlas ex vivo, han constituido las bases para el desarrollo de la terapia celular
y la medicina regenerativa. Su impacto ha sido tal, que la manipulación y el
posible empleo de un tipo particular de célula troncal humana, la célula troncal
embrionaria, ha sido motivo de debates éticos, políticos y religiosos. Sin lugar a
dudas, el área de las células troncales es, hoy en día, una de las áreas con ma-
yor relevancia científica y mayor potencial clínico.

INTRODUCCIÓN

Durante más de 100 años, biólogos y médicos han estudiado a los embriones de
una gran cantidad de especies animales —desde pequeños gusanos hasta el
ser humano— con la finalidad de responder una pregunta: ¿Cómo se desarrolla
un organismo complejo a partir de una sola célula? A lo largo de este tiempo, se
ha reconocido que dicha célula, el cigoto, es una célula muy especial, capaz
de contener todos los elementos necesarios para permitir el desarrollo del em-
brión y de las estructuras extraembrionarias.

El estudio del desarrollo embrionario llevó a algunos grupos a enfocarse en el

desarrollo de tejidos específicos. Así, a principios de la década de 1960, se reco-
noció que en algunos tejidos existen células “maestras” capaces de dar origen a
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

los distintos tipos celulares del tejido en el que se localizan. Estas células se identifi-
caron por primera vez en el sistema hematopoyético de ratones (1), sin embargo,
a lo largo de los años, se ha demostrado su presencia en muchos otros tejidos,
como la epidermis, el músculo, el hígado y hasta en el cerebro. Con el tiempo,
se vio que tanto las células formadoras de los tejidos somáticos, como el cigoto,
comparten diversas características biológicas (a nivel genético, celular y mole-
cular) y este hecho ha permitido que se les reconozca como miembros de una
misma familia, la familia de las células troncales.

En los últimos años, se ha generado gran expectativa y controversia alrede-

dor de las células troncales. Actualmente, cientos de laboratorios en todo el
mundo están trabajando en la identificación, purificación, cultivo in vitro y ma-
nipulación genética de células troncales provenientes de distintas fuentes. Nu-
merosas compañías biotecnológicas han puesto su atención en estas células y
varios centros e institutos de investigación han sido creados en torno a dichas
células. Por otra parte, durante los últimos años los gobiernos de E.U.A. y varios
países europeos han debatido sobre el financiamiento y el uso experimental
de un tipo de célula troncal, las células troncales embrionarias humanas. Sin
embargo, más allá de los intereses sociales, políticos, morales y económicos, es
evidente que el estudio de las células troncales es un asunto de gran actualidad
36 —particularmente en la biología y la medicina— debido a su relevancia para
el entendimiento de procesos biológicos básicos, como la proliferación y la di-
ferenciación celular, y también por su uso —real y potencial— en el tratamiento
de algunas enfermedades hematológicas y diversos trastornos como la enfer-
medad de Parkinson, la diabetes, las lesiones de médula espinal y el cáncer.

El objetivo de este capítulo es presentar un panorama general acerca del cam-

po de las células troncales e introducir diversos conceptos básicos sobre su bio-
logía y aplicación. A lo largo del capítulo se presentarán ejemplos tomados de
algunos de los numerosos tipos de células troncales que se han identificado y ca-
racterizado hasta ahora. En particular, utilizaremos a las células troncales de los sis-
temas hematopoyético y nervioso para este fin. Sin embargo, es importante hacer
hincapié en que dichas células serán tratadas de manera muy superficial, ya que
más adelante hay capítulos enfocados en forma específica a estos dos tipos de
células troncales (capítulo IV para las células neurales y capítulo VI para las células
hematopoyéticas). Este primer capítulo servirá de preámbulo, para que el lector
pueda entender con mayor facilidad y disfrutar aún más el resto de este libro.
capitulo I Células Troncales y Medicina Regenerativa: conceptos básicos, estado actual y perspectivas futuras

¿QUÉ SON LAS CÉLULAS TRONCALES?

La definición de célula troncal debe hacerse de acuerdo a criterios funcionales,

ya que estas células no poseen características morfológicas que puedan dis-
tinguirlas del resto de las células del tejido al que pertenecen. De acuerdo con
esto, las células troncales se han definido como células inmaduras, no diferen-
ciadas, con una alta capacidad de autorreplicación y que pueden diferenciar-
se en uno o más tipos de células especializadas con funciones específicas en
el organismo (Figura 1) (2). Como ya se ha dicho, el cigoto se sitúa al inicio del
desarrollo embrionario; por su parte, las células troncales somáticas se sitúan al
inicio del (los) linaje(s) que componen un tejido determinado.

De la definición anterior se desprende un concepto que es fundamental para

entender a las células troncales: la autorreplicación. Cuando una célula troncal
se divide, por lo menos una de las dos células resultantes conserva casi la to-
talidad de las características biológicas de la célula original, es decir, la célula
troncal se ha autorreplicado, produciendo una nueva célula troncal. En algu-
nos casos, ambas células resultantes son células troncales, en otros, solo una de
las dos células generadas conserva las propiedades de “troncalidad”, mientras
que la otra pierde la capacidad de autorreplicarse.

En la mayoría de los tejidos, entre las células troncales y su progenie total- 37

mente diferenciada, existen poblaciones intermedias de células progenitoras/
precursoras, las cuales no son capaces de autorreplicarse, poseen una capaci-
dad proliferativa limitada y un restringido potencial de diferenciación. Una de
las principales funciones de estas poblaciones intermedias es incrementar (am-
plificar) el número de células diferenciadas por cada división de las células tron-
cales (Figura 1). En tejidos como la epidermis interfolicular, el resultado final es
la generación de un amplio número de células maduras del mismo tipo, el que-
ratinocito. En contraste, en tejidos como la sangre, de una sola célula troncal
hematopoyética (HSC) se pueden originar grandes cantidades de 10 distintos ti-
pos de células maduras (eritrocitos, plaquetas, neutrófilos, basófilos, esosinófilos,
monocitos, linfocitos T, linfocitos B, células NK y células dendríticas).

La tasa de producción de células maduras a partir de las células troncales

varía considerablemente entre los distintos tejidos. En la epidermis y la sangre,
donde las células maduras tienen una vida muy corta, se generan millones de
células diariamente (ej. en un hombre de 70 kg se producen 1010 eritrocitos y 4
x 108 leucocitos cada hora). En contraste, la producción de células maduras es
muy baja en tejidos con una regeneración o recambio celular limitados, como
el cerebro o el hígado (una estimación conservadora indica que en ratas y rato-
nes, cada día se produce 1 neurona por cada 2,000 neuronas existentes).
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

38

Figura 1. Definición funcional de célula troncal. Las células troncales son células inmaduras, no
diferenciadas, que tienen la capacidad de autorreplicarse (a) y de diferenciarse (b), dando ori-
gen a uno o más tipos de células especializadas con funciones específicas en el organismo (d).
Entre las células troncales y las células maduras existen poblaciones de células transitorias (c) que
permiten la amplificación del número de células maduras.

CÉLULAS TRONCALES DURANTE EL DESARROLLO

A lo largo del desarrollo de los mamíferos se generan diversos tipos de células

troncales (Figura 2). La primera célula troncal es el huevo fertilizado, o cigoto,
la cual es una célula troncal totipotencial, capaz de producir tanto al embrión,
como a las estructuras que no formarán parte de él (extraembrionarias), pero
que son fundamentales para su desarrollo, como la placenta, el saco vitelino y el
cordón umbilical. Hasta el estadio de mórula (8 células), cada célula es idéntica
a las otras; es decir, todas son células troncales totipotenciales, lo que deja ver
la capacidad de autorreplicación del cigoto. Conforme avanza el desarrollo, el
embrión alcanza el estadio de blastocisto, en el que cada una de las células que
forma parte de la masa celular interna es capaz de formar células de cualquier
tejido del organismo, de ahí que se les considere células troncales pluripotenciales
(3). Sin embargo, dichas células troncales embrionarias (ESC, del inglés Embryonic
capitulo I Células Troncales y Medicina Regenerativa: conceptos básicos, estado actual y perspectivas futuras

Stem Cells) son incapaces de dar origen a las estructuras extraembrionarias. Es

importante destacar que bajo condiciones de cultivo específicas, las ESC pueden
ser inducidas a una proliferación ilimitada sin diferenciación (4). En el capítulo III se
presenta un análisis amplio y detallado sobre las ESC.

A partir de las ESC se producen diferentes células troncales somáticas, inclu-

yendo aquellas que dan origen al sistema nervioso central, a los nervios perifé-
ricos, la sangre, el hígado, el páncreas, los músculos, los huesos, la piel, el co-
razón, etc. Dichas células troncales son consideradas multipotenciales, ya que
pueden generar diversos linajes celulares dentro de un mismo tejido. A partir de
las ESC, se produce también un tipo diferente de células troncales no somáticas:
las células troncales germinales, las cuales migran a las gónadas en desarrollo
(crestas genitales) y eventualmente dan lugar a los gametos.

39

Figura 2. Células troncales durante el desarrollo prenatal en mamíferos. El cigoto (a) es una célula
troncal totipotencial (da origen al embrión y a las estructuras extraembrionarias). Al autorreplicar-
se, genera varias células idénticas a ella (b), las cuales constituyen el estadio de mórula. En el es-
tadio de blastocisto (c), las células de la masa celular interna (d) corresponden a células troncales
embrionarias pluripotenciales (pueden formar células de cualquier tejido embrionario). Dichas cé-
lulas troncales embrionarias dan lugar a células troncales de la línea germinal (e), o bien, a células
troncales somáticas (f) de las tres capas embrionarias: Ectodermo (ej. piel y cerebro), endodermo
(ej. hígado y páncreas) y mesodermo (ej. sangre y músculo).
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

BIOLOGÍA DE LAS CÉLULAS TRONCALES

Como se mencionó anteriormente, las células troncales no poseen característi-

cas morfológicas que puedan utilizarse para su identificación; por lo tanto, ac-
tualmente la forma de reconocer a estas células incluye tanto el análisis inmu-
nofenotípico (es decir, la expresión de moléculas de membrana —antígenos— o
moléculas intracelulares), como el análisis de la expresión de ciertos genes que
pueden actuar como marcadores. Sin embargo, son los ensayos funcionales
—tanto in vivo como in vitro— los que determinan, sin lugar a dudas, la iden-
tidad de toda célula troncal. Para ilustrar estos conceptos, tomaremos como
ejemplo a las células troncales de algunos tejidos.

En el sistema hematopoyético humano, la mayoría de las células troncales

hematopoyéticas (HSC, del inglés Hematopoietic Stem Cells) expresan los an-
tígenos CD34, CD90 y CD133, así como bajos niveles de c-kit (CD117); por otra
parte, no expresan los antígenos CD38, HLA-DR, CD45RA, CD71 o cualquier otro
antígeno específico de algún linaje celular (por lo tanto, son células linaje nega-
tivas). Las HSC de ratón expresan un alto nivel de Sca-1, H-2K y altos niveles de
c-kit y CD90, siendo también células linaje negativas (5).

Funcionalmente, las HSC se identifican por su capacidad para repoblar in vivo

40 el sistema hematopoyético de animales mielosuprimidos, es decir, animales cuyo
sistema hematopoyético se encuentra disminuido. En ratones, estos estudios se
realizan transplantando HSC en ratones irradiados; en el caso de las HSC huma-
nas, se pueden realizar estudios similares introduciendo estas células a ratones
inmunodoficientes SCID. In vitro, las HSC —tanto de humano como de ratón— se
identifican por su capacidad para generar células hematopoyéticas por largos
periodos de tiempo (varios meses) en cultivos líquidos, los cuales son establecidos
en presencia de una capa de células adherentes (células estromales), que sirven
para proporcionar a las HSC un microambiente que las alimenta y regula.

La identificación de las células troncales del sistema nervioso central, o células

troncales neurales (NSC, del inglés Neural Stem Cells) —aquellas que dan origen
a las neuronas, los astrocitos y los oligodendrocitos— depende también del uso
de distintos marcadores. Entre los marcadores que se han descrito para las célu-
las troncales neurales, la nestina, proteína del filamento intermedio, es uno de los
más utilizados. Otros marcadores, como las proteínas GFAP, vimentina, A2B5 y la
proteína Sox2, se han utilizado también para la identificación de NSC (6).

La actividad de las NSC se ha probado tanto in vivo como in vitro. Dichas

células pueden ser trasplantadas en el cerebro de ratas adultas, donde son
capaces de producir neuronas y glía. Las neuronas generadas in vivo, después
del trasplante, tienen actividad eléctrica y establecen conexiones funcionales,
exhiben eventos postsinápticos espontáneos e inducidos y responden a la apli-
cación local de reguladores como el glutamato. In vitro, las NSC son capaces
de crecer en cultivos líquidos, como monocapas adherentes o como agrega-
capitulo I Células Troncales y Medicina Regenerativa: conceptos básicos, estado actual y perspectivas futuras

dos flotantes conocidos como neuroesferas. Cuando estas últimas estructuras se

cultivan en condiciones apropiadas, pueden dar lugar a neuronas y a glía.

En otros tejidos, el empleo de marcadores también ha ayudado a la identi-

ficación y aislamiento de células troncales. Por ejemplo, en ratones, las células
troncales de hígado fetal expresan el inmunofenotipo CD29+ CD49f+ c-Met+ c-kit-
CD45- Ter119-, mientras que las células troncales de músculo expresan el fenotipo
c-Met+ n-caderina+ CD34+ Myf-5+ MyoD-; por su parte, las de la epidermis expresan
altos niveles de las integrinas β1 y α6 y niveles intermedios de la molécula p63 (7-9).

Frecuencia y localización espacial de las células troncales

En general, la frecuencia de las células troncales presentes en los distintos teji-

dos es muy baja. Esto hace que su identificación y su estudio representen retos
importantes para todos aquellos dedicados a la investigación de dichas células.
Por ejemplo, veamos el caso de las HSC. En la vida postnatal de los mamíferos, la
médula ósea (es decir, el tejido localizado en el interior de los huesos) constituye
el sitio principal de producción de células sanguíneas y la mayoría de las HSC
se localizan en este tejido. Aquí, la proporción de HSC es de 1 por cada 20,000
células de médula ósea (es decir, conforman el 0.005% del total de células de 41
médula ósea). Se estima que en el ser humano hay aproximadamente 50 mi-
llones de HSC, cada una de las cuales puede producir hasta 1013 células san-
guíneas maduras en un periodo de vida normal. La mayoría de estas células se
localiza dentro de la región endosteal, esto es, en la zona más cercana al hueso.
Conforme las HSC producen células con mayor grado de maduración, éstas se
localizarán en regiones cada vez más alejadas del hueso, hasta que las células
maduras se distribuyen predominantemente en la región central de la médula
ósea, cerca de los vasos sanguíneos, listas para entrar a la circulación (10).

Las NSC también parecen estar localizadas en áreas específicas del SNC. Varias
regiones del cerebro de roedores adultos se han identificado como fuentes ricas
de dichas células, entre ellas, la zona subventricular y la zona subgranular del giro
dentado del hipocampo. También existe evidencia de que un número significativo
de células troncales neurales se localiza en la zona subependimal. Recientemente
se aislaron NSC del bulbo olfatorio de humanos adultos y se estableció que aproxi-
madamente 1% del total de células de este tejido son células troncales capaces
de autorreplicarse y de producir neuronas, astrocitos y oligodendrocitos (11).

En la capa epidérmica de la piel, las células troncales se localizan en la capa

basal, esto es, la capa más profunda de la epidermis. Es interesante mencionar
que la frecuencia de células troncales en este tejido parece ser mayor que la
frecuencia de células troncales en médula ósea y cerebro. De hecho, se ha su-
gerido que aproximadamente 10% de la población de células de la capa basal
son células troncales (12).
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

¿Cómo se regulan las funciones de las células troncales?

La viabilidad, autorreplicación, proliferación y diferenciación de las células tron-

cales son procesos extremadamente complejos, que dependen de diversos
factores, tanto intrínsecos como extrínsecos. Los primeros involucran a una gran
variedad de moléculas reguladoras, las cuales están presentes en la célula de
acuerdo con el tejido o linaje al que ésta pertenece; los segundos, incluyen a
todos los tipos celulares y sus productos, que forman parte del microambiente
en el que la célula se desarrolla. En otras palabras, la función de las células
troncales depende de factores reguladores intrínsecos que son modulados por
señales externas.

Elementos intrínsecos. Los factores intrínsecos reguladores de la función de

las células troncales incluyen a proteínas responsables de inducir divisiones ce-
lulares, tanto simétricas como asimétricas; factores de transcripción (FT) nuclear
que controlan —de manera positiva y negativa— la expresión de los genes;
moléculas reguladoras del ciclo celular y moléculas que actúan como relojes
mitóticos y que establecen el número de ciclos de división posibles dentro de las
poblaciones de células progenitoras/precursoras. A continuación, analizaremos
brevemente cada uno de los elementos mencionados.

42 Cuando una célula troncal se divide puede dar origen a dos células troncales
o a una célula troncal y a una célula progenitora (Figura 3). En el primer caso, se
trata de una división simétrica, pues ambas células resultantes son iguales entre
sí; en el segundo caso se trata de una división asimétrica, ya que las dos células
son diferentes entre ellas. El tipo de división que llevan a cabo las células tronca-
les parece estar influenciado por ciertas proteínas citoplasmáticas o membra-
nales, heredadas por cada célula hija durante la división mitótica. Es decir, las
divisiones simétricas y asimétricas de las células troncales pueden depender de
una distribución homogénea o heterogénea de algunas proteínas localizadas
en la superficie membranal o en ciertas regiones del citoplasma (13,14).
capitulo I Células Troncales y Medicina Regenerativa: conceptos básicos, estado actual y perspectivas futuras

43

Figura 3. Divisiones simétricas y asimétricas. Cuando una célula troncal se divide puede dar lugar a
dos células troncales (a) o a una célula troncal y a una célula progenitora (b). En el primer caso, se
trata de una división simétrica, pues ambas células resultantes son iguales entre sí; en el segundo caso
se trata de una división asimétrica, ya que las dos células son diferentes entre ellas. A través de divisio-
nes simétricas se incrementa el número de células troncales, mientras que con las divisiones asimétri-
cas dicho número se mantiene. El número de células troncales puede disminuir, si al dividirse generan
dos células progenitoras (c). Esto último llega a ocurrir en ciertas condiciones de stress fisiológico.

Existe abundante evidencia de que diversos FT (proteínas que se unen a regio-

nes promotoras del DNA, activando o bloqueando la expresión de genes especí-
ficos) controlan el destino de las células troncales. Por ejemplo, dentro del sistema
hematopoyético, la expresión coordinada de los genes que determinan un linaje
específico está mediada, por lo menos en parte, por la activación/supresión pro-
gramada de FT específicos para determinados linajes o estadios celulares (15). De
hecho, cada linaje hematopoyético parece estar controlado por combinaciones
únicas de FT, cada uno de los cuales puede ser expresado individualmente en
varios linajes. La lista de estas proteínas nucleares es bastante amplia e incluye
factores como SCL, PU.1, GATA-1, GATA-2, CBFb, NFkB y la familia de genes ho-
meóticos, entre otros. Los cambios en algunos de estos factores pueden causar
cambios significativos en el balance celular y de linajes dentro del sistema he-
matopoyético. Se ha establecido claramente que algunos de estos factores son
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

absolutamente necesarios para que se realice la hematopoyesis. Por ejemplo, se

ha demostrado que la generación de células hematopoyéticas durante el de-
sarrollo es totalmente dependiente de la presencia de SCL; sin esta molécula, no
hay producción de células sanguíneas y los animales mueren; por lo tanto dicho
FT debe estar presente en las HSC embrionarias y fetales.

Otros ejemplos de la participación de FT en la regulación de la función de las

células troncales incluyen a las células neurales y epiteliales. La familia de genes
bHLH, particularmente las neurogeninas, parecen jugar un papel esencial en
la promoción de la neurogénesis durante el desarrollo (16). Por otra parte, el FT
Math1, participa en la generación de los cuatro tipos diferentes de células del
epitelio intestinal (enterocitos, células “goblet”, células enteroendócrinas y célu-
las de “Paneth”) a partir de una célula troncal multipotencial (17).

Las etapas del ciclo celular están fuertemente asociadas con la función de
las células en cada paso de la hematopoyesis. Por ejemplo, para la autorrepli-
cación de las HSC es necesario un ciclo celular lento; para la expansión efecti-
va de la población de células progenitoras se requiere un ciclo celular rápido,
mientras que para la expresión de varias funciones de las células totalmente di-
ferenciadas, la suspensión del ciclo celular es apropiada y en algunas ocasiones
necesaria (18). No se conocen completamente los mecanismos de regulación
44 del ciclo celular de las HSC, sin embargo, algunas de las moléculas están siendo
identificadas. Para mencionar un ejemplo, recientemente se demostró que la
quiescencia se mantiene gracias a la molécula p21. De hecho, los estudios rea-
lizados in vivo en ratones demuestran que p21 es el interruptor que gobierna la
entrada de las células troncales al ciclo celular, y que en su ausencia, la perma-
nencia de las células en el ciclo celular conduce al agotamiento de la reserva
de células troncales (19).

Existe una fuerte evidencia sobre el papel de la longitud de los telómeros

como reloj mitótico en células somáticas. Durante el desarrollo de los tejidos, los
telómeros (las regiones distales de los cromosomas) se acortan progresivamente
conforme las células se dividen; una vez que estas estructuras cromosómicas
alcanzan una longitud crítica, la célula es incapaz de dividirse y envejece. En
estudios con células del sistema hematopoyético se ha observado que las HSC
humanas que poseen telómeros largos —como las células derivadas de hígado
fetal o de la sangre de cordón umbilical (SCU)— tienen potenciales de prolife-
ración significativamente mayores a los potenciales de las HSC con telómeros
cortos –como las que provienen de la médula ósea de adultos (20).

Elementos extrínsecos. Las células troncales se desarrollan dentro de mi-

croambientes específicos constituidos por distintos tipos celulares y sus produc-
tos. En conjunto, estos elementos externos proporcionan señales que controlan
la conducta de las células troncales, modulando la expresión y actividad de
los elementos intrínsecos presentes en la célula. El capítulo VII de este libro está
capitulo I Células Troncales y Medicina Regenerativa: conceptos básicos, estado actual y perspectivas futuras

dedicado en forma exclusiva a analizar dichos microambientes, por lo que aquí

trataremos este tema solo de manera introductoria.

Empezaremos por mencionar que el microambiente en el que se desarro-

llan las células troncales generalmente se compone de diversos tipos celulares,
cada uno de los cuales lleva a cabo una función específica. Este hecho es
muy importante, pues deja ver que los microambientes son complejos, estructu-
ral y funcionalmente. Las interacciones y la comunicación entre las células del
microambiente y las células troncales pueden llevarse a cabo de muy diver-
sas maneras. Por un lado, puede existir un contacto físico directo entre ambas,
a través de moléculas de adhesión y/o interacciones ligando-receptor. Dicho
contacto ha sido demostrado a través de estudios de microscopía electrónica.

Por otra parte, la interacción entre ambos tipos celulares puede darse de ma-
nera indirecta, a través de sus respectivos productos; es decir, a través de molé-
culas producidas y secretadas por ellas (21). Por ejemplo, las células microam-
bientales secretan moléculas —como la colágena, la fibronectina, la laminina,
los proteoglicanos y otras más— que forman una intrincada red molecular co-
nocida como matriz extracelular. Las células troncales expresan en su superficie
una serie de moléculas (las integrinas) que interactúan con dicha matriz.

Otro tipo de interacción es a través de proteínas secretadas por ambos tipos 45

celulares y que se presentan de manera soluble. Una amplia gama de molé-
culas, como los factores de crecimiento, las interleucinas, los interferones, las
quimiocinas, etc., son producidas por las células del microambiente y llegan
hasta la célula troncal, para inducir, o inhibir, su proliferación, su diferenciación
o su migración. Dependiendo de la distancia que viajen, dichas moléculas lle-
varán a cabo acciones de tipo endócrino (cuando viajan a través del torrente
sanguíneo para alcanzar su célula blanco; este es el caso de la eritropoyetina),
parácrino (cuando viajan distancias muy cortas, para actuar sobre células veci-
nas), o autócrino (cuando actúan sobre la misma célula que las produjo). En el
sistema hematopoyético se han descrito más de 50 moléculas reguladoras, las
cuales son producidas por el microambiente de la médula ósea.

Cambios en la función de las células troncales durante el desarrollo

¿Cambia la función de las células troncales somáticas durante la ontogenia? La

respuesta a esta pregunta parece ser afirmativa, al menos para las HSC. La obser-
vación de que las HSC pueden encontrarse en el saco vitelino, el hígado fetal y
en varios tejidos hematopoyéticos de mamíferos adultos contribuyó al concepto
clásico de que las células troncales representan un tipo único de células inmorta-
les, presentes en números variables en los tejidos en distintos estados de desarrollo.
Sin embargo, estudios recientes, tanto in vivo como in vitro, han demostrado que
las HSC muestran cambios funcionales muy significativos durante la ontogenia,
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

lo que sugiere que estas células no son iguales a lo largo del desarrollo. Cuando
las HSC de hígado fetal y de médula ósea adulta de ratón se transplantaron en
ratones irradiados, se observó que el potencial de repoblación de las primeras era
muy superior al de las últimas. Estudios in vitro con HSC de humano obtenidas de
distintas fuentes, también demostraron que las células derivadas de tejidos fetales
(es decir, el hígado) poseen potenciales de proliferación y expansión superiores
a los de las células derivadas de tejidos adultos (médula ósea). Es interesante el
hecho de que los potenciales de proliferación y expansión de las HSC provenien-
tes de la sangre de cordón umbilical son superiores a los de las células de médula
ósea, pero inferiores a las de las células de hígado fetal (22). Por lo anterior, se
puede concluir que la tasa de recambio y el potencial de proliferación de las HSC
disminuyen marcadamente durante el desarrollo de los mamíferos.

Las observaciones anteriores correlacionan con el hecho de que las HSC de-
rivadas del hígado fetal poseen telómeros más largos que las HSC derivadas de
la sangre de cordón umbilical o de la médula ósea, y que las células de sangre
de cordón umbilical, por su parte, poseen telómeros más largos que las células
de médula ósea. Con base en éstos y otros estudios sobre la biología de la HSC,
se ha sugerido que la longitud de los telómeros actúa como un reloj mitótico
en las HSC, determinando la capacidad proliferativa de dichas células. Estos
46 hallazgos son difíciles de reconciliar con el concepto de que la célula troncal es
un tipo celular inmortal e invariable. En otras palabras, es posible que no exista
una “verdadera” autorreplicación de las células troncales. Sin embargo, con-
siderando el tamaño de la población de HSC en el momento del nacimiento
(aparentemente de varios millones), el hecho de que cada HSC pueda generar
hasta 1013 células maduras y que la mayoría de las HSC están quiescentes (fase
G0 del ciclo celular) por lo que su tasa de activación es lenta, la falta de una
“verdadera” autorreplicación no tendría impacto sobre la hematopoyesis, ya
que el número de HSC que un individuo posee puede ser más que suficiente
para mantener la producción de células sanguíneas durante toda su vida.

Recientemente se han presentado diversas evidencias que indican que la

función de otros tipos de células troncales, como las mesenquimales (las que
dan origen al tejido graso, hueso y cartílago) y las epiteliales también se ve dis-
minuida con la edad. Esto sugiere que los cambios funcionales ocurridos duran-
te el desarrollo no son exclusivos de las células hematopoyéticas, sino que di-
chos cambios son inherentes a muchas (probablemente a todas) de las células
troncales del organismo (23,24).

PLASTICIDAD

Como hemos visto en secciones previas de este capítulo, los potenciales de

diferenciación del cigoto (célula troncal totipotencial) y de las células troncales
embrionarias (células troncales pluripotenciales) son muy amplios, ya que las
capitulo I Células Troncales y Medicina Regenerativa: conceptos básicos, estado actual y perspectivas futuras

primeras pueden generar a todo el embrión, mientras que las segundas pueden
generar células de las tres capas embrionarias (ectodermo, mesodermo y en-
dodermo). Por otra parte, la idea general con respecto a las células troncales
somáticas (multipotenciales) era, hasta hace poco, que su potencial de diferen-
ciación estaba restringido a un sistema orgánico individual; en este sentido, las
HSC producirían únicamente células sanguíneas; las células troncales neurales
darían lugar únicamente a neuronas, astrocitos y oligodendrocitos; las células
satélite del músculo a células musculares y así sucesivamente. Sin embargo, du-
rante la última década, una gran cantidad de estudios in vivo, principalmente
en ratones, han generado evidencias que indican que este concepto pudiera
no ser del todo cierto. Es decir, que las células troncales somáticas poseen una
plasticidad de diferenciación que excede a su tejido de origen.

El término plasticidad se refiere a la capacidad de una célula troncal de un

tejido específico para dar origen a células de otros tejidos (Figura 4) (25). Aun-
que éste sigue siendo un tema controversial y la evidencia no es concluyente,
parece ser que la plasticidad de diferenciación de las células troncales somáti-
cas es mayor de lo que se había estipulado. A continuación analizaremos algu-
nos ejemplos sobre este concepto.

47

Figura 4. Multipotencialidad versus plasticidad. El término multipotencialidad (a) se refiere a la capa-

cidad de una célula troncal somática para generar células de distintos linajes dentro de un mismo
tejido. Por ejemplo, la célula troncal hematopoyética (HSC) puede producir 10 distintos tipos de
células sanguíneas (eritrocitos, plaquetas, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, monocitos, linfocitos T, lin-
focitos B, células NK y células dendríticas). El término plasticidad se refiere a la capacidad de una
célula troncal de un tejido específico para dar origen a células de otros tejidos (b y c). Por ejemplo,
hay estudios que sugieren que las HSC pueden originar células del sistema nervioso central.
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

Plasticidad de las HSC

Hace solamente 11 años, se reportó que las células de médula ósea son capa-
ces de generar células musculares in vivo. Esto se probó en estudios animales en
los que se transplantó médula ósea completa en ratones. Utilizando marcadores
específicos, se demostró que las células de médula trasplantadas dieron lugar
a miocitos en el hospedero. Estudios posteriores con HSC purificadas, demostra-
ron que estas células tienen el mismo potencial miogénico que la médula ósea
completa. Otra indicación del potencial miogénico de las células derivadas de
la médula provino de estudios en los que las células purificadas de médula ósea
de ratones adultos regeneraron vasos sanguíneos y cardiomiocitos, al ser inyec-
tadas en ratones con infarto de miocardio (26-28).

En otro grupo de experimentos con un modelo de trasplantes similar al ante-

rior, se demostró que las células de médula ósea pueden dar origen también a
hepatocitos y otras células del hígado. El desarrollo de hepatocitos a partir de
médula ósea también fue observado en humanos, en estudios con pacientes
femeninas que recibieron trasplantes de médula ósea de donadores masculi-
nos. En estudios más recientes con ratones, se demostró que la población de cé-
lulas troncales de médula ósea con el potencial de generar hepatocitos tiene el
inmunofenotipo Sca-1+ CD90+ CD117+ Lin- (29).
48
De acuerdo a ciertos estudios, las células de médula ósea también pueden
generar células nerviosas. Cuando se trasplantaron células de médula ósea de
ratón adulto —marcadas genéticamente— en ratones adultos irradiados letal-
mente, se observó que en el cerebro del animal se desarrollaron células con
morfología neuronal, las cuales no solo expresaban proteínas neuronales, sino
que también expresaban los marcadores de las células trasplantadas (30,31).
Es importante mencionar que la plasticidad de las HSC se ha demostrado a
nivel de una sola célula; de hecho, la inyección intravenosa de una sola HSC
produjo una progenie que se diferenció en células epiteliales, en células hepáti-
cas, pulmonares, de riñón e intestino (32). Esta evidencia apoya fuertemente la
existencia de HSC con un potencial de diferenciación no hematopoyético. Sin
embargo, todavía se tiene que esclarecer si todas las HSC, o sólo una subpobla-
ción de ellas, tienen dicho potencial.

Plasticidad de las NSC

Las células troncales neurales también han mostrado un potencial de diferen-

ciación anteriormente insospechado. En un estudio publicado hace 12 años,
se cultivaron NSC —derivadas de embriones o ratones adultos— y la progenie
clonal de una de dichas células se inyectó —por vía intravenosa— en ratones
irradiados subletalmente. Las células neurales transplantadas fueron capaces
de poblar la médula ósea y reconstituir la hematopoyesis en estos ratones. Es
interesante indicar que dichas células también generaron neuronas, astrocitos y
capitulo I Células Troncales y Medicina Regenerativa: conceptos básicos, estado actual y perspectivas futuras

oligodendrocitos in vitro, argumentando contra la posibilidad de que estas célu-

las fueran en realidad células hematopoyéticas errantes, que por alguna razón
estuvieran residiendo en el cerebro (33).

En contraste con estos estudios, un estudio un poco más reciente muestra

evidencias que indican que la generación de células sanguíneas a partir de
células troncales neurales no es un fenómeno común. En dicho estudio, se trans-
plantaron 128 células neurales de murino en animales hospederos y aunque es-
tas células fueron capaces de generar progenie de tipo neural in vivo, los auto-
res nunca observaron una contribución a la hematopoyesis; indicando que la
capacidad hematopoyética es una propiedad rara, si acaso existente, de las
células troncales neurales (34).

También se ha demostrado el potencial miogénico de las NSC. Cuando estas

células fueron cultivadas junto con mioblastos o inyectadas en el músculo es-
quelético de ratones adultos, el resultado fue la diferenciación de estas células
en miocitos a través de un proceso que requirió el contacto directo de las NSC
con las células musculares (35). En otro estudio, se inyectaron NSC de ratones
adultos en embriones tempranos de pollo o de ratón. En ambos modelos ani-
males, se encontró progenie de las células troncales neurales en distintos tejidos
del hospedero. Es notable que estas células se diferenciaron en distintos tipos
de células embrionarias, incluyendo hepatocitos, cardiomiocitos y células epi- 49
dérmicas, que representan a las tres capas embrionarias (es decir, endodermo,
mesodermo y ectodermo). En el mismo estudio, esta observación se confirmó a
nivel de una sola célula (36).

Controversias en torno a la plasticidad

¿Existe realmente la plasticidad? Y si es así, ¿Cómo explicarla? La primera de

estas dos preguntas surge debido a que en muchos de los estudios que sugieren
que la plasticidad existe, las células que se estudiaron no estaban totalmente
purificadas, sino que correspondían a una población heterogénea. Esto, según
algunos científicos, plantea la posibilidad de que, por razones no muy claras,
existan células neurales radicando en la médula ósea, y células hematopoyéti-
cas radicando en el cerebro, y que sean dichas células, precisamente, las que
lleven a cabo la generación de nuevas células tisulares a partir de las células
trasplantadas. Por otra parte, existen evidencias que indican que en algunos
casos se lleva a cabo una fusión entre las células residentes del tejido y las célu-
las trasplantadas, y que por ello se detectan células de dicho tejido expresando
marcadores de las células del donador. A pesar de lo anterior, hasta ahora pa-
recen ser más numerosas y sólidas las evidencias que apuntan hacia la plastici-
dad de las células troncales somáticas. Cabe mencionar que la plasticidad ha
sido sugerida no solo para las células neurales y hematopoyéticas, sino también
en células troncales de otros tejidos (37).
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

Dentro de los investigadores que apoyan la idea de la plasticidad, algunos han

propuesto que ésta ocurre cuando una célula troncal de un tejido determinado
—a través de mecanismos que no se han descifrado hasta ahora— da lugar a
una célula todavía más primitiva, la cual dará origen a una célula troncal de otro
tejido y ésta, a su vez, se diferenciará en células maduras de ese tejido (modelo
de desdiferenciación-rediferenciación) (Figura 5). Otros sugieren que una célula
troncal del tejido A podría dar origen —de manera directa, sin pasar por un esta-
dio intermedio— a una célula troncal del tejido B (modelo de transdiferenciación)
(Figura 5) (38-40). Considerando los avances alcanzados hasta ahora, no es difícil
que pronto se postulen otros modelos para explicar la plasticidad celular.

Al margen de los modelos descritos en el párrafo anterior, algunos estudios

sugieren que existe otro tipo de mecanismo por el cual se puede regenerar un
tejido lesionado a partir del trasplante de células troncales de otro tejido. De
acuerdo a este modelo, cuando las células troncales del tejido A son trasplanta-
das en el tejido B, el cual se encuentra lesionado, pueden secretar factores que
induzcan a las propias células del tejido B a que lo regeneren, sin que las células
A trasplantadas den origen a nuevas células B (auto-regeneración tisular induci-
da por las células trasplantadas). Este modelo ha sido propuesto para explicar la
regeneración de tejido cardiaco, después de que células de médula ósea han
50 sido trasplantadas en pacientes con infarto de miocardio. Sin embargo, todavía
existe una gran controversia al respecto.

A pesar de que ha crecido a pasos agigantados, es evidente que el campo de

la plasticidad de las células troncales todavía encierra muchas interrogantes. Estu-
dios más precisos —empleando células totalmente purificadas y estudiadas a nivel
individual— apoyados por técnicas moleculares y de imagenología, serán los que
ayuden a esclarecer la gran cantidad de preguntas que aún queda en el aire.
capitulo I Células Troncales y Medicina Regenerativa: conceptos básicos, estado actual y perspectivas futuras

51

Figura 5. Modelos de plasticidad. Un primer modelo (A) plantea que una célula troncal de un teji-
do determinado (a) —a través de mecanismos que no se han descifrado hasta ahora— da lugar
a una célula todavía más primitiva (b), la cual dará origen a una célula troncal de otro tejido (c) y
ésta, a su vez, se diferenciará a células maduras de ese tejido (d) (modelo de desdiferenciación-
rediferenciación). Un segundo modelo (B) sugiere que una célula troncal de un tejido (a) podría
dar origen —de manera directa, sin pasar por un estadio intermedio— a una célula troncal de otro
tejido (b), la cual dará lugar a células maduras de ese tejido (c) (modelo de transdiferenciación).
Por otra parte, existen evidencias que indican que en algunos casos (C) se lleva a cabo una fusión
entre las células troncales trasplantadas (a) y las células residentes del tejido (b), y por ello se de-
tectan células de dicho tejido expresando marcadores de las células del donador (c).
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

MEDICINA REGENERATIVA

Los descubrimientos realizados y los avances alcanzados durante los últimos

quince años, en el campo de las células troncales, han dado un impulso ex-
traordinario a la llamada medicina regenerativa. De acuerdo a la definición
publicada en la revista “Regenerative Medicine” en 2008 (“A brief definition of
regenerative medicine”. Regenerative Medicine 2008; 3: 1-5), la medicina rege-
nerativa es un campo interdisciplinario de investigación y aplicaciones clínicas,
el cual se centra en la reparación, sustitución o regeneración de las células, te-
jidos u órganos, para restaurar funciones biológicas alteradas por diversas cau-
sas, incluyendo malformaciones congénitas, enfermedades o traumatismos. La
medicina regenerativa utiliza una combinación de varios enfoques tecnológi-
cos, que van más allá del trasplante tradicional y las terapias de reemplazo.
Estos enfoques pueden incluir el uso de células troncales, moléculas solubles,
ingeniería genética, ingeniería de tejidos y terapia celular avanzada.

La terapia celular, por su parte, se ha definido como la transferencia de cé-

lulas vivas a un individuo hospedero, con la intención de introducirle nuevas
funciones o de corregir funciones defectuosas. El atractivo y la promesa de la
terapia celular se derivan del hecho de que las células introducidas pueden ser
manipuladas ex vivo, tanto a nivel celular como molecular, para hacerlas más
52 eficientes. La terapia celular es, entonces, un área de la medicina regenerativa
en la que las células troncales juegan un papel preponderante (41).

Sin lugar a dudas, las células troncales que más se han empleado en proce-
dimientos clínicos son las hematopoyéticas. De hecho, el trasplante de células
hematopoyéticas (también conocido como trasplante de médula ósea) es un
procedimiento muy común en nuestros días (ver capítulo X). Este procedimiento
es ampliamente usado para el tratamiento de enfermedades hematológicas,
como las leucemias, los síndromes mielodisplásicos y la falla medular. Sin em-
bargo, el trasplante de células hematopoyéticas en el que las HSC hayan sido
manipuladas ex vivo antes de ser introducidas al paciente se encuentra todavía
en una fase inicial (42).

Otras células troncales que están empezando a ser utilizadas con cierta fre-
cuencia en la clínica son las células troncales mesenquimales (MSC, del inglés Mes-
enchymal Stem Cells), las cuales han sido empleadas para el tratamiento de diver-
sos trastornos de tipo ortopédico y como inmunomoduladores en el trasplante de
células hematopoyéticas (43). A la fecha, no existe otro tipo de célula troncal que
ya esté siendo empleado de manera rutinaria en procedimientos terapéuticos.

El potencial de la medicina regenerativa y la terapia celular, tanto a corto

como a mediano y largo plazo, se basa en el concepto de la plasticidad de las
células troncales y la capacidad que actualmente tenemos para manipular a
estas células in vitro. Efectivamente, el hecho de que en modelos animales se
ha demostrado la capacidad de células de la médula ósea para generar cé-
capitulo I Células Troncales y Medicina Regenerativa: conceptos básicos, estado actual y perspectivas futuras

lulas neurales o musculares, ha llevado a pensar que pronto, diversos trastornos

neurológicos y degenerativos podrán ser tratados por medio del trasplante de
HSC. Igualmente se ha pensado que el empleo de otros tipos de células tronca-
les ayudará a solucionar problemas actuales relacionados con la regeneración
de diversos tejidos. Si bien, esto puede ser cierto —de hecho, las evidencias ac-
tuales sugieren que así será— el camino por recorrer es todavía largo antes de
empezar a usar a las células troncales de manera rutinaria en la clínica.

Conclusiones y perspectivas

Durante los últimos años, la biología de las células troncales se ha convertido en

un área de gran importancia; por un lado, ha contribuido al estudio y entendi-
miento de mecanismos básicos como la proliferación y la diferenciación celular,
así como el desarrollo y regeneración de tejidos y órganos; por otro lado, ha
probado ser esencial para el desarrollo de la terapia celular y la medicina rege-
nerativa. Son muchos, sin embargo, los retos que todavía debemos afrontar. Por
ejemplo, la identificación de células troncales por medio de citometría de flujo,
que permita su purificación prospectiva, es muy necesaria, pues permitirá desa-
rrollar métodos para su cultivo in vitro y su caracterización genómica y molecu-
lar; el empleo de modelos de xenotrasplantes ayudará a entender la biología 53
de las células troncales humanas en un contexto in vivo, como preámbulo para
su aplicación en la clínica. Por otro lado, la identificación y caracterización de
células troncales en diferentes tipos de tumores (ver capítulo IX) seguramente
tendrá un gran impacto en el tratamiento del cáncer.

El estudio de las células troncales embrionarias (ver capítulo III) y las células
troncales pluripotenciales inducidas (ver capítulo XIII) debe considerarse como
una prioridad, ya que es necesario valorar su posible utilidad clínica. Lo anterior,
porque se ha probado que estas células poseen un potencial de proliferación y
diferenciación extraordinario, tanto in vivo como in vitro, que excede al demos-
trado por cualquier tipo de célula troncal somática. Sin embargo, la gran preocu-
pación que surge cuando se trabaja con ESC en estudios orientados a la clínica,
es el aspecto ético asociado con el uso y mal uso de embriones (ver capítulo XV).

Es evidente que la plasticidad demostrada por distintos tipos de células tron-

cales somáticas, tanto in vitro como in vivo, tendrá una gran relevancia clínica
en los años venideros y su manipulación podría conducir a diferentes vertientes.
Por ejemplo, la creación de un banco de células troncales hematopoyéticas,
neurales o musculares, expandidas a partir de una reserva de donadores tipifi-
cados para los antígenos HLA, podría proporcionar células troncales trasplanta-
bles para una gran variedad de enfermedades. Sin embargo, antes de pensar
en la aplicación de células troncales en los contextos mencionados, primero
debemos aprender a manipularlas con seguridad, lo cual representa una tarea
formidable y nada fácil.
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

La biología de las células troncales no sólo es un campo fascinante en si mis-

mo, sino que la investigación en esta área de la biomedicina debería represen-
tar una prioridad en la medicina moderna. Actualmente, millones de personas
en el mundo son afectadas por alguna enfermedad que pudiera ser curada por
medio de la terapia celular. Sólo en los Estados Unidos, casi 60 millones de per-
sonas están afectadas por enfermedades cardiovasculares; 30 millones sufren
algún trastorno autoinmune; 16 millones están afectadas por la diabetes; más
de 9 millones tiene algún tipo de cáncer y más de 5 millones de personas sufren
algún trastorno neurológico como las enfermedades de Alzheimer o Parkinson.
En algunos países en desarrollo estas enfermedades son también problemas de
salud importantes. En México, por ejemplo, actualmente las enfermedades car-
diovasculares, el cáncer y la diabetes ocupan los tres primeros lugares como
causas de muerte en la población general (de acuerdo con el Instituto Nacional
de Estadística, Geografía e Informática; INEGI, México). Por lo tanto, el impacto
que la investigación en células troncales tendrá en la medicina en los años por
venir es más importante de lo que imaginamos.

Agradecimientos

54 Deseo expresar mi agradecimiento a mis estudiantes y colegas, presentes y pa-

sados, por su apoyo incondicional y las enseñanzas que de ellos he recibido.
También agradezco a la Coordinación de Investigación en Salud del Instituto
Mexicano del Seguro Social (IMSS) y al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnolo-
gía (CONACYT) por el financiamiento que me han brindado para poder llevar
a cabo mi investigación en el campo de las células troncales y progenitoras del
sistema hematopoyético.
capitulo I Células Troncales y Medicina Regenerativa: conceptos básicos, estado actual y perspectivas futuras

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56
Capítulo II

Células troncales embrionarias

Iván Velasco, Emmanuel Díaz-Martínez,

Rodrigo López-González & Diana Escalante-Alcalde

RESUMEN

Existen muchos tipos de células troncales, progenitoras y precursoras presentes

durante el desarrollo de los mamíferos. Aún en etapas previas a la implantación
en el útero, en el estadio del embrión conocido como blastocisto, pueden dis-
tinguirse células troncales que posteriormente generarán tejidos extraembrio-
narios, necesarios para el desarrollo del organismo, y células que darán origen
al embrión propiamente. El aislamiento de la masa celular interna y la preser-
vación de sus características de células muy primitivas en cultivo, ha permitido
la generación de líneas de células troncales embrionarias de roedores y prima-
tes, incluyendo al ser humano. Las células troncales embrionarias se clasifican
como pluripotenciales porque se diferencian a fenotipos terminales derivados
del endodermo, mesodermo y ectodermo, lo que puede estudiarse con ensa-
yos de diferenciación in vitro o in vivo. El estadio embrionario postimplantación
de roedores, conocido como epiblasto, también ha sido utilizado para generar
líneas de células troncales pluripotenciales conocidas como células troncales
del epiblasto. Existen factores transcripcionales importantes para mantener el
estado pluripotencial de las células troncales embrionarias y las células tronca-
les del epiblasto; asimismo, ambos tipos de células responden a la adición de
factores proteicos extracelulares, que mediante la activación de sus respectivas
vías de señalización intracelulares, inciden en el mantenimiento de su pluripo-
tencialidad, o de su diferenciación. Las células pluripotenciales descritas aquí
pueden ser útiles como modelos de la diferenciación, para producir progenie
diferenciada que podría utilizarse en estudios de terapia celular, así como para
probar fármacos a gran escala en células humanas diferenciadas.

INTRODUCCIÓN

Sin duda alguna, las células troncales embrionarias (ESC, del inglés Embryonic
Stem Cells) son una herramienta muy poderosa para estudiar mecanismos de di-
ferenciación y desarrollo, así como para producir ratones en donde un gen es eli-
minado de manera selectiva, y como una fuente de células diferenciadas con el
objeto de realizar estudios de terapia celular restitutiva, en donde se pretende re-
poner poblaciones con funciones muy definidas en el organismo adulto, para re-
parar alteraciones patológicas. En este capítulo introductorio nos avocaremos a
revisar la historia de la obtención de las ESC, así como describir marcadores mole-
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

culares intrínsecos y externos que les permiten preservan su estado pluripotencial.

El aislamiento y caracterización de ESC humanas han abierto la posibilidad de
estudiar fenómenos de la diferenciación previamente inaccesibles, además de
constituir una potencial fuente de células humanas terminalmente diferenciadas
para estudios de terapia celular, o de eficacia farmacológica de distintos com-
puestos. Aquí también se describen diferentes posibilidades de obtener células
pluripotenciales de embriones postimplantación y algunas manipulaciones que
permiten obtener ESC de fuentes no convencionales. Finalmente, citaremos algu-
nos ejemplos de diferenciación de células en cultivo, o bien la progenie que se
observa luego de su trasplante en ratones con un sistema inmunológico abatido.

Células troncales en el embrión temprano

El desarrollo de los mamíferos inicia cuando el óvulo es fertilizado por un esperma-

tozoide. El embrión unicelular se considera una célula totipotencial, porque pue-
de derivar tejidos de soporte ajenos al embrión (tejidos extraembrionarios como
la placenta y el saco vitelino), además de todos los tejidos del embrión después
de la implantación. Este embrión de una célula sufre segmentaciones que hacen
aumentar su número celular (ver Figura 1, capítulo XIV), hasta llegar al estado
58 de mórula. En su desarrollo preimplantación, los embriones llegan al estadio de
blastocisto (Figura 1). Justo después de implantarse, en el embrión se distinguen
células externas que forman el trofoblasto y las interiores, que incluyen a la masa
celular interna (ICM, del inglés Inner Cell Mass) y al endodermo primitivo. En esta
etapa distintas poblaciones ya se encuentran especificadas, es decir, tienen un
destino ya determinado, como se ilustra en la Figura 1. Si se aislan y se cultivan
estas 3 poblaciones celulares, se obtienen diferentes tipos de células troncales
(SC, del inglés Stem Cells): SC del trofoblasto (TSC, del inglés Trophoblast Stem
Cells), SC del endodermo extraembrionario (XEN, del inglés eXtra embryonic EN-
doderm) y ESC. Los dos primeros tipos de SC son incapaces de producir derivados
embrionarios en ensayos de diferenciación in vitro, o al inyectarse en blastocistos
de otros individuos (1). La integración de ESC en la ICM de blastocistos de ratón
constituye sin duda la prueba mas informativa de los derivados que una SC pue-
de producir, puesto que las células se introducen a un ambiente que tiene toda
la información para inducir su diferenciación a tejidos embrionarios, y solamente
si son pluripotenciales contribuirán a todos los tejidos de ese organismo en desa-
rrollo. Esta técnica se describe en detalle en el capítulo XIV, además de explicarse
cómo se realizan los ratones knockout, lo que le valió a los Drs. Martin J. Evans, Ma-
rio R. Capecchi y Oliver Smithies recibir el premio Nobel de Medicina en 2007. Una
de las consideraciones bioéticas que podría presentar esta metodología es que
eventualmente se podrían generar organismos quiméricos (es decir, constituidos
por células de especies diferentes), en donde las células humanas se incorpora-
rían al desarrollo temprano de los animales experimentales, lo cual, si bien no está
regulado en muchos países, es éticamente inaceptable (ver capítulo XV).
capitulo II Células troncales embrionarias

Figura 1. Constituyentes celulares del blastocisto. En el blastocisto, un estadio embrionario temprano,

existe segregación de linajes que dan lugar a tejidos extraembrionarios y al feto. Tres tipos de células
troncales se pueden obtener de esta etapa embrionaria: las células troncales del trofoblasto, las cé-
lulas troncales del endodermo extraembrionario y las células troncales embrionarias (ver texto). En
el lado izquierdo se representan las 3 poblaciones celulares que dan lugar a la parte embrionaria de 59
la placenta (trofoblasto), la porción externa del saco vitelino (endodermo primitivo) y al epiblasto,
que después de la gastrulación dará origen al feto propiamente. Modificada de Rossant, 2007 (1).

Células troncales pluripotenciales

Como ya se mencionó, las SC pluripotenciales pueden autorrenovarse conser-

vando su estado indiferenciado, mientras que al realizar ensayos de diferencia-
ción in vitro o in vivo, generan derivados del endodermo, del mesodermo y del
ectodermo. Las primeras SC pluripotenciales en describirse fueron las células de
carcinoma embrionario (ECC, del inglés Embryonal Carcinoma Cells). Posterior-
mente, se derivaron las ESC, seguidas de las células germinales embrionarias
(EGC, del inglés Embryonic Germ Cells). Las SC de descripción más reciente son
las SC del epiblasto (EpiSC, de inglés Epiblast-derived Stem Cells) y las células
troncales pluripotenciales inducidas (iPSC, del inglés Induced Pluripotent Stem
Cells). En los organismos existen células somáticas y germinales, estas últimas en-
cargadas de la reproducción sexual y la transmisión de la información genética
a subsecuentes generaciones. De la línea germinal se derivan las EGC y las ECC,
las cuales se describen en el capítulo III. Las iPSC se abordan en el capítulo XIII.
El principal objetivo de este capítulo es resumir las características de las ESC de-
rivadas de ratón y de humano así como compararlas con las EpiSC de roedores.
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

CÉLULAS TRONCALES EMBRIONARIAS

Derivación y caracterización de las células troncales embrionarias

Las primeras líneas de ESC de ratón se derivaron de embriones de preimplanta-

ción en estadio de blastocisto (3-4 días de edad) en 1981 por dos grupos inde-
pendientes dirigidos por el Dr. Martin Evans en el Reino Unido y por la Dra. Gail
Martin en Estados Unidos (2, 3). La derivación de estas ESC se logró al crecer
la ICM de los blastocistos sobre una monocapa “alimentadora” de fibroblastos
de origen embrionario, extraídos de embriones postimplantación de 14 días de
gestación (el desarrollo completo del ratón dura 19-20 días). Estos fibroblastos
producen factores solubles que permitieron mantener a las células de la ICM
en estado pluripotencial. Las ESC de ratón son las mejor estudiadas y sus carac-
terísticas incluyen poseer un núcleo celular grande con un citoplasma peque-
ño, crecer rápidamente en colonias compactas, poseer una alta actividad de
telomerasa (proteína que adiciona secuencias de DNA en los extremos de los
cromosomas y que cuando baja su actividad, ocasiona que las células enve-
jezcan) y presentar un cariotipo normal (es decir, solo una pequeña proporción
presenta anormalidades cromosómicas). Además, expresan marcadores mo-
leculares como la fosfatasa alcalina tejido inespecífica (una enzima que retira
grupos fosfato de las proteínas y que está presente también en células de la
60 línea germinal), factores que regulan la transcripción (es decir, regulan la síntesis
de RNA mensajero a partir de DNA) y también proteínas membranales que se
describirán mas adelante. Mantenidas en condiciones que favorecen su estado
pluripotencial, estas células no presentan características de células diferencia-
das, ni morfológicamente, ni molecularmente.

Con procedimientos similares a los usados para derivar las ESC de ratón, el
grupo del Dr. James Thomson generó ESC de primates no humanos (monos Rhe-
sus) (4) y posteriormente ESC de embriones humanos en estado de blastocistos
(5). Estos embriones fueron donados para investigación por consentimiento in-
formado de los padres y habían permanecido congelados durante varios años,
por tratarse de embriones supernumerarios que se produjeron por fertilización in
vitro, destinados originalmente para ser implantados en el útero de las mujeres
que no podían embarazarse por métodos naturales. La derivación de las ESC
humanas se realizó poco después de la clonación de la famosa oveja Dolly (6),
que fue producto de la transferencia del núcleo de una célula somática (que
es diploide, es decir, contiene toda la información genética de un organismo),
proveniente de la glándula mamaria de otra oveja adulta, a un ovocito al que
se le extrajo el núcleo. El núcleo de los ovocitos es haploide, lo que significa que
solo tiene la mitad de la información genética de la especie en cuestión, pero al
recibir el núcleo diploide de la célula somática adulta, es posible iniciar el desa-
rrollo embrionario mediante técnicas de inducción de laboratorio, como la esti-
mulación eléctrica o la incubación en una solución con calcio. El desarrollo de
la mayoría de los mamíferos se da dentro de la madre, pero es posible que antes
capitulo II Células troncales embrionarias

de la implantación, los embriones se desarrollen hasta el estado de blastocisto

en una incubadora. Los problemas más recurrentes en el trasplante de órganos
y tejido para pacientes que lo requieren son: (i) la falta de donadores y (ii) el re-
chazo inmunológico que se desencadena cuando el receptor identifica como
extraño al injerto recibido y trata de eliminarlo. Teóricamente, el procedimiento
de Transferencia Nuclear de Célula Somática (SCNT, del inglés Somatic Cell Nu-
clear Transfer), realizado en ovocitos humanos, permitiría producir ESC humanas
“personalizadas”, que se podrían expandir y diferenciar hacia los linajes reque-
ridos para el tratamiento de pacientes, sin el rechazo inmunológico. Desafortu-
nadamente, este procedimiento aún no se ha podido realizar en el humano, a
pesar de que en células de ratón sí es factible (ver abajo). En 2007 se reportó
la reprogramación de células humanas posnatales a un estado pluripotencial
mediante la expresión de ciertos factores transcripcionales descritos con detalle
en el capítulo XIII, lo que ha permitido generar iPSC humanas de pacientes (ver
también capítulo XII). El tener células diferenciadas humanas, provenientes de
ESC o iPSC podría ser útil en varias vertientes: primero, en la terapia de reem-
plazo celular (idealmente con células histocompatibles que no sufran rechazo
inmunológico); segundo, por la posibilidad de realizar pruebas a gran escala de
fármacos dirigidos a prevenir la degeneración o una disfunción celular, o bien
para incrementar la funcionalidad de tipos celulares con relevancia clínica; en
tercer lugar, para estudiar procesos de diferenciación temprana, inaccesibles 61
de realizar in vivo; por último, para la mejor comprensión de los mecanismos de
patogénesis al estudiar células iPSC reprogramadas de pacientes y diferencia-
das in vitro a los tejidos afectados por diversas enfermedades.

Recientemente se ha reportado que se pueden generar líneas de ESC de

blastocistos de rata (7, 8); estas células contribuyen a la línea germinal, lo que
permitirá en el futuro cercano realizar manipulaciones genéticas en esta espe-
cie, que tiene la ventaja de tener un mayor tamaño que los ratones, lo que po-
dría favorecer los estudios de terapia celular y también permitirá comparar los
fenotipos cuando un gen es eliminado en ratones o en ratas (9).

Otras células pluripotenciales obtenidas de fuentes naturales o artificiales

El interés de obtener células pluripotenciales sin destruir al embrión en desarrollo

tienen implicaciones bioéticas, la manera como tradicionalmente se producen
las ESC implica el sacrificio de un embrión en desarrollo. Actualmente, se han
generado ESC sin sacrificar al embrión, lo anterior se realiza al separar un blastó-
mero de un embrión de 8 células de ratón para producir ESC y células extraem-
brionarias, permitiendo que los 7 blastómeros restantes completen su desarrollo
normal y formen un feto (10). De manera similar, empleando mórulas huma-
nas de 8 células, pero sin permitir el desarrollo posterior del embrión, 2 líneas de
ESC fueron establecidas a partir de un blastómero (11). Otra técnica que se ha
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

empleado es la partenogénesis, la cual consiste en la duplicación del material

genético del ovocito para formar un embrión femenino diploide, que al desarro-
llarse permitió la generación de ESC de primates distintos al humano (12).

A pesar de que el procedimiento de SCNT no ha funcionado para la especie

humana, se han generado líneas de ESC de ratón y mono por transferencia nu-
clear (13, 14). En el caso de las células de ratón, las ESC producto de embriones
clonados por SCNT presentaron características indistinguibles de las ESC gene-
radas de embriones producto de la fertilización natural, no solo en términos de
su pluripotencialidad, sino también en su capacidad de inducir la recuperación
de ratones parkinsonianos (15). Un aplicación impresionante de cómo estas ma-
nipulaciones podrían ser útiles en el tratamiento de patologías, lo constituye un
estudio en donde se ha conseguido revertir una inmunodeficiencia causada
por la ausencia de un gen en ratones al hacer transferencia nuclear a un ovoci-
to, permitir su desarrollo para derivar ESC, realizar la restitución del gen faltante
en estas ESC mediante recombinación homóloga (un procedimiento que dirige
la inserción del gen en una región específica del genoma) y finalmente diferen-
ciar las ESC in vitro hacia derivados sanguíneos para transplantarlos y corregir la
deficiencia inmunológica en los animales trasplantados (16).

Otro procedimiento no convencional de producir SC pluripotenciales es la

62 fusión celular natural (17) o inducida (18) entre ESC y células somáticas, lo que
reprograma al núcleo somático a un estado embrionario, pero con la desven-
taja de tener como resultado células con el doble de la información genética
(tetraploides).

Posterior a la implantación en el útero, los embriones continúan su desarrollo

y alcanzan un estado conocido como de epiblasto (Figura 2). El epiblasto es el
epitelio del que se derivará propiamente el embrión. Las EpiSC se derivaron re-
cientemente de embriones de ratón y rata, por 2 grupos independientes que de-
mostraron su pluripotencialidad (19, 20). De manera interesante, las EpiSC tienen
requerimientos de factores de crecimiento distintos a las ESC de ratón, pero muy
similares a las ESC humanas, por lo que se ha postulado que el estadio de donde
se originan las ESC humanas tiene mayor similitud con el epiblasto que con el
blastocisto temprano de roedores. Las diferencias en los requerimientos de fac-
tores de crecimiento de todas estas células se discuten en la siguiente sección.
capitulo II Células troncales embrionarias

Figura 2. Origen de las células troncales embrionarias y de las células troncales del epiblasto de
roedores. Después de la fecundación, el cigoto sufre segmentaciones para formar la mórula y
posteriormente el blastocisto, alrededor del día embrionario (E) 3.5-4. Este estadio contiene a la
masa celular interna, origen de las células troncales embrionarias. Después de la implantación
en el útero, el embrión se elonga y contiene distintos tejidos, como el endodermo visceral (EV), el
endodermo parietal (EP), el ectodermo extraembrionario (ExE) y al epiblasto. De este embrión de
5.5 días de desarrollo embrionario se derivan las células troncales del epiblasto.

63
Regulación intrínseca y extrínseca del estado pluripotencial

Se han identificado reguladores muy importantes de la pluripotencialidad, los

cuales son proteínas que reconocen secuencias específicas del DNA y regu-
lan la síntesis de RNA (transcripción). Una red de estos factores constituida por
Oct4 (21, 22), Sox2 (Figura 3) y Nanog (23, 24) permite a las SC permanecer en
estado pluripotencial. En ESC humanas se ha demostrado que estos 3 factores
de transcripción (FT) tienen un círculo de retroalimentación positiva entre ellos,
además de que comparten muchos de los genes a los que regulan. De manera
importante, estas proteínas mantienen una cromatina abierta en el núcleo celu-
lar, además de permitir la expresión de genes asociados con la proliferación y la
pluripotencialidad e impedir la expresión de genes que pueden causar diferen-
ciación (25). Para enfatizar la participación de estas proteínas en el desarrollo
embrionario, la eliminación del gen oct4 en ratones modificados genéticamen-
te impide la formación de la ICM (22); de manera concordante, ratones knoc-
kout para nanog no pueden progresar para formar un embrión (23). Además
de estos reguladores transcripcionales, hay modificaciones epigenéticas (esto
es, cambios estructurales en la cromatina que no alteran la secuencia del DNA,
que transfieren a las células descendientes patrones de expresión genéticos
predefinidos), como la metilación de citosinas en las regiones CpG de los sitios
promotores de la transcripción, y la metilación de residuos de lisina en las histo-
nas, las cuales actúan en concierto con estos FT para regular la expresión géni-
ca en ESC (26). Por otra parte, existen otros marcadores moleculares que no son
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

exclusivamente FT, pero que se expresan en SC pluripotenciales (Tabla 1). Entre

estos se encuentran la fosfatasa alcalina tejido inespecífica, Rex1 y los antígenos
de superficie SSEA. No obstante, no todos estos marcadores son compartidos
por las células pluripotenciales, puesto que existen diferencias entre ESC y EpiSC
de roedores, así como entre ESC humanas y ESC de ratón (27, 28).

64

Figura 3. Expresión de los factores de transcripción asociados con la pluripotencialidad en células

troncales embrionarias de ratón. Estas células crecen formando colonias y se observa la expresión
de Oct4 y Sox2 en una alta proporción de células. Los núcleos se identifican con un colorante
que se une al DNA. Nótese que Oct4 y Sox2 se expresan exclusivamente en el núcleo, de manera
consistente con su función de reguladores de la transcripción.
capitulo II Células troncales embrionarias

Tabla 1. Marcadores moleculares de células troncales pluripotenciales mantenidas

in vitro y los factores que preservan su pluripotencialidad

ESC ratón EpiSC ratón ESC humanas

Marcadores de células troncales
Oct-4 √ √ √
Nanog √ √ √
Sox2 √ √ √
Klf-4 √ X √
Gbx 2 √ X √
Stella √ X √
Rex 1 √ X √
Fgf-5 X √ X
Fosfatasa alcalina √ X √
Marcadores de superficie
SSEA 1 √ √ X
SSEA 3/4 X X √
TRA 1-60 √ NE √
Respuesta a factores que preservan la pluripotencialidad
LIF √ X X
BMP √ X X
Nodal/Activina X √ √ 65
FGF-2 X √ √

√ significa que el marcador se expresa o que participa en la pluripotencia de las células. X sig-
nifica que el marcador no se expresa o que no participa en la pluripotencia de las células. NE
significa que no se ha examinado esa característica. Modificado de De Miguel et al., 2010 (27) y
Pera y Tam, 2010 (28).

Existen también factores externos que pueden favorecer el estado de SC plu-

ripotencial. El primer factor de crecimiento que se demostró como importante
para mantener indiferenciadas a las ESC de ratón, fue el factor inhibitorio de la
leucemia (LIF, del inglés Leukemia Inhibitory Factor). De hecho, esta es la citoci-
na que secretan los fibroblastos fetales que se utilizaron para derivar las ESC de
ratón (29). Otra molécula importante es la proteína morfogénica de hueso tipo
4 (BMP4, del inglés Bone Morphogenetic Protein-4), la cual a través de las proteí-
nas Id mantienen el estado pluripotencial (30). Ambas proteínas, LIF y BMP4 son
reconocidas por distintos receptores que se encuentran en la membrana plas-
mática de las células y cada una activa vías de señalización intracelular muy
específicas (JAK/STAT para el caso de LIF y la vía de SMAD en la estimulación
por BMP). También se ha reportado que el factor de crecimiento de fibroblastos
(FGF, del inglés Fibroblast Growth Factor) promueve la diferenciación de ESC de
ratón. La activación de receptores a FGF activa a una cascada de cinasas (pro-
teínas con la capacidad de adicionar grupos fosfato a otras proteínas) intra-
celulares conocida como cinasas activadas por mitógenos (ERK). La inhibición
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

farmacológica de los receptores a FGF o de las ERK, permite la autorrenovación

de las ESC de ratón, pero solo en presencia de LIF. De manera interesante, el
grupo del Dr. Austin Smith demostró que la inhibición de FGF/ERK, combinada
con compuestos que interfieren con la actividad de la cinasa de la glucógeno
sintetasa (GSK)3, permite el crecimiento de ESC de ratón en ausencia de LIF y
BMP4 (31). Estas manipulaciones farmacológicas han permitido la generación
de líneas de ESC de cepas de ratón en las que previamente se había intentado
la derivación de este tipo de SC, incluyendo los ratones diabéticos no obesos,
un modelos de la diabetes tipo I (32). La inhibición de las cinasas activadas por
mitógeno y la GSK3 fue el método que se utilizó para producir las ESC de rata (7,
8). De hecho, durante muchos años se trató de aislar ESC bona fide de ratas, lo
que enfatiza el hecho de que la comprensión de las vías intracelulares que regu-
lan la pluripotencia puede desembocar en importantes avances tecnológicos.

Las EpiSC de roedores y las ESC humanas requieren de la estimulación con

los factores de crecimiento FGF2 o bien con Activina (Tabla 1) para mantenerse
pluripotenciales, lo cual es distinto a lo que ocurre con las ESC de ratón. Ya se
mencionó que los FGF inducen la activación de cascadas intracelulares de pro-
teínas cinasas activadas por mitógenos, mientras que Activina enciende la vía
de SMAD, pero con componentes distintos de los activados por BMP4.
66

Diferenciación de células troncales embrionarias

In vivo, las células de la ICM se desarrollan para formar el epiblasto y posterior-

mente el embrión propiamente, al diferenciarse en células de las tres capas ger-
minales, endodermo, mesodermo y ectodermo durante el proceso conocido
como gastrulación. Dentro del embrión también se producen las células de la
línea germinal, que formarán los gametos. Esta capacidad de diferenciación se
preserva en las ESC lo que se hace evidente mediante ensayos in vitro e in vivo.
El primer tipo de estudios son más fáciles de realizar porque las SC se cultivan en
condiciones controladas, por lo que se puede estimular su diferenciación me-
diante la adición de factores de crecimiento, o bien por la interacción directa
con otras células. Otra de las ventajas que presenta la diferenciación de las ESC
en cultivo es que si los embriones no se desarrollan a término por la eliminación
(knockout) de un gen, pero los embriones se forman correctamente hasta el es-
tadio de blastocisto, se pueden generar ESC que tienen dicha mutación, para
estudiar cómo afecta ese gen los procesos de diferenciación que no se pudie-
ron observar in vivo porque el desarrollo se vió interrumpido (33). Uno de los pro-
cedimientos más extendidos para realizar diferenciación en cultivos de ESC es
la formación de cuerpos embrioides (34, 35). Usando éste y otro procedimientos
se ha conseguido tener células derivadas del ectodermo neural (36-40), células
sanguíneas (41, 42) y cardíacas (43, 44) del mesodermo, células pancreáticas
(45-47) del endodermo, así como células de la línea germinal (48, 49) (Figura 4).
capitulo II Células troncales embrionarias

67
Figura 4. Esquema de la diferenciación in vitro de células troncales embrionarias. La masa celular
interna del blastocisto es el origen de estas células, que al someterse a diversos protocolos de
diferenciación en cultivo, puede generar neuronas (ectodermo), células beta pancreáticas (en-
dodermo) o músculo esquelético (mesodermo).

Como se mencionó previamente, la manera más rigurosa de establecer el

grado de pluripotencialidad de las SC es a través de la inyección de las célu-
las a evaluar en blastocistos de roedores; sin embargo, barreras éticas impiden
realizar este tipo de ensayos con células humanas. De este modo, se han dise-
ñado ensayos para probar la pluripotencialidad in vivo en un organismo adulto.
La prueba consiste en realizar un trasplante subcutáneo de las SC en un flanco
de ratones inmunosuprimidos (carentes de timo), porque así se evita el rechazo
inmunológico (50). Si las células son pluripotenciales, se forman teratomas, que
son tumores no invasivos que presentan un alto grado de diferenciación y una
gran variedad de tipos celulares, que incluyen derivados de endodermo, meso-
dermo y ectodermo (Figura 5).
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

Figura 5. Ensayo de formación de teratomas en ratones desnudos que presentan deficiencias en el

sistema inmunológico por la ausencia de timo. La masa celular interna del blastocisto es el origen de
las células troncales embrionarias, que al trasplantarse subcutáneamente en estos ratones forman un
teratoma después de 1-2 semanas. Este tumor presenta una gran variedad de tejidos diferenciados
como cartílago (C), epitelio (Ep) y tejido conectivo (TC), como se aprecia en la fotografía del lado
68 derecho, correspondiente a un corte histológico del teratoma, teñido con hematoxilina-eosina. Este
ensayo se utiliza para estalecer la pluripotencialidad de distintos tipos de células troncales humanas.

Conclusiones

El establecimiento y estudio de las ESC constituye uno de los avances científicos

más relevantes en la Biología y en la Biomedicina de las últimas tres décadas. Es
gracias a ellas que en la actualidad podemos: (i) estudiar la participación de genes
específicos en una gran diversidad de procesos biológicos; (ii) dilucidar cuáles son
las proteínas y las vías que les confieren su carácter pluripotencial; (iii) establecer
las condiciones que dirigen su diferenciación hacia linajes celulares particulares;
(iv) emplearlas como una herramienta para realizar tamizajes de fármacos a gran
escala; (v) estudiar los mecanismos que originan diversas patologías y muy significa-
tivamente, para el tratamiento de enfermedades en terapias de reemplazo celular.

Agradecimientos

Las investigaciones en los laboratorios de los autores son auspiciadas por el Con-
sejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) mediante proyectos de inves-
tigación (D. E.-A., I.V.), la red Farmed (I.V.) y becas de posgrado (E. D.-M., R. L.-G.),
la Universidad Nacional Autónoma de México (PAPIIT IN216009, D. E.-A. y Papiit
IN224210, I.V.) y los National Institutes of Health (I.V.).
capitulo II Células troncales embrionarias

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Capítulo III

Gónadas, células germinales y células troncales

Horacio Merchant-Larios & Verónica Díaz-Hernández

RESUMEN

Por su importancia biológica las células germinales representan un linaje ambi-

guo. Por un lado, su temprana especificación las hace unipotenciales, mientras
que por otro, los ovocitos poseen factores responsables de iniciar el desarrollo
de un nuevo organismo con una gran diversidad celular. Entre las células precur-
soras de los espermatozoides, algunas mantienen el estado pluripotencial y en
condiciones patológicas o experimentales pueden derivar hacia células somá-
ticas. Los cambios en los patrones de expresión génica y epigenética durante
el desarrollo gonadal ofrecen la oportunidad de conocer los mecanismos mo-
leculares y celulares involucrados en la regulación de la potencialidad celular
durante el desarrollo. En el presente capítulo seguimos a la línea germinal desde
el inicio del desarrollo embrionario. Aunque la mayor parte de la información
actual se basa en el ratón como modelo, también mencionamos los avances
recientes hechos en el humano. La posibilidad experimental para derivar células
somáticas a partir de germinales y el proceso inverso, está abriendo nuevas ru-
tas de investigación encaminadas a la aplicación médica de este conocimien-
to. Los patrones de expresión establecen estados transitorios de especificación,
determinación y diferenciación de los diversos linajes celulares. La interacción
celular en el sistema gonadal depende de la regulación espacio temporal de
factores de señalización. El conocimiento y comprensión de dichos factores en
la gónada, como en cualquier otro órgano, representa la base para el manejo
científico de las células troncales con fines terapéuticos.

INTRODUCCIÓN

Las gónadas tienen una doble función que puede ubicarse en dos niveles de
complejidad biológica: i) A nivel de la especie son depositarias de las células
germinales, únicas células encargadas de transmitir la información genética de
una generación a la siguiente y ii) A nivel del organismo, producen factores en-
dócrinos que establecen las características fenotípicas de los genitales externos
del feto y mantienen la función del sistema reproductor en el adulto.

En mamíferos, la determinación sexual ocurre en tres etapas: 1. El sexo cromo-

sómico se establece en el momento de la fertilización por la dotación cromosoma
X o Y que aporte el espermatozoide; cabe recordar que las hembras tienen geno-
tipo XX, mientras que los machos son XY. 2. En la gónada indiferenciada, el gen Sry
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

presente en el cromosoma Y aumenta los niveles de expresión de Sox9, necesario

para la diferenciación de las células de Sertoli. En ausencia de Sry, la gónada XX
establece una red de expresión que conduce a la diferenciación del ovario. 3.
La producción de andrógenos y hormona antimülleriana por el testículo lleva a la
masculinización del tracto reproductivo y de los genitales externos, mientras que
la ausencia de estas hormonas en embriones XX lleva a la feminización (1).

Las gónadas poseen dos linajes celulares: las células germinales y las células
somáticas. Las primeras son las únicas cuyo genoma es susceptible de pasar
a la siguiente generación. Las células somáticas forman la cresta gonadal y
generan las condiciones fisiológicas y homeostáticas para que las células ger-
minales cumplan su papel en la preservación de la especie. En el embrión, las
gónadas se establecen como un par de primordios similares en los dos sexos, a
partir de los cuales se inicia un proceso de diferenciación que lleva al desarrollo
de ovarios o testículos. En los mamíferos placentados, la especificación del linaje
germinal ocurre al inicio de la gastrulación, es decir, antes de la formación de
las tres capas embrionarias: ectodermo, mesodermo y endodermo (Figura 1;
ver Capítulo II). Las células germinales primordiales (CGP) migran desde la base
de la alantoides hacia las crestas gonadales, donde interaccionan con células
somáticas mesodérmicas para formar las gónadas indiferenciadas.
72 En el presente capítulo nos ocupamos de algunos avances relevantes, tanto
para la comprensión de aspectos básicos sobre los mecanismos de determina-
ción y de diferenciación de las células germinales en el contexto embrionario y
gonadal, así como de algunos esfuerzos experimentales para utilizar el conoci-
miento básico para una eventual aplicación terapéutica.

Figura 1. Representación esquemática de la especificación del linaje germinal en el epiblasto

proximal del ratón a los 6.0-6.5 dpc. Las células germinales primordiales (CGP) iniciales se especifi-
can en la interfase entre el ectodermo extraembrionario y el epiblasto.
capitulo III Gónadas, células germinales y células troncales

El inicio del desarrollo

En términos generales, los organismos multicelulares poseen dos tipos de célu-

las: las somáticas y las germinales (2). La mayoría de mamíferos placentados,
incluida la especie humana, inician la segregación de ambos linajes después
de la implantación en el útero materno. El cigoto preimplantado se divide en
unidades celulares cada vez más pequeñas llamadas blastómeros que gradual-
mente reducen su totipotencialidad (capacidad de originar tejido embrionario
y extraembrionario; ver Capítulos II y XIII). Es decir, el proceso de segmentación
se encarga de subdividir al citoplasma del ovocito en fracciones cada vez más
pequeñas, cuya primera decisión es formar parte de las células progenitoras del
trofoectodermo o bien de la masa celular interna. Los factores responsables de
esas primeras “señales de posición” son múltiples, entre las que se incluyen el
establecimiento de complejos de unión intercelular y la expresión de moléculas
de superficie dependientes de la vecindad con la zona pelúcida (3). Tal deci-
sión implica la activación de diversos programas de expresión del genoma en
los blastómeros ubicados en posiciones diferentes de la mórula. Lo que ocurre al
inicio del desarrollo, es decir, el paso de la etapa unicelular a la etapa multice-
lular, ofrece la oportunidad de conocer los mecanismos moleculares y celulares
que permiten el surgimiento de la diversidad celular.

Las células precursoras del trofoectodermo inicialmente expresan a la proteí- 73

na Tead4 y posteriormente otros dos factores de transcripción (FT): Cdx2 y Eomes
(4, 5, 6). Las células de la masa celular interna en cambio, expresan Sall4, que
regula positivamente la expresión de Oct4 y Nanog cuyos productos, junto con
Sox2, mantienen la pluripotencialidad, es decir, la capacidad de diferenciar a
todos los tipos celulares presentes en el embrión (7, 8, 9, 10, 11; ver Capítulos II
y XIII). La regulación de la expresión de estos primeros FT se lleva a cabo por la
represión de genes de pluripotencialidad en el trofoectodermo y por el esta-
blecimiento de propiedades de autorregulación en cada etapa del desarrollo.
Divisiones celulares simétricas y asimétricas probablemente debidas a factores
citoplásmicos, controlan la ubicación y por ende el destino de esos dos primeros
linajes celulares. Las células del trofoectodermo parietal se diferencian precoz-
mente, en cambio, las de la masa celular interna continúan proliferando y en su
seno emergen dos nuevas poblaciones: el epiblasto (identificado por la expre-
sión de Nanog) y el endodermo primitivo que expresa Gata6 (8, 12). Después
de la implantación, los dos tipos celulares continúan proliferando, pero los del
epiblasto pierden su pluripotencia (Figura 2).
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

Figura 2. Representación esquemática de las divisiones celulares asimétricas que controlan la ubi-
cación y destino de los primeros linajes celulares en la mórula. Las células del trofoectodermo se
diferencian a partir de las células que están en contacto con la zona pelúcida, mientras que las
células internas de la mórula establecen la masa celular interna de la cual emergen el epiblasto
(el cual expresa Nanog) y el endodermo primitivo (que expresa Gata6).

Un gran porcentaje del DNA de las células del epiblasto se encuentra metila-
do, mediante este proceso uno de los cromosomas X en las hembras se inactiva,
74
lo cual junto con los cambios transcripcionales, provoca una barrera que dificul-
ta su reversión al estado de pluripotencia del endodermo primitivo. Sin embargo
en embriones de ratón, es posible revertir esa barrera separando el epiblasto
entre los días 5.5-7.5 de la gestación. Después de varios pases en cultivo, en pre-
sencia de factor inhibitorio de la leucemia (LIF, del inglés Leukemia Inhibitor Fac-
tor), las células del epiblasto adquieren perfiles de expresión transcripcionales
y epigenéticos similares a los del endodermo primitivo pluripotencial. Además,
estas células fueron capaces de generar todos los linajes celulares, incluida la
línea germinal (13). Dicho resultado es relevante para la comprensión de los
mecanismos de especificación y pluripotencia de las células troncales embrio-
narias (ESC, del inglés Embryonic Stem Cells, ver Capítulo II) humanas. A diferen-
cia de las células troncales (SC, del inglés Stem Cells) derivadas del endodermo
primitivo del ratón, las ESC humanas mantienen al cromosoma X inactivo y un
perfil de expresión similar al epiblasto del ratón (14).

Determinación de la línea germinal

Aspectos embriológicos

El ratón ha demostrado ser el modelo de elección para estudiar los mecanismos

celulares y moleculares involucrados en la determinación sexual. La relevancia
del conocimiento obtenido en esta línea de investigación resulta fundamental
para comprender el significado de las SC como un proceso general en el con-
capitulo III Gónadas, células germinales y células troncales

texto del desarrollo embrionario y posnatal. Las CGP son especificadas entre
células somáticas del mesodermo extraembrionario poco antes de empezar el
proceso de gastrulación. Inicialmente identificadas porque presentan una alta
actividad de la fosfatasa alcalina tejido inespecífica (TNAP, del inglés Tissue Non-
specific Alkaline Phosphatase), en el ratón alrededor de 40 CGP fueron detec-
tadas en la base de la alantoides en el día 7.5 de la gestación (18). Desde su
ubicación inicial hasta su arribo a las crestas genitales, las CGP migran por trans-
locación pasiva en el intestino posterior y finalmente por su propio movimiento.
La colonización de las crestas genitales ocurre entre los días 9.5 y 10.5, de ma-
nera que en el día 11.5 de gestación, las CGP ya se encuentran asociadas con
células somáticas de la gónada indiferenciada, llamada así por mostrar un as-
pecto histológico similar en ambos sexos. En sólo 24 horas ocurre un cambio his-
tológico dramático en la gónada de los embriones XY, haciéndose presente la
organización del testículo. El gen Sry presente en el brazo corto del cromosoma
Y se expresa en las células precursoras de Sertoli y es responsable de coordinar
una red de expresión genética que culmina con la formación del testículo (15).
Por otra parte, los embriones XX manifiestan la diferenciación histológica del
ovario poco después aunque su determinación a nivel molecular es paralela
a la del testículo. Las CGP una vez en la gónada continúan las etapas de dife-
renciación dependiendo del entorno somático. En las hembras, las CGP dejan
de proliferar por mitosis e inician la meiosis, en tanto que los machos, aunque 75
también detienen sus divisiones en la vida fetal, mantienen su capacidad proli-
ferativa después del nacimiento (16, 17). Esta situación permite la presencia de
células progenitoras en el testículo, entre las cuales se han podido identificar SC
pluripotenciales, como se verá adelante.

Aspectos moleculares

Las CGP precursoras de ovocitos y espermatozoides, al igual que los linajes de

células somáticas, son especificadas de acuerdo con un programa que incluye
la interacción de FT, vías de transducción de señales y mecanismos de regula-
ción epigenética. En el embrión de ratón, las células del endodermo primitivo
producen proteínas morfogénicas de hueso (BMP, del inglés Bone Morphoge-
netic Proteins) 4 y 8, que inducen la expresión del gen fragilis en un grupo de
células del epiblasto proximal, que dará origen al mesodermo extraembrionario
y a las CGP (18). Las BMP4/8 son parte de la familia de factores de crecimiento
TGFβ. Al unirse a sus receptores específicos presentes en la membrana de las
células, las BMP transducen su presencia a través de las proteínas SMAD1 y 5 (19,
20). Las células que expresan Blimp1 seguido de Prdm14, Sox2, Stella, Nanos3
y Nanog, se comprometen al linaje de las CGP. Blimp1 es considerado como
un “gen maestro” para la especificación de las CGP (21, 22) pero es a su vez
regulado por Lin28 a través de la represión de microRNAs de la familia let-7 que
interaccionan con la región 3’ no transcrita de Blimp1 (Figura 3; 23). Por otra
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

parte, en contraste con las células somáticas, las CGP reprimen varios genes
de la familia Hox, entre ellos a Hoxa1 y a Hoxb1, que son característicos de las
células somáticas vecinas (24). Es probable que Blimp1 participe en esta repre-
sión. Además de los cambios transcripcionales, la especificación de las CGP en
el epiblasto proximal va acompañada de cambios epigenéticos con la activa-
ción de Dnmt3b, Ezh2, Glp, G9a y Prmt5, que conllevan a la metilación de las
histonas, H3K9me2, H3K27me3 y H4H2AR3me2s (25).

76

Figura 3. Células del mesodermo extraembrionario producen BMP4/8 e inducen a un grupo de

células del epiblasto proximal a expresar fragilis. Entre ellas, algunas expresan Blimp1 seguido de
Prdm1 y 14, reprimiendo el programa de células somáticas (mesodermo extraembrionario) e indu-
ciendo la expresión de Sox2, Stella, Nanos3 y Nanog, iniciando así la especificación de las células
germinales primordiales (CGP).

Durante su trayecto hacia las crestas genitales, las CGP experimentan cambios
en el contexto de su cromatina que les son únicos con respecto a lo que ocurre
en las células somáticas. Mientras que en las células somáticas el DNA global se
mantiene densamente metilado, las CGP una vez especificadas, llevan a cabo
una desmetilación global de su DNA. Concomitante a este proceso, los niveles
de histonas H3K9, H3K27me3 y H3K64me3 son modificados durante la migración
y colonización de las crestas genitales (25). Dada la importancia de las CGP en
su función de transmisoras de la información genética, poseen pequeños RNAs
que al interaccionar con proteínas Piwi (piRNAs) son capaces de discriminar en-
tre genes endógenos y retrotransposones. El silenciamiento de éstos últimos se lo-
gra propiciando su metilación (26). Genes relacionados con pluripotencia como
Oct4, Nanog y Sox2, reprimidos en las células somáticas del epiblasto, mantienen
su expresión en las CGP al conservar desmetiladas ciertas secuencias reguladoras
capitulo III Gónadas, células germinales y células troncales

(21). Las proteínas Blimp1 y Prtm5 forman un complejo que promueve la expresión
de Dhx38 a través de la dimetilación de H2AR3 y H4R3 (27).

El complejo Blimp1-Prtm5 introduce alteraciones locales en la cromatina al re-

clutar deacetilasas de histonas (HDACs, del inglés Histone Deacetylases) que neu-
tralizan la carga positiva de las lisinas. Así, se produce una alteración en y entre los
nucleosomas, inhibiéndose la transcripción de genes específicos (25). Durante la
etapa migratoria, las CGP expresan dos factores importantes para su asociación
con células somáticas: un receptor tirosina cinasa llamado (RTK, del inglés Recep-
tor Tirosine Kinase) y su ligando (LK, del inglés ligand c-Kit), además de continuar
expresando los genes de pluripotencia Sox2, Oct4 y Nanog (28; Figura 4).

77

Figura 4. Una vez especificadas, las células germinales primordiales (CGP) pasan a la etapa mi-
gratoria durante la cual requieren LK y RTK e incrementan la expresión de genes de pluripotencia.
Al colonizar las crestas genitales, las células somáticas producen señales que determinan su com-
portamiento proliferativo y el momento en que iniciarán la meiosis.

Interacciones entre la línea germinal y la somática

Una vez en la cresta genital, el complejo Blimp1-Prtm5 es translocado del núcleo

al citoplasma a los 12.5 dpc cuando las CGP ya han iniciado su destino sexual
(ovogonia o pro-espermatogonia), bajo la influencia de la parte somática de la
gónada (29). Como se mencionó arriba, el gen Sry es el responsable del inicio
de la determinación sexual organizando la estructura testicular a partir de la
gónada indiferenciada. La colonización de la cresta genital por las CGP ocu-
rre entre los días 9.5 y 11.5 dpc en el ratón. En ambos sexos, las CGP se asocian
con células somáticas mesoteliales (CSM) originadas del epitelio celómico, las
cuales forman los cordones sexuales primarios. En los embriones XY, el gen Sry se
expresa en las CSM y su producto regula positivamente la expresión del gen au-
tosómico Sox9 en las células precursoras de Sertoli, iniciando el establecimiento
de la red de expresión génica conducente a la formación del testículo. En las
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

hembras, al carecer de Sry, el Sox9 se regula negativamente en las CSM precur-

soras de las células foliculares y gradualmente se establece la red de expresión
génica característica del ovario. La inhibición de la expresión de Sox9 es un
proceso activo y ocurre por la interacción de los productos de varios genes,
entre los cuales Foxl2 juega un papel relevante (Figura 4). Un estudio reciente
demostró que al abatir la expresión de Foxl2 en ovarios posnatales mediante la
recombinación mediada por Cre (ver Capítulo XIV), el Sox9 se expresó en las
células foliculares y tuvo lugar un dramático proceso de metaplasia tendiente
a transformar la estructura ovárica en una formación de tipo testicular (30). Los
resultados de esta investigación son pioneros en mostrar la posibilidad de “re-
programar” los tejidos de un órgano adulto in situ recapitulando un proceso que
tiene lugar en las etapas embrionaria y fetal.

Las CGP en la gónada dependen de las CSM para su determinación sexual. En

las hembras, los altos niveles de ácido retinoico (RA, del inglés Retinoic Acid) pro-
ducido por el mesonefros adyacente induce el inicio de la meiosis en las CGP. En
cambio, en los machos las células de Sertoli degradan al RA y se propicia la entra-
da en reposo mitótico (31). Es evidente que aunque las CGP están programadas
para iniciar la meiosis, su regulación esta estrictamente controlada por el entorno
somático. En los tubos seminíferos del testículo, las CGP se transforman en gonocitos
78 y espermatogonias en diversos estados de diferenciación. La formación de terato-
mas y teratocarcinomas, así como la derivación de líneas de SC de origen germinal
indican la presencia de células pluripotenciales en los testículos posnatales.

Aunque la ausencia de células germinales no parece afectar la estructura y

función endócrina del testículo, en el caso de los ovarios, la presencia de ovocitos
es indispensable para la diferenciación estructural y fisiológica del ovario (32).

Las células precursoras germinales como células troncales pluripotenciales

Si definimos pluripotencialidad como la capacidad de las células para originar di-

versos tipos celulares, es claro que la pluripotencialidad disminuye conforme avan-
za el desarrollo. Es decir, la emergencia de la diversidad celular, en armonía con
procesos de morfogénesis, representa la esencia del desarrollo embrionario en los
metazoarios. Sin embargo, la pérdida de pluripotencia es un proceso dinámico que
ocurre de manera asincrónica en los diversos linajes celulares que integran los teji-
dos. Una vez establecidos los primordios de cada órgano, la diferenciación celular
se mantiene con la proliferación de células progenitoras que mantienen diversos
grados de pluripotencialidad dependiendo del órgano en que se encuentren. La
proliferación de las células progenitoras es rigurosamente controlada por factores
parácrinos y autócrinos que en conjunto forman el “nicho” específico de cada li-
naje. Esta condición establecida en la etapa fetal, se mantiene durante el periodo
posnatal, pero puede sufrir alteraciones cuyas consecuencias llevan a transtornos
teratológicos y diversos tipos de neoplasias incluyendo al cáncer.
capitulo III Gónadas, células germinales y células troncales

Entre los estudios pioneros están los de L. Stevens (33), quien al injertar testícu-
los embrionarios (12.5 dpc) de ratones de la cepa 129 bajo la túnica albugínea
de ratones adultos, observó la formación de teratomas. Los tumores contenían
derivados epiteliales, neurales y otros tipos celulares. La presencia de células
no diferenciadas permitió el trasplante seriado de los tumores, mostrando la
aparente presencia de SC pluripotenciales. Sin embargo, cuando los testícu-
los fetales injertados fueron de 13.5 dpc, la formación de teratomas disminuyó
drásticamente y los ovarios de 14.5 no formaron tumores. Estudios posteriores
del mismo autor, apoyaron el origen germinal de los teratomas (34). Por otra
parte, al trasplantar embriones de 3 y 6 dpc también de la cepa 129, logró la
generación de teratomas trasplantables con todos los tipos tisulares en tumores
sólidos y “cuerpos embrioides” cuando los trasplantes fueron intraperitoneales.
Como en embriones jóvenes se generaron teratomas de ambos sexos genéti-
cos, Stevens y otros autores (35) concluyeron que en este caso, el origen tumoral
eran SC pluripotenciales. Si el origen de los teratomas de ratón son las CGP, la
recuperación de la pluripotencia para derivar los diferentes tipos de células so-
máticas sólo podría explicarse por un proceso de “reprogramación”, ya que la
especificación del patrón de expresión génica característica de las CGP ocurre
a los 6.5 días de la gestación, 6 días antes de injertar los testículos embrionarios.
Es decir, aunque las espermatogonias de 12.5 dpc en los testículos trasplantados
ya pasaron la etapa de CGP y están entrando a la etapa de determinación 79
sexual (17), readquieren la capacidad de generar células somáticas tumorales.

Experimentos con CGP in vitro demostraron la factibilidad de “reprogramar-

las” empleando algunos factores de crecimiento que regulan su proliferación
y supervivencia in situ. Cuando CGP son cultivadas sobre monocapas de fibro-
blastos irradiados, proliferan durante 7 a 10 días y posteriormente desaparecen
porque sufren apoptosis, ya sea antes o después de diferenciarse (16). Sin em-
bargo, si a los cultivos se les agregan tres factores de crecimiento: factor inhi-
bidor de leucemia (LIF), factor de células troncales (SCF, del inglés Stem Cell
Factor) y factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF, del inglés basic Fi-
broblast Growth Factor), las CGP continúan proliferando y forman colonias que
pueden mantenerse indefinidamente (36). LIF y SCF parecen ser importantes
en la regulación de la proliferación y como antiapoptóticos; sin embargo, el
bFGF es el que dicta directamente la reprogramación de las CGP hacia células
germinales embrionarias pluripotenciales (Figura 5). Un hallazgo interesante fue
que las CGP humanas responden a los mismos factores de crecimiento en con-
diciones similares de cultivo (37), indicando que algunas vías involucradas en la
regulación de las CGP han sido conservadas durante la evolución. No obstante,
aunque las CGP humanas in vitro han mostrado capacidad para diferenciarse
en diversos tipos de células somáticas, hasta ahora no ha sido posible mantener
su viabilidad por mucho tiempo en cultivos sucesivos (38).
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

Figura 5. Las células germinales primordiales pueden ser “reprogramadas” in vitro empleando
factores de crecimiento que regulan su proliferación y supervivencia. Una vez lograda su trans-
formación a células germinales embrionarias (EGC) in vitro, su pluripotencia es verificada al ser
inyectadas a blastocistos y dar origen a quimeras que presentan derivados celulares de las tres
80 capas embrionarias.

La decisión de las células para proliferar, morir o diferenciarse, depende de

las vías de transducción de las señales recibidas. En el caso de los tres factores
de señalización: LIF, SCF y bFGF, las vías de transducción son complejas y se
sobreponen entre sí, por lo que no ha sido fácil elucidarlas con precisión. No
obstante, se encontró que PTEN es un factor crítico en la regulación de la trans-
ducción de señales por las CGP. Ratones en los que PTEN fue eliminado, desa-
rrollaron tumores testiculares in vivo (39). La reprogramación de las CGP para
su transformación en SC pluripotenciales depende del contexto en que tal pro-
ceso se lleva a cabo. Si las células derivan de teratocarcinomas se denominan
células de carcinoma embrionario (ECC, del inglés Embryonal Carcinoma Cells)
pero si son generadas de animales en desarrollo, se les conoce como células
germinales embrionarias (EGC, del inglés Embryonic Germ Cells). Lo que hay en
común en ambas condiciones es que las CGP continúan proliferando más allá
del tiempo en que lo hacen en el contexto normal del embrión. Es posible que
en ese estado, la alternancia cíclica de condensación y relajación de la croma-
tina que ocurre en cada ciclo celular al ser prolongada por factores exógenos
en un contexto modificado (in vivo o in vitro), propicie la actividad de genes
que reprograman a las CGP, manteniendo su pluripotencia (40; Figura 6).
capitulo III Gónadas, células germinales y células troncales

Figura 6. Entre los 8 - 12.5 dpc del ratón (etapas migratoria y de colonización), las células germina-
les primordiales (CGP) son susceptibles de generar teratomas y/o teratocarcinomas in vivo o bien, 81
cuerpos embriodes in vitro (en presencia de LIF, SCF y bFGF; ver texto). En ambos contextos, las
CGP sufren un proceso de “reprogramación” y se vuelven pluripotenciales, porque son capaces
de originar derivados de las tres capas germinales.

De células germinales PRIMORDIALES a células troncales PLURIPOTENCIALES

Como es ampliamente descrito en el capítulo XIII de este libro, es posible “re-

programar” células somáticas diferenciadas hacia células pluripotenciales, al ser
transfectadas con sólo 4 FT: Oct4, Sox2, c-Myc y Klf4. Para distinguir el origen de
estas células de otras SC pluripotenciales se les denominó células troncales pluri-
potenciales inducidas (iPSC, del inglés Induced Pluripotent Stem Cells). Las CGP
que de manera natural expresan Oct4 y Sox2 en el embrión intacto, cuando son
inducidas a transformarse en EGC in vitro, regulan positivamente a Myc y a Klf4,
con lo que completan la expresión de los 4 FT empleados para la reprogramación
de células somáticas adultas a un estadio pluripotencial. Los genes de la familia
Kalf (Kalf2, Kalf4 yKalf5) son importantes en la regulación de los otros genes que
mantienen la autorrenovación y la pluripotencialidad de las ESC. Un resultado
interesante con CGP cultivadas fue el descubrir que la tricostatina A (TSA), que
actúa como un potente inhibidor de desacetilasas de histonas (ver también Ca-
pítulo XIII), es capaz de reemplazar las acciones del bFGF. La mayor eficiencia y
rapidez con la que las CGP son reprogramadas para expresar Klf4 y c-Myc y así
adquirir pluripotencialidad similar a las ESC e iPSC, sugiere un estado epigenético
inicial diferente entre los tres tipos de derivados pluripotenciales (41).
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

Un protocolo reciente desarrollado en el laboratorio de A. Smith (42), permite

simplificar la derivación de EGC en cultivo. La inhibición farmacológica de dos
enzimas, la (MAPK, del inglés Mitogen-Activated Protein Kinase) y la (GSK3, del
inglés Glycogen Synthase Kinase 3) junto con el factor de crecimiento LIF (ver
Capítulo II), aumentó la eficiencia para inducir el paso de las CGP hacia EGC
de manera considerable. El medio de cultivo fue denominado 2i-LIF (por tener 2
inhibidores y LIF), y con algunas modificaciones se consiguió derivar por primera
vez EGC de rata. Además de los marcadores usuales de pluripotencialidad y la
formación de cuerpos embrioides, la pluripotencia de las EGC generadas por el
tratamiento de CGP con 2i-LIF se demostró con la generación de ratas quiméri-
cas luego de la inyección de estas células a blastocistos (42; Figura 7).

82

Figura 7. Las células germinales primordiales aisladas de la región posterior de un embrión de rata
producen células germinales embrionarias (EGC) al cultivarse sucesivamente sobre fibroblastos
con FGF (Día 1) y después en el medio 2i-LIF (Día 3; ver texto). Su pluripotencialidad se pone en
evidencia al ser inyectadas en blastocistos hospederos, produciendo ratas quiméricas.

El camino inverso: de células troncales somáticas a células germinales

A pesar de las diferencias hasta ahora encontradas entre las CGP y los principales
tipos de SC pluripotentes (ESC e iPSC), no es sorprendente que las CGP sean ca-
paces de originar todos los tipos de células somáticas con relativa facilidad con-
siderando su jerarquía durante el desarrollo embrionario. Sin embargo, aunque la
derivación de CGP a partir de ESC e iPSC representa mayor grado de dificultad,
los esfuerzos para lograrlo se han multiplicado, dada la importancia médica y
biológica que representa. Generar ovocitos y espermatocitos fértiles en el labora-
torio, permitiría avanzar en diversos aspectos de la biología reproductiva y en la
reprogramación nuclear de células somáticas en el caso de los ovocitos.

Los primeros resultados fueron reportados por Hübner y colaboradores (43)

quienes obtuvieron estructuras similares a folículos ováricos a partir de ESC de
ratón a las que se les deprivó de bFGF y LIF. Los ovocitos en los folículos parecían
morfológicamente normales, no obstante, no contenía ZP1, que es importante
para la estabilidad de la estructura de la zona pelúcida. Además, la meiosis
capitulo III Gónadas, células germinales y células troncales

iniciada por los ovocitos resultó anómala al expresar sólo la proteína SCP3 pero
no las proteínas SCP1, SCP2 y REC (44). Aunque algunos de estos “ovocitos” ini-
ciaron una segmentación partenogenética, detuvieron su desarrollo y murieron
prematuramente. Otro intento de derivar ovocitos de ratón se realizó emplean-
do cuerpos embrioides formados por reagregados de células ES en los que de
manera “espontánea” ocurre la diferenciación de tejidos de las tres capas em-
brionarias y ocasionalmente se detectan CGP.

Toyooka y colaboradores (45) desarrollaron un protocolo que les permitió ais-

lar CGP de cuerpos embrioides, reagregarlas con testículos fetales e inyectarlas
a tubos seminíferos de ratones adultos. Lograron demostrar que en esas condi-
ciones la línea germinal iniciada en los cuerpos embrioides fue capaz de avan-
zar hasta la formación de espermatozoides. Aunque la fertilidad de los esper-
matozoides derivados de células ES fue demostrada, las crías obtenidas fueron
anormales y murieron precozmente (46).

Intentos para derivar ovocitos a partir de cuerpos embrioides han ido menos
lejos en el camino a su diferenciación. Un protocolo empleó medio condiciona-
do de cultivos primarios obtenido de testículos de ratones recién nacidos (47),
en tanto que en otro intento, los cuerpos embrioides fueron mantenidos sobre
monocapas de células foliculares (48). En ambos casos, los cuerpos embrioides
contenían varios ovocitos aparentemente detenidos en la profase I de la meio- 83
sis. Sin embargo, detuvieron su crecimiento antes de formar la zona pelúcida.

Por otra parte, también se han hecho esfuerzos por derivar células germina-
les a partir de SC de carcinoma embrionario (ECC) y SC mesenquimales (MSC,
del inglés Mesenchymal Stem Cells). Nayernia y colaboradores (49) implan-
taron cuerpos embrioides de ECC en los tubos seminíferos de ratones adultos
estériles y lograron la diferenciación de espermatozoides, aunque con un ele-
vado número de anormalidades. Al realizar pruebas de fertilidad, mostraron
que algunos espermatozoides fueron capaces de iniciar la segmentación del
cigoto al ser inyectados en el citoplasma. Sin embargo, no fueron más allá
de la etapa de mórula. En cuanto a las MSC, también se obtuvieron esper-
matogonias con el mismo procedimiento empleado para cuerpos embrioides
reagregados de MSC de médula ósea (BM MSC, del inglés Bone Marrow Me-
senchymal Stem Cells) de ratón. En este caso, el desarrollo no avanzó más allá
de la etapa de espermatogonias premeióticas (50). No obstante, un reporte
del mismo laboratorio propone haber logrado la derivación de espermátidas
humanas a partir de BM MSC (51), aunque tanto en los experimentos con célu-
las de ratones o de humanos, la viabilidad y fertilidad de las células germinales
está por demostrarse.

Un notable avance empleando ESC humanas fue reportado por Kee y cola-
boradores (52), quienes introduciendo la secuencia codificante de la proteína
fluorescente verde (GFP, del inglés Green Fluorescent Protein) ligada al promotor
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

de VASA, expresado en CGP. Se purificaron las células precursoras de la línea

germinal (que presentaban fluorescencia verde) a partir de cuerpos embrioi-
des. Asumiendo que las células VASA+ correspondían a CGP especificadas en
la mezcla heterogénea de células en los cuerpos embrioides, suministraron los
factores de señalización BMP4, 7 y 8b. En estas condiciones obtuvieron un incre-
mento de células VASA+ de 0.8 a 5%. Con esta población analizaron los patrones
de expresión de FT característicos de las CGP y de algunos factores involucrados
con su perfil epigenético. Como genes marcadores de especificación tempra-
na, se detectó la expresión de BLIMP1, STELLA, VASA y DAZL. En analogía con la
especificación de las CGP de ratón, las ESC VASA-GFP+ humanas mostraron una
notable hipometilación global de su DNA y la metilación diferencial de regiones
correspondientes a genes correlacionados con la impronta génica de las CGP.

Para determinar si las CGP derivadas de ESC VASA-GFP+ son capaces de ini-
ciar la meiosis, Kee y colaboradores (52) estudiaron la expresión de SCP3 y H2AX,
el primero forma parte de la estructura proteica del complejo sinaptonémico.
La histona H2AX se fosforila en respuesta al rompimiento de la doble cadena de
DNA necesaria para la recombinación génica de los cromosomas homólogos.
Cultivos de células VASA-GFP+ privados tanto de bFGF como de la monocapa
de células alimentadoras (feeder layers) formaron colonias similares a células
84 EGC que mantuvieron la expresión de GFP. Para hacer el seguimiento de la en-
trada en meiosis, el estudio se centró en la expresión de los genes de la familia
DAZ, típicos del humano. Se analizaron 4 genes DAZ identificados en el cromoso-
ma Y además de los genes autosómicos DAZL y BOULE, muy conservados desde
invertebrados hasta humanos. Por medio de la tecnología de silenciamiento de
horquilla corta de RNA (shRNA, short hairpin RNA), se observó que DAZL regula
la expresión de VASA. Al comparar las líneas celulares XX y XY, los resultados indi-
caron que, como se esperaba, DAZ incrementó el número de células con com-
plejos sinaptonémicos sólo en las líneas XY. Asimismo, un cierto porcentaje de
células XY con número cromosómico haploide, expresaron la proteína acrosina
que caracteriza a las espermátidas en el testículo in situ.

Por otra parte, Panula y colaboradores (53) empleando un protocolo similar

al de Kee et al. lograron derivar CGP a partir de iPSC humanas. En este caso,
los autores partieron de fibroblastos humanos con cariotipo XY reprogramados
con Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc, o de fibroblastos XX transfectados con Oct4, Sox2,
Nanog y Lin28 obtenidos del National Stem Cell Bank. Al suministrar los factores
de señalizacion BMP4, 7 y 8b, que previamente habían mostrado tener la capa-
cidad de inducir la especificación de CGP en ESC humanas (54), lograron iPSC
XX y XY enriquecidas con células positivas a VASA, indicando la especificación
de la línea germinal (Figura 8). Después, los autores siguieron un protocolo similar
al diseñado por Kee y colaboradores (52) para facilitar la entrada en meiosis de
CGP XX e inicio de la diferenciación de espermátidas putativas en las células XY.
Concluyeron que, con algunas diferencias, las iPSC humanas derivadas de fibro-
capitulo III Gónadas, células germinales y células troncales

blastos fetales y adultos, poseen una potencialidad similar a las ESC humanas
para iniciar el proceso de especificación y diferenciación de la línea germinal.

Figura 8. Las células troncales embrionarias (ESC, provenientes del blastocisto) o las células troncales
pluripotenciales inducidas (iPSC, reprogramadas de fibroblastos de piel adulta) de humano pueden
especificarse a células germinales primordiales (CGP) al diferenciarse mediante la formación de cuer-
pos embrioides en presencia de BMP4, 7 y 8b. Después de disgregar estos cuerpos embrioides para
purificar CGP, éstas se reagregaron con células somáticas y se detectó la expresión de genes que in-
dican la entrada en meiosis o bien el inicio de espermatogénesis en células XX o XY, respectivamente.

El trasplante de células troncales embrionarias y células troncales 85

pluripotenciales inducidas causa la formación de teratomas in vivo

Uno de los principales problemas a resolver para la posible aplicación terapéuti-

ca de células diferenciadas de troncales pluripotenciales in vitro, es el riesgo de
que algunas de ellas preserven su estado pluripotencial y formen tumores des-
pués de trasplantarlas. Las ESC, iPSC y SC derivadas de testículos adultos inyec-
tadas a ratones normales o inmunodeprimidos (ver Capítulo II) tiene la capa-
cidad de inducir teratomas (55, 56, 57). Las causas han sido poco estudiadas
de manera sistemática por lo que aún se desconoce si la vía por la cual se
desarrollan estos teratomas es la misma que ocurre naturalmente al generarse
los tumores de células germinales descritos en humano (58). Se ha propuesto
que el trasplante de ESC diferenciadas in vitro reduciría el riesgo de la formación
de teratomas in vivo, por lo que se debe verificar que las células a transplantar
se encuentran diferenciadas en su totalidad, ya que aun existiendo un número
bajo de células indiferenciadas pueden desarrollarse teratomas (59).

Conclusiones

Aunque el estudio de las células troncales ha resultado de gran interés en los

últimos veinte años, su descubrimiento como concepto aparece con la embrio-
logía experimental en la primera mitad del siglo XX. La idea de “inmortalidad”
de las células germinales y mortalidad de las células somáticas data del siglo
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

XIX. Sin embargo, el gran avance metodológico de la biología molecular y ce-

lular, derrumbó la barrera biológica natural, permitiendo la “inmortalidad” a las
células somáticas después de reprogramarse. Conocer las redes de expresión
génica y epigenética durante el desarrollo nos permite entender el papel que
juegan la posición espacial de las células y los diversos factores involucrados en
la regulación de la pluripotencialidad.

La especificación, determinación y diferenciación de las células germinales y

de las células somáticas que las circundan, desde su origen hasta su destino final
en la gónada, ofrecen un modelo excepcional para elucidar los factores que
regulan la potencialidad en un sistema multicelular. Su alteración es responsable
de teratologías y patologías como el cáncer. Cuando la alteración es provoca-
da por manipulación experimental in vitro, es indispensable identificarla antes
de intentar su empleo para fines terapéuticos. Es necesario entonces, conocer
los mecanismos que modulan el desarrollo embrionario normal, para dar una
base científica al empleo de las células troncales en la Medicina Regenerativa.

Agradecimientos

Este trabajo se realizó con el financiamiento PAPIIT-UNAM IN226110.

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capitulo III Gónadas, células germinales y células troncales

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Capítulo IV

Células troncales neurales

Juan José Acevedo Fernández, José Santos Ángeles Chimal,

Víctor Manuel Rodríguez Molina & Jesús Santa-Olalla Tapia

RESUMEN

El recambio de los constituyentes celulares del sistema nervioso central ha desper-

tado mucho interés, ya que abre la posibilidad de corregir defectos funcionales
generados por daño agudo, crónico, congénito o por el envejecimiento. El cono-
cimiento fino de los diferentes elementos que participan en el origen, la autorre-
novación y la diferenciación de las células troncales neurales, podría orientarnos
en su aprovechamiento en el área biomédica. Se han descrito múltiples vías de
señalización como las activadas por Sonic Hedgehog, las proteínas morfogénicas
de hueso, los factores de crecimiento fibroblástico y proteínas de la familia Wnt
que participan en estos procesos. Así mismo, se conocen muchos de los factores
de transcripción entre los que destacan los miembros de las familias de HMG, bHLH
y Zic, que se activan por la presencia de dichos efectores. Algunas de estas molé-
culas se emplean como marcadores que permiten identificar a la célula troncal
neural. Se han descrito diferentes poblaciones de precursores que integran al lina-
je neural. Además, se tiene conocimiento de factores de crecimiento, hormonas,
neurotransmisores, matriz extracelular e interacciones celulares que controlan la
proliferación, sobrevivencia, compromiso y diferenciación de las células precurso-
ras neurales. Algunos de estos procesos son activados durante la neurogénesis del
adulto, y forman parte de los elementos reguladores del nicho de la misma. Cono-
cer los componentes que regulan el proceso de recambio neural, permitirá generar
estrategias para su aplicación en la Medicina Regenerativa del sistema nervioso.

INTRODUCCIÓN

El sistema nervioso central de vertebrados está constituido por aproximada-

mente 10 billones de neuronas. Las neuronas son la unidad funcional del tejido
neural, en ellas recae la propiedad de excitabilidad, con la cual se coordinan
las diferentes respuestas que un organismo multicelular puede realizar para su
adecuada homeostasis, en los que destaca la generación de impulsos nervio-
sos, activar la secreción endócrina, exócrina o sináptica, inducir la absorción de
nutrientes, además de regular la contracción muscular. En cada una de estas
acciones una neurona establece contacto con un órgano efector, generando
una unión sináptica, por la cual fluyen impulsos nerviosos o se secretan neuro-
transmisores. Cada neurona establece comunicación con 1,000 - 10,000 neuro-
nas, lo que genera más de un trillón de interconexiones.
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

Por mucho tiempo se consideró que las neuronas no podían generarse en la etapa
adulta de los organismos. Sin embargo, desde el año de 1969 se han acumulado
evidencias de la existencia de neurogénesis en el sistema nervioso central adulto de
aves y mamíferos. Los primeros experimentos emplearon marcaje con nucleótidos
radioactivos, con lo que se mostró la presencia de células proliferantes en la región
del telencéfalo (1), aunque estos reportes no tuvieron un impacto significativo. En
el año de 1983 se documentó neurogénesis en el proceso de aprendizaje del trino
en canarios (2), lo que dio la pauta para aceptar los reportes de neurogénesis en
tejido neural de mamíferos adultos en el bulbo olfatorio de roedores en el año de
1993 (3). A partir de esa fecha se ha demostrado claramente que es posible gene-
rar neuronas en regiones como el bulbo olfatorio e hipocampo (4), incluyendo al ser
humano (5). El recambio neuronal, sin embargo, se realiza a tasas muy bajas com-
paradas con las realizadas por los epitelios o las células sanguíneas. Sin embargo,
al demostrar la renovación de algunas neuronas en el tejido adulto se ha abierto la
posibilidad de emplear dicho conocimiento para retrasar, evitar o restituir el daño
neuronal en adultos. Existe gran interés por conocer cuáles son los procesos involu-
crados y cuáles son los factores que regulan el origen, la proliferación y diferencia-
ción de la célula troncal neural (NSC, del inglés Neural Stem Cell), en cuya pobla-
ción recae la capacidad de renovación del tejido neural. En el presente capítulo se
expondrá el conocimiento que se tiene del proceso que permite la neurogénesis,
90 se describirán las diferentes poblaciones indiferenciadas que constituyen al linaje
neural, destacando la presencia de los diferentes precursores neurales multipoten-
tes, los diferentes efectores de los que se tiene conocimiento en la regulación del las
respuestas de las NSC. Se describirán los mecanismos que participan en el proceso
de diferenciación de los fenotipos terminales principales. Finalmente, se describirá
la neurogénesis en el cerebro adulto como parte de los procesos que impactan su
funcionamiento. Todo lo anterior teniendo en mente que esta información podría
ser útil para inducir a las NSC del adulto (ANSC) a contribuir con la recuperación de
lesiones agudas traumáticas o crónico degenerativas del tejido nervioso.

ORIGEN DEL SISTEMA NERVIOSO Y DE LA CÉLULA TRONCAL NEURAL

Neurulación

El tejido neural de los vertebrados se origina durante la gastrulación, en un proce-

so que recibe el nombre de inducción neural, lo que ocurre cuando se generan
las tres capas germinativas (ectodermo, mesodermo y endodermo), además se
establecen los planos corporales principales del embrión (antero-posterior y dorso-
ventral). La primera evidencia morfológica que permite observar un cambio en
la región durante el desarrollo embrionario temprano, es un engrosamiento del
ectodermo en la región dorsal, generando lo que se reconoce como la placa
neural, iniciando así la etapa de neurulación. Este proceso está ligado con la ge-
neración de la notocorda, estructura mesodérmica ubicada en la región ventral
de la placa neural, de la cual se secretan moléculas con función morfogenética.
capitulo IV Células troncales neurales

El sistema nervioso central es de origen ectodérmico, el proceso de inducción neu-

ral da inicio con la participación del organizador de Spemann en Xenopus levis, y
el Nodo en ratón y humano. La relevancia de su participación en la generación
del neuroepitelio se sustentó en experimentos de trasplantes heterotópicos, en los
cuales, fragmentos del organizador trasplantados en la región ventral de Xenopus
levis generan un segundo eje corporal (6), en el que se incluía el sistema nervio-
so central. El organizador tiene la capacidad de secretar substancias con pro-
piedades inhibitorias para la actividad de las proteínas morfogenéticas de hueso
(BMP, del inglés Bone Morphogenetic Protein), particularmente para BMP2, 4 y 7.
Las moléculas involucradas en el proceso de inducción neural incluyen a Noggin
(7), Cordina (8), Folistatina (9) y Cerberus (10). Las evidencias experimentales que
dan soporte a la participación de estas moléculas en la inducción neural son: a) Se
identificó la expresión de estas moléculas en el organizador y nodo en los periodos
de tiempo adecuados para su papel durante la inducción neural; b) Cuando se
bloquea la expresión de alguna de estas moléculas se afecta o evita la formación
de la placa neural; c) Cuando se expresan receptores dominantes negativos (es
decir, que bloquean a los receptores endógenos) para BMP se induce la expresión
sólo de marcadores de tejido neural anterior (11). Se ha propuesto también la par-
ticipación de moléculas adicionales para la generación del tejido neural, particu-
larmente para la región caudal, como los factores de crecimiento de fibroblastos
(FGF, del inglés Fibroblast Growth Factor) y proteínas de la familia Wnt (12). Actual- 91
mente, diferentes experimentos de pérdida o ganancia de función han demos-
trado que el pez cebra, la rata y la rana. Se requiere la inhibición de los BMP para
generar el tejido neural anterior. De los cerca de 30 miembros de los BMP, BMP4 es
el principal para inducir el desarrollo de la epidermis y la inhibición del tejido neural.
Esta molécula, a través de la fosforilación de sus mediadores intracelulares (Smads
1,5,8), regula positivamente la expresión de los genes Msx1, Msx2, Gata2, Vent1 y
2. Con excepción de Msx2, los demás son relevantes para delimitar la placa neu-
ral, ya que su patrón de expresión participa en definir sus bordes justo durante la
neurulación, cuya distribución es muy similar a la de BMP4 (13). Si bien en un inicio
se consideró que el proceso de diferenciación neural era directo o por defecto
(default), por requerirse la inhibición de BMP (7-10), y por experimentos en donde
se observa que en cultivos de células dispersas del polo animal de Xenopus levis
(14) o células troncales embrionarias creciendo a baja densidad celular (15) se
favorece la diferenciación neural, sin la necesidad de la presencia de inductores
adicionales. Sin embargo, se han acumulado evidencias en los últimos 10 años en
donde es clara la participación de FGF, IGF1 y Wnt3a en el proceso de inducción
neural (16). Particularmente, en dos sentidos, primero FGF2, IGF1 y Wnt bloquean la
señalización dependiente de BMP; por otro lado, reprimen la expresión de BMP. La
vía de señalización de BMP activa los genes de diferenciación epidermal, como
E-caderina y reprime los de la diferenciación neural, como lo es N-caderina. Por
otra parte, se ha demostrado que la activación de genes tempranos específicos
del neuroepitelio depende de la señalización por Wnt, y FGF (12). Recientemente,
se ha referido una participación combinada (modelo por defecto e inductivo) en
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

donde la inhibición de BMP4 induce la expresión de FGF4, el cual a su vez regula

positivamente la expresión de los genes Zic1 y 3, que son marcadores definitivos
del neuroepitelio anterior. En la región posterior se ha identificado a FGF2 como
participante, además, se ha documentado que los receptores 1 y 2 para FGF se
requieren para dar la identidad posterior al tejido neural (11).

Se han descrito diversos factores de transcripción (FT) que participan en el

proceso de inducción neural, así como su relación con los diferentes efectores
antes descritos. El primero de ellos es FoxD5 el cual comienza su expresión du-
rante el inicio de la gastrulación y la generación de la placa neural y depende
de la participación de Siamois, un FT que es regulado por Wnt. La expresión de
FOXD5 se pierde cuando se forma el surco y el tubo neural (17). Su papel es el de
mantener un estado indiferenciado al favorecer la transcripción de genes tem-
pranos neurales como Sox2, y Sox3, reprimir genes de identidad posicional como
En2 y Krox20 y los de diferenciación neural como Neurogenina y NeuroD. Los
genes Sox forman parte de la familia del grupo de alta movilidad electroforética
relacionados con Sry, gen determinante del desarrollo de los testículos. Sox 2 y 3
son considerados marcadores panneurales que se expresan en las NSC y proge-
nitores neurales. Sox2 es el que inicia su expresión durante la inducción neural,
mientras que Sox3 es de origen materno y restringe su expresión durante la for-
92 mación de la placa neural (18). Sox2 posee elementos de respuesta para FGF y
Wnt, lo cual permite la expresión en la región posterior de la placa neural (12).
Las funciones de Sox2 y 3 son redundantes, funcionan como activadores trans-
cripcionales, y se relacionan con la identidad de las NSC proliferantes, además
contrarrestan los efectos de Sox14 y Sox21, los cuales funcionan como represo-
res transcripcionales que participan en la diferenciación neural (19). Geminina
es un factor transcripcional de las proteínas con dominio de bobina enroscada
(del inglés coiled-coil), su patrón de expresión es muy similar al de Sox3, el cual
se induce por la inhibición de los BMP y se mantiene en las zonas proliferativas
del neuroepitelio (20). Su actividad está relacionada con la integridad cromo-
sómica y regulación epigenética, básicamente relacionada con su interacción
antagónicas con las subunidades catalíticas del complejo SWI/SNF, Brg, Brahma
(21). Su actividad inhibe la diferenciación epidermal y neural, expandiendo la
población de precursores neurales. Su expresión es dependiente de FoxD5 (22).
Tres genes miembros de la superfamilia de dedos de Zinc se expresan en el ecto-
dermo neural temprano (Zic1-3). Se expresan como respuesta inmediata a la in-
ducción neural. Su función es la de proporcionar estabilidad del destino neural,
proporciona una mayor sensibilidad al efecto de Noggin, particularmente Zic1.
Los estudios realizados sugieren que Zic1 y 3 promueven el inicio de la diferencia-
ción (23), mientras Zic2 mantiene a las células en un estado indiferenciado (11).
De esta manera los genes Zic participan en definir la determinación neural. Esta
función está relacionada con definir zonas de precursores que comprometerán
su destino a fenotipos terminales. La delimitación de regiones de diferenciación
por los Zic está relacionada con genes de la familia Iroquois que inician la expre-
capitulo IV Células troncales neurales

sión de genes de la familia bHLH en la región dorsal. La diversidad de efectores

y su interdependencia regulatoria, ha permitido sugerir que estos factores trans-
cripcionales participan en generar una condición susceptible para responder
adecuadamente a los inductores neurales. La interacción de los diferentes FT se
resume en la Figura 1, en donde se agrega la participación de genes que per-
miten definir adecuadamente el destino neural, bloqueando a su vez el destino
epidermal y mesodérmico, lo anterior como una necesidad de dirigir el destino
de diferenciación del neuroepitelio.

93

Figura 1. Inducción neural. El proceso inicia con la participación de Wnt3a y FGF, los cuales blo-
quean los efectos de BMP sobre el ectodermo. Las actividades se realizan a dos niveles, Wnt sobre
el organizador, a través de la vía canónica dependiente de b-catenina activa la transcripción de
los inhibidores de BMP (Noggin, Cordina, Folistatina), además de los de Activina y Nodal (Cerberus
y Lefty). Al momento de inhibir la vía de los BMP, se incrementa la expresión de Churchil, este fac-
tor transcripcional activa moléculas como SIP1, relevante para la identidad de tejido neural, esta
molécula activa la expresión de Sox2. Por otra parte, FGF tiene efecto sobre el ectodermo, activa
la vía de las MAP cinasas, las cuales fosforilan las SMAD, con lo que se inhibe su actividad depen-
diente de BMP. A la par, FGF activa la transcripción de Churchil con lo cual se activa SIP1, esta
última molécula además de participar en activar a Sox2, se une con las SMAD, bloqueando la se-
ñalización dependiente de BMP. Los FGF participan en el mesodermo, en donde se bloquea, con
el mismo mecanismo, la señalización dependiente de BMP. Las moléculas que activan el proceso
de diferenciación neural son dependientes de la actividad de FOXD5. La transcripción de este
factor se activa por efecto de Siamois, el cual a su vez depende de la participación de Cerberus.
FOXD5 se ha descrito como el factor de transcripción clave en la inducción neural, participa en
activar la expresión de Geminina y Zic2. Los cuales a su vez activan la de Sox3 y Sox2. Estos genes
se consideran como marcadores de todas las NSC. Zic2 a su vez reprime Zic1/3, los cuales partici-
pan en diferenciación, activando los genes de la familia bHLH (Neurogeninas y NeuroD). De esta
manera la cascada génica activa genes de NSC y bloquea los de diferenciación.
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

Las células troncales neurales

La inducción neural da origen al neuroepitelio, este tejido está integrado por una
sola capa de células con una morfología pseudoestratificada. Esta falsa impre-
sión de capas se genera por desplazamientos del núcleo durante la división celu-
lar, lo que ha recibido el nombre de migración nuclear intercinética. Cuando las
células se encuentran iniciando G1 migran a la periferia del tubo neural, en don-
de realizarán la duplicación de su material genético (etapa S), para regresar en
la etapa de G2 y realizar la mitosis cerca del lumen o de la zona subventricular
(SVZ, del inglés Subventricular Zone). De esta manera, el neuroepitelio se encuen-
tra altamente polarizado, experimentando divisiones celulares simétricas (24). Se
ha descrito que la proporción de NSC varía de acuerdo a la región y etapa del
desarrollo, alcanzando hasta el 50% en médula espinal a los 8 días de desarrollo
embrionario de la rata, mientras que en la corteza cerebral a los 10 días solo al-
canza el 20% (25). De esta manera, se prevé que existen diferentes elementos re-
guladores que establecerán de manera conveniente la proporción de células a
proliferar o diferenciar de acuerdo a las señales que se reciben de su entorno.
Cuando se inicia la neurogénesis, las NSC dan origen a progenitores multipotentes
y restringidos que experimentarán divisiones asimétricas y simétricas de acuerdo a
las necesidades de la región. Se han aislado NSC de tejido neural embrionario (26)
94 y de tejido adulto (27), en ambos casos las poblaciones poseen las características
propias de NSC. Las NSC se definen como una población indiferenciada, capaz
de autorrenovarse, es decir dar origen a células idénticas a sí mismas, con el mis-
mo potencial a diferenciar, y finalmente tener la capacidad de dar origen a neu-
ronas y células gliales; esta multipotencialidad debe ser demostrada clonalmen-
te. A lo largo de la vida de un individuo, incluyendo su desarrollo embrionario,
existen NSC, dadas las necesidades de cada etapa y las particularidades de las
diferentes regiones es de esperarse que existan diferentes NSC. A lo largo de los
últimos 10 años se ha demostrado que al menos existen 5 diferentes poblaciones
(Figura 2). De esta manera, la población celular que integra a la NSC más tempra-
na, se ubica en el neuroepitelio con una tasa de proliferación alta, realizando di-
visiones celulares simétricas. Esto permite la amplificación de la población por
autorrenovación, lo que genera poblaciones con un mayor potencial proliferati-
vo, necesarias para dar origen a la diversidad de fenotipos terminales que inte-
grarán al sistema nervioso en sus diferentes regiones. Los estudios que han puesto
en evidencia la existencia de las diferentes NSC, inicialmente atendieron a la de-
pendencia de factores de crecimiento para proliferar, entre los que destaca el
epidérmico (EGF, del inglés Epidermal Growth Factor) (26, 27), el FGF (28, 29), Sonic
hedgehog (Shh) (30), y Notch (31). En los últimos años se ha considerado la expre-
sión de moléculas adicionales (Figura 2). La población más temprana que se ha
descrito es la que integra al neuroepitelio, esta población se puede identificar por
la expresión de Nestina (32), Sox 1 (33) y Oct4 (34), destaca además su dependen-
cia al factor inhibidor de leucemia (LIF, del inglés Leukemia Inhibitory Factor) para
proliferar in vitro (15). Algunos grupos han denominado a esta población como
capitulo IV Células troncales neurales

Precursor Neural Primitivo, lo anterior en vista de que esta población no es definiti-

va, a pesar de expresar marcadores neurales (15). Esta población está presente
por un tiempo muy breve de desarrollo neural, en ratón es solo entre los días 5.5 a
7.5 del desarrollo embrionario, su función es la de dar origen a la célula troncal
neural temprana, la cual se ha descrito que aparece desde los 8.5 días de desa-
rrollo embrionario. Esta población requiere de FGF para proliferar y se ha demos-
trado que su generación depende del FT con caja homeótica y dedos de Zinc
Zfhx1b (también conocido con el nombre de SIP-1) (35). Su existencia ha sido
claramente demostrada por experimentos con mutaciones nulas (36) y cultivos
celulares (37), en donde se describe su presencia hasta etapas avanzadas del
desarrollo, aunque en este caso en menor proporción, esta población recibe el
nombre de NSC definitiva (35). Su potencial de diferenciación muestra una prefe-
rencia para dar origen a neuronas in vitro. En etapas avanzadas del desarrollo,
posterior al inicio de la neurogénesis, es posible detectar una tercera población
celular con características de NSC, esta población se genera de la anterior, por lo
que en este texto la referimos como NSC tardía (37). Las NSC tardías muestran una
dependencia exclusiva al EGF para su propagación in vitro, y aunque continuan
siendo multipotenciales, cuando se induce su diferenciación preferentemente
genera glía (38). Su existencia está relacionada a la adquisición de la capacidad
para expresar el receptor a EGF, evento dependiente de FGF (37). La cuarta po-
blación es la glía radial (RG, del inglés Radial Glia). Esta población celular se ge- 95
nera desde que da inicio la neurogénesis, se caracteriza principalmente por ex-
presar el antígeno relacionado que muestra homología al anticuerpo monoclonal
RC2, el transportador de glutamato específico de astrocitos (GLAST, del inglés
Glutamate-aspartate Transporter) y a la proteína de unión a lípidos cerebrales
(BLBP, del inglés Brain-lipid-binding Protein). Sin embargo, se ha demostrado que la
RG presenta diferencias en los patrones de expresión de sus marcadores (39), fa-
voreciendo la idea de la existencia de una mayor diversidad de NSC. Algunos
grupos han descrito diferencias morfológicas como elementos clave para identi-
ficar subpoblaciones de la RG. Sus funciones iniciales estuvieron relacionadas con
el soporte y guía de los neuroblastos o neuronas jóvenes, dada su morfología, que
se caracteriza por emitir prolongaciones que ponen en contacto a la célula con
las superficies ventricular y pial, regiones en donde se dividen las NSC y generan a
los neuroblastos (región ventricular) para migrar a la superficie en donde diferen-
ciarán terminalmente (cercano a la región pial). El tener acceso a ambas superfi-
cies es una de las características del neuroepitelio o NSC primitiva, y por lo cual a
la RG se le relaciona con el neuroepitelio. Actualmente, se ha demostrado que la
RG es capaz de dar origen a neuronas, además de células del linaje glial (39). La
región mejor caracterizada es la corteza, en donde inclusive se ha demostrado su
mutipotencialidad (40). Estas células pueden propagarse in vitro con la participa-
ción de EGF + FGF (41). La glía radial se identifica en corteza desde los 9 días de
desarrollo en ratón, por la expresión de Nestina, GLAST, BLBP y RC2. Sin embargo,
algunos grupos han documentado que la RG es heterogénea en su potencial a
diferenciar (42). Particularmente, se ha demostrado que existe RG que se puede
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

diferenciar hacia neurona de manera directa (43), o bien generar un precursor

intermedio a partir del cual se generarán las neuronas (44). Actualmente, no se
conoce cuál puede ser la relación que tenga la RG con las NSC tempranas o
tardías, pero es muy posible que se generen de la RG (45). Sin embargo, se ha
demostrado sin duda alguna una relación de linaje entre la RG y la ANSC (46).
Esta relación es fácil de hacer, en vista que la RG es la NSC encargada de dar
origen a las últimas neuronas corticales durante el desarrollo embrionario tardío y
posnatal inmediato (47). La ANSC (la quinta población) se ha descrito en dos ni-
chos en donde proliferan y dan origen a interneuronas del bulbo olfatorio y a las
neuronas granulares del giro dentado del hipocampo, la SVZ y la zona subgranu-
lar (SGZ, del inglés Subgranular Zone), respectivamente (48). En ambas regiones se
identifican como las células B y se caracterizan por la expresión de la Proteína
Glial Fibrilar Acídica (GFAP, del inglés Glial Fibrillary Acidic Protein). En la SVZ, la
célula inmediata a la que da origen es un precursor con alta tasa proliferativa
(célula C), la cual posteriormente generará al neuroblasto o célula A que migra al
bulbo olfatorio en donde diferenciará en una interneurona. En la SGZ del giro den-
tado del hipocampo, la NSC se identifica por su capacidad para expresar GFAP
y Sox2 (49). De igual manera ésta generará un conjunto de células precursoras, a
la cuales se les refiere como células D1, D2 y D3, que son las que darán origen a
las neuronas granulares del hipocampo (células G) (50). Las dos poblaciones del
96 adulto se han identificado como multipotentes y se autorrenuevan en ensayos in
vitro. Además, para ambas se ha demostrado que pueden entrar en estados de
quiescencia (51, 52), una de las características principales que se ha referido para
las células troncales hematopoyéticas.

La diversidad de NSC durante el desarrollo hace prever la existencia de diferen-

tes mecanismos que permitan establecer una restricción del potencial a diferen-
ciar, lo que debe relacionarse con las necesidades de la variedad de fenotipos
para cada una de las regiones. Así, si bien es posible encontrar diferentes NSC en
cada una de las regiones del sistema nervioso central, cada región tiene particu-
laridades regionales que restringen el número y tipo de células que se generarán,
este control está relacionado con la identidad o posición que posee cada NPC,
(por ejemplo, médula espinal vs corteza cerebral) (53-55). Lo anterior está especi-
ficado por diferentes FT que se expresan de manera diferencial gracias al efecto
de morfógenos (moléculas que generan respuestas diferenciales de acuerdo a
gradientes de concentración), los cuales durante el proceso de inducción neu-
ral establecen la identidad antero-posterior y dorso-ventral (véase más adelante)
(54). Dicha información posicional debe coordinarse con efectores instructivos o
selectivos, quienes establecerán dominios de la cromatina que expondrán genes
selectivos de linaje, para favorecer las restricciones del potencial a diferenciar
durante el desarrollo del sistema nervioso (56).
capitulo IV Células troncales neurales

Figura 2. Células troncales neurales identificadas en el desarrollo embrionario y en el cerebro adul-

97
to. Los precursores neuroepiteliales (NPC) primitivos, son las primeras poblaciones generadas en el
desarrollo neural, los cuales dependen de LIF. En presencia de FGF2, se generan los NPC tempra-
nos; con la adición de EGF, es posible propagar a los NPC tardíos. Las dos primeras poblaciones se
encuentran en el neuroectodermo de la placa neural. Se ha reportado que los NPC dan origen a
las células de la glía radial en el tubo neural. Éstas últimas son las encargadas de dar origen a las
NSC de la zona subventricular del cerebro adulto. Con excepción de la primera población, es po-
sible inducir la proliferación in vitro de las NPC en presencia de FGF2 y EGF. En la figura se muestran
diversas moléculas que se han empleado como marcadores para el aislamiento, identificación y
caracterización de cada una de las poblaciones de NSC.

EL LINAJE NEURAL

Durante el desarrollo embrionario, en cada uno de los tejidos que se están ge-
nerando, se producen diferentes poblaciones celulares que participan en la
coordinación de los eventos de determinación, compromiso y diferenciación
de los constituyentes celulares de cada órgano, lo que garantiza los procesos
morfogenéticos que establecerán cada tejido. Al conjunto de esas poblacio-
nes relacionadas entre sí, de manera ascendente o descendente, se le conoce
como linaje. El desarrollo de una célula a lo largo de un linaje puede ser repre-
sentado como un proceso lineal, con un incremento gradual en la especializa-
ción y una pérdida de las opciones para diferenciar, eventos acompañados de
la disminución en la capacidad proliferativa, hasta que se adquiere el fenotipo
terminal (54). La regulación fina del proceso está gobernada por la diversidad
de estímulos que reciben las células, ya sea de mediadores solubles, interaccio-
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

nes celulares o de la matriz extracelular, lo que constituye el nicho en donde se

ubican las NSC (48). En aquellos tejidos donde es necesario producir un número
importante de células, se identifican diferentes poblaciones con capacidades
proliferativas altas, lo cual permite dar origen a un mayor número de células.
Gran parte de la identificación de la diversidad celular de los linajes en los te-
jidos se ha logrado gracias al conocimiento de los procesos de diferenciación
de tejido hematopoyético. Los diferentes experimentos realizados tanto in vitro
como in vivo del sistema hematopoyético (57) y neural (58), han demostrado la
existencia de diferentes poblaciones celulares que conforman sus linajes. Dife-
rentes análisis de linaje en otros tejidos, han permitido proponer la existencia de
una serie de poblaciones relacionadas jerárquicamente que pueden ser iden-
tificadas en todos los tejidos. Para el caso del tejido neural, se han identificado
diferentes células indiferenciadas que pueden estar presentes al mismo tiempo,
en cada una de las regiones, mostrando diferentes restricciones en el potencial
para diferenciar. A continuación se describen cada una de ellas:

Constituyentes del linaje neural

En el caso del linaje neural se han acumulado evidencias de la existencia de

98 poblaciones intermedias que se relacionan en la Figura 3. En este modelo las
NSC se describen como la primer población del linaje, posteriormente se ge-
nera un precursor que posee el mismo potencial que la célula troncal, es decir
también genera a todos los constituyentes celulares del tejido, pero no posee la
capacidad de regenerarse a sí misma, es decir su vida es finita. Esta población
recibe el nombre de progenitor de amplificación transitoria (PAT) multipotente,
estas células poseen la mayor parte de los marcadores presentes en la NSC. Sin
embargo, destaca como característica el tener una tasa de proliferación alta,
por lo que son relevantes para contender con altas demandas celulares, como
puede ser durante el desarrollo, el recambio tisular o bajo situaciones de daño.
Posteriormente, se generan progenitores que adquieren el compromiso de dife-
renciar a solo algunos o un fenotipo específico. Es de esta población de donde
finalmente se originan los fenotipos terminales. Cada una de estas poblaciones
puede ser generada de las diferentes NSC antes referidas, incluyendo la de la
etapa adulta, la cual incrementa de manera notable la diversidad celular (24,
59, 60). En el linaje neural, a todas las poblaciones con capacidad proliferativa
se les denomina células precursoras neurales (NPC, del inglés Neural Precursor
Cells), este término se ha empleado en vista de la dificultad para diferenciar
con precisión a las diferentes NSC y a todos los progenitores, particularmente los
multipotentes (58). Una vez que es necesario iniciar el proceso de diferenciación
el PAT inicia un proceso de restricción para generar ya sea un progenitor glial o
neuronal (60). Cada una de estas poblaciones puede experimentar un número
finito de divisiones celulares que varía dependiendo de la región. Las poblacio-
nes pueden ser identificadas por marcadores que se relacionan en las Figuras 2
capitulo IV Células troncales neurales

y 3. Durante la progresión de la diferenciación a lo largo del linaje, las alterna-

tivas de fenotipos que se pueden generar disminuye. A nivel transcripcional se
manifiesta con una disminución de la accesibilidad a los elementos de respues-
ta regulatorios de los genes involucrados en la determinación, compromiso o
diferenciación de los distintos linajes, lo que está determinado por la configura-
ción de la cromatina, la cual se regula por mecanismos epigenéticos (56).

Las diferentes poblaciones han sido analizadas por varios grupos a nivel de
expresión global. Sin embargo, ha sido difícil establecer un marcador exclusivo
de las poblaciones. Hasta el momento la identidad de las poblaciones, particu-
larmente de la NSC y de los progenitores de amplificación transitoria, se reali-
za por evaluaciones funcionales. Destacan como marcadores de la NSC, Bmi1,
proteína de la familia Policomb, que está involucrada en la regulación epige-
nética a través de la ubiquitinación y metilación de histonas. Esta proteína es la
única que ha mostrado una actividad imprescindible para mantener la auto-
rrenovación de la NSC (61). Nestina proteína de filamentos intermedios que se
expresa desde la etapa de neuroepitelio y en todos los NPCs (62, 63), SOX2, es
clave para mantener a los precursores multipotentes, proteína imprescindible
en la represión de la diferenciación (64), su represión transcripción es necesaria
para la diferenciación neural embrionaria, posnatal y del adulto (49), mientras
que su expresión lo es para mantener a las NSC; Mushashi es una proteína de 99
unión a RNA que regula negativamente la traducción de genes como NumB,
el cual impide la traducción del RNA mensajero de Notch, con lo que se favo-
rece la actividad de Notch (65). CD133, también conocida como prominina-1,
su función no está clara, es una proteína de membrana que se ha empleado
para aislar a células troncales de diferentes tejidos incluyendo al neural y tejidos
tumorales (66). Sus niveles de expresión se han relacionado con proteínas que
responden a hipoxia (67). Notch es el receptor para Delta y Jagged, la interac-
ción de estas moléculas membranales activa una cascada de señalización que
inicia la transcripción de Hes1/5, productos génicos que participan en inducir la
proliferación, mientras que reprimen la diferenciación en etapas tempranas del
desarrollo (31). Con excepción de Bmi-1 todos los marcadores antes expuestos
se han detectado en el PAT. Las otras moléculas que se expresan en los pre-
cursores neurales se describen en la Figura 3. Se han descrito FT que presentan
relevancia para controlar la autorrenovación, proliferación y diferenciación de
las NPCs, los cuales se relacionan en las Figuras 2 y 6.
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

100

Figura 3. Linaje neural. Todas las células que integran al linaje neural se generan a partir de los cinco
tipos de NSC descritas, que son las poblaciones que tienen el máximo potencial para proliferar y di-
ferenciar. A partir de esta población, se dará origen al progenitor de amplifiación transitoria (PAT), el
cual mantiene la multipotencialidad, conserva la mayor parte de marcadores de la NSC, pero su pro-
pagación in vitro y su existencia in vivo es finita. Dependiendo de la temporalidad, los PAT dará origen
inicialmente a neuroblastos, los cuales pierden el potencial para generar células gliales, su potencial
de diferenciación se restringe para dar origen solo a neuronas. Un poco más tarde en el desarrollo,
los PAT inicia la determinación hacia el linaje glial, generando glioblastos, que se diferencian ya sea a
astrocitos u oligodendrocitos. Ambas poblaciones blásticas experimentan mitosis, pero la magnitud y
frecuencia con la que se incorporan al ciclo celular, dependerá de la región o de la condición fisioló-
gica en las que se encuentre el individuo. Finalmente, las células blásticas darán origen a los fenotipos
terminales. En la figura se indican los marcadores más representativos de cada población.

Sistemas in vitro para el estudio del linaje neural

Existen diferentes NPC (incluyendo varias NSC) en el sistema nervioso central,

presentando mayor diversidad durante el desarrollo embrionario. Es convenien-
te resaltar que las diferentes poblaciones han sido difíciles de aislar y propagar,
por lo que se tiene en mente siempre la interrogante de si se cuenta in vitro con
poblaciones que representan fielmente el fenotipo de interés in vivo. Existen di-
capitulo IV Células troncales neurales

versos protocolos que se han empleado para obtener NSC a partir de células
troncales embrionarias (ESC, del inglés Embryonic Stem Cells) (59). Si bien varias
de las poblaciones obtenidas pueden recapitular los procesos secuenciales de
diferenciación, y expresar marcadores de los diferentes tipos de precursores,
no es posible confiar en que son una fiel representación de la estirpe celular de
interés, en vista de que el comportamiento y potencial para diferenciar de cual-
quier población, incluyendo los de la etapa adulta, requieren de una diversidad
de estímulos que regulan sus respuestas celulares, los cuales son provistos de un
entorno celular diverso. Este entorno, que se denomina nicho, proporciona una
compleja gama de señales que deben de actuar de manera coordinada en
tiempo y espacio, condiciones que actualmente no son posibles de reproducir
in vitro. Sin embargo, son modelos experimentales que permiten llevar a cabo
una disección de los componentes celulares y moleculares que participan en la
regulación de las respuestas de las NSC y de sus progenitores, acercándonos así
a los mecanismos que las gobiernan.

La caracterización in vitro de las NSC se ha favorecido por dos principales siste-

mas de cultivo que permiten la propagación de células indiferenciadas del siste-
ma nervioso (68). Ambos requieren de la participación de factores de crecimien-
to como EGF y FGF (26-28, 69). Sin embargo, en los últimos años se han empleado
también Shh (70), Notch (31), LIF (15), Wnt (12), el factor de crecimiento derivado 101
de plaquetas (PDGF, del inglés Platelet-derived Growth Factor) (71). Todos estos
factores han sido reportados como mediadores relevantes de la autorrenova-
ción o proliferación de precursores neurales. En la Figura 4 se describen los dos
sistemas. El primero de ellos induce la generación de agregados heterogéneos,
que reciben el nombre de neuroesferas (72). Este sistema está caracterizado por
la inducción de la proliferación de células en cajas de cultivo no adherentes,
con lo cual se seleccionan poblaciones que crecen en suspensión. El sistema de
neuroesferas fue el primero en describirse para inducir la proliferación de las ANSC
(26) y embrionarias (27). Posteriormente, se demostró que en el sistema nervioso
en desarrollo se encuentran poblaciones que responden de manera similar a los
factores de crecimiento. Este sistema permite demostrar la presencia de pobla-
ciones de NSC. Por otro lado, a densidades clonales, es empleado para demostrar
la autorrenovación y multipotencialidad de las NSC. El segundo modelo emplea
preferentemente FGF, se realiza el cultivo sobre una caja con matriz extracelular
que favorece la adhesión de los precursores neurales, los cuales proliferan hasta
cubrir completamente la superficie de cultivo (73). Este procedimiento selecciona
a poblaciones proliferantes y es el preferido para propagar in vitro poblaciones
que mantienen un comportamiento más homogéneo. En ambos casos es posible
mantener cultivos por periodos de tiempo prolongados, es decir por más de 10
pasajes. Sin embargo, es posible que algunos tejidos solo permitan la propaga-
ción por no más de 5 pasajes, lo cual podría estar relacionado con la presencia
de progenitores neurales de amplificación transitoria o comprometidos (59).
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

102

Figura 4. Sistemas in vitro para la propagación de precursores neurales. Los precursores neurales se
obtienen de diferentes fuentes celulares (células somáticas, a través de reprogramación nuclear,
ESC, tejido neural en desarrollo, o adulto). Es posible generarlos a partir de células troncales em-
brionarias (ESC) o células pluripotentes inducidas (iPSC), exponiéndolas a diferentes protocolos de
cultivo, lo que permite analizar cuáles son los factores que participan en su determinación. Existen
dos formas de cultivar precursores neurales: en neuroesferas o en monocapa. Una neuroesfera es un
agregado celular tridimensional heterogéneo que permite propagar NSC, en el agregado hasta un
20% de las células son NSC, se demuestra la capacidad de autorrenovación sembrando a densidad
clonal las células que la constituyen, para regenerar otra neuroesfera. Sobre esos cultivos se evalúa
la multipotencialidad, con lo que se confirma que es una NSC. En monocapa las células son induci-
das a proliferar en presencia de FGF, con lo que se propagan poblaciones adherentes homogéneas
que crecen en dos dimensiones, con lo que se limita el número de contactos intercelulares. Estas
también se pude evaluar su autorrenovación y mutipotencialidad en cultivos clonales.
capitulo IV Células troncales neurales

La identificación de NSC o progenitores es crucial para algunos experimentos,

desafortunadamente la demostración de cuál población celular es la que se tie-
nen in vitro sólo se puede hacer de manera retrospectiva en ensayos funciona-
les, lo anterior debido a la carencia de marcadores de superficie que permitan
diferenciar a las NSC de los progenitores de amplificación transitoria multipoten-
tes. Por otra parte, existen reportes en donde se describe que los patrones de
expresión de los marcadores de identidad posicional no se conservan cuando
se propagan in vitro (74), lo que debe de tenerse en cuenta si lo que se desea es
conocer el potencial de diferenciación que poseen. Los estudios encaminados a
identificar cuáles son los factores que influyen en los procesos de determinación,
compromiso y diferenciación han empleado ambos sistemas in vitro para contar
con condiciones controladas, y así establecer el papel determinante que pudie-
ran tener para encausar el proceso de diferenciación hacia los linajes neuronal
o glía. Por supuesto, para confirmar su participación, dichos resultados deben de
corroborarse con experimentos de ganancia y perdida de función in vivo.

Estudios in vitro e in vivo han permitido identificar cascadas de diferenciación

de los dos principales linajes del sistema nervioso (75). Estas vías están relaciona-
das con la participación de diferentes FT que conducen a una célula hacia el
linaje glial o neuronal y reprimir los destinos alternativos. Los procesos de diferen-
ciación están ligados íntimamente con mecanismos que deben de controlar la 103
proliferación. Así, es necesario que se aprovechen las poblaciones intermedias
para amplificar las poblaciones, a la par que delimitan segmentos que com-
prometen a las células hacia fenotipos particulares, este proceso es lo que se
conoce como regionalización. En el siguiente apartado comentaremos algunos
de los factores relevantes que participan en dichas vías.

LA DIFERENCIACIÓN NEURAL

La identidad posicional

En los estadios de la placa neural y del tubo neural, se establecen en el neuroe-

pitelio núcleos de señalización locales, que reciben el nombre de organizadores
secundarios, a partir de estos sitios se producen y difunden moléculas que espe-
cificarán diferentes territorios neurales (54). Dichas moléculas se conocen como
morfógenos, en vista que tienen la capacidad de controlar el desarrollo de es-
tructuras. Los morfógenos son los elementos más importantes para dar la identi-
dad posicional a las células precursoras en desarrollo, de tal manera que esta-
blecen dominios con potenciales de diferenciación distintos. Lo anterior permite
establecer un mapa de coordenadas a lo largo de los ejes antero-posterior y
dorso ventral, sobre el cual se generarán los diferentes fenotipos presentes en
el sistema nervioso. Estas moléculas, provenientes de una fuente espacial fija,
dirigen el destino celular al activar reguladores transcripcionales que contro-
lan redes genéticas. Éstas proporcionan la especificación de la función que es
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

apropiada de las células que reciben la señalización por los morfógenos. La ca-
racterística de un morfógeno es la de viajar cierta distancia, sobre la que esta-
blece un gradiente de concentración, esta distribución genera límites o fronte-
ras que proporciona una organización en segmentos sobre la cual se delimitan
dominios que se comprometen a dar origen a determinados fenotipos (54).

La distribución de un morfógeno a través de una región es mediada por algu-

no de los 3 mecanismos siguientes:

• Difusión, activa o facilitada, a través de la matriz extracelular.

• Internalización por endocitosis y resecreción sucesiva de una célula a otra.

• Transporte mediante proyecciones citoplasmáticas conectando células

distantes (citonemas).

Los morfógenos son moléculas con efectos instructivos directos, es decir, el

efecto sobre las células que son susceptibles de responder, situadas inclusive a
una distancia considerable de la fuente, se realiza por la misma molécula, y no
por la liberación de una señal secundaria (76). Para lograr la correcta delimi-
tación de influencia de un gradiente de morfógenos es necesario conocer: la
identidad del morfógeno, la forma y la concentración absoluta del gradiente (la
104 cual se afecta por la tasa de síntesis y la tasa a la cual el ligando es removido del
tejido), los factores que crean y mantienen el gradiente en sus diferentes posi-
ciones (células vecinas y ambiente extracelular). Cada eje se establece por dos
organizadores secundarios, uno en cada extremo. Para el caso de la diferencia-
ción de la médula espinal, en la región ventral participa Shh el cual establece
la generación de 5 dominios que darán origen inicialmente a interneuronas y a
las motoneuronas; posteriormente, a los astrocitos y oligodendrocitos (54, 60).
En la región dorsal el morfógeno que participa es BMP4, siendo relevante para
definir la diferenciación de las neuronas sensoriales. Ambos gradientes permiten
delimitar convenientemente las fronteras de un total de 11 dominios, a partir de
los cuales se generan todas las neuronas de la médula espinal (ver Figura 5). La
diferenciación de las células sometidas a la influencia de un gradiente de mor-
fógenos se logra a través del reconocimiento del morfógeno por sus receptores,
presentes en las células blanco, la respuesta diferencial se debe a umbrales
de concentración de dicha molécula, la tasa de síntesis y degradación de los
receptores, así como, la manera en que las células transducen la información
para que puedan lograr un respuesta celular definida. Las células leen diferen-
tes concentraciones de un morfógeno al variar la actividad de un tipo de re-
ceptor y no por hacer uso de diferentes receptores para un mismo morfógeno,
además de que se utiliza la misma vía de señalización, independientemente de
la concentración de dicha molécula a la que están expuestas. En el caso de la
identidad antero-posterior, los morfógenos que participan son ácido retinoico,
Wnt y FGF (ver Figura 5). La interacción de los diferentes morfógenos de los ejes
capitulo IV Células troncales neurales

permiten que un mismo conjunto de moléculas (por ejemplo Shh-BMP) generen

a lo largo del eje antero-posterior diferentes fenotipos; por ejemplo, las neuronas
motoras en la región ventral pueden ser colinérgicas, serotoninérgicas o dopa-
minérgicas, dependiendo de su ubicación a lo largo del eje antero-posterior, lo
cual permite generar diversidad ante un mismo conjunto de estímulos sobre un
eje. Los morfógenos mantienen su efecto posterior a la regionalización, por lo
que su presencia es utilizada para concluir los procesos de diferenciación.

105

Figura 5. Regionalización del sistema nervioso central. En la parte superior se muestra el patrón de
expresión generado por la regionalización antero-posterior, mediante un gradiente de concentra-
ción de FGF8 en la parte anterior el cual es secretado por la cresta neural anterior (ANR, del inglés
Anterior Neural Ridge) y por el Organizador del istmo (IsO). En la región caudal, es clave la parti-
cipación WNT, FGFs y Notch. En la parte inferior se muestra el patrón de expresión que se genera
por la regionalización dorso-ventral en médula espinal. Esto sucede mediante los gradientes de
concentración de BMP4, secretado por la placa del techo (RP, del inglés Roof Plate) y Shh, el cual
es secretado por la notocorda (N) y posteriormente por la placa del piso (FP, del inglés Floor Plate).
En la médula espinal se especifica el código de factores transcripcionales que delimitan los once
dominios relacionados con los fenotipos terminales ventrales (v) y dorsales (D). Te, telencéfalo; Di,
diencéfalo; Mes, mesencéfalo; Met, metencéfalo y Miel, mielencéfalo.
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

Diferenciación neuronal

La regionalización determinada por los morfógenos establece dominios de precur-

sores, los cuales se caracterizan por un patrón de FT con caja homeótica (en el eje
dorso ventral Pax y Nkx) que regulan negativamente su expresión de manera recí-
proca en la médula espinal, particularmente entre los que se expresan de manera
contigua y hacia el extremo contrario, por ejemplo, Pax6 reprime Nkx2.1, mientras
Nkx 2.1 reprime Pax6 (77). Esta relación de regulación negativa mutua, permite de-
limitar con mayor detalle las fronteras de los diferentes dominios de precursores.
Los patrones de expresión de los factores transcripcionales generan códigos muy
bien delimitados (ver Figura 5), lo que es definitivo para dar origen a los fenotipos
terminales. Una vez que la regionalización ha establecido dominios con expresión
particular sobre las NPC, y estos se han amplificado de acuerdo a la necesidad
en número de las células que se requieren en dicha región, se activan genes que
iniciarán el proceso de compromiso hacia el fenotipo neuronal. En todo el sistema
nervioso, incluyendo al sistema nervioso periférico, el primer fenotipo terminal que
se genera es el neuronal, sin considerar a la glía radial. La neurogénesis inicia en la
médula espinal entre los días embrionarios 9 y 10 del ratón, y progresa rostralmente,
hasta concluir en etapas posnatales en la corteza (42). Los genes que controlan el
proceso son referidos como genes proneurales, relacionados con el gen Achaete
106 scute de Drosophila melanogaster. Estos genes son miembros de la familia de FT
hélice-bucle-hélice con dominios básicos, justamente sobre estos factores se ejerce
represión por los genes que participan en la autorrenovación y proliferación de las
NSC (75). El primer gen en activarse es Mash, el cual a su vez activará la expresión
de Neurogenina, para posteriormente activar a NeuroD. Finalmente, este gen par-
ticipará en activar los diferentes genes que le confieren las características de fenoti-
po terminal a la neurona, la secuencia de eventos que permite transitar desde una
NSC hasta una neurona se resumen en la Figura 6.
capitulo IV Células troncales neurales

107

Figura 6. Regulación transcripcional durante el desarrollo de las células troncales neurales (NSC).
Representación gráfica de las moléculas y factores de transcripción que regulan positiva o negativa-
mente los procesos de autorrenovación, proliferación y diferenciación de células del sistema nervio-
so central. En la NSC, existen factores de transcripción que se expresan preferente en esta población
(Hes, Sox, Gli, Hesr, Bmi1 y TLX). Su función principal es la de reprimir la diferenciación (neuronal y glial),
mientras que por otro lado promueven su autorrenovación, favorecida ésta por la sobre expresión de
NOTCH y de p21, así como la metilación de genes relacionados con la diferenciación, como GFAP;
En el caso de que se requiera un incremento en la población de la región, la NSC generarán un PAT,
cuya diferencia con la NSC, es la ausencia de BMI1. En este estadio los factores de transcripción
mantienen su represión sobre la diferenciación (MASH 1, NGN1-2, NEUROD), además se reprimen
genes que disminuyen la tasa de proliferación, como los inhibidores de CDK (p21, p27). Por otro lado,
los mismos factores de transcripción favorecen la entrada al ciclo celular, activando la transcripción
de ciclina D y de cinasas dependientes de ciclina. La diferenciación de las células que presentan
un compromiso hacia un tipo celular definido, puede ser vista como un proceso de dos pasos, don-
de los progenitores comprometidos (PC), neuroblasto (NB) y glioblasto (GB), se generan de manera
secuencia favoreciendo su desarrollo y bloqueando los destinos alternativos. Primero se generan los
neuroblastos, cuyos genes participan en inhibir el destino glial, posteriormente los glioblastos, los que
reprimen el destino neuronal. Posteriormente, darán origen a las neuronas, astrocitos y oligodendro-
citos, de acuerdo a la restricción previamente ocurrida, continuando los eventos de represión a los
linajes alternativos. La generación de estos PC depende de la interacción recíproca de factores que
contribuyen a la determinación compromiso y diferenciación de la estirpe del linaje neural. Las prin-
cipales actividades están relacionadas a reprimir los destinos alternativos, promover la expansión del
linaje de destino, esto ocurre en cada componente celular del linaje. En la medida que se avanza
hacia el fenotipo terminan, la capacidad proliferativa se va perdiendo al activar genes que favore-
cen la salida del ciclo celular. Existen muchos factores de transcripción de transcripción involucrados
en el proceso de diferenciación, en la figura solo se indican los que han mostrado efectos claros
sobre los procesos de determinación, compromiso y diferenciación, ya sea activando o reprimiendo
las vías de diferenciación de linaje. Es conveniente destacar, que el comportamiento de las NPCs
dependen de una compleja red de vías de señalización celular en donde los morfógenos, contacto
célula–célula, factores de crecimiento, citocinas y matriz extracelular tienen gran relevancia.
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

Diferenciación glial

Las células gliales son las últimas en generarse durante el desarrollo, estas células
llegan a formar hasta el 50 % de las poblaciones del tejido adulto, aunque ini-
cialmente fueron consideradas únicamente como de soporte para las neuronas,
presentan funciones adicionales relevantes que permiten regular a las neuronas,
entre las que destacan: mantener la integridad de la barrera hematoencefálica,
regular los flujos de calcio, liberar D-serina, producir neuropéptidos, y modular la
transmisión sináptica. Los astrocitos y oligodendrocitos se generan de la RG (47).
Las células gliales son también susceptibles de recibir información de la regiona-
lización que se produce durante el desarrollo del sistema nervioso, de tal suerte
que morfógenos como Shh, BMP, Wnt, Notch y FGF son relevantes en los procesos
de determinación y compromiso glial (78). En la señalización extracelular que par-
ticipa en la diferenciación de astrocitos se han identificado a LIF, BMP y CNTF. Estas
vías de señalización activan sus mediadores intracelulares (STAT, SMAD, p300) con
los cuales es posible formar un complejo capaz de activar transcripcionalmente
los genes asociados al linaje astrocítico (60). En los últimos años se han acumulado
evidencias que demuestran que de los mismos dominios de los que se originan
neuronas, se generan las células gliales. Es decir, del dominio que genera moto-
neuronas, en etapas posteriores del desarrollo, se generarán los precursores de
108 oligodendrocitos, que se reconocen por la expresión de PDGFR-a, SOX10 y NG2.
Mientras, que de los dominios P1, P2 y P3 se generarán 3 tipos de astrocitos VA1
(PAX6, Reelina), VA2 (PAX6, NKX6.1, Reelina, SLIT1) y VA3 (NKX6.1 SLIT) respectiva-
mente (42) (para identificar los dominios ver Figura 5).

De esta manera, las mismas moléculas de señalización que participan en la

generación de las NSC, participan en la regionalización del sistema nervioso, y
finalmente definen los distintos fenotipos terminales. Así ante un mismo estímulo,
las células emiten respuestas diferentes durante el desarrollo, por lo cual deben
poseer mecanismos que les permitan activar programas genéticos distintos. En ese
sentido la regulación epigenética está teniendo una gran relevancia (56, 79). La
regulación epigenética consiste en establecer patrones de expresión que van a
ser heredados en las células descendientes, sin realizar cambio de la secuencia
del ácido desoxirribonucleíco (DNA). Los mecanismos que participan en este pro-
ceso involucran modificaciones postraduccionales de las histonas y del DNA (Ubi-
quitinación, fosforilación, acetilación, metilación). La relevancia de estos mecanis-
mos, se ha puesto en evidencia mostrando que genes de diferenciación terminal
como GFAP y S100 se encuentran altamente metilados en las NSC (80, 81), pero
cuando se determina la célula hacia el linaje glial, las marcas de metilación sobre
el promotor se pierden, para facilitar la activación de su expresión. Así mismo, exis-
ten patrones epigenéticos que mantienen la expresión de genes relacionados con
autorrenovación. Recientemente se han involucrado ácidos ribonucleicos peque-
ños como elementos reguladores claves de los mecanismos de regulación epige-
nética (82), que por limitaciones de espacio ya no fueron comentadas.
capitulo IV Células troncales neurales

NEUROGÉNESIS EN EL ADULTO

Desde hace más de 100 años se consideró que la neurogénesis solo ocurría du-
rante la etapa comprendida desde el desarrollo intrauterino hasta la adolescen-
cia (83). En 1944, Globus y Kuhlenbeck a partir de estudios realizados en tejido
fresco de pacientes muertos, identificaron subependimomas (tumores formados
de remanentes embriológicamente activos de la eminencia ganglionar lateral)
en los que se encontraron células con potencial para diferenciar (84). A partir
de dichos estudios se acuñó el término de células troncales bipotenciales. Esta
bipotencialidad consistía en la transformación morfológica de las células, de
una forma pequeña y redonda a neuroblasto con morfología unipolar o bipolar.
Estas características se identificaron en tumores ependimales, subependimales y
de los plexos. Hoy día a estas células bipotenciales, se les denomina células tron-
cales neurales. Las ANSC son capaces de autorrenovarse y diferenciarse hacia
los tres fenotipos terminales (neuronas, astrocitos y oligodendrocitos) (58). Existe
basta evidencia que ha demostrado la actividad de neurogénesis en el cere-
bro adulto de roedores y humanos (1, 5, 85). También se ha demostrado que las
neuronas que se generan en el cerebro adulto, son capaces de integrarse a
los circuitos neuronales existentes y pueden intercambiar impulsos dentro de los
mismos (86, 87).
109

Métodos para la detección de la proliferación celular y la neurogénesis en el

cerebro humano.

Existen varias técnicas para la identificación de células que se encuentran en

etapa de proliferación. La técnica más difundida consiste en la identificación de
proliferación celular mediante la utilización de un análogo de la timidina (2-bro-
modeoxiuridina, BrdU), que se integra con el DNA recientemente sintetizado de
las células en proliferación, detectando así, a las células que se encuentran en la
fase S del ciclo celular (88). Dicho fármaco también se utiliza como coadyuvante
en la radioterapia de células cancerígenas, dado que incrementa la sensibilidad
a la radiación. En vista de lo anterior, en pacientes que fueron sometidos a radio-
terapia, se pudo demostrar la actividad de neurogénesis en el hipocampo. Su uso
en individuos sanos se ha limitado, por presentar deficiencias para su detección
en tejidos de personas de edad avanzada y por motivos éticos para su adminis-
tración (89). Otras técnicas consisten en la detección de una proteína nuclear,
denominada antígeno nuclear de proliferación celular, así como del Ki67, la de-
tección de la histona H3 fosforilada y el marcador 2 de minicromosomas. Una
metodología más reciente consiste en realizar el análisis de los niveles de carbono
en células post mórtem, para determinar la edad de las neuronas (90). También se
ha realizado el marcaje mediado por retrovirus y la expresión de la proteína verde
fluorescente (86). Con todos estos procedimientos ha sido posible demostrar, en
modelos animales, que se generan neuronas a partir de poblaciones proliferantes
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

del tejido neural adulto. Para la identificación In vivo, se han aplicado técnicas de
imágenes de resonancia magnética y de espectroscopía de resonancia magné-
tica, que ayudan a determinar el volumen y la forma de las estructuras neurales,
permitiendo realizar así, valoraciones de morfometría (91).

Zonas con actividad de neurogénesis en el cerebro adulto humano

En 1998 se dio la primera evidencia de neuronas progenitoras y de neurogénesis

en el hipocampo del cerebro humano (92). En 2004, utilizando técnicas de inmu-
nohistoquímica se detectaron células de la región de CA1 del hipocampo que
expresaban TUC-4, marcador de neuronas que acaban de generarse (93). En
el cerebro adulto, las neuronas que nacen en la SGZ migran hacia capas más
profundas del Giro Dentado en donde se diferencian en células granulares. Exis-
ten dos tipos de células progenitoras neurales en esta zona, la primera conoci-
da como célula progenitora hipocampal tipo 1. Estas células expresan Nestina,
GFAP, y Sox2 (49, 63, 94). A pesar de que estas células también expresan GFAP,
son morfológica y funcionalmente diferentes a los astrocitos maduros. Al segun-
do tipo celular se le denomina células hipocampales tipo 2, y no expresan GFAP.
Aún no se determina si el linaje de las células tipo 2, pueden provenir de las tipo
110 1. Se considera que los astrocitos hipocampales del Giro Dentado podrían tener
un papel relevante en la diferenciación a través de vías de señalización Wnt, ya
que al bloquear ésta, se inhibe la actividad neurogénica de los astrocitos in vivo
(95). Se ha calculado que la densidad de células positivas a BrdU, en cerebros
de humanos de 57 a 72 años de edad, es de 200–250 células ⁄ mm3 (5).

La zona subventricular de los ventrículos laterales está ubicada a un lado del

epéndima, una delgada capa celular que cubre el ventrículo lateral. Las célu-
las progenitoras migran de la SVZ, diferenciándose durante su trayecto, hacia
su destino final donde serán incorporadas a los circuitos del bulbo olfatorio y a
otras regiones del lóbulo frontal. Existen 3 tipos de células precursoras en la SVZ:
las células B que expresan GFAP, las de tipo C que funcionan como PAT y las tipo
A que constituyen a los neuroblastos migratorios. Existen diferentes factores de
crecimiento que participan en regular las respuestas celulares entre estas po-
blaciones (Figura 7). La mayor parte de estos factores se encuentra de manera
natural durante el desarrollo embrionario, desde la inducción neural hasta la di-
ferenciación terminal. Una de las razones que pudiera explican el porqué la SVZ
es una región de alta proliferación neural, es dada su vecindad con el ventrículo
lateral que representa una fuente de nutrientes y factores de crecimiento, y
su relación con los vasos sanguíneos. De manera interesante, en ambos nichos
descritos en el tejido adulto, la NSC tiene contacto con las células endoteliales
(48). La SVZ conduce la migración de las células precursoras formando un “ca-
mino delgado” de neuroblastos, que está guiado por gradientes proteicos que
son movilizados por la actividad de los cilios de las células ependimales (96, 97).
capitulo IV Células troncales neurales

Las células ependimales expresan a la proteína Noggin que promueve la neu-

rogénesis; al antagonizar la señalización de las BMP (98). Se ha demostrado que
en el cerebro adulto la SVZ produce constantemente NSC a lo largo de la vida
del sujeto. En condiciones normales de SVZ genera la corriente migratoria rostral
que lleva a los neuroblastos hasta el bulbo olfatorio.

Proliferación, migración y neurogénesis en la corriente migratoria rostral

En el cerebro adulto, las células troncales neurales se ubican en la SVZ y migran una
distancia considerable para convertirse en neuronas granulares y periglomerulares
en el bulbo olfatorio. A la corriente de migración rostral (RMS, del inglés Rostral
Migratory Stream) también se le denomina “sistema neurogénico ventrículo–olfa-
torio”. La corriente migratoria se realiza por vestigios de extensiones ventriculares.
Las células precursoras se organizan alrededor del vestigio del lumen que conecta
el ventrículo lateral con el bulbo olfatorio (99-101). Las células proliferativas de la
RMS se encuentran rodeadas por una red de células gliales, constituyendo tubos
que se distribuyen en capas conformando así, una “malla” (102). La RMS se ex-
tiende inicialmente ventro-caudalmente desde el ventrículo lateral, directamente
adyacente al núcleo caudado, formando una larga extensión descendente has-
ta antes de dirigirse ventro-rostralmente, desde donde se dirige a través del tracto 111
olfatorio hasta el bulbo olfatorio. La trayectoria de la migración celular tiene una
forma de “embudo” que se ha descrito tanto en humanos, como en primates (4).
Una vez que los neuroblastos llegan al bulbo olfatorio, se distribuyen dentro de las
distintas capas del mismo (99, 103). Se ha calculado que existen 108 300 ± 13 310
células proliferando a lo largo de la RMS (104). Las células en fase proliferativa son
más abundantes en la SVZ y en la RMS comparadas con el hipocampo.
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

Figura 7. Efectores del nicho que regulan las respuestas de la células troncal neural del adulto. A) Se
muestra la ubicación de los diferentes fenotipos que integran el nicho de la SVZ, que es adyacente
a los ventrículos laterales (VL). Se identifican las ANSC por ser células positivas a GFAP (células B), las
112 cuales mantienen un contacto con la lámina basal (LB) de los vasos sanguíneos (VS), se indica el
epéndima (E) y la relación que se guarda entre las poblaciones de la región. Las células endoteliales
que revisten los vasos sanguíneos son una fuente de factores tróficos (VEGF, FGF) para las NSC. En la
SVZ los astrocitos actúan como las NSC de esta región, se dividen para generar células multipotentes
de amplificación transitoria células tipo C, que generarán los neuroblastos, se relacionan algunos de
los factores implicados en el control de los destinos de la NSC. B) Regulación de la autorrenovación,
supervivencia, proliferación y diferenciación en el nicho de la NSC: las poblaciones celulares dentro
del nicho expresan diversos factores de crecimiento, moléculas o factores transcripcionales que
participan activando e inhibiendo los procesos que permiten la autorrenovación, diferenciación,
proliferación y supervivencia de las NSC. En el esquema se muestran algunos de estos factores o
moléculas, el origen de cada uno de ellos está indicado en el panel A. La diferenciación se favore-
ce por Wnt1, Noggin y FGF, mientras que se inhibe por BMP, PDGF, VEGF y Notch. Algunos de estos
al mismo tiempo activan la proliferación. Entre los factores que inducen la autorrenovación se en-
cuentran Shh y Notch, éste último es necesario para el mantenimiento y el reemplazo de las NSC y la
neurogenesis. Los factores que activan la proliferación son Shh, Notch, FGF, VEGF y EGF, algunos de
estos regulan negativamente la diferenciación permitiendo la expansión y manteniendo a la NSC
en un estado indiferenciado tal es el caso de VEGF y EGF.

Conclusiones

Las neuronas del tejido neural adulto humano experimentan recambio, al me-
nos en dos regiones. Se ha demostrado la existencia de NSC que pueden ais-
larse y propagarse in vitro. Dichas células muestran la capacidad de poder
diferenciar in vitro. Lo anterior permite considerar que será posible modular su
potencial a diferenciar in vivo, o generar in vitro fenotipos para restituir los feno-
tipos afectados por enfermedades neurodegenerativas. El conocimiento de las
vías de transducción o redes de regulación genética de diferenciación, per-
capitulo IV Células troncales neurales

mite considerar que será posible encausar o reprogramar a las células hacia
fenotipos de interés, en ese sentido se ha demostrado que la glia reactiva se
puede diferenciar a neuronas con la sobre expresión de genes proneurales. Así,
el conocimiento de las moléculas que participan en la toma de decisiones a lo
largo del linaje neural será de ayuda para generar procedimientos de medicina
regenerativa que permitan restituir las funciones que se han perdido por daño
agudo o crónico. Lo anterior es de particular relevancia al saber que las mismas
moléculas que se encuentran durante el desarrollo tienen actividades equiva-
lentes en el nicho de la célula troncal neural del adulto.

Agradecimientos

Este trabajo ha sido financiado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología

CONACyT (84193, 139851) y por la secretaría de Educación pública (PROMEP
CA-75-1187). Así mismo a Karina Acosta Velázquez, Carlos Mojica Cardoso, Eder
Amaury Ramírez Jiménez, Iñigo García Esquivel y Diana Toledo Hernández por la
contribución de las figuras incluidas en este capítulo.

113
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

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Capítulo V

Células troncales mesenquimales

Juan José Montesinos & Marta Elena Castro

RESUMEN

Las células troncales mesenquimales han sido en los últimos diez años unas de las
más estudiadas en el ámbito científico, debido a que representan un extraordi-
nario modelo para investigar los mecanismos biológicos por los cuales una pobla-
ción celular es capaz de dar origen a diversos tipos celulares. A esta propiedad
se le ha denominado plasticidad y aunque aún resulta controversial, ha traído
por consecuencia la idea de utilizar a las células troncales mesenquimales en
medicina regenerativa, lo que está siendo evaluado en varios proyectos clínicos.
Por otra parte, su capacidad para mantener la formación de células hematopo-
yéticas y regular la respuesta de células inmunocompetentes tanto in vitro como
en modelos in vivo, ha alentado su utilización en procedimientos clínicos.

INTRODUCCIÓN

En los últimos años se ha realizado mucha investigación en relación a las células

troncales humanas aisladas de diferentes fuentes, que incluyen tejido embrio-
nario, fetal y adulto. Las células troncales se definen por la capacidad de au-
torenovación, es decir, de producir células idénticas a la inicial (lo que permite
el mantenimiento de la población de células troncales) y por el potencial para
generar múltiples y distintas células diferenciadas (ver capítulo I). La médula ósea
(MO) se ha definido como un órgano en donde se localizan dos tipos de células
troncales, las células troncales hematopoyéticas (HSC, del inglés Hematopoietic
Stem Cells) y las células troncales mesenquimales (MSC, del inglés Mesenchymal
Stem Cells). Las HSC son las células troncales que más se han caracterizado y las
responsables de mantener la producción de las células sanguíneas (hematopo-
yesis) a lo largo de la vida de un individuo (ver capítulo VI). Por su parte, las MSC
originan a la mayoría de las células que constituyen al estroma de MO encarga-
do de mantener la hematopoyesis y además tienen la capacidad para dar lugar
a la formación de hueso, cartílago y músculo (1). Se ha demostrado que las MSC
están localizadas en muchos tipos de tejidos como músculo, tejido adiposo, folí-
culos pilosos, pulpa dental, placenta, periosteo de cerebro, pericondrio, sangre
de cordón umbilical, gelatina de Wharton, pulmón, hígado y bazo (2,3).

El avance en el conocimiento de la biología de las MSC, ha generado un

cambio muy importante en nuestra percepción de su naturaleza, dado que se
ha demostrado el potencial que tienen para ser inducidas a linajes neuroecto-
dermales y endodermales, incluyendo neuronas y hepatocitos, propiedad que
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

se ha descrito como plasticidad (4). Esta capacidad de diferenciación hacia

distintos linajes, pero además la de mantener la formación de células sanguíneas
e incluso la de inmunosupresión, han hecho que se incremente el interés tanto
en la biología de estas células como en su potencial uso clínico. Debido a lo
anterior, muchas compañías biotecnológicas están trabajando en el análisis del
potencial clínico de las MSC para asegurar su eficacia en nuevas terapias. El ob-
jetivo de este capítulo es mostrar un panorama actual de la biología de las MSC
profundizando en su plasticidad, su capacidad de mantener la hematopoyesis
y la inmunosupresión. Finalmente abordaremos su importancia en Medicina y el
mejoramiento de tratamientos clínicos a través de la terapia celular.

BIOLOGÍA DE LAS CÉLULAS TRONCALES MESENQUIMALES

Para definir a las MSC es necesario conocer algunas características del órgano
en donde se detectaron y aislaron, es decir, la médula ósea (MO). En este órga-
no existen dos sistemas de manera primordial, el sistema hematopoyético que
es capaz de formar a todas las células de la sangre y el sistema estromal, el cual
se ha definido de manera tradicional como el soporte sobre el cual proliferan y
se diferencian las células hematopoyéticas (5). El sistema estromal consiste de
120 una población heterogénea de células que incluyen células reticulares, adipo-
citos, osteoblastos, células endoteliales vasculares, células de músculo liso de las
paredes de los vasos sanguíneos y macrófagos; todas ellas participan de ma-
nera activa en la producción hematopoyética, debido a su capacidad de se-
creción de proteínas de matriz extracelular y citocinas, tanto inhibidoras como
estimuladoras, y con ello conforman lo que se conoce como microambiente
hematopoyético (ver capítulos VI y VII).

Si consideramos al sistema estromal como un tejido, en muchas especies de

mamíferos incluyendo roedores y humanos, este tejido es capaz de regenerarse
después de haber sufrido daños severos por agentes como radiación, drogas
citotóxicas o lesiones mecánicas (6). La regeneración del tejido estromal se lleva
a cabo, tanto en un estado de daño como en condiciones fisiológicas normales
a partir de una población de células troncales estromales o MSC, que tienen la
capacidad de formar la mayoría de las células estromales mencionadas (7).

Las presencia de MSC en la MO se ha sugerido en trabajos realizados desde

1869, donde se observó el potencial osteogénico (con capacidad de generar
hueso) de MO de conejo en trasplantes heterotópicos (8). Años más tarde Danis
(9) demostró que la MO total tiene capacidad osteogénica por sí misma y que
no solo era una fuente inductiva o quimioatrayente de células osteogénicas,
ello al poner a la MO en el interior de cámaras de difusión (dos membranas se-
mipermeables separadas por un anillo de plástico) e implantarlas en un animal
receptor, observando la presencia de tejido óseo dentro de dichas cámaras
mediante métodos histológicos.
capitulo V Células troncales mesenquimales

Una de las contribuciones más importantes al conocimiento de las MSC fue he-
cha por Friedenstein y colaboradores, quienes definieron que la actividad osteo-
génica de la MO recaía en un grupo de células con características adherentes,
clonogénicas, no fagocíticas y de tipo fibroblastoide, definidas como unidades
formadoras de colonias fibroblásticas (CFU-F, del inglés Cell-Forming Units-Fibro-
blasts) y que pueden ser aisladas de suspensiones celulares de MO de organismos
post-natales, al ser cultivadas en medio líquido a densidades celulares apropia-
das (10). De hecho, estos investigadores encontraron que los CFU-F pueden, bajo
condiciones experimentales adecuadas, dar lugar a la formación de tejido adi-
poso y células adherentes capaces de mantener la mielopoyesis (11).

El concepto formal de las células troncales estromales de MO fue propuesto

por Owen (7), basados en los trabajos de Friedenstein y en analogía a la jerarquía
celular del sistema hematopoyético. Este investigador propuso a la célula troncal
estromal como una célula primitiva con la capacidad de originar fibroblastos,
células reticulares, adipocitos y células osteogénicas. El término de MSC fue in-
troducido por Caplan, quien sugirió la existencia de una célula con un potencial
mayor a la descrita por Owen, la cual tiene la capacidad para diferenciarse ha-
cia múltiples fenotipos mesenquimales como tejido adiposo, tendón, ligamento,
músculo y hueso, nombrando a este proceso mesengénesis (12) (Figura 1).
121

Figura 1. Mesengénesis. Este proceso se ha propuesto para explicar la formación de tejido me-
senquimal como hueso, cartílago, tejido adiposo, músculo y tendón a partir de una población de
MSC. Se involucran mecanismos biológicos de proliferación, compromiso, diferenciación y forma-
ción de células maduras (Modificado de referencia 12).
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

Estudios sobre las CFU-F obtenidas a partir de aspirados de médula ósea hu-
mana, han demostrado que se producen entre 1 y 20 de este tipo de colonias
por cada 1 X 105 células mononucleares sembradas (13). Investigaciones reali-
zadas clonando varias CFU-F y analizándolas de manera independiente, han
determinado que algunas de ellas son capaces de diferenciarse hacia hueso,
tejido adiposo y cartílago, mientras que otras solo se diferencian a hueso (1).
La proliferación de CFU-F in vitro está regulada por diferentes factores como el
factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF, del inglés Platelet Derived
Growth Factor), el factor de crecimiento epidermal (EGF, del inglés Epidermal
Growth Factor) y el factor de crecimiento de fibroblastos básico-2 (FGF-2, del
inglés Fibroblast Growth Factor-2). De igual manera, se han detectado algunos
inhibidores de la formación de colonias de CFU-F, como el interferón-alfa (INF-
a) y la interleucina-4 (IL-4), que bajo condiciones in vitro inhiben la formación
de colonias estimuladas por la combinación de EGF y PDGF (14). A la fecha no
existe un procedimiento experimental único para la purificación de MSC y la
mayoría de los laboratorios se han basado en la adherencia y en su capacidad
de diferenciación multipotencial (hueso/adipocito/cartílago).

Por otro lado, uno de los primeros anticuerpos utilizados para enriquecer en
CFU-F a partir de aspirados de MO fue STRO-1 (13), el cual identifica a una mo-
122 lécula de superficie que está involucrada en la diferenciación de las MSC hacia
los distintos linajes mesenquimales y en la formación de la matriz en tejido dental
(15). La selección de células STRO-1 de las células de MO resulta en un enrique-
cimiento de 10 a 20 veces en CFU-F. Sin embargo, hoy sabemos que existen
poblaciones mesenquimales que no expresan dicho antígeno (16).

Otros estudios señalan que el enriquecimiento de CFU-F, se puede beneficiar

de la expresión de Thy-1 (CD90), CD44, CD49a, CD10, CD146, de receptores
de factores de crecimiento como PDGF, EGF, factor de crecimiento parecido
a insulina 1 (IGF-1, del inglés Insulin-like Growth Factor) y factor de crecimiento
nervioso (NGF, del inglés Neural Growth Factor). Anticuerpos adicionales han
sido utilizados para identificar a las MSC, tal es el caso de SH2 que reconoce un
epítope de endoglina (CD105), el receptor III del factor de crecimiento transfor-
mante beta (TGF-b, del inglés Transforming Growth Factor β) presente en las cé-
lulas endoteliales, eritroblastos, monocitos y células estromales de tejido conec-
tivo (17) y los anticuerpos SH3 y SH4 que reconocen epitopos del antígeno CD73,
una molécula involucrada en la activación de las células B (18). Aún a pesar de
que se han identificado diferentes marcadores presentes en las MSC, es difícil
establecer un inmunofenotipo característico de las mismas. La Sociedad Inter-
nacional de Terapia Celular ha postulado algunos criterios mínimos para definir
a las MSC humanas, como la expresión de los antígenos de superficie CD105,
CD73 y CD90 y la ausencia de CD45, CD34, CD14, CD11b, CD79α, CD19 y HLA-
DR, además de su capacidad para diferenciarse a osteoblastos, adipocitos y
condroblastos in vitro (19).
capitulo V Células troncales mesenquimales

Por otra parte, se ha demostrado que las MSC producen citocinas que ac-
túan de manera temprana para mantener a las células troncales hematopoyé-
ticas en un estado de quiescencia o de autorenovación más que de diferencia-
ción, tales como el factor de células troncales (SCF, del inglés Stem Cell Factor),
el factor inhibidor de leucemia (LIF, del inglés Leukemia Inhibitor Factor), el factor
derivado del estroma (SDF-1, del inglés Stromal Derived Factor-1), la oncostatina
M (OSM), la proteína morfógena ósea (BMP-4, del inglés Bone Morphogenic Pro-
tein-4), el ligando del receptor Flt-3 y TGF-b (5). Más adelante hablaremos con
mayor amplitud de las citocinas producidas por las MSC que participan en la
proliferación y diferenciación de las células hematopoyéticas.

Un aspecto importante es la localización anatómica de las MSC en la mé-

dula ósea. Algunos estudios sugieren que este tipo de células se localizan en
las paredes de la red vascular sanguínea de la médula ósea, dado que se ha
demostrado que las CFU-F obtenidas expresan actina de músculo liso alfa (a-
SMA, del inglés Smooth Muscle Actin α) y las células capaces de expresar esta
proteína se limitan a los pericitos capilares, a las células que revisten la superficie
del endosteo y a las células de músculo liso vascular de las arterias medulares.
En contraste, esta proteína no se ha detectado en las células reticulares de los
nichos hematopoyéticos, en adipocitos o células endoteliales vasculares. Una
similitud adicional entre los pericitos vasculares y las células estromales de médu- 123
la ósea es que sintetizan una variedad de proteínas de matriz extracelular muy
similar, que comprenden una mezcla de lámina basal y colágenos intersticiales
(20). En modelos de ratón, estudios recientes han demostrado la existencia de
subpoblaciones de MSC que expresan nestina (proteína presente en las células
neurales) y que se localizan en las paredes perivasculares sinusoidales de la MO
en una asociación estrecha con las HSC, lo que sugiere que las MSC-nestina+,
participan de manera activa en la formación de nichos hematopoyéticos que
regulan la funcionalidad de las HSC (21) (ver capítulo VII).

PLASTICIDAD DE LAS CÉLULAS TRONCALES MESENQUIMALES

Con la finalidad de entender mejor el concepto de plasticidad, revisaremos

algunos puntos relacionados con desarrollo embrionario. Uno de los primero
eventos en el desarrollo de los vertebrados es la integración de las tres capas
germinales: ectodermo (que origina piel y linajes neurales), mesodermo (que
da origen a sangre, tejido óseo, músculo, cartílago y tejido adiposo) y finalmen-
te endodermo (que origina tejidos de los tractos respiratorio y digestivo). Para
que la segregación de las células embrionarias a estas tres capas se realice, se
requiere la expresión secuencial de muchos genes y una vez que se presentan
estas decisiones son eventos perdurables y todas las células que se producen
subsecuentemente, como las troncales, progenitoras y maduras de cada capa
germinal, mantendrán de manera irreversible la especificidad de linaje a lo lar-
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

go de la vida de un individuo. Lo anterior nos lleva a pensar que en un individuo

adulto, la regeneración de tejidos recae en células troncales que van a dar
origen a células maduras que corresponden exclusivamente a ese tejido y que
dichas células troncales no tienen la capacidad para regenerar tejidos prove-
nientes de otras capas germinales.

Experimentos recientes han cuestionado la restricción de linaje por parte de

las células troncales y han dado cabida al nuevo concepto de plasticidad. La
plasticidad de las células troncales se puede entender como la capacidad de
diferenciación que tienen éstas para dar lugar a la formación de un tejido es-
perado (debido a su compromiso de linaje predeterminado), pero también a
un tejido no esperado, es decir que puede traspasar los límites a los que hacía-
mos referencia de su origen de capa germinal y por lo tanto bajo ciertas cir-
cunstancias se podrían “transdiferenciar” en respuesta a señales regenerativas
microambientales (22) (Figura 2). La transdiferenciación describe la conversión
de una célula de un linaje específico en otra de un linaje distinto y ello conlleva
a la pérdida correspondiente de marcadores y funciones del linaje original y a
la adquisición de ambas características del tipo celular transdiferenciado (23).

124

Figura 2. Plasticidad de las MSC. Se ha propuesto que las MSC tienen la capacidad para dar lugar
a la formación tanto de tejido esperado (diferenciación), como no esperado (transdiferenciación).
capitulo V Células troncales mesenquimales

El concepto de plasticidad de las células troncales ha provocado en la co-

munidad científica mucha controversia, debido a que se contrapone a diversos
preceptos biológicos bien establecidos y que se han demostrado experimental-
mente. Debido a ello tener evidencias definitivas de dicha plasticidad ha resul-
tado muy complicado por varias razones que veremos a continuación.

En principio las células troncales adultas o también denominadas somáticas,

localizadas en diversos tejidos, son una población extremadamente reducida
y ello dificulta tener una población completamente homogénea y por consi-
guiente, existe la posibilidad de que en dicha población de células troncales, se
encuentren presentes células troncales no comprometidas que pueden tener
la capacidad para diferenciarse a muchos tejidos, no solo al tejido en el que se
encuentran y con ello dar la apariencia de transdiferenciación de células tron-
cales comprometidas (24).

Otro fenómeno biológico que pudiera aparentar plasticidad, es la posibilidad

de que las células troncales ya comprometidas, se puedan reprogramar para
diferenciarse a células de un tejido no esperado únicamente bajo condiciones
experimentales in vitro, en las cuales se dirige hacia un linaje determinado por las
condiciones “artificiales” de cultivo (25). A pesar de dicha posibilidad, no se sabe
si en un individuo dicha reprogramación es un evento fisiológicamente normal.
125
Finalmente, también se ha documentado la fusión celular, en la cual dos cé-
lulas (en este caso de distinto linaje) se llegan a fusionan para constituir una mis-
ma con características propias del tejido al cual migra una de ellas (24). A pesar
de su descripción, dicho fenómeno no se ha observado en modelos estándares
de trasplante celular y no se ha considerado relevante por varios investigadores,
debido a que es un evento relativamente raro, aunque se tiene que descartar
en los modelos de plasticidad que se intenten describir.

Posiblemente una de las pruebas más fehacientes para demostrar el fenó-

meno de plasticidad, sea la formación de células de múltiples tejidos a partir
de una célula individual. Al respecto, uno de los estudios que se consideran
trascendentales en la demostración de la plasticidad celular es el de Krause y
colaboradores. (26), en donde se demostró que el trasplante de una sola HSC,
obtenida de una población de HSC marcadas, quiescentes y con actividad
repobladora de MO a un ratón letalmente irradiado, dio lugar a la formación
de células con marcadores epiteliales e identificadas en el esófago, estómago,
intestinos delgado y grueso, ductos biliares y piel, lo cual confirma la multipoten-
cialidad de la célula proveniente de la población de HSC.

En el caso de las MSC hay muchos estudios que sugieren su diferenciación ha-
cia tejidos no esperados, sin embargo es importante mencionar que la mayoría
de ellos no se realizaron partiendo del análisis de una célula individual y por lo
tanto de manera estricta no se podría hablar propiamente de plasticidad.
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

En relación al potencial de las MSC para generar células neurales, uno de los
primeros estudios realizados demostró que las MSC inyectadas en el sistema ner-
vioso central de un ratón recién nacido tienen la capacidad de migrar a través
del cerebro y adoptar características fenotípicas y morfológicas de astrocitos
y neuronas. Estudios posteriores se han enfocado en determinar las condicio-
nes que inducen la diferenciación neural de las MSC in vitro, como una forma
de investigar la plasticidad observada in vivo, sin embargo al respecto se han
señalado algunos inconvenientes como la inespecificidad de los marcadores
neurales descritos y la naturaleza heterogénea de las poblaciones analizadas.
Otros reportes muestran formas alternas de inducir a las MSC a expresar ca-
racterísticas de células neurales (morfología tipo neural, expresión de proteínas
neurales como nestina, proteína ácida glial fibrilar, neurofilamento-H y tubulina
β-III), como la exposición a agentes reductores, antioxidantes o químicos que
incrementan el AMP cíclico intracelular. Sin embargo, se ha propuesto que esta
expresión anormal de proteínas neurales, es el resultado de alteraciones a las
propiedades bioquímicas de microtúbulos que modifican la red de filamentos
intermedios, alternando los niveles de expresión de las proteínas neurales (27).

Por otro lado, se ha evaluado la posibilidad de que solo aquellas células me-
senquimales que expresan nestina (una proteína presente en células neurales
126 primitivas), sean las responsables del comportamiento neural observado poste-
rior a la inducción neurogénica, como la formación de agregados parecidos a
neuroesferas o la diferenciación neuronal después de su cocultivo con neuronas
granulares de cerebelo. Dado que la expresión de nestina no está restringida
al tejido neural, y que es detectable en otros tipos de células mesodermales
(27,28) será necesario realizar más investigación para determinar si la presencia
de una subpoblación de MSC que expresa nestina, es responsable de la forma-
ción de células de características neurales.

Las MSC tienen también la capacidad de transdiferenciarse in vivo. Ratones

tratados con el agente quimioterapéutico bleomicina, e inyectado con MSC han
mostrado que éstas injertan en pulmón y aunque solo un pequeño porcentaje
de ellas se localizan en la zona dañada, presentan características epiteliales y
copurifican con neumocitos tipo II (29). Otros estudios utilizando el mismo modelo
de daño pulmonar, han demostrado que las MSC después de injertar, se transdife-
rencian hacia neumocitos tipo I o presentan características fenotípicas de todos
los tipos celulares del pulmón, incluyendo fibroblastos, células epiteliales tipo I y
II y miofibroblastos (30). Además las MSC tienen la capacidad de dar lugar a la
formación de células de epitelio pigmentario retinal, células epiteliales de piel,
células de los ductos sebáceos y células epiteliales tubulares de riñón (27).

Por lo tanto las MSC poseen una plasticidad inherente que va más allá de su
capacidad para formar células de tejido conectivo (adiposo, óseo, cartílago,
etc). Sin embargo, para establecer de manera definitiva todo el potencial de
diferenciación de las MSC, es necesario determinar las características biológi-
capitulo V Células troncales mesenquimales

cas de una población más pura de MSC y traspasar la barrera de los análisis de
poblaciones heterogéneas, que hasta el momento han sido la base para des-
cribir la plasticidad de estas células.

CAPACIDAD DE SOPORTE HEMATOPOYÉTICO

DE LAS CÉLULAS TRONCALES MESENQUIMALES

Para hablar de la relación entre las MSC y el mantenimiento de la formación de

células hematopoyéticas o soporte hematopoyético, primero mencionaremos
algunos aspectos generales relacionados con la hematopoyesis, que se pue-
den consultar más ampliamente en el capítulo siguiente (ver capítulo VI).

La hematopoyesis es el proceso a través del cual se forman todas las células

de la sangre. Durante la etapa embrionaria, este proceso va cambiando de
sitio a lo largo de ella, iniciando en una región denominada aorta-gónada-me-
sonefros y trasladándose posteriormente a hígado fetal y finalmente a MO. No
se sabe con precisión porqué se realizan estos cambios de sitio, pero se piensa
que el microambiente hematopoyético en estos órganos en sus etapas tem-
pranas, es incapaz de mantener la producción de células sanguíneas. Se ha
demostrado que una parte importante de ese microambiente lo constituyen las
MSC, dado que antes de establecerse como sitios hematopoyéticos, en dichos 127
órganos ya se han detectado MSC y más aún, también en circulación. El hecho
de encontrar MSC en circulación en etapas embrionarias tempranas, se ha rela-
cionado con el establecimiento de la hematopoyesis en MO en etapas tardías,
ello debido a que el número de MSC en circulación en su nivel más elevado se
detecta en el primer trimestre embrionario y declina en el segundo, en donde
se alcanzan valores de tan solo un 0.0001% de las células nucleadas y finalmen-
te en la sangre de cordón umbilical, en donde solo se detectan el 0.00003% de
ellas. Esta disminución gradual de las MSC en circulación, implicaría que en la
etapa final de gestación, la mayoría de ellas ya se localizarían en la MO, en
donde formarán parte del órgano hematopoyético por excelencia que perma-
necerá a lo largo de la vida del individuo (31).

La primera evidencia de la participación importante de las MSC en mantener

la hematopoyesis, se describió en los trabajos de Friedenstein (11), en donde se
demostró en modelos de ratón que el trasplante de células estromales de MO,
bajo la cápsula del riñón, resultó en la generación de estructuras denominadas
oscículos, los cuales semejaban las características histológicas medulares, en las
que se podía reconocer en preparaciones para microscopía, tanto la forma-
ción de estroma proveniente del donador, como de células hematopoyéticas
provenientes del receptor del trasplante. Como hemos mencionado en seccio-
nes anteriores, este mismo grupo reportó inicialmente la presencia de MSC en
las células estromales de MO y posteriormente otros investigadores demostraron
que la inyección suplementaria y simultánea de MSC/células estromales y HSC,
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

acelera la recuperación de la hematopoyesis después de la irradiación letal de

los animales receptores (32). Estos resultados sentaron las bases para evaluar la
posibilidad de transplantar a las MSC en procedimientos clínicos, lo que ha lle-
vado a su expansión in vitro y a su administración en pacientes hematológicos a
los que se les había realizado trasplante de HSC (33).

Para constituir el tejido de sostén sobre el cual las HSC proliferan y se dife-
rencian, las MSC transplantadas deben colonizar la MO y formar los elementos
celulares estromales que favoren la producción hematopoyética. Una de las
células que se forman a partir de MSC son los pericitos, los cuales revisten los
vasos sanguíneos que irrigan la MO y dan consistencia a las uniones de células
endoteliales que forman la pared de dichos vasos. Existe una teoría que pro-
pone que el lugar de almacenaje de las MSC, son los vasos sanguíneos que
irrigan diversos tejidos y órganos, lo cual se correlaciona con las distintas fuentes
alternativas a la MO de donde se han obtenido los pericitos, como músculo,
tejido adiposo, piel, cartílago, hueso, hígado, tendones, pulpa dental e incluso
también de membrana sinovial, fluido amniótico, sangre de cordón umbilical,
placenta y cordón umbilical (3,34).

La regulación de la producción de células sanguíneas por parte de las MSC,

recae de manera importante en la capacidad que tienen para producir citocinas
128 responsables de la proliferación y diferenciación de las células troncales y progeni-
toras hematopoyéticas. Dentro de las citocinas que participan en la diferenciación
de células hematopoyéticas están la interleucina 1 (IL-1), IL-6, IL-7, IL-8, IL-11, IL-12,
IL-14 e IL-15. Cuando se cultivan en presencia de IL-1α, las HSC producen factores
de crecimiento como el factor estimulador de colonias de macrófagos y granu-
locitos (GM-CSF, del inglés Granulocyte and Monocyte-Colony Stimulating Factor)
y el factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF, del inglés Granulocy-
te-Colony Stimulating Factor), que participan en la maduración de monocitos y
granulocitos. Además de ello, las MSC presentan receptores para citocinas como
son IL-1R, IL-3R, IL-4R, IL-6R, IL-7R, InterferongR, TNF-aRI y II y el receptor para transferri-
na, de tal manera que también se lleva a cabo la comunicación en forma inversa,
es decir de células hematopoyéticas a MSC, lo cual se traduce en la formación de
un circuito entre estos tipos celulares mediado por citocinas (5).

Las MSC pudieran también participan en el desarrollo de las células T, dado

que en el timo adulto contribuyen a la formación de la cápsula y el septo, y se
pueden localizar en la corteza, donde interactúan con los timocitos inmaduros. El
mecanismo por el cual las MSC participan en el desarrollo de las células T no está
completamente definido, pero se ha propuesto que se lleve a cabo de manera
indirecta, en principio mediante la regulación de la proliferación y diferenciación
de las células epiteliales del timo, por la producción del FGF y con ello conseguir
que las células epiteliales sean las responsables de la selección positiva de los
timocitos, capaces de reconocer péptidos acoplados al complejo principal de
histocompatibilidad. Asimismo, se presupone un efecto directo de regulación de
capitulo V Células troncales mesenquimales

células T, debido a la capacidad que tienen para secretar IL-7, citocina necesaria
para la maduración de timocitos con el fenotipo CD4-/CD8-/CD25+/CD44+. Las
MSC provenientes de MO cultivadas in vitro, tienen la capacidad de favorecer el
desarrollo de linfocitos T en ausencia del timo, por lo que se piensa que las MSC
de timo se derivan de MO, dado que estudios in vivo en modelos de ratones
transplantados con MO, han demostrado que las células estromales del donador
migran al timo donde participan en la selección positiva de timocitos (31).

Además, las MSC expresan receptores importantes para la adhesión de las

células hematopoyéticas, favoreciendo la acción de las citocinas producidas
por las MSC que a su vez, expresan las moléculas de adhesión ALCAM, ICAM 1-3,
L-selectina, CD44 (receptor de hialuronato) y N-, H- y VCAM (5).

Uno de los aspectos importantes en el estudio de la capacidad de soporte

del desarrollo hematopoyético de las MSC, es la posibilidad de manipular cul-
tivos in vitro en donde estén presentes ambas estirpes; a estos sistemas se les
conoce como cocultivos (35). La idea de dichos sistemas, es tener una capa
alimentadora de MSC, sobre la cual se depositan células troncales y progenito-
ras hematopoyéticas, para que posterior a un tiempo determinado de cultivo,
se pueda obtener un número incrementado de células hematopoyéticas, sin
que se modifiquen de manera sustancial sus características originales, es decir,
129
sin que pierdan su estado primitivo de diferenciación. Esto aún se encuentra en
fase experimental; sin embargo, tener la posibilidad de producir un número ade-
cuado de células hematopoyéticas, es muy importante para el trasplante de las
mismas en las diversas enfermedades hematológicas (ver capítulo X).

Varios sistemas de cocultivo han sido desarrollados a partir de MSC de MO,

con la finalidad de incrementar el número de células CD34+ provenientes de
sangre de cordón umbilical (SCU), para que sean utilizadas en trasplantes alo-
génicos. Trabajos publicados han demostrado el incremento en la cantidad de
células primitivas CD34+/CD38-/HLA-DR- en cultivos en presencia de MSC, con
respecto a aquellos cultivos en donde solo se utilizan citocinas adicionadas de
manera exógena, pero además, se ha observado un incremento en la expre-
sión citoplásmica de proteínas inhibidoras de ciclo celular y antiapoptóticas,
como p21 y BCL-2, las cuales favorecen las características funcionales propias
de células troncales hematopoyéticas (36, 37).

Por otra parte también se han utilizado en los sistemas de cocultivo, MSC pro-
venientes de otras fuentes como sangre de cordón umbilical y tejido adiposo,
encontrándose una mayor capacidad en MSC de SCU para incrementar la can-
tidad de células CD34+CD38- que aquellas de tejido adiposo. Dicho potencial
se relaciona con la mayor expresión de moléculas de adhesión como Caderi-
na-11, N-Caderina, VCAM-1, NCAM-1 e integrinas. Un aspecto interesante es que
el análisis de la expresión de citocinas en ambas fuentes no mostró diferencias
significativas, lo cual sugiere que el incremento observado en la producción de
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

células hematopoyéticas por parte de las MSC de sangre de cordón umbilical,

está asociado con el perfil de expresión de moléculas de adhesión y por tanto
con la interacción MSC-HSC, más que con el perfil de secreción de citocinas (38).

Resultados similares se han obtenido con MSC provenientes de placenta e

incluso se ha demostrado que su cotrasplante con células hematopoyéticas de
SCU, mejora el injerto de las mismas en modelos de ratones inmunodeficientes,
sugiriendo la capacidad de las MSC para dirigirse a la MO, colonizar y favorecer
el “homing” (capacidad de las células troncales y progenitoras hematopoyé-
ticas para dirigirse a la MO) de las células CD34+ (39). Estudios in vitro han de-
mostrado que las capas de MSC en cocultivo con las células hematopoyéticas,
presentan dos sitios espacialmente distintos: a) sobre la superficie de las MSC, en
donde de manera predominante se lleva a cabo la proliferación de las HSC y
b) por debajo de la capa de MSC, en donde aparentemente se reproducen las
condiciones del nicho de HSC (40; ver capítulo VII).

INMUNOREGULACIÓN POR LAS CÉLULAS TRONCALES MESENQUIMALES

Las MSC son capaces de regular la función de diferentes componentes del sis-
tema inmune, entre ellos los linfocitos T (LT), las células dendríticas (DC, del inglés
130
Dendritic Cells), los linfocitos B y las células asesinas naturales (NK, del inglés Natu-
ral Killer). Este efecto inmunoregulador de las MSC, puede darse a través de con-
tacto celular y/o mediante la secreción de diversos factores. En esta sección nos
enfocaremos a describir el efecto inmunorregulador de las MSC derivadas de MO
humana sobre la activación y función de los LT, DC y células NK (Figura 3).

Cuando un LT es activado, prolifera y se diferencia para llevar a cabo su fun-

ción efectora. Estudios in vitro han mostrado que las MSC son capaces de inhibir
la proliferación de LT activados con aloantígenos, anticuerpos dirigidos contra
CD3 y CD28 o mitógenos. La inhibición de la proliferación se observa sobre las
poblaciones de LT CD3+, es decir linfocitos CD4+ y CD8+, sin embargo, el efecto
inmunosupresor de las MSC es más pronunciado sobre los LT citotóxicos (CD8+).
En los LT activados en presencia de MSC se observa disminución en la secreción
de citocinas pro-inflamatorias como el IFNg, mientras que se incrementa la se-
creción de citocinas como la IL-4 e IL-10, lo cual favorece el desarrollo de una
respuesta inmune anti-inflamatoria tipo Th2. Aunado a lo anterior, las MSC son
capaces de reclutar, regular y mantener el fenotipo de los Linfocitos T regulado-
res (LT reg), los cuales favorecen aún más la polarización de la respuesta inmune
anti-inflamatoria, mediante la producción de IL-10 y TGFβ (41-44). Así, las MSC
además de inhibir la proliferación de LT activados, generan un ambiente anti-
inflamatorio caracterizado por la presencia de LT reg y citocinas tipo Th2.
capitulo V Células troncales mesenquimales

131
Figura 3. Capacidad de inmunosupresión de las MSC. Inmunorregulación de las MSC sobre LT, DC
y células NK. Los efectos de las MSC sobre las células inmunes se presentan en flechas continuas,
mientras que los efectos de las células inmunes sobre las MSC se presentan con líneas punteadas.

Algunas de las moléculas involucradas en la inmunosupresión ejercida por las

MSC sobre los LT activados son el TGF-β, el factor de crecimiento de los hepato-
citos (HGF, del inglés Hepatocyte Growth Factor), la prostaglandina E2 (PGE2), la
enzima indolamina-2,3-dioxigenasa (IDO), HLA-G5 e IL-10. Al parecer cada uno
de estos factores por si solo es capaz de inhibir, en cierto grado, la proliferación de
los LT activados. Las MSC cultivadas in vitro secretan de forma constitutiva algunas
de estas moléculas sin embargo, se ha observado que la presencia de citocinas
como el IFNg, incrementa las propiedades inmunosupresoras de las MSC al estimu-
lar la producción de IDO (44,45) e incrementar la producción de PGE2 (41).

Al parecer existe un mecanismo de retroalimentación entre los diferentes facto-

res inmunosupresores secretados por las MSC; se ha observado que la IL-10 estimu-
la la secreción de HLA-G5 por las MSC (44) además de que recientemente se de-
mostró la participación de otras moléculas como Jagged-1 (un ligando de Notch)
(46), galectina I (47), galectina-3 (48) y semaforina-3A (47). Además, se ha repor-
tado que TLR-3 y TLR-4 son capaces de regular las propiedades inmunosupresoras
de las MSC sobre los LT y que dicho efecto puede ser directamente sobre ellos o a
través de la interacción de otros componentes del sistema inmune, como las DC.
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

Las DCs son las células presentadoras de antígenos (CPAs) más importantes
del cuerpo, ellas se derivan del linaje mieloide de la médula ósea e in vitro se
pueden generar a partir de monocitos estimulados con GM-CSF e IL-4. La prin-
cipal función de estas células es el procesamiento y presentación de antígenos
a los linfocitos T vírgenes o de memoria que, al reconocer antígenos acoplados
a moléculas de histocompatibilidad en la superficie de las DC, inducen la ac-
tivación, proliferación y diferenciación de los LT. Una DC debe madurar para
ser capaz de activar a los LT y durante este proceso, incrementa la expresión
de MHC-I y MHC-II, moléculas co-estimuladoras de LT (CD80 y CD86) y otros an-
tígenos como CD1a y CD40. Se ha demostrado que una DC inmadura (iDC),
además de no activar a los LT, es capaz de inducir tolerancia inmunológica, es
decir que ante la presencia de un antígeno extraño, no se monte una respuesta
inmune adecuada para su eliminación. Diversas evidencias experimentales su-
gieren que las MSC, son capaces de afectar la función de las DC en tres niveles:
a) Inhiben la diferenciación de monocitos hacía DC; b) Mantienen el estado
inmaduro de las DC y c) son capaces de revertir a una DC madura (mDC, del
inglés inglés) hacia un estado inmaduro.

Las MSC disminuyen de forma significativa la diferenciación de monocitos a

DC, siendo al parecer la citocina involucrada es este proceso la IL-10 (49; 50).
132 Por otra parte, en la activación de iDC activadas en presencia de MSC, inhiben
la secreción de TNFα y alteran en la expresión de varios receptores y correcepto-
res necesarios para la captura y procesamiento de antígenos. Todo esto resulta
en la inhibición de la maduración de las DC, lo cual repercute de forma nega-
tiva en la capacidad de migración hacia ganglios linfáticos y en estimular a LT
(41,51). Así mismo, el co-cultivo de las MSC sobre mDC, disminuye la expresión
de HLA-DR, CD1a, CD80 y CD86, lo que sugiere que las MSC pueden inducir a
las DC hacía un estado inmaduro, con menor capacidad para estimular LT. La
proliferación de los LT CD4+ activados con aloantígenos, se inhibe completa-
mente en presencia de DC co-cultivadas con MSC, en parte debido a que estas
últimas, inhiben la secreción de IL-12 lo que está relacionado con inducción de
anergía y tolerancia de las células T (50).

Las MSC también son capaces de interactuar con células del sistema inmune
innato como las NK. Estas células participan en la defensa del cuerpo contra
infecciones y cáncer, ya que son capaces de lisar a las células infectadas o tu-
morales. Las células NK se caracterizan por la expresión del antígeno CD56 y por
la secreción de citocinas inmunorreguladoras como IFNg, TNFβ, IL-10 y GM-CSF,
además presentan actividad citotóxica sobre sus células blanco (52). Las MSC
afectan el fenotipo, proliferación, potencial citotóxico y secreción de citocinas
de las células NK. En varios estudios se ha observado que las MSC inducen una
disminución significativa en la proliferación, actividad lítica y secreción de IFNg
por células NK activadas con IL-2, IL-15 o aloantígenos (41,42,52,53). Así mismo,
las citocinas secretadas por células NK activadas como el IFNg, estimulan las
capitulo V Células troncales mesenquimales

propiedades inmnosupresoras de las MSC, dado que favorece la secreción de

moléculas como la IDO (54).

La función fisiológica de la inmunosupresión mediada por las MSC es algo difí-

cil de entender. Recientemente, se ha planteado que las células estromales tie-
nen una función inmunomoduladora in vivo, esto es al prevenir la activación in-
apropiada de LT, pero también al generar un ambiente tolerogénico durante la
reparación de heridas y terminar la respuesta inmune en el saneamiento de las
mismas. En este sentido, las células estromales entre ellas las MSC, participarían
en el mantenimiento de la homeostasis de la respuesta inmune. Esta hipótesis es
apoyada por los estudios de las propiedades inmunosupresoras de fibroblastos
de piel, que son similares a las observadas en MSC. Debido a las propiedades
inmunosupresoras de las MSC, aunado a su potencial de diferenciación son cé-
lulas atractivas para el desarrollo de protocolos de terapia celular.

CÉLULAS TRONCALES MESENQUIMALES Y TERAPIA CELULAR

La terapia celular con células troncales, se refiere al uso de las mismas para re-
generar o sustituir células o tejidos dañados y restaurar la función alterada por
causas que comprenden malformaciones congénitas, enfermedades y trauma-
tismos. Las células troncales pueden ser administradas vía torrente sanguíneo o
133
directamente en el tejido dañado (55).

Las MSC poseen cuatro propiedades biológicas que las hacen candidatos
especiales para emplearlas en la terapia celular: a) baja inmunogenicidad, b)
amplio potencial de diferenciación, c) capacidad de secretar factores que
favorecen la remodelación de tejidos y d) tienen propiedades inmunorregula-
doras. Debido a estas características son numerosos los padecimientos en los
que las MSC son potencialmente aplicables, entre los cuales se encuentran:
enfermedad injerto contra hospedero (EICH), enfermedades autoinmunes, pa-
decimientos de hueso, cartílago, riñón, pulmón, hígado, cardiovasculares y del
sistema nervioso (Figura 4).

Modelos en ratón muestran que las MSC administradas por vía intravenosa,
son capaces de injertar en varios órganos como el hígado, hueso, pulmón, riñón,
vaso, tracto gastrointestinal y páncreas. Además, diversos estudios en animales
han demostrado el efecto benéfico de las MSC en cada uno de los padeci-
mientos anteriormente mencionados y por esta razón ya se llevan a cabo en-
sayos clínicos que se encuentran en las fases I, II y III con resultados alentadores
referentes a la eficacia, viabilidad y seguridad en el uso de las MSC en humanos.
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

134
Figura 4. Aplicación de las MSC en terapia celular. Debido a las tres propiedades señaladas en la
figura, las MSC actualmente se aplican en trastornos de hueso, corazón, trasplante de HSC y EICH.
En el futuro podrían ser empleadas en otros padecimientos.

Soporte hematopoyético y enfermedad injerto contra hospedero

Las MSC se han empleado principalmente en el trasplante de HSC por dos ra-
zones: a) favorecen el injerto y aceleran la recuperación hematopoyética y b)
debido a sus propiedades inmunosupresoras, son capaces de prevenir y tratar
la EICH (56). La administración de MSC en pacientes pediátricos o adultos que
recibieron un trasplante de HSC es segura y no se observan efectos adversos o
tóxicos; además hay una recuperación más rápida de neutrófilos y plaquetas.
Los mecanismos a través de los cuales las MSC ejercen este efecto benéfico in
vivo son poco conocidos, ya que se ha demostrado que las MSC son capaces
de injertar en la MO, pero en bajo porcentaje, aunque debido a su potencial de
proliferación y diferenciación podrían ser suficientes para restablecer el estroma
medular responsable de la formación hematopoyética (56).

Después de un trasplante de HSC, la EICH se presenta cuando los LT del do-

nador reconocen a los antígenos histoincompatibles del receptor y montan una
respuesta inmune en contra de ellos; esto provoca daño tisular en diferentes ór-
ganos del paciente con manifestaciones clínicas graves que incluso pueden ser
capitulo V Células troncales mesenquimales

fatales. Varios estudios clínicos fase I y II han publicado que la administración de

MSC en niños o adultos es capaz de prevenir y atenuar los síntomas de la EICH
aguda, sin embargo al menos existen dos estudios en los cuales la administra-
ción de MSC no favorece la mejora de esta enfermedad. Estos resultados con-
tradictorios posiblemente se deban a diferencias en las condiciones de cultivo,
fuente de las MSC y número de células administradas. Para tratar de eliminar
estas variables, actualmente se están realizando ensayos clínicos con una pre-
paración universal de MSC llamada Prochymal® y ya existen dos ensayos uno
en adultos y otro en niños en los que se reporta la eficacia y seguridad de esta
preparación para el tratamiento de la EICH (57,58).

Enfermedades autoinmunes

Debido a sus propiedades inmunosupresoras las MSC son una opción para el
tratamiento de enfermedades autoinmunes, las cuales se caracterizan por el re-
conocimiento de antígenos propios y la subsecuente respuesta inmune contra los
tejidos y órganos del paciente. En las enfermedades autoinmunes, el daño puede
ser sistémico (lupus eritematoso sistémico) o dirigido a un órgano o tejido específi-
co, como el páncreas (diabetes tipo I), sistema nervioso central (esclerosis múltiple)
o articulaciones (artritis reumatoide). Estudios realizados en modelos animales han 135
probado la eficacia de las MSC en el tratamiento de estos padecimientos (59).

El lupus eritematoso es una enfermedad autoinmune crónica que afecta el

tejido conjuntivo. Se han realizado algunos ensayos clínicos para el tratamiento
de esta enfermedad con MSC de MO autólogas o alogénicas, e incluso con
MSC derivadas de SCU, dando por resultado la mejora de los pacientes sin ob-
servarse efectos colaterales graves (60, 61). Existe un ensayo clínico en proceso
para evaluar el uso de las MSC en lupus eritematoso sistémico refractario.

Por su parte, la diabetes tipo I se caracteriza por una reacción autoinmune

contra las células-β pancreáticas. Ensayos in vitro demostraron que las MSC son
capaces de diferenciarse hacia células pancreáticas productoras de insulina,
mientras que modelos experimentales en ratón indicaron que las MSC son ca-
paces de revertir la diabetes tipo I (62,63). Posteriormente, un ensayo clínico de-
mostró que la administración de MSC productoras de insulina derivadas de tejido
adiposo, resultó en la disminución de los requerimientos de insulina por parte de
los pacientes (64). Aunado a lo anterior, hay ensayos clínicos fase I, II y III en pro-
ceso, en los que se pretende evaluar la eficacia de las MSC autólogas, derivadas
de SCU o de la preparación Prochymal® en el tratamiento de la diabetes tipo I.

La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad inflamatoria crónica del sistema

nervioso central que se caracteriza por perdida de la mielina y daño axonal, mien-
tras que la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) afecta selectivamente a las neuro-
nas motoras en el cerebro y médula espinal. Estudios in vitro han mostrado que las
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

MSC son capaces de diferenciarse hacia tipos celulares con características de

neuronas, astrocitos y glia. En modelos animales con lesiones desmielinizantes, la
administración intravenosa o intracerebral de MSC, resulta en la disminución de la
inflamación y desmielinización. Un ensayo clínico en 34 pacientes con EM o ELA a
los que se les administraron MSC autólogas vía intratecal o intravenosa, demostró
que las MSC ejercen un efecto inmunomodulatorio inmediato, que puede favo-
recer la disminución de la inflamación en los pacientes (65). En otro estudio reali-
zado por Mazzini y cols. (66), quienes administraron MSC autólogas directamente
en la médula espinal de pacientes con ELA, se demuestra que no hay efectos
colaterales adversos y que el uso de las MSC es seguro. Hasta el momento estos
estudios no han mostrado mejora significativa de los pacientes tratados con MSC,
por lo que es necesario realizar más estudios clínicos. Al respecto, existen dos es-
tudios clínicos en proceso en el que se analiza la eficacia y seguridad de las MSC
autólogas o alogénicas en el tratamiento de la EM.

Regeneración de tejidos

Enfermedades cardiovasculares. El infarto agudo al miocardio se asocia con

muerte de los cardiomiocitos por apoptosis y necrosis. La escasa regeneración
136 del tejido cardiaco resulta en hipertrofia y fibrosis, lo cual eventualmente provo-
ca falla cardiaca. Modelos in vitro han mostrado que las MSC son capaces de
diferenciarse a cardiomiocitos; mientras que en estudios in vivo en roedores con
daño cardiaco, se ha observado que las MSC administradas por vía sistémica son
capaces de migrar al tejido dañado, mejorar la reparación del miocardio y favo-
recer la angiogénesis. El mismo efecto se observa cuando las MSC son administra-
das directamente al tejido dañado. Al parecer su efecto benéfico se debe princi-
palmente a su capacidad para secretar factores antiapoptóticos y angiogénicos
(27,56). La administración intracoronaria de MSC autólogas derivadas de MO en
pacientes con infarto agudo al miocardio resulta en mejora de la función cardia-
ca. El mismo resultado se observa en pacientes con cardiomiopatía isquémica
(56,67). De igual manera hay estudios clínicos fase I y II en proceso para analizar la
efectividad de las MSC en isquemia e infarto agudo al miocardio.

Hueso y cartílago. Existen varios estudios realizados en niños y adultos en los

que se ha demostrado la eficacia de la administración de MSC alogénicas o au-
tólogas para el tratamiento de enfermedades óseas. En niños, la administración
de MSC se utiliza para el tratamiento de la osteogénesis imperfecta, un padeci-
miento congénito en el que los pacientes muestran crecimiento retardado, fra-
gilidad y deformación de los huesos. En estos pacientes el tratamiento con MSC
resulta en la mejoría significativa de más del 50% de los pacientes tratados y se
demuestra que hay formación de hueso, disminución del número de fracturas e
incremento en la velocidad de crecimiento de los niños (68, 27).
capitulo V Células troncales mesenquimales

Existen algunos estudios en los que se han administrado MSC a pacientes

con osteartrosis, una enfermedad que se caracteriza por la degradación del
cartílago e inflamación de las articulaciones, sin embargo hasta el momento no
se ha observado mejoría significativa en pacientes, por lo que es necesario rea-
lizar más estudios (69). Al respecto hay dos estudios clínicos fase I y II en proceso,
que pretenden analizar la eficacia y seguridad de las MSC en el tratamiento de
esta enfermedad.

Futuras aplicaciones. Recientemente se han demostrado los efectos benéfi-

cos de las MSC en modelos experimentales de daño a pulmón provocado por
bacterias y endotoxinas. Debido a estos resultados favorables, se han iniciado
estudios clínicos para el tratamiento de varios padecimientos del pulmón con
MSC (56). Así mismo, estudios pre-clínicos han mostrado el efecto benéfico de
las MSC en padecimientos del riñón e hígado, por lo que están en proceso los
estudios clínicos a mayor escala para evaluar el efecto de las MSC. En el caso
del riñón, se está realizando un ensayo clínico en pacientes con falla renal agu-
da. Por su parte, hay dos ensayos clínicos en proceso que pretenden evaluar la
eficacia de las MSC derivadas de sangre de cordón umbilical, en pacientes con
falla del hígado o cirrosis hepática.

137
Conclusiones

La investigación en MSC ha tenido mucho auge en los últimos años y en parte

se ha debido a la facilidad de su obtención y a su capacidad para ser diferen-
ciadas a distintos tipos celulares. No obstante lo factible que resulta su mani-
pulación, aún se tienen muchas preguntas relacionadas con el potencial para
dar lugar a la formación de la variedad de tipos celulares descritos, sobre todo
en aquellas MSC provenientes de fuentes alternativas a la MO. Tenemos una
comprensión limitada de las funciones biológicas que tienen en el organismo y
su participación en condiciones fisiológicas alteradas y particularmente en la re-
paración de tejidos. Hemos avanzado en el conocimiento de su capacidad de
soporte hematopoyético y de inmunosupresión; sin embargo, su potencial de
regeneración se ha visto limitado a las observaciones que se tienen después de
su administración en modelos animales y en algunos pacientes y de hecho se le
atribuye en mayor medida, a la capacidad que tienen para secretar factores
tróficos que disminuyen la respuesta inflamatoria y que favorecen la prolifera-
ción y diferenciación de las células troncales y progenitoras propias del tejido en
reparación, más que a su capacidad de diferenciación. Con ello, si nos damos
cuenta, mucho del conocimiento de las MSC ha surgido en una forma poco
ortodoxa, dado que hemos forzado la investigación hacia el conocimiento de
los mecanismos celulares y moleculares del potencial biológico de estas células,
solo después de observar sus efectos benéficos in vivo. Como hemos visto, es
amplio el potencial de aplicación de las MSC, pero son necesarios más estudios
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

básicos para entender la biología de estas células y mejorar su aplicación clíni-

ca. La posibilidad de que las MSC se distingan por ser de las pocas células con
la capacidad de monitorear el microambiente de tejidos dañados y responder
apropiadamente, está latente.

Agradecimientos

Este trabajo ha sido financiado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología

CONACyT (CB-2006-C01-61274; SALUD-2008-C01-87183) y por la Coordinación
de Investigación en Salud del IMSS (FIS/IMSS/PROT/C2007/062). Martha Elena
Castro es becario CONACyT 98013 y becario IMSS 2010128.

138
capitulo V Células troncales mesenquimales

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Capítulo VI

El sistema hematopoyético a partir de células troncales

Rosana Pelayo & Eduardo Vadillo

RESUMEN

Las células troncales hematopoyéticas son el origen de todas las estirpes celula-
res que integran el tejido sanguíneo. El conocimiento de su naturaleza biológica
y de la organización y regulación de las vías de diferenciación que utilizan para
el continuo reabastecimiento celular ha tenido notables avances en los últimos
años y ha alentado la intensa búsqueda de su aplicación en el desarrollo de
nuevos métodos terapéuticos. Así mismo, la caracterización de los progenitores
primitivos que dan origen a los programas linfoide y mieloide, y la definición de
los patrones de actividad transcripcional que controlan las decisiones del linaje
han permitido dibujar mapas de diferenciación hematopoyética basados en
la existencia de jerarquías celulares. Dichos mapas constituyen, hoy por hoy, los
mejores modelos para el entendimiento de procesos básicos que ocurren du-
rante la embriogénesis, la regeneración de tejidos y el desarrollo de plasticidad.

INTRODUCCIÓN

Célula troncal es el término comúnmente usado para describir a una célula

primitiva y funcional capaz de producir múltiples tipos celulares a través de su
diferenciación, y de mantener su actividad de autorrenovación mediante la
duplicación, sin pérdida del potencial de desarrollo. Como ha sido mencionado
en el primer capítulo de este libro, las células troncales pueden ser categoriza-
das en tres tipos: células troncales totipotenciales, células troncales pluripoten-
ciales y células troncales multipotenciales. Estas últimas son el origen de diversos
tejidos especializados, incluyendo el hematopoyético, endotelial, mesenquimal
y neural, entre otros. El sistema hematopoyético es derivado del mesodermo y
se encuentra organizado jerárquicamente en células troncales, células progeni-
toras, células precursoras y células maduras funcionales que mantienen el tejido
sanguíneo a través de un complejo proceso llamado hematopoyesis.

La hematopoyesis es iniciada por una población única de células troncales

hematopoyéticas (HSC, del inglés Hematopoietic Stem Cells), la cual reside prin-
cipalmente en el hígado en la vida fetal y en la médula ósea (MO) a partir del
nacimiento. Su diferenciación continua es estrictamente regulada y crucial para
la producción balanceada de progenitores y precursores, y el reabastecimiento
de todas las células de la sangre a lo largo de la vida. Las células sanguíneas han
sido clasificadas en dos linajes o estirpes: linfoide y mieloide. El linaje linfoide con-
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

siste de células B, células T, células asesinas naturales (NK, del inglés Natural Killer) y
algunas categorías de células dendríticas (DC, del inglés Dendritic Cells), mientras
que el linaje mieloide incluye a los granulocitos (neutrófilos, eosinófilos y basófilos),
monocitos, macrófagos, eritrocitos, megacariocitos, células cebadas y otras ca-
tegorías de DC. De acuerdo a esta clasificación, las rutas de desarrollo linfoide y
mieloide se han representado tradicionalmente como una serie de opciones bi-
narias, que son el resultado de la combinación de factores intrínsecos y microam-
bientales que impulsan la pérdida gradual de opciones de diferenciación en los
progenitores, en paralelo con la adquisición de funciones especializadas en los
precursores más comprometidos que dan origen a las células maduras.

La importancia clínica de la hematopoyesis ha inspirado su investigación con-

tinua, tal que en los últimos 20 años hemos sido testigos de dramáticos avances
tanto en el conocimiento de las bases celulares y moleculares que la regulan,
como en el establecimiento de poderosos modelos de estudio.

EL DESCUBRIMIENTO DE LAS CÉLULAS TRONCALES HEMATOPOYÉTICAS Y LA GENE-

RACIÓN DEL SISTEMA SANGUÍNEO

“El descubrimiento de las células troncales hematopoyéticas ha sido uno de

144 los más importantes descubrimientos científicos de la historia, tan fundamen-
tal como la definición de la doble cadena del DNA por Watson y Crick y tan
intenso como el hallazgo de un nuevo planeta…” (Tak Mak y Mark Minden,
tributo a Till y McCulloch ‘Legacy’, 2011).

La teoría unitaria de la hematopoyesis fue inicialmente proclamada por el médico

científico Alexander Maximow en 1909, quien fundamentalmente a partir de ob-
servaciones al microscopio sugirió que todas las células maduras de la sangre pro-
venían de una célula precursora linfoide común —el hemocitoblasto— y dibujó los
primeros esquemas jerárquicos de la diferenciación hematopoyética. Poco más
de medio siglo después, en 1961, el hallazgo experimental de James Till y Ernest
McCulloch demostró contundentemente que el sistema hematopoyético deriva
de una célula troncal multipotencial (1-3). Tras la inyección intravenosa de célu-
las de MO a ratones que habían sido letalmente irradiados, estos investigadores
observaron la formación de nódulos macroscópicos en el bazo de los animales
sacrificados a los 10-11 días post-trasplante. Dichos nódulos eran de un aspecto
oval y grisáceo, y contenían grandes cantidades de células hematopoyéticas eri-
troides, mieloides y megacariocíticas. La correlación entre el número de células
inyectadas y el número de nódulos era compatible con la idea de que células
únicas y seminales en la MO eran responsables de cada nódulo observado en
el bazo, pero la identidad de tales células era incierta en ese momento, por lo
que las llamaron simplemente Unidades Formadoras de Colonias en el Bazo (CFU-
S del inglés Colony Forming Units-Spleen). Los subsecuentes años fueron clave en
el talentoso laboratorio McCulloch para demostrar no solo el origen clonal de la
capitulo VI El sistema hematopoyético a partir de células troncales

hematopoyesis, sino también para establecer los principios básicos bajo los cuales
se definen hasta nuestros días las células troncales: autorrenovación y potencial de
diferenciación múltiple. Interesantemente, también fue propuesto por primera vez
el concepto del control estocástico (al azar) de la autorrenovación, así como la
existencia de tres compartimientos principales en el sistema hematopoyético (4):

1. El compartimiento de las células troncales de extensa proliferación, capaces

de dar lugar a nuevas células troncales y también a células diferenciadas.

2. El compartimiento de células diferenciadas tempranas, con limitada ca-

pacidad proliferativa, pero capaces de producir células diferenciadas.

3. El compartimiento de células especializadas, como los eritrocitos, cuyas

funciones son esenciales para la vida.

A partir de entonces, y como resultado de la intensa investigación biomédica,

este modelo de la hematopoyesis se ha modificado y reconstruido cada vez que
un descubrimiento de alta envergadura descifra aspectos adicionales de su or-
ganización o funcionamiento. Por ejemplo, el desarrollo de ensayos funcionales
cuantitativos por Pluznik y Sachs, y Bradley y Metcalf para la evaluación in vitro de
las células progenitoras, hizo posible describir con precisión las relaciones precur-
sor-producto que existen a lo largo de las vías de diferenciación, y definir impor-
tantes factores de crecimiento estrictamente requeridos por las células primitivas
145
(2,3). El conocimiento actual de la biología de las HSC y del desarrollo del sistema
hematopoyético proviene, en gran medida, de la investigación en modelos de
ratón, debido a la posibilidad que ofrecen éstos de llevar a cabo experimentos
in vivo para demostrar la actividad precursora de diversas poblaciones celulares,
así como a la creciente disponibilidad de ratones genéticamente modificados,
los cuales se han convertido en un instrumento básico para la elucidación de
los mecanismos que participan en las diversas vías de diferenciación. El adve-
nimiento de poderosas tecnologías como la citometría de flujo y los sistemas de
xenotrasplantes (los cuales serán revisados en la última sección de este capítulo)
han permitido sub-fraccionar a la MO de una forma tan precisa que ahora com-
prendemos que el compartimiento ‘1’ propuesto por McCulloch es heterogéneo
y contiene, además de progenitores CFU-S, células troncales más primitivas, las
cuales son muy escasas pero identificables por su fenotipo y sus atributos especia-
les de quiescencia (es decir, fuera del ciclo celular) y capacidad de reconstituir a
largo plazo todos los linajes hematopoyéticos, incluyendo el linfoide (2,3).

No hay duda de que Till y McCulloch han hecho a la humanidad una con-
tribución única. El descubrimiento de las células troncales en el sistema hema-
topoyético fue la piedra angular que revolucionó la biología celular, inició un
fascinante campo de investigación e inspiró el desarrollo de nuevas formas de
curar el cáncer y regenerar tejidos. A 50 años de su trabajo inicial, éste ha tras-
cendido en magnitud tal que millones de pacientes alrededor del mundo sobre-
viven ya a neoplasias hematológicas y otras patologías.
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

ESTRUCTURA JERÁRQUICA DEL SISTEMA HEMATOPOYÉTICO

El tejido sanguíneo contiene más de 10 tipos distintos de células maduras que son
producidas continuamente y a una velocidad mayor de un millón de células por
segundo. Sorprendentemente, todas ellas derivan de células troncales comunes
que no se encuentran en alta proliferación. ¿Cómo se puede explicar que un
tejido esencial para la vida y con semejante diversidad celular sea sostenido a lo
largo de ésta solamente por un pequeño grupo de células “semi-dormidas”?

El aislamiento de subpoblaciones hematopoyéticas basado en marcadores

celulares, seguido del análisis de sus potenciales de diferenciación, han indica-
do la existencia de una estructura jerárquica en el desarrollo hematopoyético,
en la cual la multipotencialidad es progresivamente restringida (5-7). De acuer-
do a ello, se han identificado cinco compartimientos: el de las células troncales,
el de los progenitores multipotenciales, el de los progenitores oligopotenciales,
el de los precursores y el de las células maduras (Figura 1).

146
capitulo VI El sistema hematopoyético a partir de células troncales

147

Figura 1. Modelo actual de la estructura jerárquica en el sistema hematopoyético del ratón y el huma-
no. La célula troncal hematopoyética es la de mayor jerarquía, y a partir de ella, la diferenciación gra-
dual de los progenitores multipotenciales da lugar a la producción de progenitores oligopotenciales
que generan células comprometidas a los programas mieloide o linfoide. Una vez que se producen las
células maduras, éstas son exportadas a la periferia. HSC, célula troncal hematopoyética; MPP, pro-
genitor multipotencial; LMPP, progenitor multipotencial predispuesto al linaje linfoide; ELP, progenitor
linfoide temprano; CLP, progenitor linfoide común; CMP, progenitor mieloide común; MEP, progenitor
de megacariocitos y eritrocitos; GMP, progenitor granulocítico y monocítico; MDP, progenitor de ma-
crófagos y células dendríticas; MLP, progenitor multilinfoide; B/NK, progenitor de células B y NK.
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

El primer compartimiento corresponde a las células más primitivas, las HSC.

Como se ha mencionado anteriormente, estas células tienen dos características
que las distinguen: son capaces de autorrenovarse (al dividirse, por lo menos una
de las células hijas conserva las propiedades de la célula madre), y son multipo-
tenciales (dan origen a los distintos linajes sanguíneos) (6). Su aptitud clonal para
reconstituir a largo plazo el sistema hematopoyético de animales de experimenta-
ción irradiados e inmunodeficientes, les ha merecido el nombre de HSC de largo
plazo (LT-HSC, del inglés Long Term-Hematopoietic Stem Cells). Estas células corres-
ponden a menos del 0.01% del total de células nucleadas en la médula ósea. En
el ratón, virtualmente todas las LT-HSC, así como los progenitores multipotenciales
(MPP, del inglés Multi-Potent Progenitor) y la mayoría de los oligopotenciales residen
en una fracción que constituye aproximadamente el 0.1% del total celular de la
MO y es llamada LSK (Lin-Sca-1+c-kithi) porque carecen de expresión de marcado-
res de linaje específicos (como CD3, CD8, CD19, CD20, CD33, CD13, CD11b, Gr1,
NK1.1 o DX5, TER119, etc), pero expresan en membrana la molécula Sca-1 y una
alta densidad de c-kit (CD117) (Tabla 1) (8,9). Algunos otros marcadores, como
CD34, Thy1.1 y SLAM, han sido de utilidad en el rastreo de la progresión de HSC a
los progenitores multipotenciales (10). En humanos, el antígeno CD34 ha resultado
el principal marcador para las HSC y los progenitores multi y oligopotenciales. De
las células hematopoyéticas en médula ósea, el 0.5-5% expresan CD34, y solo una
148 pequeña fracción (1-10%) de las células CD34+ que no expresan marcadores de
linaje maduros (Lin-) como CD3, CD8, CD19, CD20, CD56, CD11b, CD14 o glicofo-
rina A, ni CD38, está enriquecida en células troncales con capacidad de reconsti-
tuir a largo plazo el sistema hematopoyético y/o de iniciar cultivos a largo plazo (6).
Estas células expresan además antígenos como CD90, CD117, CD133 y VEGFR2,
que las distinguen de células en estadios de diferenciación más avanzados.

Las HSC dan origen a los progenitores multipotenciales que conforman el se-
gundo compartimiento, y el más heterogéneo del sistema. En éste, todos los
progenitores han perdido la capacidad de autorrenovación y por lo tanto la
de reconstitución del sistema hematopoyético a largo plazo. Sin embargo, al-
gunos de ellos, como los MPP, todavía conservan la propiedad de diferenciarse
a todos los linajes sanguíneos, mientras que sus descendientes han restringido
sus potenciales de diferenciación y experimentan paralelamente cambios en
sus fenotipos que los distinguen de las células más primitivas. Como revisaremos
en secciones posteriores de este capítulo, es posible que los progenitores mul-
tipotenciales predispuestos al linaje linfoide (LMPP) del ratón tengan su contra-
parte exacta en los progenitores multi-linfoides (MLP, del inglés Multi-Lymphoid
Progenitor) recientemente descritos en humanos. Sin embargo, tanto este para-
lelismo, como la búsqueda de la contraparte del progenitor linfoide temprano
(ELP, del inglés Early Lymphoid Progenitor) humano constituyen aún piezas de
investigación en progreso (Figura 1 y Tabla 1).
capitulo VI El sistema hematopoyético a partir de células troncales

TABLA 1. Propiedades de las células troncales y progenitores hematopoyéticos.

RATON HUMANO

PROG FENOTIPO POTENCIAL PROG FENOTIPO POTENCIAL

Lin- CD34+ CD38-

Lin- ckithi Sca1+ Flk2- Todos los
HSC Todos los linajes HSC CD90+ CD45RA-
CD34- Slamf1+ linajes
CD133+

Lin- ckithi Sca1+ Flk2- Lin- CD34+ CD38- Todos los

MPP Todos los linajes MPP
CD34+ Slamf1+ CD90- CD45RA- linajes

Lin- CD34+ CD38-

Lin- ckit+ Sca1+ Flk2+ Mieloide, B, T, Mieloide, B, T,
LMPP MLP CD90-/lo CD45RA+
CD34+ Slamf1- NK, DC NK, DC
Flt3+ CD7-/lo CD10+

Mieloide (débil),
Lin- ckithi Sca1+ Flk2+
ELP B, T, NK, DC, _ _ _
RAG1+
pDC

Lin- CD34+ CD38+

Lin- ckitlo Sca1+ IL- B, T, NK, DC, 149
CLP B-NK CD90- CD45RA+ B, NK
7Ra+ CD27+ pDC
Flt3+ CD10+

Lin- CD34+ CD38+

Lin- ckit+ Sca1- Erit, Plaq, Gran, Erit, Plaq, Gran,
CMP CMP CD123lo CD45RA-
CD34+ FcgRlo Mac, DC Mac, DC
Flt3+ CD90-

Lin- CD34+ CD38+

Lin- ckit+ Sca1- CD34-
MEP Erit, Plaq MEP CD123- CD45RA- Erit, Plaq
FcγR-
Flt3- CD90-

Lin- CD34+ CD38+

Lin- ckit+ Sca1- CD34+
GMP Gran, Mac, DC GMP CD123+ CD45RA+ Gran, Mac, DC
FcγR+
CD90-

Río abajo, la vía avanza de progenitores multipotenciales hacia los progenitores

oligopotenciales, representados en el ratón por los progenitores linfoides comunes
(CLP, del inglés Common Lymphoid Progenitor), los progenitores mieloides comunes
(CMP, del inglés Common Myeloid Progenitor), los progenitores eritroides y megaca-
riocíticos (MEP, del inglés Megakaryocytes and Erythrocytes Progenitor), los proge-
nitores de granulocitos y monocitos (GMP, del inglés Granulocytes and Monocytes
Progenitor) y los progenitores de macrófagos y células dendríticas (MDP, del inglés
Macrophages and Dendritic Progenitor). Excepto por el CLP, la contraparte de to-
dos ellos ha sido demostrada en humanos (Figura 1). En este tercer compartimiento,
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

la mayoría de los progenitores han incrementado su capacidad de proliferación,

pero sus potenciales de diferenciación se restringen a 2 ó 3 tipos celulares. Aunque
comparten ciertas características fenotípicas con las células de los compartimien-
tos anteriores, estos progenitores presentan patrones de expresión antigénica de
acuerdo al programa de diferenciación que están iniciando (Tabla 1).

Colectivamente los progenitores oligopotenciales dan lugar al comparti-

miento de células precursoras comprometidas a linaje, unipotenciales y con
alta capacidad proliferativa. A pesar de su inmadurez, estas células son ya re-
conocibles por su morfología a través de microscopía de luz. En total, las células
precursoras constituyen más del 90% de las células hematopoyéticas residentes
en la cavidad de la MO (6).

Finalmente, al madurar, los precursores hematopoyéticos generan a las cé-

lulas sanguíneas circulantes (quinto compartimiento). Las células maduras son
morfológica, fenotípica y funcionalmente distintas, y se dividen en dos grandes
grupos: mieloides y linfoides. Las primeras comprenden a los granulocitos (neu-
trófilos, basófilos y eosinófilos), monocitos, macrófagos, eritrocitos, megacario-
citos, células cebadas y células dendríticas, mientras que las segundas com-
prenden a los linfocitos B, linfocitos T, células NK y algunas categorías de células
dendríticas. Las células de linaje mieloide son producidas a través de un proceso
150 dinámico conocido como mielopoyesis, en tanto las de linaje linfoide son con-
secuencia de la linfopoyesis. Dentro de la linfopoyesis, la generación de los linfo-
citos T tiene características especiales. Aunque también resulta de un programa
jerárquico, éste tiene su inicio en la MO y progresa en el timo, una vez que son
importados a este órgano los progenitores multipotenciales (ver adelante la sec-
ción de Linfopoyesis-Desarrollo de células T).

En resumen, el mantenimiento de la jerarquía hematopoyética, así como el

balance preciso entre la proliferación y la diferenciación de las células en los
diferentes compartimientos explican la alta eficiencia de producción celular,
y son cruciales para el continuo funcionamiento del sistema. Los resultados de
la comparación ratón-humano indican que esencialmente la organización je-
rárquica del sistema y sus componentes son conservados entre los mamíferos, y
solo son los inmunofenotipos celulares —es decir, el conjunto de sus característi-
cas antigénicas— los que muestran cambios entre especies.

LA DIFERENCIACIÓN MIELOIDE O MIELOPOYESIS

En mamíferos, el aporte de oxígeno, la cicatrización después de una hemorragia,

así como la defensa oportuna contra microorganismos patógenos, son tareas que
competen a los eritrocitos, a las plaquetas, y a la serie granulocítica/monocítica,
respectivamente. El abastecimiento de éstas y otras importantes categorías celula-
res dentro del linaje mieloide se origina en la MO y es el resultado de la mielopoyesis.
capitulo VI El sistema hematopoyético a partir de células troncales

La mielopoyesis da inicio con la diferenciación de los progenitores multipo-

tentes (MPP) a los progenitores mieloides comunes (CMP), los cuales tienen
una gran capacidad proliferativa y poseen más del 98% de la actividad for-
madora de colonias mielo-eritroides de la MO (ver sección de Sistemas de es-
tudio de las HSC). En humanos, los CMP son identificados por su fenotipo Lin-
CD34+CD38+CD90-CD45RA-Flt3+CD7-CD10-CD123low, mientras que su contraparte
murina reduce la expresión de Sca-1 pero adquiere de manera gradual los re-
ceptores para fracciones cristalizables de las inmunoglobulinas (FcgR) (Tabla 1).
Los CMP constituyen la fuente principal de progenitores comprometidos a la
producción de granulocitos y macrófagos (GMP) y los (MEP) (Figura 1). Todo
parece indicar que cronológicamente la primera bifurcación que ocurre en la
ruta de diferenciación mieloide es la de la producción de eritrocitos y megaca-
riocitos (11,12). La ruta descrita de esta manera corresponde al modelo clásico
y vigente de la hematopoyesis, que supone la segregación de MEP y GMP a
partir de CMP. Sin embargo, esta teoría ha sido cuestionada recientemente por
la identificación y caracterización del MLP en el humano, el cual constituye una
población presumiblemente dentro de la fracción de las HSC (Lin-CD34+CD38-)
(13). Por su fenotipo, este progenitor se identifica como Lin-CD34+ CD38-CD90-/
low
CD45RA+Flt3+CD7-/+CD10+; mientras que por sus atributos funcionales, se le re-
conoce por su eficiencia para dar origen a células B, células T y células NK, así
como a monocitos/macrófagos y células dendríticas; y por carecer de poten- 151
cial de diferenciación a granulocitos (Figura 1). Sorprendentemente, éste sería
uno de los pocos aspectos sugerentes de que la segregación de la rama linfoi-
de y mieloide en el humano difiere de la del ratón.

La maduración posterior a cada uno de los linajes hematopoyéticos está defi-

nida por la pérdida gradual del potencial de diferenciación múltiple y la adquisi-
ción de una identidad y función definitivas. En estos eventos, los programas gené-
ticos y los factores de crecimiento y citocinas tienen una participación decisiva.

Diferenciación eritroide-megacariocítica

Los progenitores eritroides más primitivos son denominados unidades formado-

ras de brotes eritroides (BFU-E, del inglés Burst Forming Units-Erythroid), los cuales
mantienen una alta tasa de proliferación en respuesta a citocinas; mientras que
los progenitores eritroides más maduros, llamados unidades formadoras de colo-
nias eritroides (CFU-E) tienen un limitado potencial de proliferación. Estos proge-
nitores dan origen en forma secuencial a precursores como los pro-eritroblastos,
eritroblastos basófilos, eritroblastos policromatófilos, eritroblastos ortocromáticos
y los reticulocitos, que a su vez dan lugar a los eritrocitos (6). A lo largo de esta
ruta de diferenciación, la eritropoyetina (EPO) actúa como una de las principa-
les citocinas reguladoras, promoviendo la proliferación de las BFU-E y la sobre-
vivencia y diferenciación de las CFU-E. Además de la EPO, citocinas como la
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

interleucina 3 (IL-3), la trombopoyetina (TPO), el ligando de la tirosina fetal 3 (Flt3-

L) y el factor de células troncales (SCF, del inglés Stem Cell Factor) participan
también en la eritropoyesis, sinergizando la actividad reguladora de EPO (6,14).

Por su parte, los progenitores megacariocíticos más tempranos son definidos

como células formadoras de brotes megacariocíticos (meg-BFC, del inglés Me-
gakaryocyte-Burst Forming Cells), los cuales son responsables de la formación
de progenitores tardíos o células formadoras de colonias de megacariocitos
(meg-CFC, del inglés Megakaryocyte-colonies Forming Cells). El inicio de endo-
rreplicación en ellos (replicación de DNA sin división nuclear) conduce a la ge-
neración de precursores poliploides o megacariocitos inmaduros, quienes una
vez que desarrollan un citoplasma maduro dan lugar a megacariocitos madu-
ros y eventualmente a las plaquetas. A lo largo de este proceso, el elemento
regulador clave es la TPO, ya que promueve el crecimiento de los meg-CFC,
incrementa la tasa de endocitosis y estimula la diferenciación de megacarioci-
tos maduros. Algunas otras citocinas importantes en la vía son la interleucina-3
(IL-3), la interleucina 6 (IL-6) y la interleucina 11 (IL-11).

Diferenciación granulo-monocítica
152
En esta vía de diferenciación, las unidades formadoras de colonias granulo-
monocíticas (CFU-GM, del inglés Colony Forming Units-Granulocyte Monocyte)
dan origen a unidades formadoras de colonias granulocíticas (CFU-G, del in-
glés Colony Forming Units-Granulocyte) y a unidades formadoras de colonias
monocíticas (CFU-M, del inglés Colony Forming Units-Monocyte). Las CFU-G se
diferencian secuencialmente a mieloblastos, pro-mielocitos, mielocitos, meta-
mielocitos y células maduras (neutrófilos, eosinofilos y basófilos), mientras que
las CFU-M a monoblastos, promonocitos, monocitos y finalmente macrófagos.
Estudios recientes han sugerido la existencia de un progenitor intermedio que
deriva directamente del GMP y es común para macrófagos y células dendríti-
cas (MDP) (13,15). En humanos, el MDP puede también provenir de la población
de MLP descrita anteriormente (Figura 1). Presumiblemente este MDP constituye
un progenitor temprano de las CFU-M.

A lo largo de la ruta granulo-monocítica participan un amplio número de

citocinas y factores de crecimiento, entre los que destacan el factor estimula-
dor de colonias de granulocitos y monocitos (GM-CSF, del inglés Granulocyte
and Monocyte-Colony Stimulating Factor), el factor estimulador de colonias de
granulocitos (G-CSF, del inglés Granulocyte-Colony Stimulating Factor), el factor
estimulador de colonias de monocitos (M-CSF, del inglés Monocytes-Colony Sti-
mulating Factor), la IL-3, la IL-6 y el SCF. Los factores estimuladores de colonias
inducen la sobrevivencia y proliferación de las células progenitoras, mientras
que las citocinas como el SCF promueven el crecimiento de las HSC y los proge-
capitulo VI El sistema hematopoyético a partir de células troncales

nitores, y tienden a tener un mayor efecto cuando actúan en combinación con

los factores de crecimiento (6). Existe también un número de factores que inhi-
ben la mielopoyesis, como es el caso del factor de necrosis tumoral-a (TNFa, del
inglés Tumor Necrosis Factor-a), el factor de crecimiento transformante b (TGF-b,
del inglés Transforming Growth Factor β) y los interferones (IFN), entre otros (16).

LA DIFERENCIACIÓN LINFOIDE O LINFOPOYESIS

Durante la ontogenia y a lo largo de la vida adulta, la producción de las células

encargadas de la respuesta inmune, es un proceso dinámico y complejo, en el
cual la diferenciación de los progenitores tempranos comienza a ser activada
mucho antes de que se haya adquirido el compromiso de linaje. Los eventos
que inician el programa de diferenciación linfoide están controlados, una vez
más, por un concierto de factores de transcripción (FT) y señales microambien-
tales que culmina en la restricción funcional de las células maduras (17,18).

Los progenitores linfoides

La población de LMPP en la MO del ratón contiene progenitores clonales con 153

potencial para producir células T, B, NK, y dendríticas (19). A lo largo de su pro-
greso, la transcripción del locus de la enzima que recombina los segmentos ge-
néticos VDJ de la inmunoglobulina y del receptor de células T, la recombinasa
RAG1, marca a las células que apenas inician el programa de diferenciación
hacia la estirpe linfoide (20). La actividad de la recombinasa RAG1 es esencial
en el desarrollo del sistema linfoide, por lo que los ratones ‘knock-in RAG1/GFP’
han sido una herramienta particularmente útil en la investigación del proceso
de linfopoyesis temprana (20-22), y han permitido el aislamiento de los proge-
nitores linfoides más tempranos de los que se tiene conocimiento: los ELP. En di-
cho modelo, un alelo del gen RAG1 ha sido reemplazado por la secuencia que
codifica la proteína verde fluorescente, de tal manera que es posible localizar
la señal de fluorescencia verde por análisis de citometría de flujo en aquellas cé-
lulas que estén transcribiendo el gen RAG1, incluyendo a los ELP y toda su des-
cendencia. Los ELP dan origen a los progenitores linfoides comunes o CLP, que
son reconocidos como los más eficientes productores de linfocitos B y células NK
en la MO; y son los candidatos más probables para la colonización del timo y la
iniciación de la linfopoyesis de células T. Además, los ELP contribuyen sustancial-
mente a la producción de células de la respuesta inmune innata, como lo son
las células dendríticas convencionales (cDC, del inglés conventional Dendritic
Cells), las células dendríticas plasmacitoides (pDC, del inglés plasmacytoid Den-
dritic Cells), y las células dendríticas asesinas productoras de interferón (23-25).
Río abajo, los CLP expresan en la superficie el receptor de IL-7 (IL-7R, del inglés
IL-7 Receptor), el cual es su distintivo, y aunque muestran actividad progenitora
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

para T, B y NK (lo que originalmente les valió su designación), son bien reconoci-
dos como los más eficientes precursores de linfocitos B (22,26,27).

En humanos, gran parte del conocimiento acerca de los progenitores linfoides y

el desarrollo temprano del sistema linfopoyético se deriva de estudios in vitro, y en
menor grado, de la contribución de algunas anormalidades genéticas y modelos
quiméricos. Aún cuando los fenotipos de la superficie celular que caracterizan a
los progenitores son distintos de sus contrapartes murinas, todo parece indicar que
la via de diferenciación linfoide es también consistente con los principios delinea-
dos en el ratón (7,28). Tanto en la MO como en la sangre de cordón umbilical del
ser humano una variedad de progenitores multipotentes residen en la fracción ce-
lular que no expresa en la superficie de la membrana ningún marcador de célula
sanguínea madura, pero expresa CD34. La aparición de la molécula CD10 es uno
de los eventos que distinguen a los progenitores linfoides. Los MLP recientemente
identificados por John Dick en la Universidad de Toronto, Canadá, muestran un
fenotipo muy inmaduro y dan lugar a todos los tipos celulares linfoides (T, B y NK),
además de macrófagos y DC (Figura 1 y Tabla 1). La contraparte en humanos del
ELP murino aún no ha sido identificada con precisión, como tampoco lo ha sido
un progenitor ‘común’ como el CLP. No obstante, es perfectamente identificable
un progenitor B/NK que expresa CD38, CD45RA y CD10, y tiene un alto potencial
154 de diferenciación a linfocitos B y células NK (13).

Diferenciación de células B y NK

Haciendo uso de citometría de flujo multiparamétrica (ver sección ‘Sistemas de

estudio de las HSC’), en 1991 Hardy identificó las principales subpoblaciones con
compromiso de linaje B en la MO del ratón y propuso un esquema secuencial de
diferenciación río abajo de las CLP (29). El compartimiento celular más primitivo
fue denominado Fracción A y contiene células Pre-proB, las cuales expresan ge-
nes linfoides, despliega IL-7R en membrana y constituye la conexión entre las CLP
y el estadio Pro-B. A partir de las células Pro-B, la expresión de CD19 es la marca
definitiva del compromiso irreversible al linaje B. A lo largo de este proceso de
diferenciación, las señales de IL-7 son críticas para la actividad de los FT y la ex-
presión de las inmunoglobulinas en membrana que distinguen a los linfocitos B.

En humanos, a partir del posible CLP o progenitor B/NK se derivan las célu-
las Pro-B con fenotipo CD34+CD19+CD10+ y de ahí secuencialmente las Pre-BI
grandes CD34+CD19+CD10+, Pre-BII grandes CD34-CD19+CD10+, Pre-BII pequeñas
CD34-CD19+CD10+, B inmaduras CD34-CD19+CD10+sIgM+ hasta la producción de B
maduras CD34-CD19+CD10-sIgM+sIgD+, que eventualmente serán exportadas a los
tejidos linfoides periféricos para cumplir su función de reconocimiento de antíge-
no, activación y producción de anticuerpos específicos (6,28). La linfopoyesis de
B en humanos parece cumplirse sin el estricto requerimiento de la IL-7, y hasta el
momento se desconocen los factores de crecimiento y/o citocinas que la dirigen.
capitulo VI El sistema hematopoyético a partir de células troncales

Por su parte, los tres estadios que definen el proceso completo —el compro-
miso de linaje, la selección del repertorio de receptores NK y la maduración fun-
cional— son críticamente dependientes de la interleucina 15, la cual mantiene
la viabilidad y sostiene la proliferación de las células en desarrollo (30).

Diferenciación de células T

El timo es el sitio principal para la producción de linfocitos T; sin embargo, no con-

tiene ni produce progenitores de renovación autóloga, por lo que la linfopoyesis
de T es mantenida por la importación periódica de progenitores hematopoyéti-
cos a través de la corriente sanguínea (31). Aunque a múltiples progenitores se
les reconoce cierto potencial para generar células T bajo circunstancias experi-
mentales, no todos ellos tienen la propiedad de establecerse en este órgano. De
las categorías de progenitores linfoides identificados en la médula ósea, los que
exhiben robusta capacidad de colonizar el timo se encuentran en la fracción de
LMPP/ELP que expresan el receptor de quimiocina CCR9 (32). En timo, los proge-
nitores tempranos de timocitos (ETP, del inglés Early Thymocytes Progenitors), de-
rivados de los progenitores colonizadores, inician la diferenciación de los timoci-
tos. Los timocitos pueden subdividirse en varias poblaciones: alrededor del 5% de
ellos no expresan CD4 o CD8 (DN, doble negativos); ~80% expresan ambos CD4 155
y CD8 (DP, doble positivos), ~10% expresan solo CD4 y ~5% solo CD8. Las células
DP provienen de timocitos DN y se diferencian a linfocitos T unipositivos para CD8
o CD4. En esta clasificación, los timocitos más primitivos ETP residen en la fracción
DN y carecen de marcadores asociados con cualquier linaje hematopoyético
(8,31,32). Aunque la capacidad de los ETP para generar células del linaje T es po-
derosa, ellos retienen cierto potencial de B, NK, DC y mieloide (8), sugiriendo hete-
rogeneidad en la población. En línea con este concepto, la población DN puede
ser subdividida en 4 estadios de desarrollo basados en la expresión diferencial de
CD44 y CD25, madurando desde DN1, DN2, DN3 hasta DN4. La categoría DN1
contiene a su vez 5 subpoblaciones de acuerdo a los niveles de expresión de c-kit
y CD24, en donde las dos subpoblaciones de mayor densidad de c-kit, DN1a y
DN1b, son potentes progenitores de T con casi nulo potencial de B (33). A lo largo
de la vía, la IL-7 y el SCF contribuyen a la sobrevivencia y proliferación de los pre-
cursores tímicos, mientras que los receptores Notch intervienen críticamente en la
determinación del linaje T y en la supresión del linaje B.

En humanos, los ETP residen en la población CD34+CD1a-CD38loCD44+IL-7R+ y

a partir de ellos se inicia el compromiso de estadios intermedios de diferencia-
ción de manera análoga al proceso en el ratón. La dependencia de la vía a la
IL-7 ha sido sustentado por la profunda deficiencia en células T (pero no B) que
desarrollan los pacientes con inmunodeficiencia severa combinada por defec-
tos genéticos en el gen que codifica para la cadena g del receptor de IL-7 (28).
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

FACTORES INTRÍNSECOS Y EXTRÍNSECOS QUE REGULAN LA DIFERENCIACIÓN

HEMATOPOYÉTICA

Para garantizar la producción de las células sanguíneas durante toda la vida, la

diferenciación hematopoyética se encuentra finamente regulada por progra-
mas intrínsecos que incluyen al ciclo celular, redes de factores de transcripción,
microRNAs y elementos epigenéticos; así como por señales extrínsecas propor-
cionadas por el microambiente, en las que intervienen citocinas, quimiocinas,
factores de crecimiento y diferenciación, e interacciones intercelulares.

El ciclo celular de las células primitivas

Por largo tiempo se propuso la sucesión clonal como el mecanismo de soporte de

la hematopoyesis. En ésta, solo un número pequeño de células troncales da lugar
a las células maduras de acuerdo a la demanda del sistema, mientras que el resto
permanecen inactivas y no contribuyen a la hematopoyesis hasta que la capaci-
dad proliferativa de la clona troncal en ciclo es agotada. Para abordar esta posi-
bilidad, varios grupos de investigación han analizado la proliferación de las HSC in
vivo por medio de cinéticas de incorporación de bromo-2’-desoxiuridina (BrdU) al
DNA, y han demostrado que aproximadamente el 75% de las HSC se encuentran
156 en G0 (es decir, fuera del ciclo celular o quiescentes) pero que todas son recluta-
das intermitentemente al ciclo celular, de tal modo que la población completa se
divide en promedio cada 57 días (34,35). Estos resultados indican que las HSC no
están permanentemente en estado de quiescencia, sino que son reemplazadas
muy lentamente, y deben ser blanco de mecanismos de supresión muy eficientes.

El ciclo celular en células eucarióticas se divide en cuatro fases: G1, S, G2 y

M. Si durante la fase G1 las células son estimuladas por mitógenos o factores de
crecimiento, ellas transitan a través de G1 para proceder con la síntesis de DNA
en la fase S y alcanzar la fase G2, que es el intervalo entre la culminación de la
fase de síntesis y la mitosis (M) (36). Las células en G0 han salido del ciclo celular y
permanecen en un estado no proliferativo o quiescente. El sistema de control del
ciclo celular está basado en dos familias de proteínas clave: la de las cinasas de-
pendientes de ciclinas (Cdks), las cuales inducen procesos de fosforilación sobre
proteínas selectas; y la de las ciclinas, que son proteínas de activación que unen
moléculas Cdks y controlan su capacidad para fosforilar proteínas blanco. Las
ciclinas G1 se unen a Cdks durante la fase G1 y son requeridas para la entrada en
la fase S, mientras que las ciclinas mitóticas se unen a Cdks durante G2 y son indis-
pensables para la entrada a mitosis. El ensamble cíclico, activación y desensam-
ble de los complejos ciclina-Cdk son los eventos clave que dirigen el ciclo celular
(Figura 2). Además de la regulación por ciclinas y la fosforilación/desfosforilación
de la subunidad catalítica, los Cdks son fuertemente controlados por inhibidores
de Cdks, que interfieren con su actividad. Se han identificado dos familias de pro-
teínas capaces de interactuar con Cdks y suprimir la progresión a través de G1. La
capitulo VI El sistema hematopoyético a partir de células troncales

familia Cip/Kip, que incluye p21Cip/Waf1, p27kip1 y p57kip2 y la familia INK4 que incluye
p16INK4A, p15INK4B, p18INK4C y p19INK4D. p21 se expresa de manera muy abundante en
células troncales en quiescencia, y en ausencia de p21, la proliferación de HSC
incrementa sustancialmente (37). Entonces, p21 gobierna la entrada de las HSC
al ciclo, con lo cual impone límites al tamaño de la población y previene su des-
aparición, mientras que p27 gobierna la expansión de poblaciones progenitoras.
Además de p21, otras moléculas como el receptor tirosin-cinasa Tie2 y el produc-
to del gen PTEN promueven el mantenimiento de la quiescencia en las células
troncales. Existen importantes diferencias en la expresión de las moléculas regula-
doras del ciclo celular entre las HSC provenientes de tejidos fetales o neonatales,
y las HSC provenientes de individuos adultos, lo que determina una discrepancia
en la capacidad proliferativa de las células de las diferentes fuentes. En tanto las
células primitivas del adulto se encuentran principalmente en quiescencia, las cé-
lulas neonatales están en franca proliferación (34,36,38).

157

Figura 2. Regulación del ciclo celular en hematopoyesis temprana. La activación secuencial de

los complejos de ciclinas/cinasas dependientes de ciclinas (CDK) guían la progresión de las célu-
las hematopoyéticas en quiescencia a las fases G1 y S del ciclo, mientras que ciertos inhibidores
de CDK como p19, p21 y p27 son candidatos naturales que regulan negativamente la entrada a
las fases S y G2, controlando así el mantenimiento de poblaciones primitivas.

Redes de factores de transcripción

A medida que las células se diferencian, incrementan paulatinamente su ca-

pacidad para ejecutar funciones específicas. Para ello, es indispensable llevar a
cabo de manera gradual el ‘encendido y apagado’ de genes, proceso en el que
participan de manera esencial y concertada los FT. Estos factores son proteínas
que regulan la transcripción del DNA principalmente a través del reconocimiento
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

y la unión a secuencias concretas de DNA cerca del sitio de iniciación de la trans-

cripción. Entre las consecuencias de la actividad de los FT están la inducción de
la expresión de factores de crecimiento relacionados a la diferenciación de cada
linaje hematopoyético, la inducción de antígenos de superficie distintivos de lina-
je, y la expresión de moléculas vinculadas a funciones especializadas. Existen dos
estrategias muy poderosas para estudiar la actividad de los FT; una es a través de
la supresión de su expresión utilizando modelos Knockout, tanto in vivo como in
vitro, y la otra es a través de su sobre-expresión utilizando modelos transgénicos y
transfección celular (ver capítulo “Manipulación genética para el estudio funcio-
nal de células troncales”).

En la ruta de diferenciación al linaje mieloide, una red de FT actúa a tiempos

y puntos precisos del proceso. Al inicio, los factores Ikaros, PU.1, SCL, RunX1, Bmi1
y Gfi1, entre otros, dirigen la diferenciación de las HSC hacia los CMP (Figura 3). El
compromiso monocítico es promovido en los GMP y MDP principalmente por PU.1
y C/EBPα, en tanto que en el desarrollo de las DC convencionales y plasmocitoides
participan IRF8 y STAT3, e ICSBP y SpiB, respectivamente. Por otro lado, la actividad
de C/EBPα es indispensable para la granulopoiesis (15,39,40). Gfi1 es rigurosamente
expresado hasta el estadio de promielocito, mientras que en etapas posteriores,
los mielocitos y metamielocitos necesitan C/EBPε para la producción de las proteí-
158 nas contenidas en sus gránulos característicos; y en la maduración terminal de los
granulocitos están implicados C/EBPβ, C/EBPγ, C/EBPδ y C/EBPζ (41-43).

La diferenciación hacia megacariocitos y eritroblastos utiliza en etapas tem-

pranas FT compartidos, como Gata1, Gata2, FOG (amigo de GATA) y Gfi1b.
Cabe destacar que los ratones deficientes de Gata1, Gata2 y FOG mueren an-
tes del nacimiento debido, por una parte, a un estado de anemia severa por
falta de progresión de los pro-eritroblastos hacia eritrocitos, y por otra, a una
cuenta plaquetaria muy inferior a la normal. Río abajo, Runx1 y CBFβ contribu-
yen en la especificación de los megacariocitos, y el FT tipo Kruppel (EKLF) es cru-
cial para la eritropoyesis. Aunque SCL es también necesario para la generación
de células eritroides, este factor no es exclusivo de tal linaje (Figura 3).
capitulo VI El sistema hematopoyético a partir de células troncales

Figura 3. Factores de transcripción implicados en el desarrollo mieloide. En la diferenciación tempra- 159

na de las HSC participan una serie de factores de transcripción, como Ikaros, PU.1, Bmi1, Gfi1, SCL y
RunX1. Río abajo, la adquisición del compromiso a linaje granulocítico/monocítico es dependiente
de C/EBPa, mientras que el megacariocítico/eritroide se ve determinado por la expresión de Gata1,
Gata2, FOG y Gfi1b.

Al igual que en la mielopoyesis, en las rutas de diferenciación linfoide una

serie de FT conducen de manera orquestada el destino de las células progeni-
toras y precursoras. PU.1, Ikaros, E2A, Bcl11a, EBF y Pax5 participan en la deter-
minación del compromiso y la especificación del linaje de B (Figura 4). Ikaros y
PU.1 tienen un papel decisivo en los eventos más tempranos de la linfopoyesis.
Su deficiencia ocasiona que Flt3 no sea expresado adecuadamente, dando
como resultado un defecto en los progenitores linfoides y el bloqueo de la dife-
renciación de células B y T (18,44). Por su parte, Bcl11a es requerido en el desa-
rrollo de las células Pre-proB y su actividad parece preceder a la de EBF y Pax5
(45), mientras que E2A es crucial para la activación de la recombinasa RAG, y
sus productos regulan la expresión de Pax5, el cual a su vez regula la de genes
específicos de células B, como CD19. Más aún, varios de los genes que parti-
cipan en el rearreglo de inmunoglobulinas y la señalización del receptor Pre-B,
tales como mb-1, l5, VpreB y B29, así como las recombinasas RAG1 y RAG2, son
blancos potenciales de unión de E2A (46). En coordinación con los productos
de E2A, EBF es clave en el control previo al rearreglo de genes de inmunoglo-
bulina. Finalmente, los extensos estudios sobre la participación de Pax5 en el
desarrollo de células B indican que su función es esencial para la represión de la
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

transcripción de genes no linfoides (47). Entonces, en esta red de regulación, el

desarrollo de progenitores multipotentes Flt3+ es dependiente de PU.1 e Ikaros,
mientras que la especificación y el compromiso de las células precursoras Pro-B
representan mecanismos dependientes de E2A, EBF y Pax5, respectivamente.

160

Figura 4. Factores de transcripción implicados en el desarrollo linfoide. En la médula ósea, la di-

ferenciación temprana de HSC depende de Ikaros y PU.1, y el inicio del programa linfoide es
determinado por la actividad de Bcl11a, E2A, EBF y Pax5. E2A inhibe la producción de células NK,
las cuales son generadas a partir de precursores de células B y NK (CLP) por la acción de Id-2, un
inhibidor de las proteínas E. En timo, los progenitores son importados de la MO e inician su proceso
de diferenciación bajo la influencia de los factores E2A, TCF-1, Notch y Gata3, entre otros.

Una serie de hallazgos indican que los miembros de la familia Notch median la
decisión de linaje B/T (17,48), y que el factor Gata3 es esencial para el rearreglo
apropiado de genes del receptor de células T. Por otro lado, los FT Id2 y Id3, los cua-
les son antagonistas naturales de las proteínas E, controlan el desarrollo temprano
de las células NK a partir de CLP (Figura 4), y el balance de la expresión de las pro-
teínas E, como E2A, y sus antagonistas Id está implicado en la diversificación tímica
T/NK. En contraste al extenso conocimiento acerca de las vías de diferenciación de
células T, B y NK, el origen hematopoyético del creciente número de poblaciones
de células dendríticas en el humano está, a la fecha, pobremente definido, y por lo
tanto los FT que participan en su regulación no han sido precisados. Sin embargo, la
expresión de algunos genes asociados al linaje linfoide en las pDC sugiere una afilia-
ción linfoide en la médula ósea, y datos recientes indican que Notch, en concierto
con el FT Spi-B pudieran regular la diversificación de linaje T/pDC en el timo (49).
capitulo VI El sistema hematopoyético a partir de células troncales

En síntesis, cada uno de los FT definidos en esta sección es de vital importan-

cia en el proceso de la diferenciación hematopoyética. Uno puede deducir
que su sobre-expresión, ausencia o mutación que dañe sus funciones, puede
consecuentemente llevar a la enfermedad y en ocasiones a la muerte, aún
antes del nacimiento, no solo por ser indispensables para la formación del tejido
sanguíneo, sino porque muchos de ellos también intervienen en la formación de
otras estructuras del organismo.

Microambiente de la médula ósea

Ni las HSC ni los progenitores primitivos crecen como unidades autónomas e

independientes, sino rodeados en todas direcciones por el microambiente de
la médula ósea, el cual consiste en una estructura tridimensional altamente
organizada que incluye diversos tipos celulares y sus productos. Las interac-
ciones célula-célula y la exposición a combinaciones y concentraciones va-
riables de citocinas y quimiocinas regulan la localización y el destino de las
células hematopoyéticas (50).

Como será revisado ampliamente en el capítulo VII de este libro, el microam-

biente especializado que sostiene a las células troncales constituye el nicho he-
161
matopoyético, el cual promueve el mantenimiento de las HSC a lo largo de la
vida. Se propone que para que un microambiente sea considerado nicho deben
ser satisfechos dos criterios: que en él resida la célula troncal in vivo, y que pro-
mueva su mantenimiento. Esto significa que no todas las células que son funcio-
nalmente importantes para el mantenimiento de las HSC comprenden el nicho,
y que algunos sitios donde ellas residen son transitorios. A la luz del conocimiento
actual, existen al menos dos tipos de nichos, el osteoblástico y el vascular (Figura
5). El primero de ellos se encuentra en el endosteo, que es la superficie interna
del hueso en la interfase del hueso y la médula ósea. Este tejido está constituido
por una capa de osteoblastos y algunos osteoclastos en equilibrio dinámico bajo
condiciones normales. Los osteoblastos expresan factores que presumiblemente
mantienen los números de HSC en la médula ósea, incluyendo reguladores positi-
vos y negativos, mientras que los osteoclastos producen factores de crecimiento
y quimiocinas como la CXCL12 que son críticos para el mantenimiento y la lo-
calización de las células hematopoyéticas dentro de la MO (51). Por su parte, el
nicho vascular reside alrededor de los sinusoides, los cuales son vasos sanguíneos
especializados que transportan circulación venosa y a través de su endotelio las
células hematopoyéticas pueden entrar y salir de la circulación. El ambiente pe-
rivascular en MO parece estar marcado también por células reticulares que pro-
mueven la estancia de las células troncales (Figura 5). Además, y como fue revi-
sado en el capítulo V, otras células como las mesenquimales parecen contribuir
sustancialmente a la creación de nichos hematopoyéticos. Este tipo celular tiene
el potencial para generar hueso, cartílago y grasa, y es regulador importante de
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

la hematopoyesis normal (52,53). En general, las células que componen los nichos
pueden tener papeles y propiedades múltiples además de su función de soporte
de la hematopoyesis en un ambiente natural.

162

Figura 5. El nicho hematopoyético. El esquema muestra los componentes del nicho de las HSC
en la MO en condiciones normales. Algunas HSC se localizan cerca del endosteo, mientras que
otras son mantenidas por un nicho de una variedad de células perivasculares, incluyendo las reti-
culares o CAR. La arquitectura del microambiente para el soporte de los progenitores tempranos
permanece indefinida.
capitulo VI El sistema hematopoyético a partir de células troncales

El nicho mantiene a las HSC en ciclos de prolongada quiescencia, presumible-

mente debido a la expresión de factores genéticos intrínsecos que inhiben el ciclo
celular, así como a la actividad de moléculas de anclaje (37,54). La ‘activación’
de la HSC, por mecanismos no bien definidos a la fecha, induce la autorrenova-
ción o división celular asimétrica, en la que una célula hija conserva las propieda-
des de la célula madre y la otra se diferencia a progenitores multipotentes, que
eventualmente migran a diferentes microambientes de la médula ósea.

La arquitectura y regulación del nicho en el que residen las células troncales

hematopoyéticas, así como los sitios dentro de la MO en donde tienen lugar los
procesos de diferenciación mieloide y linfoide están siendo focos de intensa inves-
tigación actual. De particular interés es la vulnerabilidad de estas células primitivas
a cambios abruptos en el microambiente a los que se ve expuesto un individuo.

Perturbación del microambiente hematopoyético

Los factores de crecimiento y diferenciación son los elementos extrínsecos prin-

cipalmente responsables de dirigir y mantener la hematopoyesis basal bajo cir-
cunstancias normales, la cual ocurre en el contexto de secreción de niveles ba-
jos de citocinas esenciales, tales como SCF, TPO, Flt3L y GM-CSF. Sin embargo,
en respuesta a agentes mieloablativos, inflamación o infección, la liberación de
163
citocinas pro-inflamatorias y supresoras provenientes de células del sistema inmu-
ne innato y componentes del microambiente medular, puede incrementarse y
desbalancear el proceso. En particular, la sobre-exposición a citocinas pro-infla-
matorias como son IL-1, TNFa o IFNg, altera los patrones normales de producción
celular, a menudo suprimiendo la linfopoyesis e incrementando la mielopoyesis
(55). Adicionalmente, la inflamación e infección ocasiona la exportación prema-
tura de células linfoides y mieloides a la periferia. De hecho, en diversos modelos
experimentales se ha reportado la perturbación del estado de quiescencia y de
la arquitectura del nicho hematopoyético en circunstancias de infecciones y/o
estrés, en paralelo con la movilización extramedular de las células hematopoyé-
ticas (56,57). Interesantemente, algunos estudios sugieren que la granulocitosis
por inflamación compromete la linfopoyesis en la MO debido a que hay un des-
equilibrio en la actividad de algunos componentes básicos del microambiente
como es la quimiocina CXCL12, lo que promueve la liberación de los progenito-
res (55-57). Por otro lado, datos recientes señalan que células que residen tanto
en la fracción de HSC, como en la de progenitores linfoides de MO de ratón
reconocen directamente productos bacterianos a través de receptores tipo Toll
(TLR) 2, 4 y 9; y que la activación de estos receptores puede alterar el ciclo celular
y los patrones normales de diferenciación (25,58-60). Queda por determinar si la
estabilidad del linaje es perturbada bajo estas circunstancias, y si ello representa
una amenaza para la reconstitución del sistema inmune, o por el contrario, una
vía para robustecer periódicamente la linfo-hematopoyesis temprana.
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

SISTEMAS DE ESTUDIO DE LAS CELULAS TRONCALES

Y PROGENITORES HEMATOPOYÉTICOS

A partir del descubrimiento de las células troncales hematopoyéticas en los años

60s, el constante desarrollo de ensayos biológicos, el avance tecnológico en
los sistemas de purificación celular y la producción de factores de crecimiento
recombinantes han hecho posible que nuestro conocimiento acerca de estas
células durante la hematopoyesis normal y patológica haya crecido enorme-
mente (61). De particular importancia para el descubrimiento de identidades
celulares, potenciales de proliferación, diferenciación y plasticidad, han sido la
citometría de flujo, los ensayos in vivo —principalmente usando sistemas de tras-
plantes— y los ensayos de cultivo in vitro. La citometría de flujo permite detec-
tar moléculas membranales o intracelulares por medio de anticuerpos mono-
clonales específicos acoplados a fluorocromos, de tal manera que se pueden
identificar a las células de acuerdo a patrones de expresión de marcadores
característicos. Los ensayos in vivo utilizan receptores condicionados, que son
generalmente ratones, a los que se les reconstituye el sistema hematopoyético
a largo o corto plazo, según las características de las células hematopoyéticas
que se trasplanten. Los ensayos in vitro por su parte, se basan en el co-cultivo de
distintos tipos de estroma con los progenitores hematopoyéticos a estudiar y la
164 adición de diversas citocinas y factores de crecimiento. Los ensayos clonogéni-
cos, a su vez, forman parte de los ensayos in vitro y son cultivos semisólidos que
simulan la matriz extracelular en donde las células primitivas son resuspendidas
y cultivadas usualmente durante 14 días. A pesar de que estos ensayos sola-
mente permiten la evaluación de la funcionalidad de manera retrospectiva, y
hay gran heterogeneidad entre ellos debido al tipo de progenitor estudiado, a
la manera de ser purificado y hasta la efectividad de los medios y factores de
crecimiento utilizados (62,63), de no ser por su desarrollo, el conocimiento de la
biología de las células primitivas del ratón y el humano sería prácticamente nulo.

Citometría de flujo

La citometria de flujo es una técnica analítica muy poderosa que permite eva-
luar semi-cuantitativamente características celulares como tamaño y comple-
jidad celulares a través de la dispersión de la luz y fluorescencia emitidas mien-
tras se las hace pasar a través de un rayo de luz y en una suspensión celular.
Además, las células pueden ser marcadas con anticuerpos que reconocen
específicamente moléculas en la superficie o intracitoplásmicamente, y han
sido acoplados a fluorocromos, de tal manera que se puede detectar hasta 12
marcadores distintos con 12 fluorescencias diferentes en una sola célula y de
forma simultánea. Esta caracterización es bastante precisa y se lleva a cabo en
equipos llamados citómetros de flujo. Incluso, una vez identificadas las células
por la expresión de determinados marcadores, se pueden purificar a través de
capitulo VI El sistema hematopoyético a partir de células troncales

un citómetro que tiene la capacidad para seleccionarlas y recuperarlas. A este

equipo se le llama FACS (del inglés Fluorescente Activated Cell Sorter).

Previo al estudio de células primitivas por citometría, es conveniente enrique-

cerlas debido a su baja frecuencia, y también para evitar que algunos factores
producidos por otras células puedan influenciar nuestras observaciones. Para
esto, a partir de sangre de cordón umbilical, MO o sangre periférica movilizada,
se obtienen las células mononucleares por centrifugación en un gradiente de
densidad con Ficoll (Figura 6). Posteriormente se elige un método de enrique-
cimiento de poblaciones primitivas CD34+, ya sea por selección positiva o por
selección negativa. Los más utilizados están­basados en la aplicación de cam-
pos magnéticos a células que han sido marcadas con anticuerpos acoplados a
perlas magnéticas. Cuando el anticuerpo que se utiliza va dirigido contra la mo-
lécula sobre la superficie de las células de interés, se realiza un enriquecimiento
por selección positiva; mientras que cuando se marcan las células que no serán
estudiadas, por ejemplo las células maduras, y se eluye la fracción rica en cé-
lulas primitivas no marcadas, el proceso de enriquecimiento es por selección
negativa. Para tener una alta purificación celular y evitar trabajar con fraccio-
nes que contienen heterogeneidad de poblaciones, entonces se procede a la
tinción con anticuerpos conjugados a fluorocromos para la purificación por ci-
tometria de flujo con base en fenotipos específicos. En la Figura 6 se muestra un 165
ejemplo de estrategia de tinción con 4 colores fluorescentes para la identifica-
ción y purificación de HSC, MPP y ELP provenientes de MO de humano. Las HSC
se caracterizan por ser CD34+ CD38- y CD45RA-, además de ser linaje negativas,
es decir que carecen de marcadores de linaje de células B, T, NK, mielocitos,
monocitos y eritrocitos; mientras que los progenitores multipotentes se pueden
identificar como Lin- CD34+ CD38+ CD45RA- y una fracción rica en progenitores
linfoides ELP de fenotipo Lin- CD34+, CD38+ CD45RA+. Una vez purificadas por ci-
tometría de flujo, las células colectadas están listas para ser estudiadas por sus
atributos biológicos, ya sea en ensayos in vivo o in vitro.
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

166

Figura 6. Estrategia general de aislamiento y purificación de células troncales y progenitores he-

matopoyéticos humanos. A partir de una suspensión celular de MO se obtienen células mono-
nucleares por gradiente de densidad, las cuales son sometidas a un enriquecimiento de células
CD34+ por selección positiva/negativa a través de columnas magnéticas. La purificación de HSC,
MPP y ELP por citometría de flujo multicolor puede ser empleada si se desea estudiar sus potencia-
les de diferenciación en ensayos in vitro e in vivo.
capitulo VI El sistema hematopoyético a partir de células troncales

Ensayos in vivo

El único ensayo que evalúa con certeza las propiedades de una SC es la recons-
titución a largo plazo del sistema hematopoyético de ratones condicionados o
irradiados, los cuales cuando ya han sido transplantados, reciben el nombre de
quimeras debido a que su sistema hematopoyético deriva parcial o totalmente
de un donador de células hematopoyéticas. En la práctica, la reconstitución del
sistema hematopoyético con células de ratón puede llevarse a cabo por medio
de un ensayo de reconstitución competitiva que consiste en transplantar a un
ratón irradiado letalmente, con células propias de su MO simultáneamente a las
células troncales de un donador. Los ratones donador y receptor son congéni-
cos y distinguibles por la expresión de un marcador específico. La reconstitución
es evaluada a los cuatro meses y de ser deseado, el trasplante seriado puede
realizarse para el estudio de la capacidad de las células troncales de injertar
en forma seriada sin agotamiento rápido de la población. Cuando las células
troncales en investigación son de origen humano, éstas deben ser transplanta-
das por vía intravenosa a ratones irradiados y suficientemente inmunodeficientes
para no montar una reacción inmunológica contra el injerto. Este sistema se de-
nomina xenotrasplante debido a la diferencia de especies, dentro de los ratones
más utilizados se encuentran los ratones con inmunodeficiencia severa combi-
nada (SCID), los ratones diabéticos no obesos que además tienen la misma in- 167
munodeficiencia (NOD/SCID), y los ratones NOD/SCID gamma o ratones NSG, los
cuales no expresan la cadena gamma del receptor de IL-2 (IL-2Rγ) y por lo tanto
carecen de células NK, además de carecer de células T y B (Figura 7). A pesar
de ser inmunodeficientes, estos ratones deben ser irradiados (3.5-4 Gy) para que
acepten el trasplante de células humanas. Después de 8 a 10 semanas, se eva-
lúa el injerto en la médula ósea, el bazo y en la sangre periférica de los ratones
por citometria de flujo. Para determinar el éxito del trasplante, las células común-
mente analizadas son células B y mieloides (61-63). El desarrollo de los ratones
NSG ha perfeccionado definitivamente el sistema de xenotrasplantes, ya que al
carecer de actividad citotóxica de las células NK contra las células del donador,
la posibilidad de elevar la frecuencia de injertos es mucho mayor. Además, la
propensión a desarrollar linfoma tímico se reduce sustancialmente (13, 63). Debi-
do a que la conducción de ensayos in vivo a menudo resulta complicada por el
mantenimiento de colonias de ratones que requieren muchos cuidados especia-
les, la evaluación de precursores hematopoyéticos humanos se beneficia mucho
de la conducción de ensayos clonogénicos y co-cultivos (ver más adelante). Los
progenitores mieloides tienen, además, una diferenciación terminal in vivo muy
reducida, por lo que los ensayos clonogénicos y los ensayos de células iniciado-
ras de cultivos a largo plazo han sido de gran utilidad.
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

168

Figura 7. Sistemas para el estudio de la diferenciación de células troncales y progenitores hema-

topoyéticos. Los ensayos de reconstitución a largo plazo utilizan ratones irradiados de cepas SCID,
NOD/SCID o NSG como receptores, que son transplantados consecutivamente cada 8 semanas.
Al término de 3 o 4 trasplantes, la reconstitución por HSC es evaluada por citometría de flujo o
ensayos in vitro (panel superior). En los ensayos clonogénicos (panel medio), las células progeni-
toras son resuspendidas en medio semisólido suplementado con factores de crecimiento por un
máximo de 3 semanas. A su término, la morfología de las colonias producidas se evalúa bajo el
microscopio. Las colonias CFU-MIX y CFU-GEMM provienen de un progenitor multipotencial, que
da origen a progenitores bipotenciales que rinden colonias CFU-GM y dan lugar a colonias mo-
nocíticas (CFU-M) y granulocíticas (CFU-G). Además, las colonias BFU-E son eritroides tempranas
y las CFU-E eritroides tardías. Los ensayos LTC-IC permiten detectar células primitivas capaces de
dar origen a progenitores comprometidos a linaje en ensayos de largo plazo (panel inferior). Las
fotografías de colonias hematopoyéticas son cortesía del Dr. Héctor Mayani, IMSS.
capitulo VI El sistema hematopoyético a partir de células troncales

Ensayos in vitro

La mayoría de los ensayos in vitro fueron desarrollados primero en ratón y pos-

teriormente se realizaron modificaciones para el estudio de células humanas.
Los cultivos a largo plazo de médula ósea, también conocidos como cultivos
tipo Dexter se basan en la interacción de las células hematopoyéticas con cé-
lulas estromales derivadas de la médula ósea, tienen una duración de 8 a 12
semanas pero si se suplementan con TPO, su longevidad se puede ver drásti-
camente incrementada. En este sistema, las células hematopoyéticas forman
conglomerados que reposan adyacentes a la capa de células estromales, las
cuales pueden provenir de líneas celulares de ratón como MS-5 o S17, las cuales
dan soporte a la mielopoyesis y a la linfopoyesis (61,63). Al término del cultivo, las
células producidas pueden ser cosechadas y analizadas por citometría de flujo.

Los ensayos clonogénicos identifican en medios semisólidos libres de estroma a

progenitores ya comprometidos a algún linaje, después de 14 o 21 días de cultivo,
y hacen posible la evaluación de colonias con base en su composición, tama-
ño, color y disposición. Las colonias formadas son observadas al microscopio y
son clasificadas como: unidades formadoras de colonias (CFU) mixtas (CFU-Mix),
o formadoras de colonias de granulocitos, eritrocitos, monocitos y macrófagos
(CFU-GEMM), o formadoras de colonias de granulocitos y monocitos (CFU-GM),
de granulocitos (CFU-G), de monocitos (CFU-M), o unidades formadoras de colo- 169
nias megacariocitoides (CFU-Meg), las de brotes eritroides (BFU-E) que dan origen
a las unidades formadoras de colonias eritroides (CFU-E) (Figura 7, panel medio).
Estos ensayos no son aptos para evaluar la función de progenitores muy primitivos
debido a que la vida media del medio semisólido (metilcelulosa) no excede las
tres semanas. En la práctica estos cultivos son relativamente sencillos de montar,
ya que solo se debe contar con los progenitores a evaluar, los cuales se resus-
penden en el medio semisólido suplementado con citocinas para permitirles su
diferenciación. A la fecha, los ensayos de colonias para linaje linfoide no han sido
estandarizados, excepto el de precursores de células B del ratón (61).

Posiblemente la técnica más utilizada para la evaluación de la frecuencia de

células primitivas in vitro es el ensayo de células iniciadoras de cultivos a largo plazo
(LTC-IC, del inglés Long-Term Culture-Initiating Cells). Estas células fueron descritas
como una rara población de células hematopoyéticas que después de 5 sema-
nas en co-cultivo con células estromales, aún podían ser capaces de producir
progenitores comprometidos detectables por medio de ensayos clonogénicos. En
esta prueba, se forman áreas de crecimiento celular en forma de adoquín y las
células producidas pueden ser evaluadas además por ensayos de dilución limitan-
te. El LTC-IC fue inicialmente diseñado para el crecimiento de las células troncales
humanas in vitro, pero mostró ser útil también en la medición de la frecuencia de
células murinas y en el estudio de progenitores linfoides y mieloides (63).
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

Tanto la citometría de flujo, como el trasplante en animales receptores con-

dicionados y los cultivos in vitro, han sido herramientas fundamentales para el
estudio de las células troncales y progenitores hematopoyéticos. Debido a su
constante mejoramiento, nuestro conocimiento en esta área se incrementa con-
tinuamente, en una era donde su futura aplicación es una promesa curativa.

Conclusiones

A lo largo de la vida, el reabastecimiento continuo de todos los linajes sanguí-

neos requiere una rápida pero precisa producción celular proveniente de la
médula ósea. Por un lado, la accesibilidad de las células más primitivas ha faci-
litado la elucidación de las bases celulares de la hematopoyesis, y por otro, el
aislamiento de citocinas y factores de crecimiento que dirigen su proliferación y
diferenciación ha permitido conocer sus requerimientos y establecer poderosos
modelos de estudio, que han servido como paradigmas para la investigación
de procesos normales del desarrollo en mamíferos. Por su importancia para la
práctica clínica, posiblemente una de las prioridades actuales del mundo bio-
médico sea definir los mecanismos que regulan los patrones de diferenciación
temprana en respuesta a circunstancias anormales de inflamación, infecciones
170 y actividad neoplásica.

Agradecimientos

Los autores agradecen la colaboración de los miembros del Laboratorio de Lin-

fopoyesis de la UIMEO. Nuestras investigaciones sobre Células Troncales y Dife-
renciación Linfoide reciben el apoyo de la Coordinación de Investigación en
Salud del IMSS (R-2006-3602-16, R-2008-3602-25 y 2010-785-012) y del Consejo Na-
cional de Ciencia y Tecnología CONACyT (CB-2006-C01-61274). E.V. fue becario
CONACYT para sus estudios de Posgrado (B081650).
capitulo VI El sistema hematopoyético a partir de células troncales

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173
Capítulo VII

El nicho de las células troncales

Eugenia Flores Figueroa

RESUMEN

En esta revisión haremos una descripción y análisis del nicho de las células tron-
cales, el cual se define como un sitio anatómico que regula la participación
de las células troncales en los procesos de generación de tejidos, homeostasis,
recambio y reparación. Tomaremos como modelo el nicho de las células de la
línea germinal en invertebrados y analizaremos detalladamente el nicho de las
células troncales hematopoyéticas en el modelo murino. Daremos énfasis en los
retos para estudiar el nicho y sus posibles aplicaciones en la clínica.

INTRODUCCIÓN

Se estima que el cuerpo de una persona adulta esta formado por 1014 células,
dentro de éstas, el cerebro contiene cerca de 100 mil millones de neuronas, y en
la circulación sanguínea están presentes en promedio 6 mil millones de células/
kilogramo de peso. La mayoría de estas células tiene un tiempo de vida limita-
do, por lo que para poder mantener un número adecuado de ellas desde que
nacemos hasta nuestra muerte, es necesaria de su producción continua. Uno
de los mecanismos de producción se basa en la generación de células maduras
a partir de células inmaduras, células que poseen un potencial muy grande de
proliferación y diferenciación. Este tipo de células denominadas células tronca-
les (SC) tienen la propiedad de dar origen a miles de millones de células de va-
rios tipos (como eritrocitos, leucocitos o células musculares), tienen además una
característica única, la de hacer copias de ellas mismas, lo que se conoce como
autorrenovación. Sin embargo, supongamos que si todas las SC estuvieran proli-
ferando, autorrenovándose o diferenciándose en un momento dado, entonces
el cuerpo tendría un exceso de células, lo que además favorecería la pérdida
de la población en poco tiempo. Es necesario que un subgrupo de SC perma-
nezcan quiescentes o “dormidas”, es decir, en estado G0 del ciclo celular. La
regulación de las SC es fundamental para mantener el equilibrio en el organismo,
por lo que las señales que dictan su destino celular están restringidas a sitios muy
particulares y específicos en los tejidos denominados como Nichos (1,2).

El nicho se define como aquellos compartimentos o lugares específicos del mi-

croambiente de los tejidos en los cuales residen las SC, lo que permite regular su
fisiología, es decir, en estas zonas existen los elementos necesarios para inducir su
muerte, sobrevivencia, quiescencia, autorrenovación, o migración. Para que una
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

SC pueda salir de su estado “dormido” o quisecente y pueda diferenciarse debe de

abandonar su nicho e ingresar a otra zona dentro del microambiente en donde exis-
ten los factores adecuados para que ésta pase de un estado indiferenciado hasta
una célula madura y funcional, proceso que se lleva a cabo gradualmente (1).

Una de las principales limitantes para poder estudiar a las SC en su nicho,

es la falta de marcadores específicos y únicos que permitan identificar a estas
células dentro de los tejidos. Por otra parte es fundamental contar con modelos
in vivo que permitan realizar experimentos funcionales, modificando tanto a las
SC como a su nicho. Los nichos de las SC de la línea germinal en Drosophila y C.
elegans cumplen con ambas características, por lo que se han utilizado como
modelos biológicos. En esta revisión primero analizaremos estos nichos que servi-
rán de base para comprender los nichos de las SC en mamífero.

EL ORIGEN DEL CONCEPTO DE NICHO

La palabra “nicho” deriva de la palabra nicher del francés antiguo que quiere
decir anidar. El término fue acuñado por el naturalista Joseph Grinell en un artí-
culo publicado en 1917 refiriéndose al hábitat específico de un tipo de aves que
se localizan en California, U.S.A. y Baja California, México. Grinell utilizó el térmi-
176 no de nicho ecológico para describir la suma de los requerimientos del hábitat
o ambiente que le permite a una especie persistir y reproducirse. El concepto
de nicho fue popularizado por el zoólogo británico-americano George Evelyn
Hutchinson en 1957. Hutchinson estaba interesado en conocer el porqué existen
tantas especies diferentes en un mismo hábitat y amplió la definición de nicho a
la suma de las condiciones ambientales tanto físicas como biológicas que per-
miten que un organismo exista, es decir un segmento en un eco espacio que es
ocupado por una sola especie (3). El concepto de nicho fue adaptado al cam-
po de las SC por Ray Schofield en su publicación de 1978 (4). En esta publicación
Schofield hizo una revisión de la literatura analizando los datos experimentales
de múltiples estudios en donde se trasplantaban células hematopoyéticas pri-
mitivas en modelos murinos. Como resultado de ello, Schofield argumentó que
las unidades formadoras de colonias en el bazo, las cuales representaban a las
células hematopoyéticas más primitivas que se habían descrito en esa época,
no eran células troncales (ver capítulo VI). ¿Cómo dedujo esto? El autor encon-
tró que conforme se iban trasplantando, el número de unidades formadoras de
colonias en el bazo y su capacidad para producir nuevas colonias iban disminu-
yendo. Es decir, no se observaba esa inmortalidad que debían de exhibir las SC.
Por lo que propuso que las verdaderas SC se encontraban en otro lugar de la
médula ósea, en un sitio específico, asociadas fuertemente con otros tipos ce-
lulares tan estrechamente que no eran extraídas al momento del trasplante. Las
células de este sitio específico además de retenerlas, determinaban su compor-
tamiento celular. Las SC se convertirían esencialmente en células fijas al tejido y
capitulo VII El nicho de las células troncales

protegidas de señales inductoras de maduración o proliferación (4). Este sitio fue

nombrado por Schofield como nicho de las células troncales.

En el año del 2006, David Scadden, una de las figuras clave en el estudio del
nicho, publicó en la revista Nature la definición hasta ahora más completa y cla-
ra de este concepto. Este autor definió al nicho como – un sitio anatómico que
regula la participación de las células troncales en los procesos de generación de
tejidos, homeostasis y reparación – . El nicho protege a las células troncales de ser
depletadas, protegiendo al organismo huésped de una proliferación exacerbada
de células troncales. Constituye una unidad básica del tejido, integrando señales
que median el balance entre los requerimientos del organismo y las respuestas de
las células troncales. La interrelación entre las células troncales y su nicho, crean
un sistema dinámico necesario para mantener los tejidos. El concepto de nicho
implica dimensiones tanto anatómicas como funcionales (5).

MECANISMOS DE REGULACIÓN DE LAS CÉLULAS TRONCALES POR LAS CÉLULAS

DEL NICHO.

Las células del nicho se comunican y le dan señales a las células troncales a
través de moléculas que secretan al medio o que presentan en su membrana
a través de ligandos membranales, para lo cual es necesaria una interacción
177
y una localización muy cercana entre la célula del nicho y la célula troncal.
La presencia de un tipo de molécula puede variar dependiendo del nicho o
incluso en un mismo nicho pueden actuar diversas moléculas como citocinas,
quimiocinas, morfógenos, entre otros. Aun cuando las moléculas en los diversos
nichos varíen, por lo general en cada nicho encontramos representantes de
la misma familia. Una de las familias que se encuentra representada desde C.
elegans hasta mamíferos, es la familia del receptor Notch y su ligando Delta. La
familia de Notch se encuentra ampliamente conservada y esta presente en la
mayoría de los organismos multicelulares. En los mamíferos existen cuatro dife-
rentes receptores NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3 y NOTCH4, los cuales poseen un
dominio o una región membranal, una extracelular y una intracelular. La región
extracelular es necesaria para hacer contacto con su ligando, el cual también
es por lo general transmembranal. Para que dos células puedan interactuar a
través de lo receptores y ligandos de Notch es necesaria una interacción célula-
célula muy cercana. La región membranal de Notch atraviesa una sola vez la
membrana y llega hasta la parte citoplásmica de la célula, este dominio sufre
un corte proteolítico después de haber sido activada por su ligando. La fracción
de la proteína que se corta del receptor, viaja al núcleo y ahí es capaz de unirse
a diferentes promotores de genes (región de un gen que regula su encendido y
apagado), con lo que se puede inducir la expresión de otros genes o de apagar
su expresión, modificando de esa manera la expresión genética de las células.
Los receptores Notch se encuentran en varias SC, mientras que sus ligandos se
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

expresan en las células del nicho. Delta y Serrato son dos ligandos de Notch que
se encuentran en Drosphila melanogaster: mientras que LAG-2 es su ligando en
C. elegans y en mamíferos encontramos el ligando tipo Delta y Jagged.

Es dentro de los nichos, en donde se determina el destino celular de las SC, el cual
las lleva a su autorrenovación, quiescencia y migración. Para que las SC puedan
diferenciar, deben de abandonar el nicho y ocupar otra parte del microambiente
del tejido, en donde encontrarán las condiciones necesarias para seguir con sus
patrones de diferenciación hasta originar células funcionales, en un estado terminal
de diferenciación. En algunas condiciones, las SC pueden también abandonar su
nicho y sufrir apoptosis (muerte celular) o migrar a otro tejido (Figura 1) (Tabla 1).

178

Figura 1. Las células del nicho regulan las decisiones de destino de las células troncales. 1 y 2, las
células del nicho determinan la autorenovación, quiescencia y sobrevida de las células troncales. 3,
las células troncales deben de abandonar su nicho para poder diferenciarse, o migrar (4).

TABLA 1. Comparación entre el nicho de las células troncales germinales en

invertebrados y el nicho de las células troncales hematopoyéticas en ratón.

MODELO NICHO CELULAS DEL NICHO MOLECULA REF

REGULADORA
C. elegans Germinal Célula de la punta distal LAG-2 11,12
D. melanogaster Germinal Células filamentosas Delta, Serrato, 6,13,14
terminales, células de la E-cadherina
cápsula, células de la BMP
vaina interna Piwi/Yb

Ratón Hematopoyético Osteoblastos, células en- Tipo Delta, Jagged 1, 16,24,25,

doteliales, células tronca- N-cadherina, Wnt, 32,36
les mesenquimales (ma- Angiopoyetina
crófagos, adipocitos*) CXCL12
(SDF-1)
capitulo VII El nicho de las células troncales

EL NICHO DE LAS CELULAS TRONCALES DE LA LINEA GERMINAL EN INVERTEBRADOS

Mientras que las células troncales de tejidos o somáticas desempeñan su fun-

ción en la formación y mantenimiento de los tejidos, las células troncales de
línea germinal (GSC, del inglés Germinal Stem Cells) se encargan únicamente
de producir a los gametos para la reproducción. En los invertebrados y en los
vertebrados inferiores existen GSC tanto en las hembras como en los machos. En
los mamíferos las GSC masculinas se localizan en los testículos y son las encarga-
das de formar a los espermatozoides durante toda la vida del individuo, sin em-
bargo todavía es tema de controversia si existe su contraparte en las hembras.
Gracias a que sus estructuras anatómicas son menos complejas, el nicho de las
GSC en Drosophila y C. elegans ha sido ampliamente explorado y ha servido
como modelo para entender el nicho de SC en los mamíferos (6).

El nicho de las células troncales de la línea germinal en C. elegans

El pequeño nematodo (gusano) Caenorhabditis elegans es un organismo de

vida libre que se alimenta de bacterias y mide aproximadamente 1mm de longi-
tud. La mayoría de los individuos son hermafroditas siendo únicamente el 0.05%
machos. C. elegans es un excelente modelo de estudio por diversas razones, (1)
Representa un modelo multicelular eucarionte, (2) Su manejo y costo es bajo, (3)
179
Además puede congelarse para ser almacenado por largos períodos de tiempo
sin que pierda su viabilidad (sobrevida). (4) Y otra de las grandes ventajas de
este modelo es que el organismo es transparente lo que facilita la localización
de sus células y estructuras, característica que en el estudio del nicho cobra gran
importancia, para seguir los linajes de una estirpe. Como prueba del impacto
que ha tenido la investigación del uso de este modelo, las contribuciones de
investigadores que utilizaron a este nematodo como modelo de estudio, les ha
permito ser galardonados con el premio Nobel (2002, 2006 y 2008). A pesar de
que el nicho de las células troncales en C. elegans es el menos complejo (7), no
fue el primero en describirse, fue descrito dos años más tarde que el de las GSC
del ovario de Drosophila por Xie y Spradling (2000) (8) y un año más tarde que
el nicho de las GSC de testículo en los machos de esta mosca de la fruta (9,10).

La gónada de C. elegans es similar a la de otros organismos, esta formada por

una estructura en forma de tubo sin salida, en donde las células germinales se en-
cuentran proliferando en el extremo cerrado de esta estructura (zona distal) y los
gametos en el extremo abierto (proximal), las células en estados de diferenciación
intermedios se encuentran entre estas dos zonas en una zona denominada de tran-
sición. La línea germinal en C. elegans esta formada por un sincitio, es decir, una es-
tructura celular grande llena de citoplasma que contiene muchos núcleos, así que
la definición de una célula germinal se refiere a un núcleo rodeado de citoplasma
y una membrana que retiene una apertura central que mantiene el contacto con
otros núcleos. Sin embargo la comunicación entre las “células” dentro del sincitio
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

es restringida, por ejemplo dos núcleos adyacentes pueden estar pasando por pro-
cesos diferentes (uno dividirse y el otro no). A pesar de que biológicamente parece
que cada núcleo es independiente, debido a la estructura en sincitio se hace difícil
el uso de marcadores o de sistemas experimentales de trasplante (7).

La zona distal es la zona mitótica, de proliferación o zona proliferativa, la cual

contiene por lo menos dos tipos de poblaciones de células germinales: células en
mitosis y células en meiosis en fase S. Estas zonas son identificadas por sus figuras
mitóticas (núcleos en división celular) que se localizan distales a la zona meiótica
que marca el comienzo de la zona de transición. (Figura 2). Alrededor de 225 cé-
lulas germinales se localizan en la zona distal o mitótica en una cercana asocia-
ción con una célula denominada célula de la punta distal (DTC, por sus siglas en
inglés, distal tip cell); las células más próximas a la DTC se encuentran en mitosis y
en esta región es donde se localizan las GSC. La idea de que la DTC actúa como
un nicho para las GSC proviene de varios experimentos. Mediante la eliminación
por laser de las DTC se demostró que estas células son necesarias para mantener
a las GSC en la región mitótica, indicando que las DTC inducen la proliferación y
la autorrenovación de las GSC. La relocalización de las DTC llevan a una reloca-
lización de la zona mitótica, así como si se duplican las DTC también se duplican
las células germinales incluyendo las GSC. Finalmente, las DTC expresa moléculas
180 en su superficie como LAG-2 (semejante a la molécula Delta) la cual es capaz de
activar directamente al receptor GLP-1 (semejante a la molécula Notch) y activar
la cascada de señalización de Notch, la cual se conoce es necesaria para man-
tener a las GSC y a la zona mitótica en las gónadas. Esta evidencia ha ayudado
a establecer que la DTC actúa como un nicho en la zona germinal (11,12).

El nicho de la gónada de C. elegans es controlado por la ruta de señalización

de Notch mediante el receptor parecido a Notch llamado GLP-1 (GLP-1/Notch).
GLP-1 se expresa en las GSC, en donde después de hacer contacto con su ligando
LAG-2, una molécula parecida a Delta que se expresa en las DTC, lleva el mensaje
al núcleo y modifica la expresión de los genes que intervienen tanto en la prolifera-
ción como en la autorrenovación de las GSC. Los promotores de los genes fbf-2 y
lip-1 son regulados por GLP-1/Notch, fbf-2 es un represor y lip-1 es una fosfatasa de
una proteína que regula el ciclo celular (MAPK), respectivamente, y ambos funcio-
nan reprimiendo los programas de diferenciación de las GSC (7,11,12) (Figura 2 A).

El nicho de las células troncales de la línea germinal en Drosophila

El 13 de octubre del 2000, dos investigadores del Instituto Médico Howard Hughes,
Allan C Spradling y su colega Ting Xie publicaron en la revista Science la descrip-
ción del nicho de las GSC en D. melanogaster (8), la misma mosca de la fruta
que ha sido utilizada tradicionalmente como modelo genético y biológico y que
es el modelo experimental por excelencia para el estudio de los procesos de de-
sarrollo. Esto se debe a la facilidad de su reproducción en laboratorio, a su corto
capitulo VII El nicho de las células troncales

ciclo de vida y al profundo conocimiento que se posee acerca de su genética,

su nivel de complejidad y su riqueza anatómica. A diferencia de C. elegans, en
el modelo de Drosophila se cuenta con organismos del género femenino y mas-
culino, por lo que encontramos dos tipos de GSC, la que da origen a los gametos
en las hembras y la otra en los machos. Spradling y Xie describieron a las GSC en
las hembras, por lo que éstas células dan origen a los óvocitos. Este modelo repre-
senta un sistema para estudiar la función del nicho en la regulación de las células
troncales, ya que cumple con tres características fundamentales: la primera es
que la constituyen un número reducido de células troncales (dos o tres), la segun-
da característica es que tanto las células troncales como su progenie pueden ser
identificadas con marcadores y por último, que el sistema permite realizar estudios
funcionales. El desarrollo del ovocito dentro del ovario de Drosophila comienza en
el germario, una estructura localizada en la punta de la ovariola, que contiene
de dos a tres GSC. Las células troncales están rodeadas por tres tipos de células
somáticas, las células filamentosas terminales (terminal filament), las células de la
cápsula (cap cells) y las células de la vaina interna (escort stem cell). Conforme
envejece la mosca, el número de células filamentosas terminales y de células de
la vaina interna se ve modificado, sin embargo el número de células de la cápsu-
la permanece constante, y son éstas últimas las que se encuentran en contacto
directo con las células troncales, las que permiten su adhesión. Por otro lado, un
incremento en el número de células de la capsula induce un incremento en el 181
número de células troncales, lo que sugiere que estas células desempeñan una
función importante en la regulación de las células troncales. En condiciones nor-
males, cuando una GSC se divide genera dos células, una de las cuales es otra
GSC (autorrenovación) que sigue manteniendo su contacto directo con las cé-
lulas de la cápsula, y otra de las células se diferencia en cistoblasto, alejándose
de las células de la cápsula, proceso denominado como división asimetrica (6).

Las moléculas que participan en la función del nicho de las GSC en Drosophi-
la pertenecen a varios grupos de moléculas, como por ejemplo la E-cadherina,
una molécula de adhesión que media el anclaje de las GSC a las células del ni-
cho (específicamente con las células de la cápsula), las proteínas morfogenéti-
cas de hueso (BMP, por sus siglas en ingles), las cuales son morfógenos (proteínas
involucradas en el desarrollo embrionario las cuales actúan dependiendo de su
concentración) secretados por las células filamentosas terminales y las células
de la capsula, que reprimen la diferenciación y favorecen la autorrenovación
de las GSC. Se ha observado que estas proteínas se secretan y actúan a corta
distancia (una distancia de una célula de diámetro), por lo que a pesar de ser
secretadas al ambiente, su acción se restringe a las GSC. Adicionalmente a és-
tas moléculas, existen señales recientemente descritas a través de las proteínas
Piwi/Yb en las células filamentosas terminales y en células de la cápsula respec-
tivamente. La proteína Yb regula la expresión de dos proteínas, piwi y hh en las
células filamentosas terminales y en células de la capsula, las cuales regulan la
autorrenovación de las GSC (13,14).
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

EL NICHO DE LAS CELULAS TRONCALES EN MAMIFEROS

El nicho de las células troncales hematopoyéticas como modelo de estudio

Desde el nacimiento y durante toda la etapa post natal, la médula ósea

(MO) es el principal órgano hematopoyético en los humanos. Es en este órgano
donde se lleva a cabo la producción diaria de más de 6x109 células sanguíneas/
kg peso. La MO es el sitio en donde se producen todas las células sanguíneas
incluyendo eritrocitos, granulocitos, linfocitos B y plaquetas. Estas células tienen
además de una morfología, una función muy distinta participando en el trans-
porte de oxígeno, coagulación o respuesta inmune, respectivamente (VER CA-
PITULO VI). Sin embargo, todas ellas son producidas a partir de un solo tipo celu-
lar, denominado célula troncal hematopoyética (HSC, del inglés Hematopoietic
Stem Cells) (15). El nicho de las HSC fue el primero en ser conceptualizado (4)
sin embargo los primeros estudios funcionales en donde se establecía un papel
directo entre una célula del nicho y las HSC fueron publicados hasta el 2003 (16,
17). El camino hacia el conocimiento del nicho en el sistema hematopoyético
no ha sido fácil, debido a que presenta tres grandes retos, el primero es la difícil
identificación de las células troncales, ya que se requiere el uso de múltiples
marcadores, (tanto la expresión de unos como la ausencia de otros) lo cual es
posible analizar mediante citometría de flujo (VER CAPITULO VI) también es po-
182 sible auxiliarse por la inmunohistoquímica e inmunofluorescencia (en donde se
pueden localizarse varios marcadores simultáneamente). Por otra parte, existe
una falta de marcadores específicos que identifiquen a las células troncales, así
como de anticuerpos que puedan utilizarse en inmunohistoquímica en muestras
incluidas en parafina. La baja frecuencia de células troncales en los tejidos es
el segundo reto (15). Si comparamos la frecuencia de HSC en relación al total
de células en la MO (sin incluir células rojas ni granulocitos) con la población de
la República Mexicana, equivaldría a que tan sólo 37 mexicanos fueran células
troncales con respecto al resto de la población nacional. Finalmente, el último
reto es la identidad de las células del nicho. Imaginemos el tratar de localizar a
los mismos 37 mexicanos, con únicamente tres características físicas y sin saber
en que estado de la república se encuentran.

A pesar de los grandes retos para su estudio, el nicho de las HSC en ratón es
el más estudiado y el mejor descrito, es en este modelo en donde se han des-
crito los mecanismos de interacción entre las células del nicho y las HSC y se ha
revelado la identidad de varias moléculas que participan en esta interacción.

En los mamíferos, desde el momento del nacimiento hasta la muerte, la MO

es el principal sitio en donde se producen las células sanguíneas, y es el lugar
en donde habitan las HSC (15). En los ratones y en los niños menores de 5 años,
prácticamente todos los huesos del esqueleto son hematopoyéticos, es decir
producen células hematopoyéticas. Sin embargo en los humanos después de
los 5 a 7 años de edad, los huesos largos (extremidades inferiores y superiores,
capitulo VII El nicho de las células troncales

como fémur) dejan de producir células sanguíneas y se llenan de grasa, mien-

tras que los huesos planos (cráneo, crestas iliacas, caja torácica) y los irregulares
(vertebras) son los huesos en donde las HSC se encargan de producir todas las
células de la sangre. El hueso se divide en hueso compacto y hueso trabecular,
es éste último en donde se localiza la MO (18).

Dentro de la MO existen células pertenecientes a cuatro componentes, los

cuales interaccionan entre si para producir a las células sanguíneas, a las óseas
y para mantener la homeostasis del organismo. El primer componente es el he-
matopoyético, el cual tiene su origen en un progenitor hematopoyético común,
y es el encargado de producir a las células sanguíneas circulantes. El compo-
nente vascular es el segundo componente y es clave para llevar nutrientes y oxí-
geno a la MO y servir como transporte para las células hematopoyéticas dentro
y fuera de la médula. El componente estromal sirve no solo de sostén si no es el
encargado de regular la hematopoyesis, finalmente el componente nervioso,
uno de los menos descritos en la médula, pero que promete ser fundamental en
la regulación de la hematopoyesis (15,19).

Componente hematopoyético

En condiciones de homeostasis, el sistema hematopoyético de un individuo se 183

mantiene por un número limitado de HSC, también conocidas como Células
Madre o Células Tallo; las cuales proliferan, se expanden y maduran gradual-
mente dando origen a los progenitores hematopoyéticos, éstos a su vez a los
precursores hematopoyéticos (PH) y finalmente a los miles de millones de células
sanguíneas maduras (20) (VER CAPITULO VI).

Componente vascular

La irrigación de la MO se deriva en parte por la arteria nutricia central, la cual se

bifurca en arteria medular ascendente y descendente, sus ramificaciones dan
origen a arteriolas y capilares que radian a través del endostio y entran al hueso y
nuevamente a la médula ósea, abriéndose en una red de células endoteliales lla-
mados sinusoides. Los sinusoides son vasos de pared muy delgada que emergen
en el sinusoide central, y juegan un papel importante mediando el paso de las
células hematopoyéticas entre la médula y la circulación, también existe una irri-
gación a través de capilares corticales que penetran la MO desde el periostio, es-
tas estructuras vasculares están constituidas por una capa de células endoteliales
la cual es rodeada por una capa de células de músculo liso. El Sistema Vascular
nutre a la MO y permite el egreso y reingreso de las células hematopoyéticas (20).
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

Componente estromal

El término estroma se utiliza para definir a células de tejido conectivo que man-
tienen la estructura de un órgano y a las células del parénquima (las que llevan
a cabo la función del órgano). La palabra estroma deriva del griego que quiere
decir “cama” y del latín que quiere decir “colchón”, ya que de acuerdo con
la definición más antigua, se pensaba que estas células proveían únicamente
un soporte físico para las células hematopoyéticas (15). El conocimiento de las
células estromales tiene dos grandes vertientes, por una parte fueron estudiadas
por patólogos, los cuales analizando biopsias de MO describían a células reti-
culares, que presentaban grandes prolongaciones citoplasmáticas y contenían
fibras en su citoplasma. La distribución exacta no quedaba clara, debido a la
falta de marcadores específicos que las reconociera en los cortes de las biop-
sias de médula ósea, sin embargo su presencia se asocia a los sinusoides y entre
el parénquima, en cercana asociación a las células hematopoyéticas (21).

Por otra parte, gracias a los avances en los cultivos desarrollados por Michael
Dexter en la década de los setenta, fue posible cultivar MO humana y mantener-
la in vitro por varias semanas. Este tipo de cultivos denominados cultivos a largo
plazo tipo Dexter, permitieron el desarrollo de una capa de células adherentes, a
la cual se le denominó como “capa estromal”, la cual era capaz de mantener la
184 proliferación y la diferenciación de las células hematopoyéticas, sin la necesidad
de añadir citocinas o factores exógenos. La definición de célula estromal en este
tipo de sistemas correspondía a una célula adherente al plástico de la caja de
cultivo. Sin embargo, las células adherentes no correspondían a un solo tipo ce-
lular, la capa era heterogénea, e incluía en una mayor proporción a fibroblastos
estromales o miofibroblastos, macrófagos y en menor proporción adipocitos y os-
teoblastos (21). Posteriormente el estudio sobre el estroma fue realizado utilizando
líneas celulares que permitían el crecimiento de células hematopoyéticas, mie-
loides o linfoides. Gracias a estos sistemas, se caracterizaron diversas moléculas
de adhesión, componentes de la matriz extracelular y citocinas secretadas, sin
embargo no se conoce si estas poblaciones de células estromales se encuentran
en la misma proporción o con el mismo inmunofenotipo in vivo.

Las células del estroma junto con sus productos (matriz extracelular y citoci-
nas) forman una estructura conocida como Microambiente Hematopoyético,
el cual regula a las células sanguíneas, desde mantener y permitir la prolifera-
ción y diferenciación de las HSC hasta la migración de las células maduras (15).
La mayoría de las células estromales son de origen mesenquimal, y al igual que
en el sistema hematopoyético, son originadas a partir de una célula troncal,
denominada como Célula Troncal Mesenquimal (MSC, por sus siglas en ingles
Mesenchymal Stem/Stromal Cell) (22) (VER CAPITULO V). La MSC da origen a los
osteoblastos, adipocitos y fibroblastos estromales; y a los condrocitos, los cuales
hasta la fecha no se les ha involucrado con la hematopoyesis, pero llevan a
cabo funciones importantes en la formación del cartílago. Las MSC regulan la
capitulo VII El nicho de las células troncales

hematopoyesis a través de varios mecanismos que incluyen, la secreción de

moléculas reguladoras como citocinas y quimiocinas; el contacto célula-célula a
través de diversas moléculas de adhesión y receptores membranales, así como
mediante la secreción de matriz extracelular (22).

Componente nervioso

La presencia de células nerviosas es más abundante en los huesos largos, las

vertebras y los huesos planos de mayor tamaño. Muchas de las fibras nervio-
sas acompañan a los vasos sanguíneos hacia el interior de los huesos y hacia
los espacios perivasculares de los canales Harvesianos. Los nervios vasomotores
acompañan a las arterias dentro de los huesos, y son los encargados de con-
trolar la constricción vascular y la dilatación. Los nervios en la zona del periostio
son nervios sensoriales, los cuales llevan mensajes de sensaciones al cerebro,
algunos de ellos llevan mensajes de dolor, y es por ello que la toma de muestra
de MO en los pacientes hematológicos es dolorosa. Algunas terminaciones ner-
viosas se encuentran adyacentes a las trabéculas óseas y en estrecha asocia-
ción con las células del hueso. Los huesos son inervados por el sistema nervioso
simpático, el cual se origina en la médula espinal y es parte del sistema nervioso
autónomo. Los neurotransmisores liberados por estas terminaciones nerviosas 185
parecen tener un papel en la formación del hueso y en su remodelación. Un
modelo murino en el cual fueron eliminados ambos alelos del gen transportador
de dopamina (DAT(-/-)) presenta una reducción en la masa ósea y deficiencias
en la estructura e integridad del esqueleto (18). Además de su participación
indirecta en la regulación de la hematopoyesis al intervenir en la remodelación
ósea, las células del sistema nervioso regulan directamente la hematopoyesis a
través de la secreción de neurotransmisores (2).

NICHO HEMATOPOYÉTICO

Los estudios en modelos murinos establecen que dentro del microambiente he-
matopoyético de la médula ósea, las HSC se localizan en sitios definidos de-
nominados nichos hematopoyéticos. El nicho hematopoyético se define como
una región específica dentro de la médula ósea, compuesta por células y pro-
ductos celulares que regulan la fisiología de las HSC.

La identidad de las células del nicho

Como mencionamos anteriormente, dos estudios publicados en el mismo núme-

ro de la revista Nature en el año 2003 (16,17), fueron de los primeros en asociar
a una población específica de células estromales con el nicho. Los osteoblastos
quienes a partir de este momento son considerados como células del nicho, son
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

capaces de modificar el tamaño de la población de HSC, demostrando así ser

un componente del nicho hematopoyético. Dos años mas tarde fue revelada
una segunda población de células del nicho, las células endoteliales presentes
en los sinusoides, que demostraron contener a una proporción importante de
HSC primitivas (23). Más recientemente, en el 2010, Omatsu y colaboradores
describieron a otra célula del nicho, las células reticulares productoras de la qui-
miocina CXCL-12 ó SDF-1 (factor derivado del estroma 1) las cuales se denomi-
nan como célula reticular con abundante CXCL12 (CAR, por sus siglas en inglés)
y demostraron diferenciarse hacia los linajes adipogénico y osteogénico, lo que
representaría a células troncales mesenquimales (24).

Osteoblastos

Dentro de la MO encontramos células del linaje de osteoblastos en diferentes

estadios de maduración, desde las MSC hasta los osteoblastos maduros y los os-
teocitos, que se encuentran incluidos en el hueso. Los osteoblastos se encuentran
formando una capa delgada de células en el endostio, una región localizada en-
tre la médula y el periostio (la parte compacta del hueso) y rodeando las trabé-
culas dentro de la médula ósea. Los osteoblastos participan en la formación del
186 hueso y en su remodelación, ya que son los principales blancos de hormonas que
regulan la reabsorción o formación ósea (como la hormona paratiroidea o PTH),
estas células son las encargadas de regular a los osteoclastos, células de linaje
macrofágico que secretan enzimas proteolíticas para reabsorber el hueso) (25).

Aunque desde 1975 se contaba con la evidencia de que células muy inma-
duras capaces de originar colonias hematopoyéticas en el bazo (CFUs, por sus
siglas en ingles) (VER CAPITULO VI) se localizaban preferentemente en el endos-
tio (26) no fue hasta que se utilizaron modelos murinos en donde pudieron des-
cribirse las poblaciones de las células del nicho. En tres modelos que involucran
la eliminación de células del linaje de osteoblastos (knockout para RUNX2, un
factor de transcripción (FT) de osteoblastos inmaduros o tempranos, la expresión
condicional de timidina cinasa en los osteoblastos colágena tipo I positivos y la
eliminación condicional de las células que expresan el receptor de la proteína
morfogenética de hueso BMPRIA) (27,28,16) se observó una drástica disminu-
ción en el número de progenitores hematopoyéticos primitivos y de HSC aso-
ciado a una disminución en el número de osteoblastos. En el estudio de Zhang
y colaboradores, se observó adicionalmente, una disminución en el número de
osteoblastos que expresaban N-cadherina, una molécula de adhesión que se
ha involucrado en la localización y en regular la autorrenovación de las HSC a
través de interacciones homotípicas (16).

Por otra parte, en modelos murinos en donde se ha incrementado el volumen

óseo, y con ello al número de osteoblastos, ha resultado en un aumento en el nú-
mero de HSC. Calvi y colaboradores (29) examinaron los efectos de la activación
capitulo VII El nicho de las células troncales

constitutiva del receptor de la hormona paratiroidea y encontraron un incremen-

to en el volumen trabecular, además de un incremento en el número de osteo-
blastos que expresaban el ligando de Notch, Jagged 1, lo cual correlacionaron
con un incremento en la activación de Notch por parte de las HSC y en su abun-
dancia. Para que pudiera observarse una correlación positiva entre el número de
osteoblastos y de HSC era necesaria la activación de Notch por parte de Jagged
1 en los osteoblastos, ya que si se adicionaba un inhibidor de Notch, tal efecto no
se observaba aún cuando existiera un aumento de osteoblastos (25).

Otro de los hallazgos que ha permitido establecer que los osteoblastos forman
el nicho endosteal y que favorece la expansión de las HSC, es que producen
una gran variedad de citocinas como el factor de crecimiento de granulocitos
(G-CSF), de macrófagos (M-CSF), de granulocitos-macrófagos (GM-CSF,) la inter-
leucina 1 (IL-1) y la IL-6. así como se ha encontrado la expresión del factor inhi-
bitorio de la leucemia (LIF), factor de necrosis tumoral alfa (TNFα), el factor de
crecimiento endotelial vascular (VEGF), el factor de crecimiento transformante
beta (TGF-β) y linfotoxina TNF-β (LT). La producción de estas citocinas es basal, y
puede ser regulada positivamente por IL-1, el TNFα y lipopolisacáridos. (30). Calvi y
colaboradores (2003) encontraron que los osteoblastos son capaces de regular la
hematopoyesis por otros mecanismos además de la secreción de citocinas, inclu-
yendo la señalización de Notch (29). Además, los osteoblastos producen factores 187
que permiten a las células hematopoyéticas llegar a la MO (homing), como es la
angiopoyetina 1 (Ang-1) (31) y el factor derivado del estroma (SDF-1) (32).

Es importante mencionar que los modelos en donde existe un incremento de

osteoblastos, siempre correlacionan con un aumento de HSC, sin embargo en los
modelos en donde se eliminan los osteoblastos, disminuyen pero no desaparecen
las HSC. Esto puede deberse a que en estos modelos no se eliminan completa-
mente a los osteoblastos, o se eliminan en una etapa específica de su diferencia-
ción. En el modelo murino, el bazo es un sitio muy activo de hematopoyesis, por lo
que la HSC también pueden salir de la MO y llegar al bazo. Sin embargo también
se debe de considerar la posibilidad de que las HSC tienen varios nichos dentro
de la médula ósea, uno de ellos es el de las células endoteliales o nicho vascular.

Células endoteliales

Las células endoteliales han sido reconocidas por su papel en el aporte de nu-
trientes a la MO y por mediar la entrada y salida de las células hematopoyéticas
a la circulación. Son también los sinusoides, formados por un capa delgada de
células endoteliales, el sitio de localización de megacariocitos lo cual permite
que la salida de plaquetas sea más eficiente (33,34). La posibilidad de un nicho
adicional al endosteal proviene de dos estudios principalmente, ambos publi-
cados en el 2005. Spinkins y colaboradores localizaron a las HSC/progenitoras
hematopoyéticas en zonas vasculares que contenían células endoteliales que
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

producían CXCL12, lo que ubicaba al sitio vascular como un posible nicho (33).
Sin embargo gracias al descubrimiento de una combinación de antígenos de
la familia SLAM, Kiel y colaboradores tuvieron la capacidad de localizar especí-
ficamente a HSC, células progenitoras y células maduras en la MO de ratones.
Con la presencia de marcadores que podían ser utilizados en inmunohistoquí-
mica, estos autores fueron capaces de describir la localización de las HSC, en
donde un 57% se localizó en la médula trabecular, un 14% en el endosteo y un
60% se encontró asociado con los sinusoides (23).

Las células endoteliales in vitro, expresan el factor von Willebrand (vWF), el an-
tígeno CD34, la molécula de adhesión de plaquetas-endotelio (PECAM), trom-
bospondina, así como bajos niveles de las moléculas intercelulares de adhesión
ICAM-I (CD54), la molécula de adhesión vascular (VCAM-I) y CD106, así como
E-selectina. Las células endoteliales regulan la hematopoyesis a través de varios
mecanismos que incluyen la secreción de citocinas como IL-6, IL-11, IL-5, TGF-β,
el factor de crecimiento de células troncales (SCF), G-CSF, GM-CSF, LIF y M- CSF
(35); moléculas de adhesión, las cuales son importantes para regular el tráfico y
localización de las células hematopoyéticas, como E-selectina, VCAM-1, ICAM-1,
PECAM y CD34+, así como secretan la molécula de matriz extracelular fibronec-
tina (35). Aunada a la secreción de citocinas, es necesario el contacto directo
188 entre las células endoteliales de MO y las células hematopoyéticas primitivas (36).

Hasta el momento se desconoce si ambos sitios (nicho de osteoblastos y en-

dotelial) contienen HSC en diferentes estados del ciclo celular o de activación,
o se complementan para formar un solo nicho, ya que se ha observado que
la zona trabecular puede encontrase en estrecha asociación con sinusoides.
Probablemente el nicho endotelial tenga una mayor participación en otros ór-
ganos hematopoyéticos en donde se carece de hueso, como el bazo o la pla-
centa y saco vitelino, dentro del desarrollo embrionario (25).

Células troncales mesenquimales

Las MSC tienen una participación importante en el nicho hematopoyético ya

que dan origen a los osteoblastos, que forman parte de las células del nicho. Sin
embargo, estudios tanto in vitro como in vivo han demostrado una participación
directa de las MSC como células del nicho hematopoyético. En cultivo, las MSC
producen y secretan diversas moléculas reguladoras de la hematopoyesis, tanto
citocinas como IL-6, IL-11, LIF, M-CSF, SCF, el ligando de FLT-3, trombopoyetina,
VEGF, el factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF-2), la proteína quimioatra-
yente de monocitos 1 (MCP-1) y el factor angiogénico PIGF, así como moléculas
de matriz extracelular, entre ellas colágenas I,III,IV y VI, laminina, trombospondina,
tenacina y fibronectina (22). Las MSC en cultivo comienzan a expresar moléculas
características de músculo liso, como la actina alfa de musculo liso y CD146 por lo
que ha sido difícil poder comparar a las MSC que crecen en cultivo con las MSC
capitulo VII El nicho de las células troncales

presentes en MO (22). Sin embargo en el 2010 fueron publicados dos trabajos

utilizando modelos murinos en donde fue posible evaluar tanto la localización de
dos subpoblaciones específicas de MSC in vivo, como su funcionalidad (24,37).
Utilizando un ratón modificado genéticamente para acoplar la expresión de la
proteína verde fluorescente con la de nestina en las MSC, Méndez-Ferrer y cola-
boradores identificaron a una subpoblación de MSC localizadas principalmente
perivasculares, aunque también en menor proporción cercanas al endostio (37).
Las MSC Nestina+ se encontraron asociadas a HSC y con fibras adrenérgicas del
sistema nervioso simpático. Estudios funcionales demostraron que el eliminar a las
MSC Nestina+ inducia un movilización del 50% de las HSC al bazo, así como se re-
ducía la llegada de HSC trasplantadas en un 90% a la MO (Méndez Ferrer 2010).
Por otra parte, Omatsu y colaboradores describieron una población de MSC pro-
ductora de la quimiocina CXCL 12 a la cual denominaron como CAR (célula
reticular con abundante CXCL12), la mayoría de las HSC fueron encontradas en
cercana asociación con las células CAR, las cuales se localizaron en áreas mas
centrales de la médula ósea, lejanas al endosteo (24). Estas células también se
encontraron asociadas a las zonas perivasculares y será necesario dilucidar si
forman parte también de los pericitos. Las células CAR también producen SCF,
una citocina importante para la sobrevida de las HSC (24).

De acuerdo a los estudios en el sistema murino, las células estromales del ni- 189
cho hematopoyético incluyen a los osteoblastos (nicho endosteal), las células
endoteliales (nicho endotelial) y subpoblaciones especificas de células tronca-
les mesenquimales. Recientemente otros tipos celulares como los macrófagos y
los adipocitos han sido sugeridos como también posibles componentes (24, 25,
38). Sin embargo serán necesarios nuevos estudios que involucren marcadores
más específicos de HSC, así como que reconozcan a HSC en diferentes estados
de activación, para poder establecer el papel de cada uno de los nichos y si
estos interactúan entre si para formar un solo nicho. Faltan también, estudios
en MO de humanos para validar los resultados encontrados y establecer si los
mecanismos que rigen a las HSC son los mismos en ambos modelos (Figura 2 B).

Todos los componentes de la MO (hematopoyético, vascular, estromal, nervio-

so) son de vital importancia para mantener la homeostasis del organismo. Para
que se lleve a cabo la hematopoyesis todos los componentes deben de estar en
un balance, que permita al organismo contar con el número necesario de célu-
las sanguíneas, y ser capaz de responder ante una mayor demanda (infección o
sangrado), por lo que alteraciones en alguno de ellos o en varios de sus sistemas
pueden resultar en el desarrollo y progresión de enfermedades hematológicas.
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

190

Figura 2. Comparación entre el nicho de las células germinales en C. elegans y el nicho de las célu-
las troncales hematopoyéticas en ratón. A. Nicho de las células germinales en C. elegans. El nicho
esta constituido por una única célula denominada célula de la punta distal (DTC), la cual interactúa
con las células troncales germinales (GSC) a través de la molécula LAG-2 expresada en la célula del
nicho y su receptor GLP-1 expresado en las GSC. Cuando las GSC abandonan el nicho, comienzan
su proceso de diferenciación. B. Nicho de las células troncales hematopoyéticas (HSC) en ratón. En
la medula osea se han descrito tres nichos de HSC. El nicho endosteal o trabecular (1) está formado
pricipalmente por osteoblastos; (2) el nicho vascular, compuesto por las células endoteliales de los
sinusoides (S) y (3) el nicho de las células troncales mesenquimales (MSC) o células CAR (células
reticulares productoras de CXCL-12). Los adipocitos (A) se localizan en los tres nichos descritos. Las
células endoteliales en arterias y capilares (Ar, Cap) no han sido involucradas en el nicho vascular.
capitulo VII El nicho de las células troncales

Conclusiones

A partir del nuevo milenio, el campo de estudio del nicho de las células troncales
ha tenido un crecimiento acelerado, describiéndose los nichos de las células tron-
cales de la línea germinal en Caenorabditis, Droshoplila, por otro lado en ratón
y humano, el nicho de las células troncales del sistema nervioso, de las células
troncales del intestino, y de las células troncales hematopoyéticas, entre otras. El
conocimiento básico del nicho de las células troncales en condiciones normales,
a permitido establecer su participación en procesos malignos (nicho tumoral, VER
CAPITULO IX) así como en envejecimiento e incluso en terapia celular y medicina
regenerativa. Comprender los mecanismos que regulan y dictan el destino celu-
lar de las células troncales podrá aportar herramientas para modificarlas tanto in
vitro como in vivo, el conocimiento generado del nicho tumoral permitirá dirigir
nuevas estrategias terapéuticas que tengan como blanco no sólo a las células
tumorales si no también a las del nicho que les permite proliferar y autorrenovar-
se. Finalmente, el conocer el proceso por medio del cual las células troncales se
adhieren y se retienen en el nicho, nos dará información para implementar estra-
tegias para movilizarlas y utilizarlas en terapia celular. Sin duda el conocimiento
del nicho de las células troncales obtendrá un gran adelanto cuando se cuente
con marcadores específicos de SC que permita localizarlas dentro de los tejidos.
191

Agradecimientos

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología CONACyT, a la Coordinación de

Investigación en Salud y al Programa de Cooperación Internacional del Instituto
Mexicano del Seguro Social, a la Red Farmed del CONACyT, a la Asociación
Mexicana para el Estudio de la Hematología (AMEH) al Departamento de Pa-
tología de la Universidad de Stanford, California, al Grupo Mexicano de Investi-
gación en Células Troncales, a los miembros del Laboratorio de Microambiente
Hematopoyético y al Ing. Humberto Flores Rodríguez y la Ing. Quim. Hilda Jannet
Saldívar Santoyo por sus comentarios y revisión del capitulo.
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

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193
Capítulo VIII

Sangre de cordón umbilical: biología,

almacenamiento y trasplante clínico

Patricia Flores Guzmán & Verónica Fernández Sánchez

RESUMEN

La sangre de cordón umbilical ha surgido como una fuente para obtener cé-
lulas troncales y progenitoras hematopoyéticas, con diversas ventajas sobre su
contraparte que puede ser obtenida directamente de médula ósea o, después
de su movilización, en sangre periférica. Debido a ello, el interés en el estudio de
su biología y, sobre todo, de su aplicación, ha favorecido que diversos medios
no científicos generen falsas expectativas. Por tal motivo, para poder discutir y
establecer el alcance de sus aplicaciones potenciales, es necesario proporcio-
nar un conocimiento confiable sobre las características biológicas de las células
troncales hematopoyéticas y células progenitoras, aisladas a partir de la sangre
de cordón umbilical. En el presente capítulo, se describen de manera general
las características que definen a las células troncales hematopoyéticas y células
progenitoras de la sangre de cordón umbilical, particularmente los conceptos
que han permitido desarrollar su aplicación terapéutica en pacientes con en-
fermedades hematológicas.

INTRODUCCIÓN

La sangre de cordón umbilical (SCU) es reconocida como una fuente alterna a la

médula ósea (MO) para obtener células troncales hematopoyéticas (HSC, del in-
glés hematopoietic stem cell), y su uso en trasplantes es una realidad. Se emplea
principalmente en pacientes pediátricos, aunque en los últimos años empieza a
ser utilizada también en adultos; esta preferencia es debido al volumen de mues-
tra que puede ser recuperada de una unidad (cantidad de sangre proveniente
de una sola placenta) de SCU. La SCU, también conocida como placentaria, es
la cantidad de sangre que queda remanente en la placenta y cordón umbilical
después que un recién nacido ha sido obtenido durante un parto o cesárea. Su
colecta es relativamente fácil y sin riesgos para el donador; no obstante, actual-
mente se considera aún material biológico de desecho. A pesar del bajo volu-
men de sangre obtenido de cada placenta (≈150 mL), la concentración de HSC
y células progenitoras hematopoyéticas (CPH) es mayor a la que presenta la MO
adulta; sin embargo, hay que considerar que el volumen que se obtiene de MO
es casi 9 veces más, aproximadamente un litro de MO para cada unidad, lo que
en valores finales equivale a un mayor número de HSC/CPH derivadas de MO,
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

comparadas con las que tiene una unidad de SCU. Es por ello que, actualmente,
se encuentran en estudio diversas estrategias que permitan contender con el nú-
mero limitante de células presente en la SCU, para lograr con ello que pacientes
adultos tengan acceso a un trasplante de esta fuente, o incluso, para emplearla
en otros procedimientos de terapia celular. De esta manera, se espera que au-
mente la demanda de unidades de SCU, esta es una de las razones por las que
se ha incrementado la oferta de bancos de SCU. Sin embargo, la creación de
los mismos debe de realizarse bajo estrictas normas de calidad. Así, la disponibili-
dad de unidades certificadas facilitará su uso en procedimientos alternativos de
terapia celular en la clínica.

HISTORIA

Aunque Knudtzon, en 1974, reportó la presencia de progenitores hematopoyéti-

cos en la SCU, la relevancia de sus usos potenciales no fue vislumbrada sino hasta
finales de la década de los 80s, cuando Broxmeyer y su grupo de trabajo deter-
minaron que el 100% de las muestras analizadas contenían CPH con capacidad
de generar colonias multipotentes en cultivos semisólidos, además de demostrar
que respondían a varias citocinas hematopoyéticas en cultivos líquidos (1). A
196 este último estudio le siguió el primer trasplante empleando la SCU de un dona-
dor compatible, un niño con anemia de Fanconi. Ésta fue la primer evidencia clí-
nica —y exitosa— que demostraba que una unidad de SCU contenía cantidad
suficiente de HSC/CPH para mantener la hematopoyesis en un individuo (2).

A raíz de este primer trasplante empleando SCU, se iniciaron estudios para

conocer la biología de las HSC y CPH presentes en esta fuente. Las interrogan-
tes no se centran únicamente en la capacidad para restablecer las funciones
hematopoyéticas de un individuo trasplantado, sino también en las diferencias
biológicas entre las HSC y CPH de individuos adultos, así como los riesgos y apli-
caciones reales hacia diversas enfermedades no hematológicas.

Tipos de células troncales presentes en sangre de cordón umbilical

Aunque el tipo de SC que se caracterizó de manera inicial en la SCU fue la he-

matopoyética, en los últimos años se han identificado al menos dos tipos más de
SC presentes en esta fuente: las mesenquimales (MSC, del inglés mesenchymal
stem cells) y las células troncales somáticas sin restricción (USSC, del inglés un-
restricted somatic stem cells). Se encuentra en duda la existencia de otros tipos
de células descritas como troncales en la SCU, como las células troncales muy
pequeñas semejantes a las embrionarias (VSELS, del inglés very small embryonic-
like stem cells), y las endoteliales.
capitulo VIII Sangre de cordón umbilical: biología, almacenamiento y trasplante clínico

Las MSC, descritas originalmente en MO, son células semejantes a fibroblastos,

adherentes, con una elevada capacidad para generar los diferentes compo-
nentes no hematopoyéticos presentes en este sitio anatómico. Las MSC se han
aislado de otros órganos y tejidos, incluyendo la SCU y la placenta. Acerca de
la biología y posibles aplicaciones de las MSCs, un capítulo (Capítulo V) ha sido
incluido en el presente libro. Por otra parte, las USSC también son células adhe-
rentes con una morfología semejante al fibroblasto, que tienen la capacidad de
diferenciar a células representativas de las tres capas germinativas (3). Aunque
tanto las MSC como las USSC presentan inmunofenotipo, frecuencia, producción
de citocinas y mantenimiento de células hematopoyéticas semejantes (4-6), se
considera que las USSC son células más multipotentes que las MSC, si bien las di-
ferencias estrictas entre ambos fenotipos de SC no han sido del todo aclaradas.

Con respecto a los otros tipos de SC identificadas en la SCU, aún existe discrepan-
cia acerca de su presencia, debido en buena medida a que la mayoría de ellas ha
sido descrita por un solo grupo de investigación. Sin embargo, las VSELS son de las
que mayores evidencias experimentales se han acumulado para dar sustento de
su existencia. Estas SC se describieron primero en la MO de ratón, con una frecuen-
cia de 0.03% con respecto al total de las células mononucleares (CMN), con un
inmunofenotipo semejante al descrito para las HSC de ratón (Sca-1+Linaje- (Lin-)),
aunque con un tamaño mucho menor, 3.63 ± 0.14 µm, apenas semejante al de las 197
plaquetas; de esta característica deriva su nombre (7). En humano, éstas células
han sido identificadas en MO, sangre periférica movilizada (SPm) y SCU, en base
a su tamaño (6.58 ± 1.09 µm) e inmunofenotipo (Lin-CD45-CD133+CD34+CXCR4+).
También se han encontrado en órganos no hematopoyéticos de ratón como ce-
rebro, riñón, páncreas y músculo esquelético. Recientemente, un grupo distinto de
investigadores reportó la presencia de células tan o más pequeñas que las VSELS
(2 a 3 µm), pero con potenciales semejantes de diferenciación (8), lo cual refuerza
la idea de la existencia en la SCU de SC de bajo tamaño.

CARACTERÍSTICAS BIOLÓGICAS DE LAS CÉLULAS TRONCALES HEMATOPOYÉTICAS

Y CÉLULAS PROGENITORAS HEMATOPOYÉTICAS

En los primeros estudios sobre las HSC y CPH de SCU, se sugería que éstas pre-
sentaban características biológicas semejantes a las observadas para aquellas
células provenientes de MO adulta. Sin embargo, posteriormente, se determina-
ron diversas diferencias entre las HSC/CPH provenientes de ambas fuentes. En
la Tabla 1 se presentan datos comparativos en la frecuencia de células CD34+
presentes en MO, SPm y SCU, así como el porcentaje de CPH y HSC, definidas
por ensayos funcionales (para conceptos generales y jerarquía del sistema he-
matopoyético, se sugiere revisar el Capítulo VI). A lo largo del siguiente segmen-
to se describirán algunas características biológicas de las HSC y CPH de SCU.
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

Origen de las células troncales hematopoyéticas en sangre de cordón umbilical

Las HSC obtenidas de la SCU son de origen fetal, aunque no se tiene una explicación
consensuada de porque se encuentran en circulación al final de la gestación. La
presencia de HSC circulantes se ha descrito en condiciones anormales en sangre
periférica en adultos, por efecto de factores de crecimiento, radiación o drogas que
provocan su salida desde sus nichos en MO. Las posibles razones por las cuales las
HSC/CPH se encuentran circulando en la sangre del producto, en una frecuencia
mayor a como se hallan en la MO adulta, incluyen: a) es posible que se relacionen
con una fase final del proceso de embriogénesis y organogénesis; b) que participen
como sensoras o reparadoras de daño tisular, y c) como una respuesta normal a los
múltiples factores de crecimiento producidos por la misma placenta, de forma se-
mejante a como ocurre durante la extravasación de las HSC/CPH en la SPm.

Las células sanguíneas, al igual que el resto de las estructuras hematopoyéti-

cas, tiene un origen mesodérmico. Durante el desarrollo embrionario, las HSC y
CPH se producen en dos ciclos o momentos. El primero es de origen extraembrio-
nario y se lleva a cabo en el saco vitelino; allí llegan las primeras células hemato-
poyéticas, para dar origen principalmente eritrocitos y monocitos-macrófagos, en
las llamadas islas sanguíneas (9). Para el ratón, este proceso ocurre entre el día 7
a 7.5 posterior al coito (p.c.) y a principios de la tercera semana, en humanos. En
198 esta etapa, la hematopoyesis no es definitiva, porque no existen HSC en el sentido
estricto: Las células presentes en ese momento del desarrollo están restringidas,
principalmente, al linaje eritroide —con hemoglobina embrionaria— y mieloide,
con poca o nula presencia de unidades formadoras de colonias (CFU, del inglés
colony forming unit), con lo que se demuestra la presencia de células progenito-
ras capaces de generar las estirpes del linaje hematopoyético. La hematopoyesis
definitiva, que se llevará a cabo de forma activa en el hígado, bazo y MO fetales,
se realizará a partir de HSC embrionarias. Específicamente, la región embrionaria
conocida como aorta-gonáda-mesonefros (AGM), es el sitio de origen de estas
células (10); sin embargo, los mecanismos exactos (por inducción, determina-
ción o migración) así como su precursor, aún son motivo de debate. La evidencia
apunta a que las células hematopoyéticas definitivas tienen un origen a partir de
un tipo particular de endotelio, conocido como hemogénico, el cual adquiere
la capacidad, ya siendo endotelio, de cambiar su destino celular y generar a las
HSC (11). La presencia de las HSC en la región AGM ocurre después del día 9 p.c.
para ratón y al final de la tercera semana en humanos. De esta región, migran
las HSC a los primordios del hígado, bazo, pulmón y riñón, de donde partirán nue-
vamente hacia la médula ósea (semana 8-9 en humanos). Sin embargo, aún se
desconoce si las células que colonizan el hígado y otras estructuras fetales son las
mismas que llegarán a la MO, o si son derivadas de una HSC previa (la originada
en la región AGM). Las HSC originadas en la región AGM, son consideradas defi-
nitivas porque ya tienen la capacidad de generar todos los linajes hematopoyé-
ticos, así como de reconstituir la hematopoyesis en organismos inmunosuprimidos.
capitulo VIII Sangre de cordón umbilical: biología, almacenamiento y trasplante clínico

Otro sitio probable del origen de las HSC y CPH que son recuperadas al final
de la gestación en la SCU, es la placenta. Se ha documentado que éste órgano
fetal tiene un elevado contenido de HSC y CPH, en forma casi traslapada con
la región AGM. Estas evidencias han permitido sugerir que la placenta podría ser
un sitio de origen de HSC. Lo anterior ha encontrado apoyo por la presencia de
HSC y CPH en los vasos coriónicos en el modelo de ratón, donde no existe circu-
lación sanguínea entre el feto y la placenta (12); así mismo, recientemente se
ha demostrado que en placentas humanas a término existen HSC y CPH CD34+,
ubicadas en sus vasos sanguíneos (13). Sin embargo, la presencia de estas HSC/
CPH CD34+ no es una evidencia sólida de su origen placentario, porque pudie-
ron haber migrado de otros sitios hematopoyéticos como bazo, hígado o MO
fetal. Pero, sí sugiere que la placenta presenta características que le permiten a
las HSC y CPH llegar a este órgano y madurar, incluso en etapas previas al esta-
blecimiento de la hematopoyesis en hígado fetal (14).

Inmunofenotipo y morfología

Al igual que con las células provenientes de la MO, en la SCU se han caracte-
rizado los antígenos de superficie de las HSC/CPH. Con diferencias muy sutiles,
los antígenos de superficie de las HSC/CPH de SCU, son virtualmente los mismos
que se encuentran sobre su contraparte de la MO adulta o SPm. Las diferencias 199
principales entre estas poblaciones se encuentran en las proporciones del tipo
celular que definen dichos antígenos.

Las HSC/CPH no expresan moléculas de superficie celular específicas de los

linajes sanguíneos, por ello se consideran que son Lin-. El primer marcador de su-
perficie celular que, de forma específica, permitió separar a las HSC/CPH de las
poblaciones más maduras, fue CD34. Aunque en ratón este marcador no siempre
coincide con la presencia de HSC/CPH, para humanos es el más empleado para
obtener poblaciones de HSC/CPH enriquecidas o purificadas de cualquier fuen-
te. Las células CD34+Lin- incluyen a aquellas con capacidad de reconstituir en
animales inmunosuprimidos la totalidad de los fenotipos hematopoyéticos (célu-
las repobladoras), y las células iniciadoras de los cultivos a largo plazo (LTC-IC, del
inglés Long-Term Culture-Initiating Cells). Sin embargo, el definir a las HSC como
células CD34+Lin- únicamente es erróneo, porque en esta población también se
encuentran presentes CPH capaces de generar colonias in vitro, junto con cé-
lulas que no tienen ninguna de estas actividades. Es por ello que, otros antíge-
nos han sido sugeridos para determinar la presencia de HSC y CPH, como CD38,
CD133, c-Kit, KDR, o el receptor para el factor de crecimiento del endotelio vas-
cular-1 (VEGFR1, del inglés Vascular Endothelial Growth Factor Receptor). Actual-
mente, se considera que las HSC humanas, de cualquier fuente, se encuentran
en una elevada proporción (no pureza) dentro de poblaciones definidas como
CD34+CD38-CD133+c-Kitlow, pudiendo aún ser divididas en KDR+ (0.1-0.5% de las
células CD34+ de MO son KDR+), o VEGFR1+ (≈ 5% de las células CD34+ de SCU
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

e hígado fetal son VEGFR1+) (15). Sin embargo, para estos dos últimos marca-
dores existe poco consenso para ser incluidos como marcadores que ayuden a
definir a las HSC/HPC, porque se encuentran presentes también en progenitores
endoteliales, presentes tanto en MO como en SCU. Por ello, en procedimientos de
trasplantes de HSC/HPC, el antígeno CD34 es el marcador más empleado para
cuantificar el número de HPC que se utilizan. Con fines comparativos, en la Tabla
1, se muestra el porcentaje de células CD34+ de MO, SPm y SCU.

Morfológicamente, las células de los diferentes linajes sanguíneos que se en-

cuentran en la SCU, son semejantes a las de MO, pudiendo ser reconocidas y
clasificadas de igual forma. La diferencia más notable es la presencia de eritro-
citos con núcleo (10%, aproximadamente), característica del ambiente hipóxi-
co por las que pasa el producto durante el embarazo, las cuales desaparecen
de la circulación en la primera semana de vida postnatal (16). De igual forma,
las HSC y CPH de SCU presentan una morfología semejante a la de su contra-
parte en MO, la cual es parecida a un linfocito pequeño, con una proporción
núcleo/citoplasma elevada, sin gránulos y prominentes nucleolos.

Regulación del ciclo celular y de la senescencia

200 El ciclo celular es una serie ordenada de eventos responsables de coordinar la
duplicación del material genético y citoplásmico de una generación celular a la
siguiente, dividido en cuatro fases G1, S, G2 y M. Durante la fase G1, las células
pueden estar sujetas a estimulación por mitógenos extracelulares y factores de
crecimiento, lo que les permite transitar de esta fase a la de síntesis del ácido des-
oxirribonucleíco (DNA, del inglés DeoxyriboNucleic Acid) (fase S); la fase G2 es el
intervalo de tiempo que emplea la célula desde que termina la síntesis de DNA,
para llegar a la mitosis (M). Existe también una fase G0, la cual es usada para iden-
tificar a las células que han salido del ciclo celular, en el que permanecen en un
estado de quiescencia, o no proliferativo. Las SC, por definición, en condiciones
normales se considera que se encuentran preferentemente en este último estado.

Para abastecer la demanda de células sanguíneas maduras y evitar la pér-

dida del conjunto de HSC, se ha postulado un “modelo de sucesión-clonal”. En
éste se propone que una o un pequeño número de HSC da origen a las célu-
las sanguíneas maduras de acuerdo a las necesidades del organismo, mientras
que las restantes HSC permanecen en un estado de quiescencia, por lo que no
contribuyen en la hematopoyesis, sino hasta que la capacidad proliferativa de
la clona activa, se agote. Esta hipótesis se basa en estudios donde la historia de
la proliferación de las HSC/CPH fue seguida por medio de la incorporación de
5-bromo-2´-deoxyuridina, estudios de los que se dedujo que sólo el 8% de la po-
blación total de las HSC/CPH (en muestras frescas) entran de forma asincrónica
al ciclo celular por día de cultivo (17).
capitulo VIII Sangre de cordón umbilical: biología, almacenamiento y trasplante clínico

Específicamente para SCU, en estudios realizados en poblaciones de células

hematopoyéticas CD34+, muestran que un elevado porcentaje de HSC/CPH se
encuentran en fase G0/G1 (72%, Tabla 1), pero que resulta inferior a lo observado
para fuentes como SPm (92.2%) (18). Si células CD34+, de ambas fuentes, son cul-
tivadas, lo que se observa es una respuesta más rápida para entrar a proliferar, así
como una generación de números mayores de células nucleadas totales (CNT),
por parte de las provenientes de SCU. Durante un cultivo de 7 días, un número im-
portante de células derivadas de SCU presentan una mayor cifra de ciclos celu-
lares (7-9 ciclos) en comparación con las de SPm (5-6 ciclos), lo que coincide con
elevados niveles de expresión de proteínas como ciclina D3, cinasa dependiente
de ciclina 4 y p27 (19). De forma semejante, se ha demostrado que el potencial
de injerto de las HSC CD34+ de MO y SPm esta restringido a las células en la fase
G0 del ciclo celular, pero en el caso de las células de SCU, el estado del ciclo
celular no es un factor determinante. Estas diferencias en el comportamiento al
parecer están asociadas con 4 rutas de señalización dentro de las HSC/CPH: 1)
rutas de señalización asociadas a integrinas, 2) señales mediadas por p53, 3) ruta
de apoptosis regulada por linfocitos T citotóxicos, y 4) señales apoptóticas media-
das por c-Myc (22), las cuales difieren entre las fuentes adultas y la de SCU (20).

Tabla 1. Comparación de algunas características biológicas

201
de las HSC presentes en la SCU con respecto a las de MO y SPm.

Característica MO adulta SPm adulta SCU

% Células CD34+1 1-4 1-5 0.8-2.9

% UFC1 0.23 0.27 0.3

% LTC-IC1 0.7 5.7 0.6

% Células
0.000033 0.000016 0.0001
repobladoras1

% Células CD34+ en
fase G0/G1 del ciclo 88.4 92.2 72
celular
% Células CD34+ en
fase S/M del ciclo 9.2 6.5 11
celular
1
Los datos son en CMN de cada fuente. Referencias: 18,19, 23, 24, 54 y 55

Estos resultados, en conjunto pueden explicar porque las células de SCU po-
seen un potencial de proliferación in vitro superior al observado con células de
SPm e indican que la respuesta de las HSC/CPH (de cualquier fuente), se halla
estrechamente asociada con la fase del ciclo celular en el que se encuentran,
por lo que será necesario considerar esta variable para lograr un injerto exitoso.
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

Otro evento que se encuentra firmemente unido al ciclo celular, es el de la

senescencia. El envejecimiento de las SC es el resultado de la disminución de su
capacidad proliferativa, lo cual se relaciona con un incremento en la expresión
de ciertas proteínas que inhiben la progresión del ciclo celular, como p16INK4a, un
inhibidor de las cinasas dependientes de cliclina. No hay que confundir el esta-
do senescente con el estado reversible de quiescencia, en el que las células se
encuentran en reposo proliferativo, o fase G0 del ciclo celular. En general, las SC
tienen una baja actividad replicativa, estando cuidadosamente moduladas las
señales que reciben del medio ambiente en nichos especializados. Es el nicho
el que define si la SC debe de realizar una división asimétrica, que le permite
autorrenovarse e iniciar la diferenciación. Así mismo, se desempeña una función
importante en la regulación del envejecimiento.

Uno de los eventos intrínsecos más conocidos de la célula, que mejor describe
el mecanismo implicado en el evento del envejecimiento celular, es el acorta-
miento de los telómeros, lo que sucede en cada ronda de división celular (21).
Los telómeros están compuestos por secuencias de DNA pequeñas repetidas en
tándem, ubicadas en los extremos de los cromosomas, sobre las que se unen pro-
teínas que permiten compactarlos. Estas regiones se extienden por la acción ca-
talítica de la telomerasa, en ausencia de esta enzima tiene lugar su acortamiento
202 hasta que finalmente, se produce la pérdida de su función, y con ello la pérdida
del potencial replicativo de la célula. Los mecanismos implicados en la regula-
ción de la senescencia de las HSC/CPH no se conocen totalmente, ya que en
modelos de ratones transgénicos que sobre expresan la telomerasa, cuando se
trasplantan sus HSC a otro individuo, el injerto no es infinito como podría esperarse,
sino que mantienen la capacidad proliferativa por solo 4 generaciones (22). Otros
aspectos, se encuentran en estudio, en los que se incluye las secuencias presen-
tes a nivel de la cromatina subtelomérica, proteínas asociadas a los telómeros, o
el tiempo de replicación en las SC. El conocimiento del papel que juegan estos re-
guladores tendrá relevancia para explicar el proceso de senescencia en las HSC.

Para la SCU, se ha encontrado una correlación en el tamaño de los telómeros

con las células de mayor jerarquía en el linaje hematopoyético: a mayor inma-
durez, mayor tamaño de los telómeros. Este evento debe estar relacionado con
el número de ciclos celulares que han pasado las CPH. La disminución en la
longitud de los telómeros es dependiente de la edad, como se ha demostrado
en el análisis de estas regiones en HSC/CPH derivadas de SCU, hígado fetal, MO
adulta, los telómeros más cortos corresponden con las células de mayor edad.
Se ha reportado que el mayor acortamiento de los telómeros ocurre en el primer
año de vida postnatal, seguida por una tasa más lenta que se estabiliza a los 50
a 60 años. Sin embargo, como para otros aspectos del envejecimiento, se debe
considerar no sólo la edad, sino diversos mecanismos como: regulación epige-
nética, la dieta o las enfermedades adquiridas durante la vida (22).
capitulo VIII Sangre de cordón umbilical: biología, almacenamiento y trasplante clínico

Respuesta in vitro de las células troncales y progenitoras de la sangre de cordón

umbilical

El análisis de la respuesta in vitro de las HSC y CPH de SCU, se ha evaluado desde

dos conceptos básicos: la capacidad de proliferación y la de expansión. La pro-
liferación se define como un incremento en el número total de células, indepen-
dientemente de la relación que guarden con la población de origen. Por su par-
te, la expansión se relaciona con un incremento en el número de células después
de determinado tiempo de cultivo, pero para que sea considerada como tal,
debe haber mayor número con características semejantes a las que definieron a
la población de inicio. Los efectos de expansión, se relacionan con el inmunofe-
notipo (particularmente referido con células CD34+), capacidad de generar co-
lonias (HPC, tipo y tamaño de CFU), injerto de células repobladoras en modelos
animales, y/o número de LTC-IC. Un tercer escenario puede presentarse durante
el cultivo de células hematopoyéticas donde, después de determinado tiempo,
se obtienen células semejantes a las cultivadas inicialmente, tanto en número
como en características; en este caso, se habla de un mantenimiento (23, 24).

Se ha demostrado que las HSC/CPH derivadas de SCU presentan un mayor

potencial de proliferación y de expansión que su contraparte adulta. La expan-
sión ha sido observada no solo a nivel de CFU, sino también en LTC-IC, y células
repobladoras; estos datos resultan alentadores para los protocolos de expan- 203
sión clínica, donde lo que se requiere es incrementar el número original de HSC/
CPH, generar determinados linajes celulares, y/o establecer sistemas de cultivo
que permitan la transfección retroviral para la corrección de defectos genéticos.
Con esto en mente, la mayor parte de los trabajos sobre el análisis in vitro de las
células de SCU, han sido establecidos con el uso de combinaciones de citocinas
recombinantes, aunque también han sido probados otro tipo de estímulos mito-
génicos, como el plasma autólogo obtenido de cada unidad, plasma alogéni-
co, o medio condicionado de cultivos de células hematopoyéticas y no hema-
topoyéticas de MO, donde se tiene combinaciones de citocinas producidas de
manera natural o inducida. Recientemente, se ha probado un agente quelante
de cobre (25) para el cultivo de células de SCU para protocolos de trasplantes
en adultos. También se han empleado células no hematopoyéticas que podrían
aportar los estímulos necesarios para el cultivo de las HSC/CPH sin comprometer
su autorrenovación y diferenciación. Se han probado células estromales prove-
nientes de MO normal, capas preestablecidas de MSC, líneas celulares humanas
o de ratón, células endoteliales provenientes de vena de cordón umbilical, así
como modelos de coestimulación libres de células: placas con fibronectina y
sulfato de heparán, entre otros (26-40). Otros procedimientos incluyen el uso de
biorreactores, donde en sistemas cerrados con agitación constante, se ha logra-
do un incremento en el número CNT y en el número de CPH recuperadas (37, 38).

Entre las citocinas más empleadas en el cultivo de células de SCU, se en-

cuentran: el ligando de FLT-3 (FL); la trombopoyetina (Tpo) y el factor de células
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

troncales (SCF, por sus siglas en inglés Stem Cell Factor). Es conveniente desta-
car que las combinaciones y concentración de ellas varía entre los grupos de
trabajo. El uso de estas tres citocinas tiene que ver con sus características: se ha
sugerido que FL y Tpo son los factores más importantes para la autorrenovación
de las HSC de SCU, mientras que SCF e Interleucina-6 lo son en el proceso de
proliferación y mantenimiento de las CPH.

El análisis de la expansión se ha realizado con respecto a la generación de

CFU, LTC-IC y células repobladoras. En la Tabla 2 se muestran, de manera sinteti-
zada, los resultados de la expansión de las HSC/CPH con diferentes combinacio-
nes de citocinas y/o la presencia de una capa estromal. Para la elaboración de
este cuadro se tomaron en cuenta algunos de los estudios más representativos
sobre la expansión de las células hematopoyéticas de SCU. Sin embargo, de to-
dos los modelos descritos hasta el momento, son pocos los que han demostrado
su efectividad en trasplantes clínicos.

Tabla 2. Resultados de algunos protocolos de expansión empleados para el cultivo

de células troncales o progenitores hematopoyéticos de sangre de cordón umbilical.

Población Células Ensayos in vivo

Condición de CNT CFU
celular inicial CD34+ (en ratones)
cultivo (IV) (IV)
204 (IV)
Citocinas + es-
CD34+ 35 NR NR NR
troma de MO
Injerto de células
CD34+ Citocinas 348-587 55-80 NR cultivadas por 7-8
semanas
Bajo porcentaje de
CD34+CD38-
Citocinas 12.6 9.4 19.1 injerto después de 6
Lin-
días en cultivo
Elevado porcen-
Citocinas + es- taje de injerto con
CD34+ 224 140 89
troma de MO células cultivadas 4
semanas
Bajo porcentaje de
injerto con células
CD34+ Citocinas NR 18.1±2.4 20.9±5.4
cultivadas por 7
días.
Injerto en pacientes
CMN Citocinas 4.5-5.4 171-518 NR junto con células sin
expandir.
CD34+ Citocinas + MSC
4.6 ± 0.6 NR 3.75±0.9 NR
CD38- de MO
Lin- Citocinas 77.1±0.2 34±8 NR NR

CD34+ Citocinas + BGM NR NR 8.2±10 Injerto

Citocinas +
CD34+ inhibidores de 30-70 NR 3 Injerto
caspasas
Injerto en pacientes
562 ±
CD34+ Citocinas NR 164±48 junto con células sin
134
expandir
Abreviaturas del cuadro: IV: Incremento en veces con respecto al día cero de cultivo; MO: Médu-
la ósea; NR: No reportado; MSC: Células Troncales Mesenquimales; BGM: Betaglucano Maitake.
Referencias, 26-35 y 40.
capitulo VIII Sangre de cordón umbilical: biología, almacenamiento y trasplante clínico

Las células expandidas no se han introducido como dosis única en pacientes,

sino que sólo una parte de cada unidad de SCU se emplea en la expansión (re-
gularmente 1/3 de la unidad), conservando el resto para introducirlo junto con
las células obtenidas del cultivo. Una alternativa es el empleo de dos unidades,
compatibles entre sí y con el receptor, de las cuales, una es expandida y otra se
introduce sin manipular (40). Los esquemas empleados depende del protocolo
clínico, siendo el más relevante el momento en que se aplican las unidades (jun-
tas en el día cero del trasplante o separadas por algunos días). Por ello, el impacto
del procedimiento de la expansión de CPH de SCU en pacientes, no se saben con
certeza, pues su efecto puede estar encubierto por las CPH sin expandir y que
han sido introducidas a la par (31). Sin embargo, se ha evaluado que no existe
efecto tóxico de las células expandidas introducidas en los pacientes, lo que esti-
mula el desarrollo de estrategias de cultivo de las HSC/CPH de SCU (41).

ALMACENAMIENTO DE LA SANGRE DE CORDÓN UMBILICAL

El primer Banco de Sangre de Cordón Umbilical (BSCU), de carácter público,

fue establecido en 1991, por Pablo Rubinstein en New York, lo que permitió los
primeros trasplantes de SCU no relacionada, convirtiéndo así a la SCU en una
opción para pacientes que carecen de un donador de HSC/CPH de MO (42, 205
43). Posterior al primer trasplante de SCU, los dos siguientes se realizaron usando
unidades provenientes de este banco (43).

En la actualidad, existen más de 107 BSCU en el mundo, casi todos públicos

(44). Estos BSCU han permitido la realización de trasplantes de SCU no relaciona-
dos en niños y adultos, con enfermedades hematopoyéticas y no hematopoyéti-
cas (Tabla 3) (43). Debido al crecimiento de número de BSCU, fue necesario esta-
blecer una fundación que regula su establecimiento y que permitiera compartir
la información contenida en cada uno de ellos. Este organismo es NETCORD,
que se fundó en 1998, su misión es mantener el registro internacional de unida-
des de SCU y desarrollar procedimientos y normas de calidad para su uso clínico
seguro. Estos esfuerzos permitieron, a su vez, el establecimiento de la sociedad
NETCORD-FACT (Fundación para la acreditación de terapia celular), quien es la
encargada de emitir los estándares internacionales para la acreditación de la
recolección, procesamiento, análisis y criopreservacion de la SCU (43).
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

Tabla 3: Enfermedades tratadas con células provenientes de SCU.

Leucemias agudas Síndromes mielodisplasicos

Leucemia bifenotípica aguda Amiloidosis
Leucemia linfocítica aguda (LLA) Leucemia mielomonocítica crónica
Leucemia mieloide aguda (LMA) (LMMC)
Leucemia indiferenciada aguda Anemia refractaria (AR)
Leucemias crónicas Anemia refractaria con exceso de blas-
Leucemia linfocítica crónica (LLC) tos (AREB)
Leucemia mieloide crónica (LMC) Anemia refractaria con exceso de blas-
Leucemia mieloide crónica juvenil (LMCJ) tos en transformación (AREB-T)
Leucemia mielomonocítica juvenil (LMMJ) Anemia Refractaria con sideroblastos en
anillo (ARSA)

Desórdenes de células troncales

Desórdenes mieloproliferativos
Anemia aplástica (severa)
Mielofibrosis aguda
Citopenia congénita
Metaplasia mieloide agnogénica (mielofi-
Disqueratosis congénita
brosis)
Anemia de Fanconi
Trombocitopenia esencial
Hemoglobinuria paroxística nocturna
Policitemia vera
(HPN)

Desórdenes Linfoproliferativos
Anormalidades plaquetarias hereditarias
Enfermedad de Hodgkin
Amegacariocitosis/Trombocitopenia
Linfoma no-Hodgkin
206 Leucemia prolinfocítica
congénita

Desórdenes Fagocíticos Desórdenes histiocíticos

Síndrome Chediak-Higashi Linfohistiocitosis eritrofagocitica familiar
Enfermedad granulomato crónica Hemofagocitosis
Deficiencia en actina de neutrófilos Histiocitosis-X
Disgénesis reticular Histiocitosis de células de Langerhans

Desórdenes del sistema inmune Con-

génitos (Hereditarios)
Enfermedades de almacenaje liposomal Síndrome de Inmunodeficiencia Se-
Adrenoleucodistrofía vera combinada, ausencia de células
Enfermedad de Gaucher ByT
Síndrome de Hunter (MPS-II) Síndrome de inmunodeficiencia seve-
Síndrome de Hurler (MPS-IH) ra combinada, ausencia de células T
Enfermedad de Krabbe Ataxia-Telangiectasia
Síndrome de Maroteaux-Lamy (MPS-VI) Síndrome de linfocitos Bare
Leucodistrofía metacrómica Inmunodeficiencia variable común
Síndrome Morquio (MPS-IV) Síndrome DiGeorge
Mucolipidosis (enfermedad celular I) Síndrome Kostmann
Mucopolisacaridosis (MPS) Deficiencia en la adhesión leucoci-
Enfermedad de Niemann-Pick taria
Síndrome de Sanfilippo Síndrome de Omenn
Deficiencia Beta-glucoronidasa, Síndrome Sly Inmunodeficiencia severa combinada
Enfermedad Wolman Síndrome de Wiskott-Aldrich
Desorden linfoproliferativo ligado a
cromosoma X
capitulo VIII Sangre de cordón umbilical: biología, almacenamiento y trasplante clínico

Anormalidades de eritrocitos hereditarias

Desórdenes de células plasmáticas
Beta-Talasemia mayor
Mieloma múltiple
Anemia de Diamond-Blackfan
Leucemia de células plasmáticas
Aplasia pura de la serie roja
Macroglobulinemia de Waldenstrom
Enfermedad de células en hoz

Otras enfermedades malignas

Otros desórdenes hereditarios
Tumores de cerebro
Hipoplasia cabello-cartílago
Sarcoma Erwing
Lipofuscinosis ceroide
Neuroblastoma
Porfiria eritropoyética congénita
Cáncer de ovario
Trombastenia Glanzmann
Carcinoma de células renales
Síndrome Lesh-Nyhan
Cáncer de pulmón de células peque-
Osteopetrosis
ñas
Enfermedad Tay Sachs
Cáncer testicular
Enfermedades autoinmunes
Síndrome Evan
Esclerosis múltiple (a nivel experimental)
Artritis reumatoide (a nivel experimental)
Lupus eritematoso sistémico (a nivel experimental)
Aplicaciones clínicas emergentes de las células troncales (a nivel experimental)

Enfermedad de Alzheimer Daño en médula espinal

Enfermedad de Parkinson Diabetes
Enfermedades cardíacas Distrofia muscular 207
Enfermedades hepáticas Esclerosis múltiple
Infarto cerebral Lupus

Fuente: [Link] (56)

Existen dos tipos de BSCU, los públicos y los privados. Los bancos públicos por
lo general son subsidiados por entidades gubernamentales o de bien público, sin
fines de lucro. Se dedican a recolectar y almacenar la SCU donada por las muje-
res gestantes quienes, antes del parto, deben de dar su consentimiento. Una vez
donada, la SCU pasa a ser propiedad de la institución colectora, que se encar-
gará de su procesamiento y criporeservación, ocupándose de todos los aspectos
de seguridad para proporcionar un producto biológicamente adecuado y segu-
ro a quiénes lo necesitan. Por otro lado, los bancos privados, tienen la finalidad
de salvaguardar la SCU para ser usadas por el mismo donador, en caso de que
en el futuro desarrolle una enfermedad, o puede ser empleada por un familiar
del donante que él considere. En este caso, se debe tener el consentimiento de
recolección firmado por la mujer gestante, junto con un contrato que avale el
resguardo de la SCU, siendo la unidad propiedad de la familia, ya que el costo
del servicio es erogado por ellos (42,43). Existe una polémica con la existencia de
los bancos privados, que radica principalmente, en la baja probabilidad de que
la unidad sea útil para el donante de la misma (1 en 20,000) (45). Se debe tomar
en cuenta que si el niño, cuyas células han sido criopreservadas, desarrolla una
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

enfermedad onco-hematológica en los primeros meses de vida, no sería raro que

las células guardadas también presenten información genética que haya predis-
puesto a la enfermedad. Es importante mencionar que los bancos privados no
pueden obtener su registro en ninguna de las fundaciones que rigen a los BSCU
públicos; sin embargo, eso no los excluye de seguir sus indicaciones y mantener
los mismos estándares de calidad de sus unidades de SCU almacenadas.

Los protocolos para la recolección, procesamiento y criopreservación de

muestras de SCU, son relativamente sencillos y, a continuación, se describen
brevemente.
Recolección: La recolección puede llevarse a cabo previo al alumbramiento
(recolección in-útero) antes de que la placenta sea expulsada, mediante la
punción y aspiración de la vena umbilical, o después del alumbramiento (reco-
lección ex-útero). En este último caso, la sangre es colectada por gravedad. En
ambos casos, la SCU se recolecta en bolsas con anticoagulante, que una vez
llenas, se mantienen a una temperatura entre 15º C y 25º C, hasta su traslado al
laboratorio de procesamiento, no debiendo ser refrigerada; la bolsa debe ser
entregada al laboratorio dentro de las 48 horas de haberse realizado la reco-
lección. Ambos métodos de recolecta no producen diferencias en cuanto a la
obtención del número de CNT o volumen total de las unidades de SCU.
208 Procesamiento y Análisis: Las normas actuales emitidas por NETCORD-FACT, in-
dican que todas las unidades de SCU deben de ser procesadas dentro de las 24
hrs. de la toma, ya sea en un sistema cerrado o en una sala limpia, para garan-
tizar la esterilidad y evitar la contaminación durante el proceso. El volumen de la
SCU deberá ser mayor de 60 ml para ser considerada dentro de los parámetros
establecidos para su procesamiento. Las primeras unidades almacenadas por los
BSCU fueron congeladas sin ser manipuladas, pero pronto quedo claro que el
almacenamiento a largo plazo de un gran número de unidades crearía un pro-
blema de espacio, por lo que era necesaria la reducción del volumen antes de
ser guardadas. Los métodos de reducción del volumen se basan en eliminar a
los glóbulos rojos y reducir el volumen del plasma, dejando la capa leucocitaria
en un volumen estándar, manteniendo la calidad y cantidad de las HSC/CPH
recolectadas. Una importante consideración con los métodos para la reducción
del volumen, es la preservación del mayor número de CNT y de células CD34+
en la capa leucocitaria almacenada. La SCU es separada en sus componentes
celulares (plasma, leucocitos y células rojas) por centrifugación o por sedimenta-
ción. Para la concentración celular se utilizan juegos de bolsas interconectadas
para trabajar en circuito cerrado, donde se incluye la bolsa de criopreservacion;
estos sistemas tienen menos probabilidad de contaminación, y una menor expo-
sición de las células a substancias químicas y a la agresión gravitacional. De cada
unidad colectada se toman alícuotas para realizar estudios para la determina-
ción de HLA, grupo sanguíneo y factor Rh, serologías virales (VIH, hepatitis B y C),
cultivos para bacterias y hongos. También se realizan análisis para determinar el
capitulo VIII Sangre de cordón umbilical: biología, almacenamiento y trasplante clínico

probable riesgo de transmisión de enfermedades infecciosas o genéticas. Final-

mente, de la capa leucocitaria concentrada, se toman alícuotas para realizar
recuentos celulares (CNT, CMN y con inmunofenotipo CD34+, y CFU).

Criopreservación: El concentrado leucocitario es mezclado con un crioprotec-

tor que habitualmente es dimetilsulfóxido (DMSO) diluido en Dextran 40, al 10%.
Este concentrado celular es transferido a bolsas especiales de almacenamiento
de PVC o poliolefina o, en algunos casos, en crioviales que soporten bajas tempe-
raturas. Se ha reportado que el mantenimiento en viales a cualquier temperatura
de criopreservación es inferior al que se logra con bolsas de PVC o de poliolefina,
logrando una mejor viabilidad en las unidades descongeladas. El proceso de crio-
preservación se realiza a una velocidad de enfriamiento de -1º C por minuto, hasta
alcanzar la temperatura constante presente en el nitrógeno líquido. Este proceso
de congelación gradual reduce el riesgo de pérdida celular por cambios bruscos
de temperatura. El almacenamiento se realiza en un contenedor bicameral, lo
que permite su uso en momentos diferentes. El contenedor se introduce en una
canastilla metálica antes de su almacenamiento definitivo en el tanque de crio-
preservación. Bajo estas condiciones, la recuperación de la viabilidad de las célu-
las congeladas esta por arriba del 80%, tanto de CNT como de CPH, confirmadas
por ensayos de CFU y la presencia de la molécula de superficie CD34 (44).

Los valores aceptables para el volumen y las CNT contenidas en una unidad 209
de SCU almacenada, son establecidos por el programa de cada BSCU, garan-
tizando que se cumplan los requisitos de los centros de trasplantes. La mayoría
de los BSCU almacenan unidades de SCU con un conteo de CNT por arriba de
100x109. Es importante mencionar que los lineamientos de criopreservación han
sido establecidos para HSC y CPH; otros tipos de SC (como las MSC y USSC) no
han sido identificadas en unidades de SCU congeladas (46). Específicamente,
estos dos tipos de SC se han aislado de unidades frescas, almacenándose de
forma posterior a su expansión in vitro.

EXPERIENCIA CLÍNICA

Hasta el año 2010 se habían realizado más de 20 000 trasplantes en todo el mun-
do, empleando la SCU como fuente de las HSC/CPH (47). La experiencia clíni-
ca con trasplantes de SCU, tanto con donadores relacionados (emparentados)
como no relacionados, ha demostrado que existe una elevada probabilidad de
injerto confiable, reduciendo el riesgo de enfermedad injerto contra huésped
(GVHD, del inglés Graft Versus Host Disease), y un tiempo de sobrevida superior
comparado con trasplantes de MO y SPm (48). La SCU tiene las ventajas, con
respecto a MO, de no ser un tratamiento invasivo para el donador y sin ningún
riesgo para el mismo, lo cual se refleja en los costos de un trasplante, además
del bajo riesgo de transmisión de infecciones por citomegalovirus y herpesvirus
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

(comunes en trasplantes de MO) y la capacidad de generación de todos los

linajes sanguíneos. En la Tabla 4, se resumen algunas características de la SCU,
en comparación con MO y SPm de su empleo en trasplantes de HSC/CPH.
Tabla 4. Características comparativas entre las diferentes
fuentes de HSC empleadas en terapias de trasplante.

Sangre
Sangre periférica
Médula ósea de cordón
movilizada
umbilical
Porcentaje células
1-4% 0.8-2.9%
CD34+ en CMN

Riesgo donador Presente Presente Inexistente

Transmisión de
infecciones virales Alta Alta Mínima
como CMV y VEB
Mortalidad
28-67% 13-37% 19-27%
relacionada con
trasplante al día 100 PtT
Sobrevida a 2 ó 3 años
28-66% 38% 49-64%
PtT
Injerto de neutrófilos 15-25 días PtT 12-19 días PtT 22-68 días PtT
210
Injerto de plaquetas 15-30 días 10-28 días 15-255 días

Recuperación inmune 1-12 meses 1-12 meses 8-24 meses

Flexible: hasta
Alta para asegurar Alta para asegurar 2/8 para
Histocompatibilidad
injerto (8/8 o 7/8) injerto (8/8 o 7/8) asegurar
injerto

Incidencia de EICH Alta Alta Baja

Tipo de EICH: Aguda

10-40% 7-28% 0-36%
(II-IV)
13-54% 40-100% 4-25%
Crónica
Pediátricos y Pediátricos y
Pacientes Pediátricos
adultos adultos

Número de CNT 1-28X 107/

12-40 X 107/kg de 9.5 X 108/kg de peso
introducidas por kg de peso
peso corporal corporal
trasplante corporal
Número de células
6-23 X 105/kg de 1-3X 105/kg de
CD34+ introducidas
peso corporal peso corporal
por trasplante
Volumen de la 0.05-0.15 litros
muestra o unidad para 0.9-1 litros (1 X 109 CNT/
trasplante. unidad)

CMN, células mononucleares; CMV, Citomegalovirus; VEB, Virus Epstein-Barr, PtT, Post-trasplante;
CNT, Células nucleadas totales. Referencias 32, 42, 51-54.
capitulo VIII Sangre de cordón umbilical: biología, almacenamiento y trasplante clínico

Tipificación

Se ha demostrado que la compatibilidad de los antígenos leucocitarios humanos

(HLA, del inglés Human Leukocyte Antigen) para un trasplante, es menor en los
de tipo alogénico que en los autólogos; sin embargo, la capacidad de almace-
namiento de los BSCU públicos, permite una disponibilidad y diversidad genética
amplia. Una compatibilidad óptima entre el donador y el receptor requiere de un
mínimo de 8/8 alelos de HLA (en los alelos A, B, C y DRB1); conforme se aleje de
esta compatibilidad, hay mayor asociación con un mal pronóstico de sobrevida,
mortalidad relacionada al trasplante (MRT) y una elevada frecuencia de GVHD.
Otros alelos, como el DQB1 y DPB1, se encuentran en estudio como factores de
seguimiento clínico, de demostrarse su efectividad, elevaría la búsqueda a 10 ale-
los, lo que repercutiría negativamente en la posibilidad de encontrar un donador
histocompatible. El tiempo promedio para encontrar un donador de MO va entre
los 3 a los 5 meses, en país que cuentan con registros actualizados. Una alternativa
que reemplaza el tener un donador histocompatible de 8/8 alelos, es hallar algu-
no con sólo 3 de 6 antígenos HLA (alelos A, B y DRB1). Estos trasplantes requieren
que la donación de HSC/CPH, cuando proviene de una fuente adulta, sea vía
SPm, lo anterior por que la proporción de células CD34+ es elevada, lo que puede
contrarrestar la barrera de no histocompatibilidad total (49). En el caso de SCU, se
siguen las mismas indicaciones de tipificación, aunque teniendo en cuenta que el 211
número de CNT donantes es finito y que cada unidad es irrepetible.

Dosis

El éxito del injerto y sobrevida del paciente después del trasplante depende del
número de células nucleadas totales infundidas o del número de células CD34+
por kilogramo de peso del receptor (48), aunque el nivel de histocompatibilidad
también tiene efecto. Cuando la compatibilidad entre las células de SCU y el re-
ceptor es en sólo 7 de 8 antígenos, una dosis ≤ a 2.5-3 x107 CNT/Kg, es considerada
aceptable para realizar el trasplante. Por otra parte, datos recientes recomiendan
que cuando el número de alelos de HLA dispares sean ≥ a 2, el promedio de CNT
para un trasplante de SCU debe ser ≥ a 2.5 x 107 por Kg de peso del receptor. Para
aquellos trasplantes donde los antígenos de histocompatiblidad sean idénticos
(en pacientes pediátricos) y se trate de enfermedades oncológicas, el promedio
de dosis celular para SCU es de 4.7 x 107 CNT/Kg, casi diez veces menos que cuan-
do se emplea MO como fuente (en promedio 35 x 107 CNT/ Kg) (50)
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

Enfermedad injerto contra huésped

Una de las complicaciones médicas más comunes de un trasplante, es el desa-

rrollo de una enfermedad secundaria provocada por la respuesta inmune de las
células del donador contra los tejidos del receptor, conocida como GVHD, que
es una evidencia de rechazo al trasplante. Se ha demostrado que el trasplante
con células de SCU, tanto relacionado como no relacionado, conduce a una
reducida incidencia de GVHD, en cualquiera de sus grados o tipos (aguda o
crónica). La severidad de GVHD es menor cuando se emplea SCU comparada
con los procedimientos en los que se usa MO o SPm, con grado similar de com-
patibilidad en los HLA. Por otra parte la SCU permite trasplantes con histocom-
patibilidad en tan sólo 2 de 8 antígenos (Tabla 4). Sin embargo, a pesar de la
disminución en GVHD, los efectos de un injerto en contra de una leucemia (IvL)
se mantienen, los rangos de recaída son comparables a los trasplantes realiza-
dos con MO no relacionados. Todo lo anterior hace a la SCU una mejor fuente
de HSC/CPH. La disparidad entre los HLA es el principal factor que determina la
severidad de la GVHD, por ello, resulta de suma importancia la tipificación de
los alelos entre la SCU del donador y el receptor (48-50).

212 Injerto de los diferentes linajes celulares

El éxito del injerto en neutrófilos se encuentra entre un 78 a 92%, con tiempos que
se ubican entre los 23 y 33 días, mientras que para plaquetas se cuenta con un in-
jerto de entre el 60 al 90%, posterior al día 180 postrasplante, en promedio. La do-
sis de CNT, específicamente el número de células CD34+, es el factor de mayor
influencia para que se den los valores de injerto previamente reportados. Otra
variable que puede afectar, pero con menos peso, es la disparidad en los HLA,
sobretodo para la recuperación de neutrófilos; al parecer, el régimen clínico pre-
vio al trasplante no tiene un efecto significativo en los tiempos de injerto (48-50).
Por otra parte, los datos de recuperación inmune después de un trasplante con
SCU son limitados, pero sugieren que ésta puede ocurrir en tiempo semejantes, o
incluso más rápido, que lo reportado para otras fuentes como MO y SPm, donde
se eliminó la presencia de células T (41). Sin embargo, la ausencia de estos datos
en la literatura especializada es resultado, al menos en parte, de técnicas sensi-
bles que permitan medir de manera funcional y antígeno específica, la función
inmune del injerto, tanto en trasplantes con SCU como con MO o SPm.

El riesgo de recaída después de un trasplante de SCU, en pacientes con en-

fermedades oncológicas, se ha reportado en un 26% para trasplantes relacio-
nados (29 a 34 meses postrasplante) y en un 30 a 30% en pacientes no rela-
cionados (2 a 3 años postrasplante) (48-50). Por otra parte, la sobrevida de los
pacientes es menor en aquellos trasplantados con SCU por una enfermedad
maligna que aquellos con una no maligna. El promedio de sobrevida libre de
enfermedad (SLE) a dos años, es de 36%, 21% y 51% para enfermedades onco-
capitulo VIII Sangre de cordón umbilical: biología, almacenamiento y trasplante clínico

lógicas, defectos de nacimiento y anemia aplásica, respectivamente (trasplan-

tes no relacionados). Para trasplantes relacionados, la sobrevida se ubica por
arriba del 60%. Existe un trabajo en donde se reportan los datos de sobrevida
de 161 pacientes pediátricos, trasplantados con SCU o MO, señalándose que
existe una menor incidencia de GVHD crónica cuando se empleó SCU, a dos
años postrasplante (49).

Para pacientes adultos (n=966), un estudio sugirió que no existen diferencias

en la SLE con disparidades en 1 o 2 antígenos para trasplantes con SCU, compa-
rados con MO (6 de 6). También se ha reportado que el empleo de 2 unidades
de SCU para pacientes adultos, para contrarrestar las dosis celulares limitantes,
coincide con una mejoría en el rango de injerto hematopoyético, sin incremen-
tar la incidencia de GVHD aguda (49).

Experiencia en trasplantes no hematopoyéticos

Las características biológicas de la SCU descritas en el presente capítulo, junto con

la facilidad con la cual puede ser obtenida, ha permitido que se busquen usos al-
ternativos, siendo actualmente empleada para dar tratamiento a enfermedades
no relacionadas con el sistema hematopoyético (Tabla 3 ). Entre las diferentes apli-
caciones en las que se ha sugerido que esta fuente puede tener un efecto bené- 213
fico se encuentran: enfermedades autoinmunes; infarto al miocardio; diabetes y
desordenes neurológicos (infarto cerebral, enfermedad de Alzheimer y Parkinson,
esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad infantil de Krabbe y daño agudo de la
médula espinal). La mayoría de los protocolos se encuentran en fase preclínica
empleando animales; muy pocos han sido aprobados para utilizarse en humanos.
Entre los ejemplos más notables se encuentra el protocolo de la Universidad de
Duke, en Durham, Carolina del Norte, donde se ha probado el trasplante de SCU
en niños con la enfermedad de Krabbe. Los resultados iniciales indican una mejo-
ría repentina en los movimientos corporales de los pacientes, sugiriendo una mie-
linización de las neuronas, sin que se tuviera una idea clara del mecanismo por el
cual ocurría (51); sin embargo, casi tres años después de realizados los trasplantes,
quedó de manifiesto que la mejoría por la aplicación de SCU fue sólo en el retardo
de la enfermedad, pero no de su remisión completa (52). Pese a esto, se sigue tra-
bajando en el establecimiento de la vía correcta para realizar el trasplante (local o
sistémica), así como el régimen clínico previo al mismo, el tipo de células y la dosis
a ser utilizada (53). Uno de los puntos más importantes a definir para la aplicación
de las células de SCU en enfermedades no hematológicas, son sus subsecuentes
complicaciones, particularmente saber cual es la forma más segura y eficaz de
su uso, además de cuales serían las enfermedades en las que tendrá un efecto
benéfico, sin generar riesgos potenciales adicionales.
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

Conclusiones

Los avances en la caracterización de las SC presentes en la SCU, particular-

mente las hematopoyéticas, han permitido ampliar su aplicación en trasplantes
no pediátricos. Sin embargo, la SCU no es la panacea para la cura de todas
las enfermedades, como varios bancos de SCU privados presentan en su infor-
mación publicitaria. La SCU es una opción terapéutica, con varias probables
aplicaciones aún en estudio, pero de ningún modo es un seguro de vida para el
donador o receptor de la misma. Los verdaderos alcances de sus beneficios o
complicaciones de su empleo, aún faltan por determinarse.

Agradecimientos

Al Dr. Héctor Mayani y al personal técnico del Laboratorio de Células Troncales y

Progenitoras Hematopoyéticas. Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CO-
NACYT) y al Fondo de Investigación en Salud del IMSS, por el apoyo económico
para realizar investigación sobre SC de SCU. A los compiladores por la invitación.

214
capitulo VIII Sangre de cordón umbilical: biología, almacenamiento y trasplante clínico

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217
Capítulo IX

Células troncales tumorales:

el modelo de leucemias mieloides

María Antonieta Chávez-González

& Dafne Moreno Lorenzana

RESUMEN

Existen diversas poblaciones de células troncales con propiedades únicas en to-

dos los tejidos de los organismos multicelulares adultos, y son componentes fisio-
lógicos cruciales en la autorrenovación, mantenimiento y reparación de daño.
En los últimos años, evidencia creciente indica que las células troncales también
están involucradas en la patogénesis de diferentes tumores y su existencia ha
sido demostrada en un amplio número de cánceres humanos, siendo las leuce-
mias mieloides el modelo mejor descrito.

El presente capítulo muestra una revisión sobre los principales mecanismos que
regulan la conducta de las células troncales leucémicas, los modelos sobre el origen
y desarrollo tumoral, las estrategias celulares que provocan fallas al tratamiento y
la reciente descripción de células troncales en algunos tumores sólidos, todo esto
con la finalidad de situar al lector en un marco actual del conocimiento, haciendo
especial énfasis en las grandes interrogantes que aún rodean a la biología tumoral.

INTRODUCCIÓN

Bajo condiciones normales, las células troncales representan poblaciones celu-

lares numéricamente reducidas, que tienen la capacidad de autorrenovarse,
proliferar y generar múltiples linajes celulares. Estudios realizados en las últimas
décadas han demostrado que, semejante a la normalidad, diversos tumores
son originados y mantenidos gracias a la existencia de células troncales tumo-
rales, siendo el modelo mejor descrito el de los tumores del sistema hematopo-
yético, específicamente las leucemias mieloides, de las que ahora se sabe se
originan en una población de células troncales leucémicas, con características
y comportamiento biológico muy particular.

Algunos marcadores característicos de las células hematopoyéticas normales

así como el estado de quiescencia, son compartidos entre la hematopoyesis nor-
mal y su contraparte leucémica. No obstante, existen importantes diferencias entre
los mecanismos que regulan la proliferación, expansión, diferenciación, autorreno-
vación y muerte de ambas poblaciones, eventos que asociados a factores provis-
tos por el microambiente tumoral así como a alteraciones en el mismo, parecen
participar directamente en el crecimiento, mantenimiento y desarrollo tumoral.
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

Como resultado de la creciente investigación sobre células troncales hema-

topoyéticas normales y leucémicas, las patologías hematológicas son actual-
mente abordadas empleando estrategias clínicas y moleculares enfocadas a
eliminar a la población troncal tumoral ya que su permanente estado de quies-
cencia las ubica como responsables principales de resistencia o intolerancia a
fármacos, así como a fallas al tratamiento, situaciones que están directamente
asociadas con las recaídas de la enfermedad.

CÉLULA TRONCAL TUMORAL Y SU ORIGEN

La existencia de una célula troncal tumoral representa la visión actual de la

observación realizada en 1855 por los patólogos Rudolph Virchow y Julius
Cohnhein, quienes proponían que las células cancerosas eran el resultado de la
activación de tejido embrionario dormante o quiescente y remanente; propues-
ta que sustentaban en la similitud histológica existente entre fetos en desarrollo
y teratocarcinomas. Entre 1960 y 1970 diversos autores sugirieron que los tumo-
res comprenden poblaciones celulares heterogéneas, ya que sólo un pequeño
porcentaje de células provenientes de diferentes tipos tumorales (mieloma, lin-
foma, leucemias, cáncer de ovario y cerebro) tenían potencial clonogénico,
220 lo que condujo a especular acerca de la presencia de una fracción celular de
número reducido y con características especiales, a la que más tarde denomi-
naron célula troncal tumoral o cancer stem cell (CSC) (1).

Durante los siguientes años, el estudio de diferentes tumores aportó eviden-

cias de que el cáncer es producto del arresto en la maduración de células
específicas de un tejido. Sin embargo, no fue hasta finales de 1980 y principios
de los noventas, que se dispararon los avances tecnológicos que gradualmente
fueron revelando hallazgos importantes. Irving Weissman y colaboradores com-
binaron el uso de la separación celular activada por fluorescencia (FACS), desa-
rrollada por Herzenberg en 1972 con el desarrollo de anticuerpos monoclonales
dirigidos a moléculas de superficie celular que podían asociarse con linajes y
estados de desarrollo definidos, describieron con ello la ontogenia del sistema
hematopoyético normal y fueron pioneros en describir y utilizar modelos de xe-
notrasplante humano-ratón para recapitular y analizar la hematopoyesis normal
(2,3,4). Estos estudios fueron posteriormente aplicados a la ontogenia tumoral
que en el sistema hematopoyético corresponde a las leucemias.

El modelo de xenotrasplante, fue refinado por el grupo de John Dick, utilizan-

do ratones inmunodeficenes (SCID, del inglés Severe Combined Immunodefi-
ciency) y ratones diabéticos no obesos (NOD/SCID), con lo cual demostraron
por primera vez que las células aisladas de sujetos sanos y de pacientes con
diagnóstico de leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfoblastica aguda
(LLA) y leucemia mieloide crónica (LMC), podían injertar y proliferar en ratones
SCID, y que las células leucémicas eran capaces de recapitular la enfermedad
capitulo IX Células Troncales Tumorales: el Modelo de Leucemias Mieloides

humana. Estos hallazgos dieron evidencia contundente de la existencia de cé-

lulas troncales normales y tumorales que inicialmente recibieron el nombre de
células repobladoras de ratones SCID (SRC), en el caso de la normalidad y cé-
lulas iniciadoras de leucemia en ratones SCID (SL-IC, del inglés SCID-Leukemia
Initiating ) en el caso de las que provenían de las patologías mencionadas (1,5).

Una vez que se conocía la existencia de células tumorales capaces de recapitu-

lar una enfermedad, la curiosidad científica se vio plagada de nuevas interrogan-
tes. ¿Cómo se originan las SL-IC?, ¿Existen estados pre-tumorales que finalmente lle-
ven a la generación de un tumor?, ¿En un tumor todas las células son iguales?, etc.

Una aproximación para responder estas preguntas fue considerar que la gran
mayoría de las células en un organismo son transitorias, es decir tienen un tiempo
de vida media definido antes de ser remplazadas por nuevas células. Con esta
idea, cualquier alteración genética que se originara en alguna de éstas células
transitorias no podría persistir, al menos que una misma célula adquiera eventos ge-
néticos adicionales que magnifiquen y hagan evidente la alteración o bien, que la
alteración inicial tuviera lugar en células con características especiales como son
las células troncales normales (ampliamente descritas en los capítulos I y VI).

De acuerdo a lo anterior, si consideráramos que un proceso de génesis tumo-

ral (patogénesis) tiene múltiples pasos, podrían plantearse los siguientes escena- 221
rios: 1) que una célula troncal normal adquiera una primera mutación (evento
pre-tumoral) que provoque inestabilidad genómica, contribuyendo con ello a
la adquisición de una segunda mutación en la misma célula, para dar lugar al
desarrollo y progresión de la enfermedad (Figura 1A), 2) que una célula troncal
normal adquiera una primera mutación, que le permita continuar con su proceso
de maduración y que sea hasta el estado de célula progenitora o precursora, en
donde se adquiera la segunda mutación que desencadene la patología (Figura
1B), o 3) que las células troncales y progenitoras tengan un desarrollo normal y
sea hasta estados finales de la diferenciación en que se adquieran los eventos
genéticos necesarios para iniciar la enfermedad (Figura 1C) (6,7). El resultado final
en los tres escenarios anteriores, es la aparición de una célula iniciadora de tumor
que presenta una primera alteración y posteriormente adquiera la capacidad
de autorrenovación, dando lugar a una CSC, responsable del mantenimiento del
tumor, pero cuyo origen y desarrollo tendrá serías implicaciones terapéuticas.
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

Figura 1. Génesis tumoral. La figura muestra tres modelos que sugieren el origen y evolución de la
LMA. A) Una célula troncal normal adquiere una lesión que genera inestabilidad genómica y condu-
ce a una segunda lesión en la misma célula, B) La primera lesión se origina en una célula troncal sin
alterar su diferenciación hacia célula progenitora, siendo este estadio donde se presenta la segunda
alteración y C) La primera y segunda lesión aparecen a nivel de células progenitoras. En los tres ca-
sos, el resultado es la aparición de una LSC y su consecuente desarrollo tumoral (Modificado de 7).

222 Una vez que el tumor se ha establecido, las siguientes cuestiones por enten-
der son ¿Cómo es que el tumor se mantiene? y ¿Todas las células dentro del mis-
mo tumor son iguales? En este sentido, diversos grupos en el mundo han demos-
trado que tal y como se proponía desde los años sesenta, un tumor comprende
una población celular heterogénea tanto morfológica como funcionalmente y
para explicar su permanencia y desarrollo se han propuesto dos modelos mu-
tuamente excluyentes (Figura 2).

El modelo jerárquico predice que una vez que existe una CSC, el tumor se
comporta como una modificación del desarrollo normal de los tejidos y que
mantiene un orden jerárquico. En este modelo las CSC son biológicamente dis-
tintas del resto de las células presentes en el tumor, ya que ellas y sólo ellas, po-
seen la capacidad de autorrenovarse y generar progenie con cierto grado de
maduración, por lo que la descendencia no contribuye significantemente a la
perpetuación del tumor (Figura 2). El modelo estocástico o de evolución clonal
propone que una vez que se genera un tumor, todas las células que lo integran
son biológicamente equivalentes y que la conducta tumoral es influenciada por
factores intrínsecos (propios de la célula) como: FT y vías de señalización; o por
factores extrínsecos (externos a la célula) como pueden ser: factores del hospe-
dero, microambiente, respuesta inmune, etc. Estos factores influyen de forma
no predecible o azarosa sobre la población tumoral en su conjunto y puede
generar subclones con diferentes estados de transformación, conduciendo con
ello a la variación intratumoral, aunque todas las células tienen capacidad de
autorrenovación, por mínima que esta sea (8) (Figura 2).
capitulo IX Células Troncales Tumorales: el Modelo de Leucemias Mieloides

Figura 2. Modelos de heterogeneidad tumoral. El modelo jerárquico propone la existencia de una cé-
lula troncal tumoral con propiedades biológicas únicas que la hacen responsable de la perpetuación
y mantenimiento tumoral. El modelo estocástico propone que todas las células del tumor son biológi-
camente equivalentes y que la conducta tumoral es modificada por factores intrínsecos o extrínsecos.

223

DEFINICIÓN DE LEUCEMIAS MIELOIDES

La existencia de células troncales tumorales fue inicialmente documentada en el

cáncer del sistema hematopoyético, es decir en las leucemias. En 1989, John Dick
y su grupo de investigación demostraron que al trasplantar células provenientes de
Leucemia linfoblástica aguda (LLA) de células B en ratones SCID, se recapitulaba la
enfermedad de forma muy semejante a lo que sucede en humanos y propusieron
el uso de este tipo de modelos in vivo, como una aproximación para entender el
crecimiento, progresión leucémica y abordaje terapéutico (9). En 1994 el mismo
grupo demostró que al fraccionar muestras provenientes de sujetos con leucemia
mieloide aguda (LMA), de acuerdo a la expresión de los antígenos CD34 y CD38,
sólo las células con fenotipo troncal (CD34+ CD38-) eran capaces de transferir la pa-
tología a ratones SCID (5). Años más tarde, se reportó la existencia de células con
características semejantes en la Leucemia mieloide crónica (LMC) (10).

Las leucemias son un grupo de enfermedades malignas del sistema hemato-

poyético, caracterizadas por una sobreproducción de leucocitos (células blan-
cas) que pueden encontrarse en etapas inmaduras, como sucede en el caso
de las leucemias agudas, o terminalmente diferenciadas como en las leucemias
crónicas. Además, las leucemias se subdividen de acuerdo al tipo de leucocito
en el que tiene su origen, de manera que existen leucemias mieloides y leuce-
mias linfoides (11). Las características generales de cada uno de los cuatro tipos
de leucemias se describen en la Tabla 1 (Modificado de 12).
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

TABLA 1. CLASIFICACIÓN Y CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LAS LEUCEMIAS

LMA LMC LLA LLC

De acuerdo a la FAB
(French American British)
De acuerdo a la
M0 (no diferenciadas),
FAB:
M1 (mieloblástica, sin
Fase L1 (células
maduración), Linfocitos B
Crónica (CP), pequeñas y
M2 (mieloblástica, con (más común)
Fase uniformes),
Clasificación maduración), Linfocitos T
Acelerada (AP), L2 (células
M3 (promielocítica), (menos común).
Crisis B grandes)
M4 (mielomonocítica),
lástica (BC) L3 (células
M5a (monoblástica),
grandes y
M5b (monocítica),
vacuoladas).
M6 (eritroblastíca),
M7 (megecarioblástica).
Linfocitos B:
CD19+, CD20+,
CD23+, CD43+,
CD5+, expresión
CD19+, CD10+,
Alta expresión de de cadena ligera
CD13+, CD33+, CD15+, CD20-/+ y TdT+
Fenotipo ILRap (proteína monotípica.
MPO+ (mieloperoxidasa), (desoxinucleotidil
accesoria del
CD117+ transferasa
receptor para IL-1) Linfocitos T: CD2+,
terminal).
CD3+, CD5+, CD7+,
expresión variable
de CD4 o CD8.

M2 y otros: t(8:21)(q22;q22);
224 fusión AML1-ETO. t(9;22) (q34;q11.2);
M3: t(15;17)(q22;q12); fusion BCR-ABL
fusión PML-RARα. t(v;11q23); fusion del(13q14);
Alteraciones M4: t(16;16)(p13;22); fusión MLL t(12 ;21) del(11q);
citogéneticas CBFβ-MYH11. t(9:22) (q34;q11) (p13 ;q22) ; del(17p);
y moleculares M4/M5. Anormalidades en fusión TEL-AML1 sobreexpresión
11q23. t(1;19) (q23; de CD38.
M0-M5: Mutaciones que p13.3); fusión E2A-
activan el receptor tirosina PBX1
cinasa FLT3.

Inhibidores de
Daunorubicina o
BCR-ABL: Imatinib
Citarabina, Ácido Trans Daunorubicina Quimioterapia,
(Gleevec
Retinoico para M3, o Citarabina, Anticuerpos
®), Dasatinib
Tratamiento Mylotarg® (gemtuzumab corticoides, monoclonales
y Nilotinib,
convencional ozogamicin), Inhibidores trasplante de (rituximab o
Interferon α y
de FLT3, trasplante de médula ósea. alemtuzumab)
Trasplante de
médula ósea.
médula ósea

Resistencia a
fármacos contra
Eventualmente
Bcr-Ab, perdida Resistencia a
Resistencia múltiples la enfermedad
de la remisión múltiples drogas,
Cambios drogas, recaída a la progresa hasta
molecular recaída a la
clínicos leucemia después de la que se vuelve
(Imatinib no leucemia después
remisión refractaria a la
elimina a LSC de la remisión.
terapia.
Ph+ que están
quiescentes)
capitulo IX Células Troncales Tumorales: el Modelo de Leucemias Mieloides

PROPIEDADES DE LAS CÉLULAS TRONCALES Y PROGENITORAS LEUCÉMICAS

Fenotipo y organización jerárquica

De forma semejante a la hematopoyesis normal, la hematopoyesis en las leu-

cemias mieloides mantienen un orden jerárquico y la punta de la pirámide está
ocupada por las células troncales leucémicas (LSC, del inglés Leukemic Stem
Cell ), definidas como las células leucémicas (tumorales) que tienen la capaci-
dad de autorrenovarse, dividirse y dar lugar a linajes celulares heterogéneos, y
que funcionalmente son responsables de recapitular la leucemia (o crecimiento
tumoral) in vivo. Estas LSC dan lugar entonces a progenitores y precursores tu-
morales que constituyen la mayor parte de la población anormal, pero que ya
no son capaces de autorrenovarse, aunque pueden o no alcanzar un estado
de diferenciación terminal.

Actualmente el modelo que mejor describe a las LSC, es el de leucemia mie-

loide aguda, en donde se ha descrito que de los 8 subtipos existentes, 7 se ori-
ginan en el compartimiento de las células troncales con fenotipo CD34+CD38-
(13) y el subtipo restante, que corresponde a la leucemia promielocítica aguda
(M3), inicia en la fracción de células progenitoras con fenotipo CD34+CD38+
(14). Aunado a lo anterior, se ha descrito que antígenos como CD90 y CD117 (c-
kit), no se encuentran o están disminuidos en las LSC, aunque si son expresados 225
en su contraparte normal (15,16). En contraste, moléculas como CD123, CD44 y
CD96, se encuentran sobre-expresados en células CD34+CD38- de LMA, pero su
presencia es mínima en la normalidad (17-19) (Figura 3A).

En el caso de la leucemia mieloide crónica, se ha determinado que el cromo-

soma Philadelphia (Ph) y su producto oncogénico Bcr-Abl —presente en el 95%
de los casos—, puede ser detectado en todos los linajes celulares maduros, en las
HSC, e incluso en células endoteliales de pacientes con dicha patología, lo que
ha sugerido que la enfermedad pudiera tener su origen en un progenitor más
primitivo que las HSC al que se ha denominado hemangioblasto. El trabajo de Ho-
lyoake y su grupo han demostrado que la LMC se origina en células Lin- CD34+ que
se encuentran en estado de quiescencia (fuera del ciclo celular) pero que son
capaces de recapitular la hematopoyesis leucémica cuando se trasplantan en
ratones inmunodeficientes. A diferencia de la LMA, este tipo de leucemia no ha
mostrado alteraciones en la expresión de moléculas de superficie, aunque recien-
temente se observó una estrecha asociación entre el cromosoma Ph y la proteína
accesoria del receptor de IL-1 (IL1RAP), planteándola incluso como un marcador
para distinguir a las LSC de su contraparte no leucémica (20-22) (Figura 3B).

Cabe mencionar que aunque existen grandes esfuerzos por encontrar un fe-
notipo que distinga a las LSC de su contraparte normal, la expresión de antíge-
nos de superficie cambia conforme progresa la diferenciación, y debemos estar
conscientes que la diferenciación es un proceso seriamente alterado en cáncer.
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

226

Figura 3. Jerarquía hematopoyética en leucemias mieloides. Los modelos muestran la coexisten-

cia de células troncales tumorales y células troncales normales. A) En la LMA se muestran los 8
diferentes subtipos en recuadros (M0-M7), que reciben su nombre dependiendo del tipo celular
específico en que la diferenciación se arresta, y tiene como consecuencia la elevación numérica
de sus respectivos blastos, aunque existen células maduras del resto de los linajes hematopoyé-
ticos. B) En la LMC se observa la presencia del cromosoma Philadelphia (Ph+) en todos los linajes
hematopoyéticos, siendo particularmente evidente un elevado número de granulocitos total-
mente diferenciados. HSC/LSC: Coexistencia de células troncales normales y leucémicas; MPP:
Progenitor multipotencial; ELP: Progenitor linfoide temprano; CLP: Progenitor linfoide común; T, NK,
B y DC: Células precursoras/maduras T, NK, B y dendríticas, respectivamente; CMP: Progenitor mie-
loide común; GMP: Progenitor granulo-monocítico; MEP: Progenitor megacariocítico-eritroide; G:
Granulocitos; M: Monocitos; Meg: Megacariocitos; E: eritrocitos; b, e, n, m, p, e: Células precurso-
ras/maduras basófilos, eosinofilos, neutrófilos, monocitos, plaquetas y eritrocitos, respectivamente.
capitulo IX Células Troncales Tumorales: el Modelo de Leucemias Mieloides

Alteraciones en el comportamiento celular

Como anteriormente se mencionó, una característica de las células de LMA es el

bloqueo en algún punto de su diferenciación, evento que se asocia directamente
a la presencia de daños moleculares ya que en el 80% de las leucemia mieloides
se encuentra por lo menos una alteración cromosómica, y se han descrito cerca
de 100 diferentes translocaciones asociadas a estos padecimientos hematológi-
cos que frecuentemente involucran genes asociados con FT, los cuales tienen re-
lación con el desarrollo y especificación del linaje hematopoyético (Tabla 1) (23).

Autores como Gilliland han propuesto el modelo de lesiones dobles (doble

hit) para el desarrollo de las leucemias. De acuerdo con este modelo, el primer
hit estaría relacionado con un bloqueo en la diferenciación y en consecuencia
asociado a las alteraciones cromosómicas mencionadas. El segundo hit, por su
parte, debe estar asociado con un incremento en la proliferación y/o modifica-
ciones en los procesos de muerte celular por apoptosis apoptosis (24).

En este sentido, las ventajas de proliferación son provistas por la activación

de receptores para factores de crecimiento que envían continuamente señales
mitogénicas, como es el caso del receptor para el ligando de la tirosina fetal 3
(flt-3) y del receptor para el factor de células troncales c-kit (SCF, del inglés Stem
Cell Factor ). Han sido identificadas mutaciones en flt3 entre el 17-34% de sujetos
227
con LMA, y un 50% adicional expresa altos niveles del receptor normal. Por otro
lado, c-kit es expresado en el 80% de los casos de LMA y se encuentra mutado
en una pequeña proporción de ellos. En ambos casos la consecuencia biológi-
ca es la inducción permanente a la proliferación de células de LMA in vitro (23).

Una proteína que participa de manera crucial en procesos de proliferación leu-

cémica es la proteína de fusión BCR-ABL, que se ubica preferencialmente en el cito-
plasma, en donde tiene una incrementada y constitutiva actividad tirosina cinasa,
responsable de estimular vías intracelulares de proliferación (RAS, STAT y PI3-cinasa)
y adhesión celular (b-integrinas, selectinas e inmunoglobulinas), que tienen como
consecuencia final un incremento en el número de células tumorales totales (25).

Algunas de las moléculas arriba mencionadas también han sido relacionadas

con los mecanismos que regulan la autorrenovación de las LSC, y no debemos per-
der de vista que autorrenovación y proliferación hacen referencia a mecanismos
celulares distintos. Estudios en modelos in vivo, utilizando trasplantes seriados sugieren
que el potencial de autrorrenovación de las LSC es significativamente mayor que su
contraparte normal y aunque los mecanismos que la regulan no han sido definidos
con exactitud, se ha descrito que moléculas como: NF-kB, Notch, Sonic Hedgehog,
Wnt y Bmi, no solo participan en la autorrenovación normal, sino que en un estado
constitutivamente activo participan en el mantenimiento de las LSC (7, 23).

El otro aspecto que se mencionó en el modelo del doble hit es una modificación
en los mecanismos de muerte de las células leucémicas, lo que también se ha des-
crito como evasión de la apoptosis. Este mecanismo permite a las células pre-leucé-
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

micas (que podrían considerarse portadoras del primer hit), persistir por tiempos pro-
longados durante el tiempo y adquirir con ello alteraciones adicionales. Miembros
de la familia de proteínas antiapoptóticas como Bcl-2, Bcl-xl y Mcl-1 funcionan como
antagonistas de la muerte, mientras sus competidores Bax, Bad y Bak, la promueven,
por lo que la ganancia de función en el primer caso y la pérdida de función en el
segundo, se han asociado como factores pre-disponentes o asociados a diferentes
cánceres. En el caso particular de leucemias mieloides, se sabe que existe una alta
expresión o mutaciones que activan a los diferentes miembros de la familia Bcl-2.
Aunado a lo anterior, se ha descrito que el ligando de muerte FAS (CD95), presenta
mutaciones en células leucémicas, lo que conduce a deficiencias en su señaliza-
ción intracelular y en consecuencia reducción de la muerte (14,23).

Ciclo celular vs quiescencia

Como se ha descrito en las secciones anteriores, las células troncales tumora-

les parecen compartir muchas propiedades con las células troncales normales:
tiempo de vida media largo, capacidad de autorrenovación, habilidad de di-
ferenciación, resistencia a la apoptosis y quiescencia. Siendo este último punto
constante objeto de estudio durante los últimos años (26).

228 La quiescencia es un estado fuera del ciclo celular (en fase G0) en el que la cé-
lula se mantiene con un gasto metabólico mínimo, pero es capaz de responder
a diferentes estímulos, dependiendo de las necesidades del organismo. El ciclo
celular es una serie de pasos finamente regulados que aseguran la división celular
y en el que se distinguen cuatro etapas. Durante dos de ellas, las células llevan a
cabo dos eventos básicos en la división celular: generación de una copia idénti-
ca de su material genético (Fase S o de síntesis) y la segregación de los compo-
nentes celulares entre las dos células hijas (Fase M o mitosis). Las otras dos fases
del ciclo celular, G1 y G2, del inglés Gap, representan intervalos durante los cuales
la célula se prepara para la terminación de las fases S y M, respectivamente (27).

En el caso del sistema hematopoyético, las HSC que se encuentran en las fa-
ses G0/G1 del ciclo celular, son capaces de reconstituir totalmente la hematopo-
yesis en ratones irradiados, mientras que las HSC que se encuentran en las fase
S/G2/M, tienen un potencial mínimo de injerto. Además, el modelo de la suce-
sión clonal ha sugerido la existencia de dos reservorios: uno de células capaces
de responder a estímulos sin perder su multipotencialidad, y otro quiescente,
con limitada capacidad de autorrenovación, pero que entra en ciclo celular
de forma esporádica e impredecible (28).

En la LMC, la persistencia de la clona leucémica de LSC en pacientes des-

pués del tratamiento con altas dosis de agentes quimioterapéuticos, sugirió por
un tiempo la presencia una población en estado quiescente, hasta que en 1999
el grupo de Holyoake lo corroboró demostrando que la LMC se origina a partir
de una población de LSC altamente quiescente (fenotipo CD34+Ph+ en la fase
capitulo IX Células Troncales Tumorales: el Modelo de Leucemias Mieloides

G0 del ciclo celular), incapaz de responder in vitro a la estimulación de la prolife-

ración, pero capaz de recapitular el fenotipo leucémico en ratones letalmente
irradiados (21). La presencia de células troncales tumorales en estado quiescen-
te también se ha propuesto en tumores sólidos, principalmente en cáncer de
colon, páncreas, riñón y mama, pero aún se carece de evidencias experimen-
tales contundentes ya que no se ha podido demostrar en modelos in vivo (29).

El mecanismo por el cual se regula toda la maquinaria del ciclo celular, involu-
cra la participación de moléculas como Rb, p53, E2F, complejos Ciclina/cdk, inhibi-
dores de los complejos ciclina/cdk (cdki), etc, y aunque la participación de cada
uno de ellos en el sistema hematopoyético no ha sido completamente descrita, se
ha podido demostrar que los complejos ciclina/cdk así como los cdki, tienen im-
portante participación en la proliferación, diferenciación y apoptosis de las células
hematopoyéticas dependiendo de estados específicos de su maduración (28).

Cabe mencionar, que la característica de quiescencia en las LSC se ha sugerido

como uno de los eventos responsables de la falta de respuesta a agentes quimio-
terapéuticos, por lo que se ha hecho necesario el desarrollo de tratamientos que
sean capaces de eliminar a las células troncales tumorales que no estén en división.

DISEÑO DE FÁRMACOS Y RESISTENCIA A TERAPIA 229

Como anteriormente se mencionó, los tumores —incluidos las leucemias— com-
prenden poblaciones celulares fenotípica y funcionalmente heterogéneas, por lo
que sus abordajes terapéuticos deben reunir características particulares.

Actualmente las leucemias agudas son tratadas con agentes quimioterapéu-

ticos citotóxicos, que tienen como principal intención eliminar la mayor parte de
las células leucémicas, mientras que las leucemias crónicas son controladas con
agentes que suprimen la producción de leucocitos (ver Tabla 1). Sin embargo,
aunque en ambos casos la quimioterapia induce remisión de la enfermedad, el
30% de los adultos con LMA manifiestan recaídas durante los 5 años siguientes a
pesar de continuar en tratamiento, mientras que en LMC el 16% de los pacientes
presentan resistencia o intolerancia al tratamiento entre el primero y el tercer año.
En ambas patologías esta falla al tratamiento se ha relacionado con la presencia
de LSC y actualmente existen dos grandes vertientes enfocadas a la eliminación
de las mismas (12, 30). La primera, denominada terapia basada en anticuerpos,
plantea la posibilidad de eliminar a las LSC a través de la unión específica de
ciertos anticuerpos —que pueden incluso estar conjugados con algún fármaco
o toxina— a moléculas expresadas únicamente en la superficie tumoral, pero no
en la superficie de células normales. Ejemplos de estos agentes son: el anticuerpo
contra el receptor de la cadena alfa de IL-3 (CD123) / acoplado a la toxina dif-
térica, que tiene la capacidad de reducir el injerto de células de LMA en ratones
NOD-SCID; anti VLA-4 (a4b1 integrina), que se une a la fibronectina expresada en
blastos de LMA y disminuye la señalización inducida por PI3K y Akt y puede erradi-
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

car a las células de LMA residuales en modelos de ratón; anti CD44, que favorece
la diferenciación terminal y la apoptosis de blastos leucémicos de los subtipos de
LMA M1 y M5 al tiempo que elimina la posibilidad de injertar LMA en ratones se-
cundarios, lo que sugiere la eliminación de las LSC (31, 32, 33) (Figura 4).

La segunda aproximación para eliminar a las LSC es mediante el uso de fárma-

cos específicos contra moléculas involucradas en su autorrenovación y/o prolife-
ración. Ejemplos de estos fármacos son: el inhibidor del proteasoma MG-132, que
inhibe la activación de NF-kB (FT activo constitutivamente en LSC de LMA) a través
de la estabilización celular de su inhibidor IkB, induciendo con ello la apoptosis en
LSC; partenolide, que actúa inhibiendo al inhibidor de la actividad cinasa de IkB,
induciendo muerte selectiva de células de LMA, al tiempo que inhibe a NF-kB, p53
y la activación de especies reactivas de oxígeno. Otro agente muy atractivo en
el tratamiento de la leucemia promielocítica aguda (LMA M3) es el ácido trans-
retinoico y/o trióxido de arsénico, ya que mientras el ácido trans-retinoico induce
diferenciación de las células que se encuentran en estado de blastos, el arsénico
induce arresto en la proliferación y muerte por apoptosis (34 - 36) (Figura 4).

Un fármaco que ha cambiado radicalmente la historia natural de la LMC es

el STI571 (inhibidor de la transducción de señales 571) también llamado Imatinib,
que funciona como un inhibidor competitivo de la actividad cinasa de Bcr-Abl,
230 conduciendo con ello a la inhibición de todas sus propiedades pro-leucémicas,
lo que lo ha colocado como la primera línea de tratamiento en sujetos con diag-
nóstico de LMC (37) (Figura 4).

Figura 4. Agentes terapéuticos para LSC. La figura muestra algunos de los principales agentes pro-
puestos para eliminar LSC de LMA y LMC. CD123a, aVLA4 y CD44 representan moléculas utilizadas
en terapias basadas en el uso de anticuerpos. IkB cinasa, IkB, PML-RARa y Bcr-Abl representan
moléculas que son blancos para fármacos específicos.
capitulo IX Células Troncales Tumorales: el Modelo de Leucemias Mieloides

Desafortunadamente, Imatinib no es capaz de eliminar a las LSC ya que exis-

ten pacientes que son resistentes o refractarios al tratamiento. Además, se ha
descrito que células provenientes de sujetos tratados con el fármaco y hemato-
lógicamente sanos mantienen la presencia de Bcr-Abl in-vitro, lo que justifica que
al momento de suspender el tratamiento, la enfermedad se re-establezca (38).

Las causas de resistencia a Imatinib pueden ser divididas en primarias y se-

cundarias. La resistencia primaria se refiere a aquella en donde los pacientes
nunca responden al tratamiento, a pesar de administrarse dosis elevadas del
fármaco, evento que se ha asociado a que las células leucémicas tenga un
bajo nivel de expresión del transportador catiónico orgánico 1 (hOCT-1), mo-
lécula responsable del ingreso de Imatinib al interior celular, o bien a un incre-
mento de la glicoproteína P en la superficie de la célula leucémica, de manera
que se que permita un flujo excesivo del fármaco al exterior celular (39) (Figura
5). La resistencia secundaria o resistencia adquirida, se refiere a pacientes que
inicialmente respondieron al tratamiento (obteniendo respuestas citogenéticas
y favorables), pero que de forma inesperada pierden la respuesta. Este evento
de resistencia es más común en sujetos que inician el tratamiento en estados
tardíos de la enfermedad, y se asocia con las siguientes alteraciones celulares:
amplificación del gen Bcr-Abl y la consecuente sobre-expresión de la proteína;
mutaciones en el sitio en el que se une Imatinib a Bcr-Abl, evitando su asocia- 231
ción; encendido de nuevas vías de señalización celular que se adicionen y/o
reemplacen las vías ya encendidas por Bcr-Abl, y finalmente la propia quiescen-
cia de las LSC, ya que esta población se mantiene en un estado no sensible al
efecto del fármaco. En los casos de respuesta sub-óptima, intolerancia o resis-
tencia a Imatinib, se han propuesto las siguientes estrategias: el incremento de
la dosis de Imatinib, el uso de nuevos agentes inhibidores de Bcr-Abl (Nilotinib
y/o Dasatinib), el trasplante de células hematopoyéticas, o el empleo de agen-
tes en fase de investigación mediante la inclusión de pacientes en protocolos
clínicos (40) (Figura 5).

Cabe mencionar que la quiescencia de las LSC pudiera ser responsable de la

persistencia y recaída de las leucemias una vez que los pacientes recibieron tra-
tamiento con agentes quimioterapéuticos. Si esta visión es cierta, y teniendo en
conocimiento que las LSC comparten muchas otras características con las HSC
normales, es probable que en un futuro se deba hacer un cuidadoso balance de
los blancos celulares y sus terapias cito-tóxicas de manera que permitan maximi-
zar la muerte de LSC minimizando a la vez el efecto tóxico en las HSC normales.
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

Figura 5. Principales mecanismos de resistencia a Imatinib. a) Disminución en la expresión del trans-

portador catiónico orgánico 1 (hOCT1), que permite el ingreso del fármaco a la célula en condi-
ciones normales. b) Incremento de la glicoproteína P, que favorece el flujo del agente al exterior
celular. c) Amplificación del gen Bcr-Abl. d) Expresión aumentada de la proteína Bcr-Abl. e) Muta-
232 ciones que evitan la asociación del fármaco. f) Activación de nuevas vías de señalización celular
que favorecen la progresión tumoral. g) Auto-estimulación de la proliferación. h) Permanencia de
las LSC en estado de quiescencia celular.

NICHO DE LAS CELULAS TRONCALES LEUCÉMICAS

Como se describió ampliamente en el capítulo VII, la hematopoyesis humana

se realiza anatómicamente en la cavidad de la medula ósea, en el marco del
microambiente hematopoyético, el cual está compuesto por elementos celula-
res, moléculas de la matriz extracelular y otros elementos reguladores que favo-
recen el mantenimiento, autorrenovación, diferenciación y proliferación de las
células hematopoyéticas (41).

Aunque la localización exacta de las HSC permanece en debate, se ha pro-

puesto que dentro de la médula ósea pueden encontrarse dos nichos específicos.
El primero, denominado nicho endosteal u osteoblástico; contiene osteoblastos,
fibroblastos estromales y osteoclastos que permiten mantener a las HSC en estado
quiescente o de reserva. En contraste, el segundo nicho o nicho perivascular, está
localizado más al centro de la cavidad medular y contiene células endotelia-
les vasculares, células reticulares y megacariocitos que alojan preferencialmente
HSC involucradas en la recuperación medular posterior a daño (42, 43).

Si asumimos que aunque existen diferencias entre las HSC y las LSC, también
existen claras similitudes, es posible que dentro del nicho hematopoyético las
células leucémicas pudieran ocupar en los estados tempranos de la enferme-
capitulo IX Células Troncales Tumorales: el Modelo de Leucemias Mieloides

dad, nichos semejantes a las HSC. Sin embargo, es posible que en cierto mo-
mento las LSC sean capaces de escapar a las señales inhibidoras provistas por
el nicho primario y migrar a otro tipo de nicho que favorece su desarrollo (44).
A este respecto, diversos estudios han señalado, que las LSC ocupan y reciben
importantes señales del microambiente, lo que se ve reflejado en su diferencia-
ción, autorrenovación, mantenimiento, e incluso resistencia a la terapia. Intere-
santemente, células progenitoras de sangre de cordón umbilical (SCU) transfor-
madas in vitro con el oncogen MLL-AF9 (que participa en leucemia linfoblástica
aguda), al ser trasplantadas en ratones NOD/SCID son capaces de desarrollar
leucemia linfoblástica cuando el ratón carece de b2 microglobulina, pero tam-
bién son capaces de desarrollar LMA cuando los ratones NOD/SCID tienen defi-
ciencia en la expresión de algunos genes de citocinas como SCF, GM-CSF o IL-3,
lo que sugiere que el microambiente en el que las LSC se desarrollan modifica el
compromiso hacia algún linaje hematopoyético en particular (45).

Un aspecto de gran relevancia en la interacción del nicho hematopoyético

y las LSC es la adhesión celular, en la cual toman particular importancia CD44
y CXCR4/CXCL12. La molécula de adhesión CD44 (que esta incrementada en
LMA y participa en el mantenimiento de las LSC) media el contacto célula-cé-
lula y célula-matriz extracelular, induciendo con ello constantes estímulos a la
proliferación. La inhibición de la actividad de CD44 mediante el anticuerpo mo- 233
noclonal H90 conduce a una importante reducción de la carga leucémica en
ratones inmunodeficientes transplantados con HSC provenientes de LMA. Por
otro lado, el complejo CXCR4/CXCL12 está implicado en la supervivencia, pro-
liferación y retención de las HSC en su nicho y se ha descrito que la pérdida de
su interacción en médula ósea conduce a la salida de las HSC a sangre perifé-
rica. CXCR4 se encuentra significativamente elevado en células leucémicas y
modelos preclínicos han demostrado que el bloqueo de la interacción CXCR4/
CXCL12 puede representar una nueva estrategia para remover a las célula leu-
cémicas de su microambiente (46, 47).

Reportes recientes en un modelo de rata indican que células leucémicas infil-

trantes de médula ósea son marcadamente hipóxicas comparadas con las célu-
las presentes en la médula ósea de ratas sanas. Además, este nivel de hipoxia en
médula ósea está relacionado con la sobre expresión del componente regulador
de óxigeno HIF1a en LLA. HIF1a también induce la expresión de CXCL12 en células
endoteliales e incrementa con ello la adhesión celular. Estos datos sugieren que
el microambiente hipóxico de la médula ósea representa un nicho en el cual se
puede facilitar la retención de células troncales y progenitoras leucémicas (46).

En resumen, parece ser que de forma paralela a los eventos leucemogéni-

cos del sistema hematopoyético en médula ósea, el microambiente hematopo-
yético también adquiere modificaciones que generan nichos específicos con
señales dominantes en donde se favorece la proliferación y el mantenimiento
leucémico. En este sentido, un modelo terapéutico de dos pasos sería de gran
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

beneficio: en el primer paso se activarían a las LSC haciéndolas salir de su nicho

de manera que se tornen sensibles a los estímulos externos, mientras que en el
segundo paso, se aplicarían los fármacos enfocados a su eliminación (42).

CÉLULAS TRONCALES EN TUMORES SÓLIDOS: MAMA, CEREBRO Y COLON

Las células troncales leucémicas han sido aisladas y caracterizadas aprovechan-

do su similitud fenotípica con las células hematopoyéticas normales, además de
que han demostrado ser capaces de recapitular el tumor primario cuando se
trasplantan en ratones inmunodeficientes, prueba biológica y funcional contun-
dente de su capacidad troncal.

En el caso de los tumores sólidos, la identificación de las CSC es significativa-

mente diferente. En la mayoría de los casos, a diferencia del sistema hemato-
poyético, la jerarquía de desarrollo en el tejido normal no ha sido identificada,
lo que dificulta la selección de marcadores fenotípicos para aislar determinada
población y compararla con la normalidad. Así mismo, los modelos funciona-
les in vivo son técnicamente difíciles de abordar, debido a la accesibilidad del
tejido original, tal y como sucede con los cánceres de pulmón, colon, vejiga,
etc; por lo que en estos casos la inyección o implantación bajo la capsula renal
234
pueden ser exitosos, aunque es esencial confirmar que estos ensayos recapitu-
lan perfectamente la histología del tumor original y al ser nuevamente aislados
e implantados, generan tumor en un receptor secundario (48, 49).

En el 2003, Al-Hajj y colaboradores fueron los primeros en demostrar que el cán-

cer de mama contenía una pequeña población celular capaz de formar tumores
in vivo, mientras que esto no sucedía cuando se utilizaba el tumor completo, aún a
muy altos números celulares. La población inductora de tumores se identificó fenotí-
picamente como CD44+ CD24- lin- y podía generar tumores al ser trasplantada en el
tejido graso de la mama de ratones NOD/SCID hasta con 200 células, además de
detectar células similares a las de la población tumoral original. Datos de los últimos
años muestran un avance importante en el conocimiento de la jerarquía normal y
tumoral de la glándula mamaria, y plantean el uso de diferentes marcadores aso-
ciados a tipos celulares específicos en el tejido normal y patológico. En éste tipo de
tumor también han sido implicadas alteraciones genéticas, modificaciones en el
microambiente del tejido mamario, así como con cambios epigenéticos; y aunque
recientemente se ha sugerido que puede ser sujeto de terapia viral oncogénica,
terapia de diferenciación y nanotecnología, la complejidad de la patología hace
necesario ampliar el conocimiento de la biología del tumor antes de que alguna
de estas estrategias terapéuticas tenga un uso exitoso (50, 51).

Por otro lado, el aislamiento de células troncales tumorales del sistema nervioso
central (CNS) ha sido posible aprovechando que ellas crecen en superficies no
adherentes y generan cúmulos celulares denominados neuroesferas, las cuales
son capaces de autorrenovarse y generar neuronas, astrocitos y oligodendroci-
tos maduros. Además, las células troncales neurales expresan en su superficie el
antígeno CD133, un marcador comúnmente encontrado en células troncales y
progenitoras de varios tejidos (52, 53). Esta información aunada a la aplicación
de estrategias experimentales antes descritas, hizo posible que en el año 2004 se
demostrara la existencia de células iniciadoras de tumores cerebrales ya que al
trasplantar 100 células provenientes de glioma humano con fenotipo CD133+ en
cerebros de ratones NOD/SCID, se generaba un tumor con las mismas caracte-
rísticas del tumor original, evento que se repetía en receptores secundarios (54).

Entonces, los tumores cerebrales pueden originarse en células troncales o

progenitoras neurales que expresan algunos marcadores de su contraparte nor-
mal, pero tienen alteraciones en diferentes vías de señalización que participan
en proliferación, autorrenovación, ciclo celular, etc. Como cada una de las vías
parece ser particularmente regulada dependiendo del tipo de tumor cerebral,
se ha preferido nombrarlas como células iniciadoras de tumores cerebrales o
células parecidas a troncales tumorales cerebrales, antes de utilizar un término
más contundente como el de CSC cerebral (55).

La existencia de CSC en carcinoma colorectal ha sido demostrada ya sea

utilizando células disociadas de un tumor primario y enriquecidas en células
CD133+, como también utilizando una población pura con fenotipo CD44+/ 235
EpCAM+. En ambos casos las poblaciones celulares fueron capaces de desarro-
llar tumores en ratones inmunodeficientes, lo que no sucedió con la población
CD133- o con las células CD44-/EpCAM- (56).

La expresión de los antígenos CD133, CD44 y EpCAM ha sido también utiliza-

da para obtener CSC de próstata y páncreas, mientras que antígenos como
CD138 se han propuesto como marcadores de células troncales tumorales en
mieloma múltiple, y CD20 en melanoma (49). Es importante mencionar que en-
contrar un marcador característico de CSC sería esencial para realizar un co-
rrecto diagnóstico y abordaje terapéutico en cada patología, aunque hoy por
hoy se utilizan fracciones celulares enriquecidas en células capaces de desarro-
llar tumores en ratones inmunodeficientes, la cual es una estrategia poderosa
existente para acercarnos a las verdaderas CSC.

Conclusiones

El planteamiento de la existencia de células troncales tumorales ha causado

gran interés científico en los últimos años y ha revolucionado la forma de abor-
dar y entender el cáncer. Diversas moléculas de superficie, vías de señalización
y microambientes específicos, parecen tener un papel fundamental en la su-
pervivencia y mantenimiento de los tumores. No obstante, diversos aspectos
siguen sin entenderse. Ante este panorama, el interés científico se ha volca-
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

do en interrogar a las células haciendo uso de múltiples métodos —que van

desde análisis de la superficie celular y ensayos funcionales hasta tecnologías
que permiten describir firmas genéticas y epigenéticas—, pero la búsqueda de
respuestas continúa. Seguramente el advenimiento de nuevas tecnologías y la
habilidad de aplicar éstas a números celulares pequeños, como los que se pre-
sentan en las células troncales —incluidas las tumorales— , permitirá aislarlas y
distinguirlas específicamente de las células troncales normales, de manera que
se pueda definir con exactitud cuáles son las estrategias que cada tipo tumoral
utiliza y permita abrir la posibilidad de proponer estrategias terapéuticas espe-
cificas para la eliminación tumoral. El camino es largo y apasionante, pero sin
duda de gran bebeficio para la humanidad.

Agradecimientos

La investigación que se realiza en el laboratorio de células troncales leucémicas,

ha sido financiada por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología CONACyT
(CB-2008-01.105994) y por la Coordinación de Investigación en Salud del IMSS
(R-2006-3501-10).

Dafne Moreno Lorenzana recibe una beca de Maestría del Consejo Nacional
236 de Ciencia y Tecnología. CONACyT. (332745).
capitulo X Trasplante de Células Hematopoyéticas

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Capítulo X

Trasplante de células hematopoyéticas

Héctor Mayani

RESUMEN

El trasplante de células hematopoyéticas consiste en reemplazar a células he-

matopoyéticas que son intrínsicamente anormales, o que han sido dañadas por
quimioterapia o radiación, por células hematopoyéticas sanas. Este procedi-
miento surgió hace más de 50 años y en la actualidad se ha convertido en una
terapia común para el tratamiento de una gran variedad de enfermedades
hematológicas. Tan solo en el año 2008 se llevaron a cabo más de 56,000 tras-
plantes a nivel mundial. No solo la médula ósea, principal sitio hematopoyético,
sino la sangre periférica movilizada y la sangre de cordón umbilical han sido
empleadas como fuentes para obtener células para los trasplantes. De acuerdo
al progreso observado, es muy probable que en un futuro cercano los HCT en-
cuentren aplicación en el tratamiento de enfermedades no hematológicas. Sin
embargo, a pesar de los avances logrados a lo largo de este tiempo, los retos en
el campo siguen siendo numerosos. Algunos tienen que ver con la biología de
este procedimiento (por ejemplo, las reacciones de rechazo inmunológico o las
recaídas por progresión de la enfermedad); mientras que otros tienen que ver
con la necesidad de hacer de los trasplantes hematopoyéticos una práctica
médica accesible a los países pobres y en vías de desarrollo.

INTRODUCCIÓN

De los distintos tipos de células troncales somáticas, las células troncales he-
matopoyéticas (HSC, del inglés Hematopoietic Stem Cells) fueron las primeras
en identificarse, purificarse, caracterizarse fenotípica y funcionalmente, y fueron
también, las primeras en emplearse en la clínica. La idea del trasplante hema-
topoyético surgió hace cerca de 60 años, a partir de estudios en ratones irra-
diados, en los que se demostró que la médula ósea es el principal sitio hema-
topoyético, y que como tal, podía ser extraída e introducida en ratones de la
misma cepa, ayudando a su recuperación hematológica. El concepto general,
en realidad, era muy simple: si la hematopoyesis se lleva a cabo en la médula
ósea y ésta puede ser trasplantada de un organismo a otro, entonces se puede
tratar a pacientes con trastornos hematopoyéticos a través del trasplante, em-
pleando como donadores a individuos hematológicamente sanos.

El trasplante de células hematopoyéticas (HCT, del inglés Hematopoietic Cell

Transplant), como procedimiento terapéutico, nació a mediados de la déca-
da de 1950, cuando se llevaron a cabo los primeros estudios clínicos en los
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

que células de la médula ósea de sujetos sanos fueron introducidas en pa-

cientes con trastornos hematológicos, que habían sido tratados con radiación
y quimioterapia. Los resultados de este estudio fueron poco alentadores, sin
embargo, dejaron ver que el HCT era factible y que podría convertirse en una
verdadera opción para pacientes cuyo sistema hematopoyético se encontra-
ba severamente afectado.

Durante más de 5 décadas, el HCT ha evolucionado de una manera sorpren-

dente (1), gracias a los avances en diversas áreas de la biomedicina, como la
inmunología, la biología celular, el cultivo in vitro de células hematopoyéticas,
la citometría de flujo y la biología molecular. De hecho, el progreso en el HCT ha
sido paralelo a los avances en el estudio de la hematopoyesis. En efecto, el co-
nocimiento acerca de las células troncales, de la biología del sistema hemato-
poyético y de los mecanismos de la respuesta inmune, han permitido perfeccio-
nar y expandir el horizonte de los trasplantes hematopoyéticos, a tal grado que
hoy en día, el HCT se ha convertido en un procedimiento bastante común para
el tratamiento de diversos tipos de enfermedades hematológicas, como las leu-
cemias, la anemia aplásica, los síndromes mielodisplásicos, el mieloma múltiple
y algunos trastornos congénitos de falla medular, como la anemia de Fanconi.

En este capítulo, se hará una revisión sobre el HCT, desde sus orígenes hasta
240 su estado actual. Se presentará un panorama histórico acerca de su evolución,
se analizarán aspectos biológicos y se discutirán aspectos relacionados con su
aplicación en México y en el mundo.

PERSPECTIVA HISTÓRICA

En 1951, Lorenz y colaboradores demostraron que la inyección de células de

médula ósea proveniente de ratones sanos evitaba la muerte de ratones que
habían recibido una dosis letal de radiación (2). Algunos investigadores propusie-
ron, sin tener prueba de ello, que el efecto protector de la médula ósea trasplan-
tada se debía a alguna sustancia orgánica. En 1954, Barnes y Loutit presentaron
las primeras evidencias de que la recuperación hematológica de los ratones irra-
diados era debida a las células trasplantadas y no a sustancias contenidas en la
médula ósea (3). Durante los siguientes tres años, varios grupos de investigación
reportaron resultados que apoyaban las observaciones de Barnes y Loutit.

Basado en los buenos resultados obtenidos en los estudios realizados en rato-

nes, en 1957 Donall Thomas llevó a cabo los primeros trasplantes de células he-
matopoyéticas en humanos. Thomas y su grupo de colaboradores trasplantaron
a pacientes con neoplasias hematológicas después de que habían sido tratados
con radio y quimioterapia (4); sin embargo, los resultados de esos primeros tras-
plantes fueron decepcionantes, pues todos los pacientes murieron debido a la
falta de injerto y a la progresión de la enfermedad. A pesar de ello, no todo fue
capitulo X Trasplante de Células Hematopoyéticas

negativo; estos investigadores habían demostrado que era posible introducir en

humanos cantidades relativamente grandes de médula ósea y dejaban ver que
el trasplante de células hematopoyéticas era un procedimiento factible, que po-
dría convertirse en una alternativa terapéutica real en un futuro no muy lejano.

Desafortunadamente, durante los siguientes 5 años los trasplantes realizados

en pacientes con leucemia o en sujetos que habían sufrido exposición acci-
dental a radiación, dieron malos resultados. Por esta razón, un grupo de exper-
tos, entre los que se contaban Thomas, Mathé, Van Bekkum, Santos, Congdon y
Uphoff, decidieron que no se deberían hacer más HCT en humanos hasta que
se tuviera mejor caracterizado dicho procedimiento. Para tal efecto, diversos la-
boratorios de EUA y Europa se dieron a la tarea de trabajar en modelos animales
—empleando ratones, perros y primates— con la idea de caracterizar distintos
aspectos celulares y moleculares involucrados en el HCT.

En esos años, se reportaron varios hallazgos científicos que ayudaron a enten-

der la biología detrás del HCT. Snell, Dausset y Benacerraf descubrieron un grupo
de antígenos involucrados en la histocompatibilidad, los llamados antígenos del
complejo principal de histocompatibilidad (MHC o HLA en humanos); Till y McCu-
lloch presentaron evidencias experimentales que demostraban la existencia de
las HSC y caracterizaron su dinámica de proliferación, autorreplicación y diferen-
ciación después de un trasplante (5); y varios laboratorios desarrollaron nuevos 241
compuestos quimioterapéuticos. Por otra parte, en diversos países se desarrolla-
ron mejores terapias de soporte para pacientes con trastornos hematológicos,
como la transfusión sanguínea, la nutrición parenteral y terapias para prevenir o
tratar infecciones virales, bacterianas o fúngicas.

Así, en 1968 se reportó el primer caso exitoso de un trasplante hematopoyético

alogénico (es decir, entre un donador y un paciente no emparentados) en un
paciente con inmunodeficiencia severa combinada. Es importante mencionar
que dicho paciente no fue tratado con agentes inmunosupresores, pues su siste-
ma inmunológico ya se encontraba suprimido (6). Entre 1969 y 1975 los trasplan-
tes realizados estuvieron restringidos a pacientes con enfermedades no malignas,
como inmunodeficiencias y anemia aplásica. En 1977 se reportaron los primeros
trasplantes alogénicos exitosos en un pequeño grupo de pacientes con leucemia
y en 1979 fueron publicados dos estudios en los que se trasplantaron números ele-
vados de pacientes con leucemia, tanto mieloide como linfoblástica (7,8).

A partir de los estudios mencionados, quedó bien establecido que la proba-

bilidad de éxito de los HCT era mayor si eran realizados en etapas tempranas de
la enfermedad; por el contrario, los resultados eran peores si los pacientes eran
trasplantados en etapas tardías. Durante los años 80s se llevaron a cabo diversos
estudios clínicos en los que se compararon diferentes esquemas de quimiotera-
pia e inmunosupresión, y hacia finales de esa década se empezaron a emplear
fuentes alternas de células hematopoyéticas.
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

FUENTES DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICAS

Existen tres fuentes de células hematopoyéticas que pueden ser empleadas para
trasplantes. En primer lugar la médula ósea (MO), sitio en donde se lleva a cabo la
hematopoyesis y que tradicionalmente ha sido empleada para este tipo de proce-
dimientos. En segundo lugar, la sangre periférica movilizada (SPm), en la que a tra-
vés del uso de citocinas recombinantes —como el factor estimulador de colonias
de granulocitos y monocitos (GM-CSF, del inglés Granulocyte and Monocyte-Co-
lony Stimulating Factor) y el factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF,
del inglés Granulocyte-Colony Stimulating Factor)— se promueve la migración de
células hematopoyéticas primitivas de la médula ósea hacia la circulación; en la
actualidad este tipo de trasplantes es el más común en todo el mundo. Finalmente,
la sangre de cordón umbilical (SCU), la cual se obtiene al momento del parto; esta
última se ha convertido en una fuente muy importante de células hematopoyé-
ticas y este tipo de trasplantes se está llevando a cabo con mayor frecuencia. A
continuación revisaremos brevemente cada una de estas tres modalidades.

Médula ósea

La médula ósea se encuentra diseminada en los más de 200 huesos que consti-
242
tuyen el esqueleto. Al nacimiento y durante los primeros años de la infancia, la
mayoría de los huesos albergan al tejido hematopoyético, sin embargo, confor-
me avanza la edad del individuo, la médula ósea hematopoyética se va redu-
ciendo y se concentra en los huesos del esqueleto central (esternón, costillas,
columna vertebral y crestas iliacas). En un adulto promedio, la cantidad de mé-
dula ósea activa corresponde a 2.6 kg, con un total de 123 x 1010 células totales,
aproximadamente, y una tasa de recambio de 19 x 107 células /kg/hora (9).

Desde los primeros procedimientos realizados en 1957, hasta principios de la

década de 1990, la médula ósea representó la principal fuente celular para llevar
a cabo trasplantes hematopoyéticos. La razón era muy lógica, pues dicho tejido
constituye el principal sitio hematopoyético en el humano. Inicialmente, la aspira-
ción de médula ósea se realizaba puncionando tanto el esternón como las crestas
iliacas. Hoy en día, el sitio más común para la punción es la cresta iliaca posterior.

El volumen de médula ósea que se extrae varía enormemente, dependiendo

del donador; dicho volumen puede ser tan bajo como 200 ml y tan alto como
2,400 ml; en general, el volumen obtenido es alrededor de 1,000 ml. De igual
forma, el número de células totales que se obtiene durante la aspiración me-
dular varía significativamente; dentro de dicha variabilidad, se considera que
una buena cosecha oscila entre 17 – 24 x 109 células totales. Desde el punto de
vista de las células que son transfundidas al paciente, se considera que para
un trasplante adecuado, el número debe ser igual o mayor a 4 x 108 células por
kilogramo de peso del paciente (10).
capitulo X Trasplante de Células Hematopoyéticas

El trasplante hematopoyético empleando células de médula ósea tiene un

gran inconveniente: constituye un procedimiento altamente invasivo en el que
se requiere la hospitalización del donador. En general, se deben realizar entre
200 y 300 aspiraciones a través de varias punciones en hueso y esto lleva alre-
dedor de dos horas. Después de realizado el trasplante, el donador es dado de
alta y regresa a casa, teniendo dolores óseos durante varios días. Todo lo ante-
rior, ha promovido la búsqueda de nuevas fuentes de células hematopoyéticas,
buscando que dichas fuentes sean igual de efectivas y menos invasivas.

Sangre periférica movilizada

La presencia de células hematopoyéticas en sangre periférica de sujetos adultos

fue reportada en los años 1970s, sin embargo, los números observados eran extre-
madamente bajos, por lo que era imposible pensar en la sangre periférica como
una fuente de células hematopoyéticas para trasplantes. Actualmente sabemos
que desde los primeros meses de gestación, existen células hematopoyéticas
circulando en el torrente sanguíneo. A los dos meses, el número de progenitores
hematopoyéticos es muy bajo —aproximadamente 130 células formadoras de
colonias (CFC)/ml); durante los siguientes meses, dicho número se incrementa
significativamente, alcanzando su máximo nivel a los 5 meses de gestación (alre- 243
dedor de 65,000 CFC/ml)—. En el momento del nacimiento, se detectan cerca
de 10,000 CFC/ml y en un adulto promedio, el número de CFC es de 225/ml (11).

Hacia finales de la década de 1980 se observó que al inyectar factores hema-

topoyéticos (G-CSF o GM-CSF) en sujetos con neutropenia, no solo aumentaban
los niveles de neutrófilos, sino que los niveles de células CD34+ —células hemato-
poyéticas primitivas— se incrementaban significativamente en la circulación san-
guínea. Efectivamente, diversos grupos reportaron incrementos muy significativos
en los números de CFC y de células CD34+ en la sangre de individuos tratados
con G-CSF (Tabla 1) (12). Aún cuando en ese momento el mecanismo por el cual
se movilizaban las células troncales y progenitoras hematopoyéticas de la mé-
dula ósea hacia la sangre periférica no se conocía, se planteó la posibilidad de
utilizar dichas células como fuente alternativa a los trasplantes hematopoyéticos.
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

Tabla 1. Niveles de células troncales y progenitoras hematopoyéticas en

sangre periférica de sujetos adultos y en sangre de cordón umbilical

Sangre Periférica Sangre de Cordón

Sangre Periférica
Movilizada Umbilical
CD34+ 0.006 1.3 1.1
CFC-M 89 3,500 7,000
CFC-E 125 6,250 8,000
CFC-MIX 3 200 500
LTC-IC 1 8 12
SRC ND 0.2 1

Los resultados corresponden a los promedios observados en estudios reportados por diversos gru-
pos de investigación. CD34+, porcentaje de células CD34+; CFC-M, número de progenitores mie-
loides por ml de sangre; CFC-E, número de progenitores eritroides por ml de sangre; CFC-MIX,
número de progenitores multipotenciales por ml de sangre; LTC-IC, número de células iniciadoras
de cultivos a largo plazo por ml de sangre; número de células repobladoras de ratones SCID por
106 células nucleadas. Esta tabla ha sido modificada de la referencia 11.

Desde mediados de los años 1990s, la sangre periférica movilizada se ha con-

vertido en la fuente principal de células hematopoyéticas con fines de trasplan-
244 te. En la actualidad, en 7 de cada 10 HCT se emplean células de sangre movili-
zada. El esquema de movilización consiste en inyectar al donador sano el factor
G-CSF a una dosis de 10 μg/Kg/día durante 4 días y al quinto día se realiza la
aféresis. El número de células nucleadas que se obtiene por este procedimiento
permite infundir un promedio de 9 x 108 células por kg de peso del paciente;
dicho número es superior al que se infunde cuando se emplean células de mé-
dula ósea (4 x 108 células por kg de peso del paciente, en promedio) (13).

Ahora bien, ¿cómo ocurre la movilización de células inmaduras hacia la cir-

culación? Como sabemos, las células troncales hematopoyéticas (HSC) y las
células progenitoras hematopoyéticas (HPC, del inglés Hematopoietic Progeni-
tor Cells) interactúan con las células del estroma medular y con las moléculas de
la matriz extracelular a través de diferentes moléculas de adhesión (integrinas)
y de receptores –como c-kit- que forman complejos con sus respectivos ligan-
dos. Cuando un individuo recibe inyecciones de G-CSF, dicho factor estimula la
producción y activación de granulocitos, los cuales secretan una serie de enzi-
mas que interfieren en las interacciones mencionadas; de esta forma, las células
hematopoyéticas quedan libres (Figura 1), se dirigen a los sinusoides y atravie-
san la membrana endotelial, ingresando a la circulación (14,15). Por supuesto
que todo este proceso es muy complejo e involucra la participación de diversos
elementos moleculares, como quimiocinas (en particular CXCR4 y su ligando
CXCL12), metaloproteinasas, citocinas solubles, citocinas asociadas a células,
etc. Incluso, evidencias recientes indican que el sistema nervioso también parti-
cipa en la movilización de células hematopoyéticas hacia la sangre (16).
capitulo X Trasplante de Células Hematopoyéticas

245

Figura 1. Las células troncales y progenitoras del sistema hematopoyético se encuentran interac-
tuando de manera permanente con las células estromales del microambiente hematopoyético
(fibroblastos, osteoblastos, adipocitos, células endoteliales, etc.). Dichas interacciones son me-
diadas por diferentes tipos de moléculas de adhesión, citocinas y quimiocinas y sus respectivos
receptores. Durante la movilización, las interacciones mencionadas son desestabilizadas y las cé-
lulas hematopoyéticas quedan libres. En (A) se muestran cuatro de las interacciones más impor-
tantes que ocurren dentro del nicho hematopoyético y en (B) se representa el momento en que
dichas interacciones dejan de ocurrir.

Sangre de cordón umbilical

Desde los 4 meses del periodo gestacional y hasta el momento del nacimiento,
existen HSC y HPC circulando en la sangre de cordón umbilical (SCU). Dichas célu-
las poseen características funcionales muy particulares, demostradas tanto in vivo
como in vitro, lo que ha generado un gran interés en ellas (17). Las células hema-
topoyéticas de la SCU son presentadas de manera detallada en el capítulo VIII
de este libro, por lo que aquí solo se mencionarán algunos aspectos relevantes.
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

Se han demostrado diferencias cuantitativas y cualitativas entre las células

hematopoyéticas de la SCU y de sujetos adultos (18). Por ejemplo, la frecuencia
de HSC y HPC —particularmente aquellas capaces de producir colonias mielo-
eritroides in vitro— en la sangre de cordón umbilical es superior a la observada
en la médula ósea. Por otra parte, empleando cultivos semisólidos y líquidos,
ha sido plenamente demostrado que las células de la SCU poseen potenciales
de proliferación y expansión muy superiores a los de su contraparte adulta. Este
hecho se debe a una serie de propiedades intrínsecas de las HSC y HPC de la
SCU que las hace superiores a las de médula ósea. Por un lado, se ha visto que
las células de la SCU tienen la capacidad de salir de la fase quiescente del ciclo
celular más rápidamente que las de médula ósea. Por otra parte, a diferencia
de las células de médula ósea, una proporción significativa de las células de la
SCU es capaz de producir citocinas que ellas mismas requieren para su prolife-
ración (mecanismo autócrino). Finalmente, Lansdorp y colaboradores han de-
mostrado que las células de la SCU poseen telómeros (partes terminales de los
cromosomas, asociadas con la capacidad replicativa de las células) de mayor
longitud que los de su contraparte medular.

Las ventajas más inmediatas en el empleo de la SCU como fuente de células

hematopoyéticas son: el fácil acceso a las muestras, la facilidad técnica en la
246 obtención de la muestra, la ausencia de riesgo para el donador y el reducido
riesgo de infección (19). Otra ventaja importante es la facilidad de crear bancos
de SCU, en donde las unidades son almacenadas en tanques de criopreserva-
ción (a –196°C) y están listas para ser empleadas en cualquier momento (20).
Desde el punto de vista médico, una gran ventaja es que la incidencia de la
enfermedad de injerto contra hospedero es reducida, comparada con los tras-
plantes de médula ósea y sangre periférica movilizada; además, cuando dicha
complicación se presenta, generalmente corresponde a las formas menos se-
veras (estadios I y II) (21).

A la fecha, se han llevado a cabo más de 20,000 trasplantes de células hema-

topoyéticas en los que se ha empleado SCU (Dr. J.E. Wagner, Universidad de Min-
nesota; comunicación personal). Los padecimientos que han sido tratados con
este procedimiento incluyen diferentes tipos de neoplasias (leucemias mieloides y
linfoides, síndromes Mielodisplásicos, linfomas y neuroblastoma), síndromes de fa-
lla medular (anemia aplásica, anemia de Fanconi, anemia de Blackfan-Diamond,
Dyskeratosis congénita y síndrome de Kostman), hemoglobinopatías (anemia de
células falciformes y talasemia), errores del metabolismo e inmunodeficiencias.

TIPOS DE TRASPLANTES DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICAS

En un trasplante hematopoyético, la idea general es reemplazar a las células

hematopoyéticas anormales con células sanas provenientes de otro individuo.
Este, de hecho, es el fundamento de un trasplante alogénico. Sin embargo,
capitulo X Trasplante de Células Hematopoyéticas

como veremos a continuación, existen variaciones al respecto. Efectivamen-

te, bajo ciertas circunstancias el propio paciente puede ser el donador de las
células hematopoyéticas, lo que constituye la base del trasplante autólogo (Fi-
gura 2). En los trasplantes alogénicos, el donador es una persona hematológi-
camente sana que es inmunocompatible con el paciente. Este tipo de trasplan-
te generalmente se emplea cuando la enfermedad involucra directamente al
sistema hematopoyético del paciente; por ejemplo, en una leucemia o en la
anemia aplásica. En todos estos casos, las células hematopoyéticas primitivas
son intrínsicamente anormales, por lo que deben ser reemplazadas por células
sanas. Dependiendo de las indicaciones médicas, al sujeto donador se le pue-
de extraer médula ósea o sangre periférica movilizada. Por supuesto que en
situaciones muy específicas, las células a trasplantar pueden provenir de una
unidad de sangre de cordón umbilical.

247

Figura 2. En el trasplante hematopoyético alogénico se busca a un sujeto que sea lo más inmuno-
compatible posible con el paciente. A dicho sujeto (donador) se le extrae médula ósea o sangre
periférica movilizada, la cual es introducida al paciente —por vía intravenosa— una vez que el
tratamiento con radiación y/o quimioterapia ha finalizado.

En ciertos trastornos hematológicos en los que las células troncales y progenitoras

hematopoyéticas no parecen estar involucradas, como los linfomas y el mieloma
múltiple, el trasplante autólogo —en combinación con quimioterapia— se ha em-
pleado con resultados muy favorables. De hecho, en una elevada proporción de
pacientes se observa una remisión (desaparición de los síntomas de la enfermedad)
completa y duradera (22,23). El trasplante autólogo también es empleado en pa-
cientes con neoplasias no hematológicas. Por ejemplo, imaginemos a una persona
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

que tiene un tumor sólido, en el cual no participa el sistema hematopoyético. Este

tipo de neoplasias son tratadas con quimioterapia y/o radioterapia; sin embargo,
debido a que no son específicos, dichos procedimientos también afectan a tejidos
sanos que tienen un alto recambio celular, como el epitelio intestinal, la piel y el
sistema hematopoyético. Para evitar complicaciones hematológicas provocadas
por el tratamiento, las cuales pueden llegar a poner en riesgo la vida del paciente,
en muchos casos se realiza un trasplante autólogo (Figura 3). Esto es, antes de iniciar
el tratamiento se obtiene médula ósea o sangre periférica movilizada del paciente,
la cual es criopreservada a -196°C; posteriormente se inicia el esquema terapéu-
tico, el cual puede durar varios meses. Al finalizar el tratamiento, se descongela la
unidad de células hematopoyéticas y se transfunde al paciente.

248

Figura 3. En el trasplante hematopoyético autólogo el paciente es también el donador. Antes de ini-

ciar el tratamiento, al paciente se le extrae médula ósea o sangre periférica movilizada y las células
son criopreservadas. Una vez que el tratamiento con radioterapia y/o quimioterapia ha finalizado,
las células hematopoyéticas son descongeladas e introducidas al paciente por vía intravenosa.

Si bien los trasplantes hematopoyéticos han contribuido a mejorar los tratamien-

tos de pacientes con enfermedades hematológicas, es claro que existen proble-
mas, algunos de ellos muy serios, asociados a estos procedimientos. En cuanto
a los trasplantes alogénicos, hay dos problemas de consideración. El primero de
ellos se refiere a la probabilidad de encontrar donadores compatibles con el pa-
ciente. Dentro del ámbito familiar, la probabilidad de encontrar un donador es del
capitulo X Trasplante de Células Hematopoyéticas

20%; fuera de dicho ámbito, la probabilidad es menor. En algunas ocasiones los

tiempos de espera son de varios meses, lo cual puede resultar en la muerte del pa-
ciente antes de haber encontrado al donador. El segundo problema se refiere a
la Enfermedad de Injerto contra Hospedero, en la cual los linfocitos T del donador
generan una reacción inmunológica contra los tejidos del paciente, provocando
alteraciones que pueden ir de las indolentes a las muy graves (24). Esta patología
se presenta en una proporción muy significativa de pacientes trasplantados y su
frecuencia aumenta mientras menor es la compatibilidad con el donador.

En cuanto a los trasplantes autólogos, el principal problema es la probabili-

dad de reintroducir células neoplásicas, las cuales pueden reactivar la enferme-
dad y provocar las recaídas. Esto es mas evidente en los pacientes con enfer-
medades hematológicas; aunque, aún en pacientes con tumores sólidos existe
la posibilidad de reintroducir células malignas existe. No debemos olvidar que la
médula ósea parece ser un reservorio de células de diferentes tejidos, por lo que
puede albergar células cancerosas que se “desprendieron” del tumor y viajaron
por el torrente sanguíneo.

BIOLOGÍA DEL TRASPLANTE HEMATOPOYÉTICO

Como ya sabemos, en la médula ósea están presentes diversos tipos celulares 249
que son fundamentales para la hematopoyesis, esto es, células hematopoyéti-
cas, células endoteliales y células estromales. Estas tres poblaciones son obteni-
das durante la aspiración de médula ósea —por supuesto que las células hema-
topoyéticas son las que se obtienen en mayor proporción— y son introducidas
al paciente durante el procedimiento de infusión. En las unidades de sangre
periférica movilizada y sangre de cordón umbilical la frecuencia de células es-
tromales y endoteliales es menor, sin embargo, los resultados con las tres fuentes
son comparables, lo que indica que realmente es el contenido de células he-
matopoyéticas el que determina el éxito del trasplante.

No importa cual sea la fuente de células hematopoyéticas, la infusión de éstas

generalmente se hace por vía intravenosa. Esto significa que las células trasplan-
tadas deben viajar en el torrente sanguíneo y “encontrar” su camino hacia la mé-
dula ósea, en donde se establecerán y repoblarán el sistema hematopoyético.
Lo anterior se lleva a cabo a través de la interacción entre moléculas secretadas
por el microambiente hematopoyético y sus respectivos receptores presentes en
las células hematopoyéticas. En particular, existe un complejo que juega un papel
fundamental en este proceso, el complejo CXCL12 – CXCR4. CXCL12, también
conocido como Stroma-Derived Factor-1 (SDF1) es un factor producido y secre-
tado por las células del estroma medular, el cual se une a su receptor (CXCR4) en
la superficie de las células hematopoyéticas primitivas (25). Hay evidencias de la
formación de un gradiente de CXCL12, el cual “guía” a las células hematopoyé-
ticas recién trasplantadas hacia la médula ósea; de hecho, alteraciones en la
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

formación de dicho complejo impiden la migración y la colonización medular por

parte de las células inyectadas en el sujeto receptor del trasplante.

¿Cuál de todas las poblaciones celulares hematopoyéticas es la más impor-

tante durante el trasplante; las células troncales, las progenitoras o las maduras?
Esta es una pregunta que en repetidas ocasiones ha sido planteada por los inves-
tigadores del área. La respuesta correcta es: todas las anteriores. Efectivamen-
te, durante el trasplante hematopoyético es necesaria la presencia de todas las
poblaciones mencionadas. De acuerdo a estudios experimentales en modelos
animales (ratones), las células maduras y precursoras contenidas en la unidad de
células hematopoyéticas trasplantadas permiten que exista un aporte inmediato
de células sanguíneas para cubrir las necesidades fisiológicas durante los primeros
días posteriores al trasplante; las células progenitoras permiten la generación de
células sanguíneas que cubren las necesidades fisiológicas a partir de la segunda
semana, mientras que las células troncales se encargan de la reconstitución per-
manente del sistema hematopoyético, con lo cual se cubre el aporte sanguíneo
durante el resto de la vida del individuo (Figura 4). Si una persona fuera trasplan-
tada exclusivamente con células progenitoras, su reconstitución hematopoyética
sería transitoria y después de unos 40-50 días ya no produciría células sanguíneas;
si dicha persona fuera trasplantada exclusivamente con células troncales, no ten-
250 dría células sanguíneas para cubrir las necesidades fisiológicas durante las prime-
ras 3 semanas postrasplante, por lo que moriría durante esos días.

Figura 4. Contribución relativa de las células hematopoyéticas trasplantadas. De acuerdo a es-

tudios en modelos animales, se ha observado que inmediatamente después del trasplante, las
células sanguíneas presentes en la circulación corresponden a las células maduras que fueron
trasplantadas; diez días después del trasplante, la mayoría de las células sanguíneas provienen de
las células progenitoras que fueron trasplantadas; después de los 40 días pos-trasplante, las células
sanguíneas provienen de las células troncales trasplantadas.
capitulo XI Regeneración

ESTADO ACTUAL DE LOS HCT EN EL MUNDO

Como ya se ha mencionado, el HCT es un procedimiento terapéutico de gran

uso en la actualidad. En los últimos tres años, el número de trasplantes realizados
a nivel mundial ha sido superior a los 55,000 procedimientos por año. Estos datos
incluyen reportes de 1,327 centros hospitalarios en 71 países. Cerca de la mitad de
los trasplantes (48%) se realizan en Europa, mientras que un 35% se realiza en los Es-
tados Unidos de América. El resto son realizados en América Latina, Asia y África.

En algunas instituciones de países desarrollados el trasplante hematopoyéti-

co se realiza con gran frecuencia. Por ejemplo, en el Fred Hutchinson Cancer
Research Center, en Seattle, EUA, se realizan más de 500 trasplantes al año, lo
que significa que se lleva a cabo más de 1 trasplante al día. Números similares se
reportan para el MD Anderson Cancer Center, en Houston, EUA. La estadística
mundial indica que cerca del 60% de los trasplantes corresponde a trasplantes
autólogos, mientras que el 40% restante corresponde a trasplantes alogénicos.

La principal fuente de obtención de células hematopoyéticas es la sangre

periférica movilizada, la cual se emplea en el 50% del total de trasplantes alo-
génicos y en el 90% de los autólogos, seguida por la médula ósea —que se usa
en el 25% de los alogénicos y en el10% de los autólogos— y la sangre de cordón
umbilical (usada en el 25% de los alogénicos). Sin embargo, es importante des- 251
tacar que en pacientes pediátricos, la sangre de cordón umbilical es fuente de
células hematopoyéticas en el 45% de los casos.

EL TRASPLANTE HEMATOPOYÉTICO EN MÉXICO

Los primeros HCT llevados a cabo en México se realizaron a principios de la dé-

cada de 1980. El Dr. Ricardo Sosa, en el Instituto Nacional de la Nutrición (INN-
SZ), y el Dr. Manuel Morales Polanco, en el Instituto Mexicano del Seguro Social
(IMSS), fueron los pioneros en esta área. Ambos recibieron adiestramiento en el
Fred Hutchinson Cancer Research Center, en Seattle, en el Departamento dirigi-
do por el Dr. E Donall Thomas. Los primeros trasplantes fueron esfuerzos aislados
con resultados pobres; esto ocasionó que se perdiera el entusiasmo y que se le
diera poca importancia a este procedimiento, de tal suerte que desapareció
de la práctica médica nacional durante casi 15 años. Fue hasta mediados de
la década de 1990 cuando los trasplantes hematopoyéticos volvieron a cobrar
interés por parte de las instituciones médicas mexicanas. Varios médicos salieron
del país a prepararse en instituciones norteamericanas y europeas (principal-
mente en España y Francia) y al regresar impulsaron la creación de programas
de trasplantes hematopoyéticos en diversas instituciones nacionales.

La institución mexicana que más trasplantes hematopoyéticos ha realizado

es el IMSS; el cual ha llevado a cabo alrededor del 60% de todos los trasplantes
que se han hecho en México. Dentro de esta institución, destacan el Centro
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

Médico Nacional “La Raza” (en el D. F.), el Centro Médico Nacional “Manuel
Ávila Camacho” (en Puebla) y el Centro Médico Nacional “Siglo XXI” (en el D.
F.). Otras instituciones de salud que han destacado en el ámbito público son el
Hospital Universitario de la Universidad Autónoma de Nuevo León, en Monterrey,
el Instituto Nacional de Pediatría, el INCMNSZ, el Instituto Nacional de Cancero-
logía y el Centro Médico Nacional “20 de Noviembre”, del ISSSTE. En el ámbito
privado han destacado el Centro de Hematología y Medicina Interna de Pue-
bla y el Centro Médico ABC, en la Ciudad de México (26).

De acuerdo a un cálculo conservador, el número total de trasplantes hemato-

poyéticos realizados en México, desde que se iniciaron los programas institucio-
nales —en 1995— hasta el día de hoy, es alrededor de 3,800. Este número indica
que durante los últimos 15 años, se han realizado, en promedio, 260 trasplantes al
año. Estas cifras dejan ver que la práctica nacional en materia de trasplantes he-
matopoyéticos es todavía muy pobre. Si bien, la realidad nos dice que el número
de procedimientos ha ido en aumento, el estado actual de los trasplantes hema-
topoyéticos en México sigue siendo preocupante. En la actualidad, en México se
realizan alrededor de 400 trasplantes hematopoyéticos al año, tanto en institucio-
nes públicas como privadas. Considerando el tamaño de nuestra población, así
como las necesidades y requerimientos, este número es muy bajo. Efectivamente,
252 de acuerdo a un cálculo basado en el número de habitantes en nuestro país y el
número de personas que requieren un HCT, se ha concluido que en México debe-
rían realizarse alrededor de 4,000 trasplantes cada año, lo que significa que solo
se realiza el 10% de los trasplantes que se deberían llevar a cabo.

En cuanto a trasplantes de sangre de cordón umbilical, la experiencia nacio-

nal es todavía incipiente. Este tipo de trasplantes se realiza en contadas institu-
ciones y los números son todavía pequeños. Sin embargo, es importante desta-
car que esta práctica va en aumento y ya se cuenta con 4 bancos públicos de
importancia (en el Centro Nacional de la Transfusión Sanguínea, en el Centro
Médico Nacional “La Raza” del IMSS (27), en el Hospital Universitario de la Uni-
versidad Autónoma de Nuevo León y en el Instituto Nacional de Diagnóstico y
Referencia Epidemiológica (INDRE).

EL FUTURO DEL HCT

Si consideramos el camino que ha recorrido este procedimiento terapéutico du-

rante los últimos 50 años, estoy seguro que debemos ser muy optimistas al hablar
del futuro de los trasplantes hematopoyéticos. Yo, en lo particular, soy optimista,
pues estoy convencido de que los avances en diversas áreas de la biomedicina
permitirán expandir el panorama de este tipo de trasplantes. En un futuro cercano
veremos mejores resultados en cuanto al tratamiento de las enfermedades hema-
tológicas en las que ya se emplean los trasplantes; los efectos secundarios y los pro-
blemas de histocompatibilidad serán mejor controlados, la morbilidad asociada al
capitulo XI Regeneración

trasplante disminuirá en forma significativa y los periodos de supervivencia libre de

enfermedad serán cada vez más prolongados y con mejor calidad de vida. Pronto,
diversas enfermedades autoinmunes, metabólicas y neoplásicas, por mencionar
algunas, serán tratadas con más frecuencia con HCT. No me cabe la menor duda
de que así será. Por otra parte, en la medida en que se demuestre la plasticidad de
diferenciación de las HSC será posible ver el empleo del HCT para enfermedades
no hematológicas. En mi opinión, tiempos fascinantes se vislumbran en el horizonte.

Conclusiones

Sin lugar a dudas, los HCT han revolucionado el tratamiento de un gran número
de enfermedades del sistema hematopoyético. Algunos tipos de leucemias o
de síndromes de falla medular eran, hasta hace algún tiempo, incurables y ha
sido gracias a este tipo de trasplantes que en la actualidad los pacientes logran
varios años de supervivencia. Si bien lo mencionado en la sección anterior deja
ver mi actitud optimista con respecto al futuro, también me queda claro que
los retos en este campo siguen siendo numerosos. Desde mi punto de vista, el
principal reto es hacer de los trasplantes hematopoyéticos una práctica médica
accesible a los países pobres y en vías de desarrollo. Esto, evidentemente, ten-
drá que lograrse con base en políticas públicas que impulsen la investigación en 253
esta área y que permitan la capacitación de profesionales médicos y la adqui-
sición de mejor infraestructura y más recursos.

Agradecimientos

Deseo expresar mi agradecimiento a mis estudiantes y colegas, presentes y pa-

sados, por su apoyo incondicional y las enseñanzas que de ellos he recibido.
También agradezco a la Coordinación de Investigación en Salud del Instituto
Mexicano del Seguro Social (IMSS) y al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnolo-
gía (CONACYT) por el financiamiento que me han brindado para poder llevar
a cabo mi investigación en el campo de las células troncales y progenitoras del
sistema hematopoyético.
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

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Capítulo XI

Regeneración

Jesús Chimal-Monroy, Donovan Correa Gallegos

& Claudio Iván Galván-Hernández.

RESUMEN

La regeneración es un fenómeno biológico que consiste en la restauración o

reemplazo de estructuras completas u órganos cuando éstos han sido dañados
o amputados. El ajolote es un animal que tiene la extraordinaria capacidad
de regenerar sus extremidades, su cola y parte de su corazón después de una
amputación. De igual manera, es sorprendente la capacidad regenerativa del
corazón y de la aleta del pez cebra. Uno de los animales más sobresalientes por
su capacidad regenerativa, es la planaria, un gusano plano que es capaz de
regenerar un organismo completo prácticamente a partir de cualquier frag-
mento que haya sido cortado. En mamíferos, la capacidad regenerativa varía;
se sabe por un lado, que el hígado tiene una alta capacidad regenerativa y por
otro, que en las extremidades sólo la punta de los dedos, en edades perinata-
les, es capaz de regenerar. El por qué algunos animales tienen gran capacidad
regenerativa y otros no, es una pregunta que ha sido investigada a fondo por
muchos años y aunque actualmente aún no se tiene respuesta, este conoci-
miento ha sentado las bases de la medicina regenerativa para su aplicación en
tratamientos de enfermedades crónico-degenerativas o bien de amputaciones
de extremidades en humanos.

INTRODUCCIÓN

¿Qué es la regeneración?

El término regeneración se ha usado ampliamente para explicar los fenómenos

de reemplazo homeostático de los tejidos, por ejemplo: la piel, el linaje sanguí-
neo y el epitelio intestinal. Muchos organismos, a lo largo de su vida, pierden
constantemente partes de su cuerpo y tienen la capacidad de reemplazarlos.
Por ejemplo, en la planaria y en los gusanos anélidos existe una alta capacidad
para regenerar todo su cuerpo. En vertebrados, algunos anfibios tienen la capa-
cidad de reemplazar extremidades y colas, mientras que especies como el pez
cebra regeneran el corazón. Los venados, recambian periódicamente sus astas.
Los mamíferos, incluido el humano, son capaces de reparar el tejido muscular
esquelético dañado o el tejido hepático; en las hembras, tras su período mens-
trual se lleva a cabo la renovación del endometrio.
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

Mitología de la regeneración o de la inmortalidad

En la mitología griega resaltan dos historias que reflejan la capacidad de regenerar

órganos, lo que reflejaba la inmortalidad. En una de estas historias, Hércules, hijo
de Zeus, luchó contra el monstruo Hidra como parte de uno de sus 12 trabajos
encomendados para purificarse. Este monstruo mitológico de origen acuático,
tenía forma de serpiente y muchas cabezas. En la leyenda, Hércules, al intentar
matar a la bestia, cortaba cada una de las cabezas, sin embargo, cada vez que
lo hacía, las cabezas regeneraban y se multiplicaban. Para evitar el crecimiento
y multiplicación de las cabezas, Hércules cauterizó las heridas de los cuellos
recién cortados, evitando con ello la regeneración, al tiempo que lograba
vencer al monstruo (1). En una segunda historia, Prometeo intentó burlar a los
dioses entregándole el fuego a los humanos, motivo por el cual Zeus ordenó
fuera encadenado. Bajo este castigo, en el día un águila devoraba su hígado,
y éste se regeneraba durante la noche, ciclo que se repetía todos los días (2, 3).

En la mitología mexica, para poner en movimiento al Quinto Sol y crear a la hu-

manidad, era necesario sacrificar a los dioses. Uno de ellos, Xólotl, hermano mellizo
de Quetzalcóatl, rehuyendo a su destino se escondió en la tierra transformándose
inicialmente en maíz, luego en maguey y finalmente en ajolote, cuyo nombre ná-
huatl es axolotl (Figura 1). Tal vez los mexicas, al conocer la capacidad regenerati-
256 va del ajolote, lo asociaran al Dios Xólotl y con ello a la inmortalidad (4, 5).

Figura 1. El ajolote (Ambystoma mexicanum). Variantes criadas en cautiverio y usadas en la inves-

tigación de la biología regenerativa.
capitulo XI Regeneración

Historia de la regeneración

El primero en realizar estudios científicos sobre regeneración fue René-Antoine

Réamur en 1712. Réamur estudió la capacidad de los cangrejos de río para re-
generar sus extremidades. Existe registro, en la Academia de Ciencias de París,
de los trabajos de Melchisedech Thevenot en 1686 y de Claude Perrault en 1688
sobre la regeneración de la cola de la lagartija y de discusiones anecdóticas,
en 1690, sobre la regeneración de los dedos en humanos.

A partir de 1744, el estudio de la regeneración adquirió notoriedad con los ex-

perimentos de Abraham Trembley, quien tratando de descifrar si las hidras eran
animales o plantas, realizó los primeros experimentos en zoología. Para ello deci-
dió cortarlas (6). Si era planta, la hidra sería capaz de regenerar, si era animal no
regeneraría. Aunque en un principio, al observar un alto potencial de regene-
ración, concluyó que la hidra era una planta, observaciones más cuidadosas le
llevaron a afirmar que era un animal. También demostró, que tras hacer cortes
era posible generar organismos completos de sus pedazos y que al hacer cortes
parciales de un organismo regenerante, podría generar una hidra con muchas
cabezas (como el mitológico monstruo griego). Los aportes de Trembley inclu-
yen también las descripciones sobre la polaridad de la regeneración, el proceso
de cerrado de herida, la cantidad mínima de tejido necesaria para regenerar
y la capacidad de reproducción asexual de ciertos animales. En 1744, Charles 257
Bonnet, influenciado por los descubrimientos de Réamur y Trembley, describió la
capacidad regenerativa de las lombrices de tierra. En 1768, Lazzaro Spallanzani
estudió la capacidad de regeneración en gusanos acuáticos, babosas, cara-
coles, salamandras, renacuajos, ranas y sapos juveniles. Los experimentos de
Spallanzani en vertebrados tuvieron un mayor impacto, ya que permitían espe-
cular sobre la posible regeneración en humanos (7).

En 1823, John Todd analizó la participación de los nervios en la regeneración

de la extremidad y de la cola de las salamandras (8). Sin embargo, sus descubri-
mientos no adquirieron importancia sino hasta el siglo XX. A finales del siglo XIX y
principios del XX, debido a la gran cantidad de información difusa sobre rege-
neración, Thomas Morgan se dio a la tarea de definir la “regeneración” como
el reemplazo de partes pérdidas de un organismo, incluyendo el desarrollo de
todo un organismo a partir de una de sus partes. Para ello, acuñó los concep-
tos de “morfalaxis” y “epimorfosis”. Por un lado, Morgan (9) definió la morfalaxis
como la recuperación de parte o de todo el organismo a través de la remode-
lación de los remanentes del propio organismo; por el otro, definió la epimorfosis
como la recuperación de parte o de todo el organismo a través de la formación
de una estructura nueva que incluía un microambiente en la zona de daño; a
esta estructura se le denominaría posteriormente blastema (10).

Durante la primera mitad del siglo XX, se refinaron las hipótesis sobre los meca-
nismos celulares de la capacidad regenerativa en diferentes modelos animales.
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

Sin embargo, fue hasta la segunda mitad del mismo siglo que dichas hipótesis
se replantearon a la luz de las nuevas técnicas de la Biología molecular. Las
preguntas sobre la regeneración son las mismas desde los planteamientos de
Réamur en 1712.
TABLA 1. LÍNEA DEL TIEMPO

Año Investigación sobre regeneración

Thevenot y Perrault demostraron por primera vez la regeneración de la cola de la

1686
lagartija.

1712 Réamur presenta evidencia empírica sobre la regeneración de los cangrejos de río.

1744 Trembley demuestra la regeneración en la hidra.

1750 Bonnet confirma la regeneración en gusanos.

Spallanzani estudia la capacidad de regeneración de gusanos de tierra, urodelos y

1768
anuros. Sin saberlo fue el primero en describir la formación de un blastema.
Todd descubre la función del sistema nervioso en la regeneración de la extremidad
1823
de la salamandra.

Goodsir describe que en cada extremidad de los crustáceos existía un cuerpo

1844
parecido a una glándula que proporcionaba los precursores de las futuras patas.
258
Ernst Haeckel y Richard Greeff realizan experimentos de regeneración en organismos
1860
unicelulares.
Paul Frasse define las características celulares del proceso regenerativo. Trabajó
1885 con la epidermis, las glándulas y órganos subepidérmicos, el sistema esquelético en
vertebrados, el sistema nervioso, el muscular y el vascular.
Mortiz Nussbaum y Dietrich Barfurth demostraron en protozoarios que tanto el núcleo
1891
como el protoplasma eran necesarios para la regeneración.
Gustav Wolff realizó los experimentos de la regeneración del lente en el ojo de la
1894 salamandra. Mostró que éste regenera a partir del iris (no de la superficie del
ectodermo que es de donde se desarrolla).

1901 Morgan define la Regeneración e introduce los términos epimorfosis y morfalaxis.

Fritsch demuestra que la regeneración se debe a la formación de células del blastema

1911
indiferenciadas.
Godlewski proporciona evidencia sobre el origen epidérmico de las células del
1928
blastema.
Hellmich, siguiendo los trabajos de Collucci (1884), propuso que el origen celular del
1930
blastema era sanguíneo.
Butler propuso que el blastema se formaba por la capacidad del mesodermo del
1933
muñón a desdiferenciarse.
Weiss propuso que el origen celular del blastema era la existencia de reservas celulares,
1939
lo que implicaba la existencia de células indiferenciadas de tejido conjuntivo.

1959 Georges Mathé realizó el primer trasplante de médula ósea.

Hay y Fischman confirman la función de la desdiferenciación en la formación del

1961
blastema mostrando la transición de células músculares a células mononucleares.
capitulo XI Regeneración

DEFINIENDO EL FENÓMENO

La regeneración es un fenómeno biológico que consiste en la restauración o

reemplazo de órganos o estructuras complejas, como la extremidad (Figura 2) e
inclusive de organismos completos como la planaria, la hidra y la estrella de mar,
a partir de fragmentos cuando los organismos han sido dañados o amputados.
Morgan (9) propuso dos estrategias distintas de regeneración que enfatizaban
los dos modelos más estudiados hasta entonces. Por una parte, la amputación
de la extremidad de los anfibios urodelos (salamandras y tritones), lleva a la
creación de una estructura fácilmente vista llamada “blastema” que sugirió se
formaba por la proliferación de las células; a esta estrategia la llamó epimorfo-
sis. Por la otra, para él durante la regeneración de la planaria, no era evidente
la formación de un blastema, pero sí la plasticidad de todo el cuerpo para re-
cuperar su morfología. Es común que cuando se corta en fragmentos pequeños
a una planaria, se formen planarias de dimensiones parecidas a los fragmentos
y no al tamaño original. Morgan supuso que en la regeneración de la planaria,
la modificación global del organismo para recuperar su morfología era más im-
portante que la proliferación celular; a este proceso lo llamó morfalaxis. En la
actualidad el uso de esta clasificación se ha conservado, no obstante diversos
autores (9, 11-14) apuntan que estos procesos no son excluyentes e incluso son
complementarios durante la regeneración. Por ejemplo: 1) si se afecta de ma- 259
nera importante la proliferación como resultado de la denervación, el blastema
de las salamandras forma una extremidad más pequeña por reorganización de
las células adyacentes como ocurre en la morfalaxis (12, 15); 2) en la planaria se
forma un blastema en el sitio de corte como consecuencia de la proliferación
de los neoblastos (16); y 3) en la hidra dependiendo del nivel de amputación
o la estructura a regenerar se ha descrito que se opta por alguna de estas dos
estrategias, o por las dos (12, 17).
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

Figura 2. Regeneración de la extremidad del ajolote. Seguimiento fotográfico de la regeneración

de la extremidad del ajolote (A. mexicanum) a los 0, 10, 20, 30 y 60 días (d) post aumputación.

260
En términos generales en este capítulo consideramos que la regeneración
puede ocurrir a través de 4 mecanismos (18), aunque estos pueden ocurrir al
mismo tiempo en distintas especies:

La regeneración mediada por células troncales. Uno de los ejemplos mejor

estudiados es el que ocurre en la médula ósea, que es la encargada del reem-
plazo incesante de las células sanguíneas (Capítulo IV). Este mecanismo, tam-
bién es observado durante el reemplazo del epitelio intestinal o de la epidermis
y la formación de los tejidos ocurre debido a que las células troncales residentes
del tejido reciben señales que les indican que deben iniciar el programa de di-
ferenciación celular (Capítulo VII).

Epimorfosis. El término acuñado por Morgan se ha extendido y actualmente

se refiere a la formación de un tejido adulto a partir de una estructura com-
puesta de células indiferenciadas que da origen a una nueva estructura. Esta
estructura es llamada “blastema” y se ha especulado que este se forma a partir
de la desdiferenciación de las células de los tejidos residentes y/o bien a partir
de células indiferenciadas y/o células troncales. Otra de las características de
este proceso es la proliferación celular. Existen dos ejemplos muy claros de este
tipo de regeneración; la amputación de las extremidades de ajolotes y la rege-
neración de las planarias (Figura 3a y 3b).

Morfalaxis. Este proceso, se caracteriza porque la regeneración ocurre a partir

de una reorganización de los tejidos existentes, donde la proliferación celular es
capitulo XI Regeneración

muy reducida o nula. El mejor ejemplo de este tipo de regeneración es la que lle-
va a cabo la hidra (Figura 3c). Este organismo es capaz de regenerarse por com-
pleto a partir de un fragmento de tejido y el organismo formado es exactamente
igual al organismo de origen, pero reducido en tamaño. Sin embargo, después
de la regeneración el organismo crece hasta alcanzar su tamaño original.

Regeneración compensatoria. En este proceso ocurre la proliferación de las

células diferenciadas para restaurar el tamaño original del órgano dañado. Has-
ta ahora no se ha observado que las células que proliferan se originen de célu-
las troncales o de un blastema. El mejor ejemplo de este tipo de regeneración
se lleva a cabo en el hígado.

En cualquiera de los casos, es importante resaltar que las células a partir de

las cuales ocurrirá la regeneración son capaces de identificar su posición y de
restablecer el patrón espacial de los tejidos formados, además resulta intere-
sante que las células indiferenciadas no sólo se rediferencian en los tejidos, sino
que además adquieren la forma adecuada que permite la funcionalidad de la
estructura regenerada, este proceso se llama morfogénesis (19).

261

Figura 3. Epimorfosis y morfalaxis. La regeneración de la extremidad del ajolote (a) y de la planaria

(b) están mediadas por la proliferación celular y formación de un blastema en el sitio de corte,
por lo que son considerados procesos epimórficos. En el caso del ajolote, las células provienen de
los tejidos adyacentes, mientras que los neoblastos son la principal fuente celular en la planaria.
Por otro lado, en las hidras (c), la amputación del pie y/o la decapitación no forman blastemas y
no hay proliferación en los sitios de corte, las células en los sitios de corte forman las estructuras a
regenerar por procesos morfaláxicos. Pero en el caso de que el corte fuese a la mitad del cuerpo,
donde proliferan activamente las células troncales intersticiales, el proceso se vuelve epimórfico.
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

La regeneración mediada por células troncales

En este proceso es importante la presencia de un nicho de células troncales,

uno de los más conocidos, el hematopoyético, se explica en el capítulo VII. El
epitelio intestinal, es otro de los ejemplos mejor conocidos en los que el recam-
bio se lleva a cabo a partir de la activación de las células troncales que residen
en las criptas. Las células troncales no entran inmediatamente al programa de
diferenciación, antes llevan a cabo una amplificación transitoria que da origen
a las células precursoras. Mientras ocurre la proliferación, las células de la base
de las criptas migran hacia su parte superior en donde inicia su diferenciación
(20). La señalización a través de la vía “WNT”, tiene una función muy importante
en este proceso de diferenciación. Si la señal se reduce o elimina, el comparti-
mento de células troncales se pierde y, por el contrario, al sobre activar la seña-
lización WNT la población de células troncales se incrementa; este proceso está
asociado a la generación de tumores (21-23). Por lo tanto, para mantener la
homeostasis del epitelio intestinal, existen señales que contrarrestan los efectos
de la señalización WNT y promueven la diferenciación del epitelio intestinal.

La señalización WNT es una ruta bastante conservada en la evolución, se

caracteriza por la presencia de ligandos WNT que se unen a receptores tipo
Frizzled, al interactuar activan la proteína β-catenina promoviendo su liberación
262 de un complejo que la lleva a degradación (23, 24). La β-catenina activada
regula positivamente la transcripción de una gran variedad de genes.

Regeneración por epimorfosis

Regeneración de planarias

La planarias son gusanos planos, no segmentados del filum de los Platyhelmintos,

con una porción cefálica identificable con dos manchas oculares en la parte dor-
sal, una porción central con una abertura ventral y una faringe dilatable y la cola
en la porción posterior. Tienen gran capacidad de regenerar segmentos o la to-
talidad de su cuerpo, capacidad que es usada como una estrategia de repro-
ducción asexual al auto-segmentarse (25). Durante la regeneración, las planarias
forman una estructura especializada o blastema en el sitio de daño. Este blastema
surge a consecuencia de la proliferación de una población de células troncales
pluripotentes llamadas neoblastos (16, 26). A partir de esta estructura, todos los
tejidos que se perdieron por la amputación inician su formación (27) (Figura 3b).

Uno de los aspectos más sobresalientes del estudio de la regeneración de las

planarias es que los fragmentos que son capaces de regenerar lo hacen estable-
ciendo los distintos ejes de simetría, de manera que el organismo regenera de ma-
nera correcta (25). El fragmento del animal que se cortó hacia la región anterior es
capaz de formar una cabeza con mucha mayor frecuencia que lo que lo hace
un fragmento cortado hacia la región posterior (asociado a la regeneración de la
capitulo XI Regeneración

cola). Esto sugiere la existencia de gradientes de señalización que le confieren la

polaridad antero-posterior al fragmento en regeneración. Se ha descrito que la se-
ñalización WNT es sumamente importante para establecer esta polaridad antero-
posterior. Una disminución gradual de la señalización WNT o su ausencia lleva a la
generación de individuos sin cola, con dos cabezas y dos faringes o con dos cabe-
zas y faringes desorganizadas; la forma más severa de alteración en la polaridad es
una planaria con una gran cabeza con una simetría tipo radial (25, 28, 29).

Regeneración de extremidades de urodelos

Los anfibios del orden de los urodelos como las salamandras, tritones y el ajolote
Ambystoma mexicanum (Figura 1), poseen un potencial regenerativo envidia-
ble dentro de los vertebrados ya que son capaces de regenerar la cola, el ojo,
la mandíbula, varios órganos internos y, en particular, estructuras tan comple-
jas como la extremidad (Figura 2), que muestra paralelismos con el desarrollo
embrionario (30). Vertebrados como las aves, los reptiles y los mamíferos care-
cen de la capacidad de regenerar sus extremidades, y en los anfibios anuros la
capacidad de regenerar sus extremidades se pierde una vez que los animales
salen de su etapa larvaria (asociado a cambios en los sistemas inmunológico,
óseo y endocrino). Al ser amputada una extremidad del ajolote, ocurren varios 263
procesos celulares que culminan con la regeneración completa de todas las
estructuras de la extremidad (19) (Figura 3a). En primer lugar ocurre la repara-
ción de la herida, que es un proceso bastante rápido en el que se incluye una
gran remodelación de la matriz extracelular. En mamíferos, que carecen de la
capacidad de regenerar la extremidad, también se lleva a cabo el proceso de
cerrado de herida, sin embargo, a diferencia de los urodelos existe una respues-
ta inflamatoria que conlleva a la formación de una cicatriz (31, 32).
Posterior al cerrado de la herida se forman dos estructuras que promueven la
regeneración de la extremidad; 1) el blastema que se forma entre el epitelio que
cierra la herida y el tejido del muñón y 2) la Capa Epidérmica Apical (AEC por sus
siglas en inglés) que se forma por debajo del epitelio que cubre la herida (18, 19).
El blastema ha sido considerado como un grupo heterogéneo de células que
conservan su memoria posicional y cuyo origen, es el tejido cercano a la herida
que se ha desdiferenciado hacia un estado pluripotencial, a partir de la cual pue-
den regenerarse todas las estructuras de la extremidad (33). Sin embargo, aún no
se ha logrado establecer si el blastema alberga células troncales. Recientemente
se reportó que las extremidades en regeneración de salamandra expresan mar-
cadores de células pluripotenciales como Nanog, Sox2 y Klf4 (CapítuloXIII).

Una vez que la extremidad amputada ha cerrado la herida y formado el blas-

tema ocurren muchos procesos que llevan a la morfogénesis de la extremidad y el
establecimiento de los patrones de manera similar a lo que ocurre durante la forma-
ción de la extremidad embrionaria. En la extremidad en regeneración, se observa
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

que las células indiferenciadas dentro del blastema responden a las señales especí-
ficas que inducen la formación de los distintos linajes celulares, que dan origen a los
distintos tejidos de la extremidad con una organización espacio-temporal que lleva
al desarrollo correcto y funcional de la extremidad. Este último proceso depende
de la AEC la cual es muy similar a la cresta ectodérmica apical que se forma en el
primordio de la extremidad embrionaria. La regeneración de la extremidad puede
bloquearse si en algún momento del proceso estas estructuras (epitelio de cierre de
herida, blastema y la AEC) son eliminadas. Hay reportes que sugieren una participa-
ción importante de la señalización WNT en la regeneración de las extremidades (34,
35). Si se bloquea la señalización de WNT en extremidades en regeneración, ésta se
inhibe, mientras que si se activa, se promueve. Por ejemplo, si se bloquea la señal
WNT en extremidades de ajolotes durante la regeneración, esta es inhibida, mientras
que si se activa en la rana africana Xenopus laevis, se promueve la regeneración de
las extremidades incluso en etapas en las que normalmente no regenera.

Es importante resaltar que las extremidades en regeneración normalmente

recuperan las partes faltantes. Sin embargo, el uso de fármacos que inhiben o
sobre activan los gradientes de señalización generan anomalías en el proceso
de regeneración. Por ejemplo, un exceso de ácido retinoico es capaz de indu-
cir la regeneración de una extremidad completa sin importar el nivel al que se
264 corta, generando una duplicación próximo-distal.

Otro de los factores que se ha considerado en el estudio de la regeneración

es la innervación, ya que se sabe que los factores neurotróficos son capaces de
estimular la expresión de genes implicados en ella (36, 37).

Regeneración de las aletas de peces

A diferencia de la extremidad de los urodelos, las aletas de los peces son mucho
más simples y carecen de musculatura. Esta relativa simplicidad permite rege-
nerar completamente las estructuras pérdidas en menos de dos semanas (38).
El componente principal de las aletas son los radios espinales, de los cuales se
forman blastemas independientes en el sitio de corte durante la regeneración.
Particularmente, el blastema del pez cebra se divide en dos subpoblaciones fun-
cionalmente distintas. La primera subpoblacion corresponde al blastema distal,
que prolifera lentamente y se cree dirige el crecimiento regenerativo, mientras
que la segunda subpoblación corresponde al blastema proximal que prolifera
rápidamente (39). No se ha reportado hasta la fecha, algún estudio que sugie-
ra el origen de las células que forman el blastema durante la regeneración de
la aleta, pero la evidencia apoya la hipótesis de que el blastema se forma por
desdiferenciación de las células presentes como ocurren con el ajolote. El pro-
ceso de regeneración en la aleta del pez cebra difiere de la regeneración de la
extremidad en otros vertebrados, en que el proceso de cerrado de herida sólo
implica la migración celular, este proceso dura menos de dos días y está regu-
capitulo XI Regeneración

lado por la sobre expresión de moléculas de las que resaltan algunos miembros
de la familia WNT. Si la señalización WNT/ β-catenina se altera en las primeras 6
horas de amputación, el epitelio que cubre la herida no se desarrollará de ma-
nera correcta (40). Se sabe que la expresión diferencial de WNT a lo largo del eje
próximo-distal participa en la formación del blastema, en la proliferación celular
y en el crecimiento adecuado de la aleta al regular la expresión de genes y la
activación de otras rutas de señalización (40, 41).

Regeneración por morfalaxis

Regeneración de hidras

Las hidras son cnidarios del grupo de los hidrozoos, y al igual que los ajolotes lle-
gan a la madurez sexual manteniendo características físicas juveniles. Su cuerpo
se divide en tres segmentos: en la base del cuerpo está el disco basal o pie con el
que se aferran a algún sustrato, el cuerpo columnar en el que se ubica el intestino
y la cabeza donde se encuentra el hipostoma que contiene una boca primitiva
y los tentáculos motiles. La distribución y diferenciación de las células están de-
terminadas por la constante división de células troncales en el cuerpo columnar
(Figura 3c), por una migración activa y un desplazamiento pasivo de las células
hacia los dos polos (cabeza-pie) (12, 17, 42). Dentro del cuerpo columnar de la
265
hidra hay tres poblaciones celulares que cumplen los criterios de troncalidad:
las células troncales intersticiales —con gran capacidad mitótica—, las células
troncales endodermales y las células troncales ectodermales con una menor
capacidad mitótica (42). Durante la regeneración de la cabeza de la hidra no
hay proliferación celular evidente, las células endodermales en el sitio de corte
pasan por un estado transitorio donde pierden sus uniones y su polaridad apical-
basal, adquiriendo una morfología redonda y desorganizada semejante a un
blastema. Después las células recuperan su polaridad y cambian su morfología
para regenerar las estructuras de la cabeza por el mecanismo de morfalaxis. Sin
embargo, si el corte se realiza a la mitad de cuerpo columnar se lleva a cabo la
regeneración de la cabeza por un mecanismo epimórfico (17, 42). Esta diferen-
cia en el proceso de regeneración de la cabeza dependiente del nivel de corte
se ha asociado a dos mecanismos: 1) la presencia de un morfógeno que regula
la polaridad antero-posterior; y, 2) los niveles de apoptosis. En la regeneración
del pie, por otra parte, las células más basales al sitio de corte adquieren la iden-
tidad de disco basal. En este caso la regeneración depende únicamente de la
proliferación de las células troncales y su migración activa y pasiva (43).

La regeneración de la hidra es también un excelente modelo para estudiar

la formación de los patrones espaciales. Se sabe que en la cabeza, existe un
centro organizador o morfógeno que emite una señal de WNT que promueve su
formación (17, 42). Tras una decapitación, WNT inicia su expresión a los 15 minu-
tos y mantiene su expresión hasta que termina el proceso. Su expresión mantie-
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

ne la regeneración, regula la correcta formación de los ejes y brinda las señales

necesarias para activar el programa regenerativo y no un simple cerrado de
herida. Existe otra señal proveniente de la parte inferior del cuerpo que es capaz
de inhibir la formación de la cabeza.

Regeneración compensatoria

Regeneración del hígado

El hígado es el único órgano de mamíferos con una gran capacidad regenerativa,

se sabe que es capaz de recuperarse aun después de la eliminación de un 70%
de su masa tisular. En humanos este proceso ocurre en un lapso de tiempo de 3 a
6 meses (18), lo que refleja la importancia del hígado como un órgano vital en el
metabolismo del individuo. La pérdida del tejido hepático puede ocurrir por mu-
chas causas, pero una de las principales se debe a la muerte celular provocada
por la ingesta de toxinas o por infecciones virales. El tipo celular más abundante
del hígado es el hepatocito, que inicia su ciclo celular una vez que comienza la
regeneración (44). Es importante resaltar que en este proceso los hepatocitos no se
desdiferencian. Los hepatocitos son el primer linaje celular que prolifera en el pro-
ceso de regeneración; posteriormente lo harán los otros tipos celulares residentes
266 del hígado. Se ha establecido que en la regeneración del hígado podrían partici-
par células progenitoras residentes, probablemente, en los canales de Hering en el
árbol biliar, llamadas células ovales. Por un lado, se ha observado que estas células
progenitoras se diferencian hacia hepatocitos. Por otro, se ha observado que en el
hígado en regeneración, los hepatocitos son capaces de transdiferenciarse hacia
células epiteliales biliares en condiciones en las que estas células no serían capaces
de proliferar, o cuando esta capacidad está limitada por factores externos (44).

Resulta interesante mencionar que la arquitectura correcta del hígado no se

lleva a cabo hasta finalizar el proceso de la regeneración, momento en el cual
se restablece toda la organización de los hepatocitos, las células de Kuppfer, las
células del epitelio biliar y los endotelios.

En la regeneración hepática se sabe que participa la ruta WNT. Esta promueve

la diferenciación de las células progenitoras “ovales” hacia hepatocitos. En ausen-
cia de WNT, las células ovales se diferencian hacia células del epitelio biliar (24, 45).

OTROS MODELOS DE REGENERACIÓN

Regeneración de la punta de los dedos en mamíferos

Un modelo que ha planteado dudas acerca de la regeneración en mamíferos,

es la regeneración de la punta del dedo de ratones perinatales (46). Cuando se
corta la falange terminal del dígito de las extremidades de ratones de hasta 3
capitulo XI Regeneración

semanas de nacidos se ha observado que regeneran (Figura 4). Aunque el pro-

ceso de regeneración en la falange terminal del dígito generará una falange
nueva, esta tendrá una forma de gancho y será más corta (Figura 4K, 4L, 4O y
4P). La regeneración de la falange terminal implica un proceso dual de osifica-
ción (mientras que la parte que queda próxima a falange medial inicia un pro-
ceso de osificación endocondral, la parte más distal inicia un proceso de osifica-
ción directa). De manera general, en la regeneración del dígito, la médula ósea
se transforma en tejido óseo (Figura 4H 4L y 4P). Se ha sugerido, sin demostrarse,
que la regeneración del dígito se debe a la existencia de células troncales en la
región ungueal (zona de formación de la uña) (Figura 4B 4F y 4H). Por lo tanto,
se hace relevante determinar la presencia de células troncales en la punta de
los dedos de animales en edades con capacidad regenerativa y compararlos
con animales que han perdido esta capacidad, ya sea por su edad o por que
la amputación se realiza en una zona diferente a la falange terminal.

La capacidad regenerativa de la punta del dedo disminuye mientras más

proximal sea el nivel de la amputación. Cortar la cuarta parte más distal de la
última falange conlleva a una adecuada regeneración, cortes en la mitad de
la falange afecta importantemente la capacidad regenerativa y amputacio-
nes más proximales no pueden recuperarse. Este proceso de regeneración se
cree que es parecido a los urodelos, mediado por la creación de un blastema 267
formado de células de origen mesenquimal, principalmente de los fibroblastos
en el tejido conjuntivo. El origen exacto de las células que forman el blastema y
su naturaleza se desconoce. Pocos laboratorios en el mundo han desarrollado
estrategias para encontrar la identidad celular del blastema. Un estudio com-
parativo entre distintas cepas de ratones, mostró que la cepa MRL posee un ma-
yor potencial regenerativo que otras cepas. Dicha capacidad, es parecida a la
mostrada en anfibios (47). Esto alienta la idea de que al entender semejanzas y
diferencias entre mamíferos y anfibios se pueda mejorar la capacidad regene-
rativa en roedores y en última instancia, en humanos (46).
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

268

Figura 4. Regeneración del dígito de ratón. (A) Vista ventral de la pata posterior del ratón. Tinción de
esqueleto con azul alciano y rojo alizarina. Se muestra la identidad de los dígitos (1-5) en el eje antero-
posterior. La falange terminal (f.t.) tiene forma de garra y se embebe en la uña. (B) Vista sagital del
dígito en el día 11 posnatal. Tinción tricrómica de Masson donde se aprecian: (m.u.) matriz ungueal,
(f.m.) falange medial, (f.t.) falange terminal, (c.) cojinete y (u.) uña. (C) Vista sagital del dígito am-
putado a nivel distal. La amputación se realizó a la mitad de la falange terminal eliminando la región
correspondiente de la uña y un pedazo del cojinete del dedo (este incluye la epidermis, dermis y glán-
dulas). La matriz ungueal quedo intacta. (D) Secuencia temporal de regeneración. Se obtuvieron los
dedos 2 (control) y 3 (amputado) a los 7, 25, y 35 días post amputación (pa). La amputación del dedo
3 se realizó el día 11 post natal. El proceso de regeneración del dígito de ratón dura aproximadamente
30 días. A los 7 días post amputación el dedo 3 (G-H vs E-F) esta inflamado, lo que queda de la f.t. está
en un proceso de osificación endocondral y el cojinete ha desaparecido. En el dígito regenerante, la
médula ósea (m.o.) se transforma en tejido óseo (t.o.) (L-P). A lo largo de la f.t. del dígito regenerante
se observan islotes de hueso que se está separando. El cojinete, que se ha perdido en la amputación,
no se recupera durante el proceso de regeneración (H, L, P). Durante la regeneración, la f.t. adquiere
una forma de gancho (L,P), es más gruesa que la del control (J, N) y su longitud es menor. Barras de
escala: (A) 1 mm, (M) 228 mm y (E, F, G, H, I, J, K, L, N, O, P) 200 mm.
capitulo XI Regeneración

Regeneración de las astas

Las astas de los cérvidos (renos, venados, alces) son un modelo interesante de
regeneración (48), ya que anualmente producen un par de nuevas astas a par-
tir de protrusiones en el cráneo llamadas pedículos, esto en respuesta a picos
de testosterona temporales. La capacidad para regenerar las astas reside en el
periosteo frontal del pedículo, también llamado periosteo asterogénico (AP). La
evidencia experimental sugiere que existe una población de células troncales
dentro del AP responsables de la regeneración de tejidos mesoblásticos en las
astas (músculo liso, cartílago, vasculatura y dermis). Aunque este proceso no
está descrito a profundidad se presume que ocurre por epimorfosis.

Regeneración en otros organismos

Los organismos que se reproducen asexualmente, por medio de la fragmenta-

ción mantienen una gran capacidad regenerativa (49). Los gusanos anélidos
del género Enquitraeus pueden auto-segmentarse y formar hasta 10 organismos
independientes en dos semanas (50). La recuperación de los segmentos, perdi-
dos durante la autotomía (proceso de auto-segmentación), surge a partir de la
formación de un blastema en la parte más anterior para formar la cabeza y otro
posterior para la cola, la regeneración de los segmentos intermedios se da por 269
la morfalaxis de los anillos originales. Al igual que en la planaria, el blastema de
estos gusanos anélidos se forma por la acción de neoblastos y además, por la
desdiferenciación de células intestinales y epiteliales (50).

También se ha sugerido, la acción de células troncales multipotentes en otros

organismos con gran capacidad regenerativa como los equinodermos: lirios de
mar, erizos de mar, estrellas de mar, así como en los protocordados ascidias (51-
55). Sin embargo, la falta de herramientas moleculares dificultan su estudio.

EVOLUCIÓN Y REGENERACIÓN

Una de las preguntas que surge del estudio de la regeneración se refiere a la

aparición del proceso en la evolución de los organismos. Dicha pregunta se
planteó incluso antes de los postulados de adaptación natural y evolución de
Lamarck y Darwin con las descripciones de Réamur, Trembley, Bonnet y Spallan-
zani, al percatarse que incluso en animales parecidos variaba la capacidad
regenerativa (Figura 5). Asimismo, los pioneros en el estudio científico de la rege-
neración se percataron de la importancia de otros factores, por ejemplo medio
ambientales (la disposición del alimento, el ciclo de muda de exoesqueleto y la
propensión de las extremidades a ser amputados). Aunque el debate fue deses-
timado por Morgan (9), la necesidad de proponer argumentos sólidos inició dos
tipos de estudios: los ecológicos y los evolutivos. Se empezó a investigar sobre fe-
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

nómenos indirectos de la regeneración: el éxito reproductivo, la sobrevivencia,

el costo de regenerar y el costo de no regenerar (10, 56).

Se ha considerado a la regeneración, como un proceso evolutivamente con-

servado que sería el mismo o muy parecido entre todas las especies y que invo-
lucraría mecanismos conservados del mantenimiento de la homeostasis de los
tejidos (12, 17, 49, 57, 58). Bely (57) ha propuesto analizar la regeneración com-
parando el cerrado de herida, la formación de una zona inductora, la formación
de un blastema y la consolidación del mismo en distintas especies. El sugiere con-
siderar la regeneración como un proceso conservado a lo largo del árbol filoge-
nético y que se perdió en distintas especies por presiones ambientales (Figura 5).

Ya desde el siglo XVIII se sabía sobre las posibles alteraciones en la extremidad

regenerada, sin embargo, no se habían desarrollado investigaciones sobre la in-
fluencia de la regeneración en el desempeño del propio organismo en su medio
ambiente. Los estudios ecológicos se han centrado en la evaluación de las ventajas
evolutivas que representa para un organismo regenerar, se han utilizado dos estrate-
gias; comparar organismos que no regeneran contra organismos que si regeneran
y comparar organismos que se auto-amputan y regeneran contra organismos que
se auto-amputan y no regeneran. Aunque la amputación de la extremidad impli-
ca una ventaja inmediata ya que podría sobrevivir al escapar de un depredador,
270 durante el proceso de reparación del tejido se tendrían consecuencias en la loco-
moción, forrajeo, reproducción (fecundidad, conducta de apareamiento), creci-
miento y tener consecuencias metabólicas, alterando así la sobrevivencia (56, 58).

A nivel molecular, es sobresaliente la identificación de rutas de señalización

comunes que han aparecido con la evolución de los metazoarios. En este ca-
pítulo nos hemos enfocado principalmente a la señalización WNT, aunque ésta
no es la única ni la más importante, pero su participación en el desarrollo y en
la regeneración es innegable. Por lo tanto, cabría preguntarse si el proceso de
regeneración y los procesos de diferenciación celular, establecimiento de pa-
trones y polaridad que ocurren en los embriones de los metazoarios durante su
desarrollo, así como la homeostasis de los tejidos adultos tienen algo en común.
De igual manera hay que resaltar que esta misma señalización, es muy impor-
tante en la generación de tumores y éstos principalmente se forman porque las
células troncales son las afectadas.
capitulo XI Regeneración

Figura 5. Evolución de la regeneración. Árbol filogenético que muestra organismos con capacida-
des regenerativas. Note que la capacidad regenerativa disminuye mientras más complejo es el
organismo (representado por el degradado).

271
MEDICINA REGENERATIVA

Una de las metas de la medicina regenerativa es el aplicar el conocimiento ob-

tenido sobre el estudio de los distintos modelos animales, para el tratamiento de
enfermedades degenerativas y en el mejor de los casos inducir la regeneración
de tejidos y órganos. De los aspectos más importantes que se debe tener en
mente, es que las células a partir de las cuales ocurrirá la regeneración deben
ser capaces de identificar su posición y de restablecer el patrón espacial de los
tejidos formados.

Existen dos alternativas para el tratamiento de enfermedades crónico-degene-

rativas. Una primera, enfocada principalmente a la terapia celular, al hacer uso
de las células troncales directamente. Sin embargo, se debe tener en cuenta
que estas células, tienen la capacidad de autorrenovación y presentan división
celular asimétrica, de manera que si en el tejido hospedero, las células troncales
no son capaces de diferenciarse en el tipo celular correcto, se corre el peligro
de que esta población se mantenga en su estado troncal con una alta proba-
bilidad de generar tumores. Por lo tanto, debe considerase como alternativa el
inducir la diferenciación celular hacia un linaje específico a partir de las células
troncales, y mantener este estado diferenciado. Esta estrategia, en principio
evitaría la formación de tumores, por lo que el reto importante, es el que se logre
la integración de la población celular diferenciada. Una segunda alternativa
que se debe considerar, y en la que actualmente se están desarrollando inves-
tigaciones en este campo, es la “creación” de órganos completos in vitro, a
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

partir de controlar la diferenciación celular y morfogénesis del órgano formado.

Finalmente, uno de los retos más importantes, es lograr inducir la regeneración
de estructuras completas con el uso de pequeñas moléculas que actúan como
agonistas o antagonistas de distintas rutas de señalización. Un reto importante
de la medicina regenerativa es lograr inducir la regeneración de las extremida-
des en humanos de manera similar a como ocurren en los urodelos.

Por otro lado, es importante tener en cuenta de que para lograr tratamien-
tos exitosos no es suficiente con inducir la diferenciación celular correcta de
los tejidos, sino que es necesario que las células logren generar la organización
tridimensional correcta en el tejido hospedero, evento que favorecerá la funcio-
nalidad del tejido u órgano.

Conclusiones

Desde la antigüedad, el humano se ha interesado en el proceso de la regene-

ración, probablemente por el deseo de recuperar estructuras del cuerpo pérdi-
das por alguna lesión o enfermedad. El estudio de la regeneración, ha llevado
considerar a proceso como un mecanismos molecular evolutivamente conser-
vado. Para fines de estudio, podemos decir que la regeneración ocurre por 4
272 mecanismos: I) la regeneración mediada por células troncales residentes. II) La
epimorfosis caracterizada por la formación de un blastema, III) La morfalaxis,
en la cual el tejido restante se reorganiza para reconstruir la morfología original
y IV) la regeneración compensatoria, que se enfoca en la recuperación de la
función, y no de la forma, mediante la proliferación y restauración de la masa
tisular funcional. El conocimiento generado a partir de los estudios básicos en
modelos animales, permite generar la expectativa que en un futuro la Medicina
Regenerativa logre avances importantes y proponga pensar en la restauración
o reemplazo de tejidos, órganos o estructuras complejas en los humanos.

Agradecimientos

Los autores quieren agradecer el apoyo bibliográfico a la Lic. Lucía Brito. Este
trabajo fue apoyado por los financiamientos del CONACYT No 53484 y por PA-
PIIT-DGAPA No IN220808. Donovan Correa Gallegos recibió beca por parte del
Observatorio de Visualización Ixtli de la UNAM y la Red FARMED del CONACYT.
Claudio Iván Galván-Hernández recibió beca por parte de la Fundación Lorena
Alejandra Gallardo, i. de a.p. y la Red FARMED del CONACYT.
capitulo XI Regeneración

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Capítulo XII

Las células troncales en el rescate

de patologías del sistema nervioso

Mónica Lamas & Iván Velasco

RESUMEN

A principios del siglo XX, el premio Nobel de Fisiología y Medicina, Santiago Ra-
món y Cajal declaró: “Las vías nerviosas en el adulto son algo fijo, acabado,
inmutable”. Si bien este dogma se mantuvo durante casi un siglo, actualmente
es un hecho aceptado que en el cerebro de los mamíferos, incluyendo a la es-
pecie humana, hay generación de nuevas neuronas en regiones restringidas del
cerebro. Al día de hoy, la caracterización del proceso de neurogénesis, partien-
do de células troncales y el desarrollo de la capacidad de obtención, manipu-
lación y trasplante de estas células con capacidad neurogénica, abren el ca-
mino de la Medicina Regenerativa para abordar la reparación de la retina o el
Sistema Nervioso Central en estado patológico. Las principales estrategias que
se están explorando en la actualidad son la activación y posterior diferencia-
ción de precursores endógenos, o bien el trasplante de neuronas diferenciadas
in vitro que sustituyan la función de las células nerviosas ausentes o disfunciona-
les. De este modo, esperamos que en el futuro todo, o buena parte del Sistema
Nervioso adulto, pueda ser reparable.

INTRODUCCIÓN

Sin duda, el sistema más complejo en los animales es el nervioso. Los órganos sen-
soriales nos permiten percatarnos de lo que pasa en nuestro entorno y el cerebro
nos permite procesar información para responder a tales estímulos, además de
que nos define como individuos. Desafortunadamente, accidentes que afectan
a los componentes del sistema nervioso, así como el desarrollo de patologías
agudas o crónicas han contribuido a un aumento en las enfermedades que lo
afectan, como la ceguera, las enfermedades de Alzheimer y Parkinson, así como
otros padecimientos como la depresión, la Esclerosis Múltiple, la Esclerosis Lateral
Amiotrófica (ALS por sus iniciales en inglés), incapacitan a una proporción signi-
ficativa de la población mundial. En este capítulo nos concentramos en discutir
hallazgos relevantes para la restauración de la visión, así como estrategias para
mejorar la condición de modelos animales de Parkinson y de la ALS.
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

RESTAURACIÓN DE LA VISIÓN

Estructura del ojo y el proceso de la visión

El ojo es el órgano encargado de convertir la señal luminosa en estímulos ner-

viosos y transmitirlos al cerebro para su procesamiento. Desde el punto de vista
anatómico, el globo ocular está constituido por tres capas: externa, media e in-
terna. La capa externa o esclerótica está formada por una parte de tejido con-
juntivo opaco con una función protectora y una parte de tejido transparente
o córnea. En la capa media, se distinguen a su vez tres estructuras: la coroides,
una membrana formada principalmente por vasos sanguíneos; una estructura
muscular denominada cuerpo ciliar y el iris, que contiene una abertura central o
pupila. La capa interna, está constituida por la retina, una estructura que onto-
genéticamente constituye una extensión del cerebro anterior que avanza junto
con el nervio óptico hasta penetrar en el ojo.

Las diferentes estructuras se organizan de manera que tras la córnea se loca-

liza una cámara que contiene el humor acuoso, un fluido que separa la córnea
de la lente o cristalino. Por detrás de ésta se localiza el humor vítreo cuya presión
mantiene la forma del ojo.

276

Figura 1. Representación esquemática de las principales estructuras del ojo humano. Para detalles
ver el texto.
capitulo XII Las células troncales en el rescate de patologías del sistema nervioso

El ojo, además, es un órgano altamente vascularizado irrigado principalmen-

te por la arteria oftálmica. En el proceso de irrigación participan dos sistemas
vasculares: los vasos retinianos y los vasos uveales o ciliares. En los seres huma-
nos, los vasos oculares derivan de la arteria oftálmica que se ramifica en la arte-
ria central de la retina y las arterias ciliares posteriores y anteriores.

Durante el proceso de la visión, la luz entra en el ojo a través de la córnea,

cruza el iris y el humor acuoso, dirigiéndose hacia el cristalino. Tras abandonar
la lente, la luz atraviesa el humor vítreo e incide sobre la retina. Es en este tejido,
la retina, donde a través del proceso de fototransducción los impulsos de luz se
transforman en señales eléctricas, que pueden ser transportadas a lo largo del
nervio óptico, para su procesamiento e interpretación en áreas especializadas
del cerebro, como la corteza visual. Deficiencias en cualquiera de los compo-
nentes o estructuras de este proceso, ya sea en la maquinaria de la fototrans-
ducción, en vías neuronales o, más comúnmente, en la vasculatura, pueden
llevar a la pérdida de la visión de forma irreversible. Lamentablemente, para
algunas de las patologías oculares más graves todavía no se dispone de tra-
tamientos clínicos efectivos. En este contexto, surge la propuesta de terapias
regenerativas basadas en la capacidad de las células troncales (SC, del inglés
Stem Cells) de dirigirse hacia lugares donde se ha producido daño tisular, dife-
renciarse a fenotipos celulares terminales y contribuir a la estabilización del teji- 277
do dañado, por lo tanto, a evitar la pérdida de la visión durante el desarrollo de
algunas de patologías oculares.

Medicina regenerativa ocular: estrategias y dificultades

La terapia regenerativa ocular aprovecha el potencial para diferenciar que po-

seen las SC, siguiendo diferentes estrategias que conllevan a la obtención de
logros específicos, entre los que se destaca: el reemplazo o sustitución de aque-
llas neuronas que han sido dañadas (1); la creación de microambientes neu-
roprotectores a través de la secreción de factores tróficos o de supervivencia
(2); o la activación y posterior diferenciación de SC endógenas (3). En modelos
animales, el trasplante regenerativo en el ojo se realiza mediante diversas estra-
tegias experimentales, siendo la más común la inyección de SC en el espacio in-
travítreo o subretinal que deben, posteriormente, migrar hacia la zona dañada,
integrarse y establecer conexiones funcionales o comenzar a secretar factores
neurotróficos o neuroprotectores.

En estos protocolos se han utilizado SC de diversos orígenes que han arrojado

resultados variables:

Células troncales embrionarias (ESC, del inglés Embryonic Stem Cells), con
una capacidad pluripotencial de diferenciación, estas células pueden ser ma-
nipuladas, de manera previa al trasplante, para obtener los fenotipos de neu-
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

ronas retinales requeridas (4). Un problema asociado con la utilización de éstas

células es su capacidad de formar tumores.

Células troncales mesenquimales (MSC, del inglés Mesenchymal Stem Cells),

fácilmente aisladas de la médula ósea o del cordón umbilical, presentan la ven-
taja de permitir la realización de trasplantes autólogos (5).

Células precursoras/progenitoras neurales (NPC, del inglés Neural precursor/

progenitor cells), derivadas del hipocampo adulto que, en microambientes per-
misivos, pueden diferenciar y expresar ciertos marcadores de células retinales,
pero cuya eficacia todavía es materia de controversia (6).

Células progenitoras derivadas del ojo que han sido aisladas del margen retinal
anterior o cuerpo ciliar, del epitelio corneal y de la retina, que hasta el momento
son los mejores candidatos por su capacidad para generar linajes retinales (7).

Células troncales pluripotentes inducidas (iPSC, del inglés Induced Pluripotent

Stem Cells), cuya máxima ventaja es que pueden ser obtenidas a partir de fi-
broblastos humanos, presentan la capacidad de generar linajes neuronales es-
pecíficos de la retina. Se ha reportado la restauración de la respuesta a la luz
después del trasplante en el ojo dañado en modelos animales. Lo relevante del
procedimiento es que pueden ser obtenidas del mismo paciente con lo que se
278 evita el rechazo inmune (8). Las iPSC, similar a las ESC, pueden potencialmente
producir tumores conocidos como teratomas (ver capítulo II).

Además de encontrar una fuente eficiente de células para el trasplante,

existe una serie de dificultades asociadas al procedimiento que incluyen, entre
otras, el rechazo del trasplante, la deficiente supervivencia e integración de las
nuevas células en el tejido, la persistencia de un ambiente patológico inhóspito,
la dificultad de formar conexiones apropiadas entre las nuevas células y el tejido
residente, la formación de tumores, etc. A pesar de ello, la posibilidad de restau-
rar la visión mediante el uso de SC es cada día más real. Como se describe en
los apartados siguientes, experimentos en modelos animales han demostrado
que éstas células pueden restituir poblaciones en las retinas dañadas, reparar
vías de señalización en la corteza cerebral y restaurar las respuestas a la luz. Pero
además, en los últimos años se ha adquirido el conocimiento y se ha desarrolla-
do la tecnología, que ha hecho posible la generación de córneas a partir de
SC, las que han sido trasplantadas en humanos con cierto grado de éxito, por
lo que se han iniciado ensayos clínicos enfocados a la reparación de retinas
dañadas por ciertas retinopatías comunes.

Medicina regenerativa ocular: la córnea

La córnea es un tejido óptico transparente con una alta capacidad de refracción,

a través de la cual la luz se introduce en el ojo para generar finalmente imágenes
capitulo XII Las células troncales en el rescate de patologías del sistema nervioso

enfocadas en la retina. La integridad y funcionalidad de este tejido es esencial en

el proceso de la visión y las patologías que afectan a la córnea constituyen, des-
pués de las cataratas, la principal causa de ceguera alrededor del mundo (9). La
córnea está compuesta por tres capas celulares separadas por membranas ba-
sales especializadas: el epitelio corneal, una capa externa compuesta por células
epiteliales que se renuevan constantemente y se diferencian para formar una
capa superficial que establece una superficie óptica lisa; el estroma, una matriz
formada por fibras de colágeno y proteoglicanos, que contiene queratocitos y fi-
nalmente, una capa única de células endoteliales sin capacidad de replicación.

La agudeza visual depende, entre otros factores, de la transparencia de la

córnea, y ésta, a su vez, de la ausencia de vasculatura en el estroma y de la
integridad del epitelio. El epitelio corneal mantiene su integridad mediante un
ciclo constante de eliminación de células superficiales y del reemplazo de éstas
mediante nuevas células basales del epitelio. La fuente de las nuevas células
basales es el epitelio del “limbo” (Figura 2) o “unión cornoescleral”, una zona de
transición de aproximadamente 1 mm de anchura (situada entre la córnea y
el epitelio de la conjuntiva adyacente). De hecho, el limbo contiene SC (limbal
epithelial stem cells, LESC) que se mantienen en un estado indiferenciado. Tras
la activación, las LESC sufren una división asimétrica mediante la cual una célula
hija permanece como LESC mientras que la otra comienza a migrar a través de 279
las capas epiteliales y a diferenciar hasta convertirse en una célula madura que
se posiciona en la superficie ocular. Cualquier evento patológico que altere este
proceso da lugar a la degradación del epitelio.

Figura 2. Localización del limbo ocular.

 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

El conjunto de patologías caracterizadas por un daño extenso al limbo se

conoce como deficiencia de células troncales limbares (LSCD, del inglés limbal
stem cell deficiency). La LSCD puede ser hereditaria, como en el caso de la ani-
rida, o adquirida por ejemplo a través de quemaduras químicas o térmicas, o in-
fección. Las terapias desarrolladas en los últimos años para el tratamiento de la
LSCD involucran trasplantes de pequeñas biopsias de tejido limbar autólogo en
el caso de que la LSCD sea unilateral o de un donador cadavérico en el caso de
patología bilateral. El desarrollo de técnicas de cultivo y trasplante de SC cor-
neales aisladas ha permitido un avance importante en el área que ha llevado
incluso hasta la posibilidad de la fabricación de córneas artificiales que están
siendo exitosamente trasplantadas en pacientes (10). Se están explorando ade-
más, fuentes alternativas para la obtención de células corneales como MSC o
SC de los folículos pilosos que son cultivadas en medios químicos permisivos para
la diferenciación corneal (11). Sea cual sea el origen de las células o técnicas
utilizadas, el fin de estos procedimientos es siempre promover la reepitelización
y estabilización del epitelio, restaurar la transparencia de la córnea y recuperar
una cierta agudeza visual. A pesar de ciertas controversias sobre la duración y
eficiencia de los tratamientos, la evaluación de estos criterios en algunos ensa-
yos clínicos recientes ha llevado a reportes de rangos de éxito del 76%, aumen-
tando las opciones terapéuticas para estas patologías y haciendo de ésta una
280 de las áreas más avanzadas en el campo de la Medicina Regenerativa ocular
basada en el uso de SC (12).

Medicina regenerativa ocular: la retina

La retina es la capa más interna del globo ocular y físicamente se aprecia como
una capa delgada parcialmente transparente que tapiza la cara interna de la
coroides y limita su superficie interna con el vítreo. La vascularización retiniana
depende de la arteria central de la retina, una rama de la arteria oftálmica, que
forma una extensa red capilar encargada de la nutrición de las capas internas.
A su vez, las capas externas de la retina son alimentadas por los vasos coroideos.
La retina está constituida por elementos neuronales, gliales y células pigmentarias.

Las células de tipo neuronal incluyen:

1.- Fotorreceptores: responsables de la fototransducción, es decir, absorción de

las radiaciones luminosas y su transformación en impulso bioeléctrico o se-
ñal nerviosa. Se distinguen dos tipos, Conos, encargados de la visión fotópi-
ca (percepción visual que se obtiene con niveles de iluminación diurnos) y
bastones, encargados de la visión en condiciones escotópicas (percepción
visual en niveles bajos de iluminación).

2.- Células horizontales: que integran y regulan la señal proveniente de los foto-
rreceptores.
capitulo XII Las células troncales en el rescate de patologías del sistema nervioso

3.- Células bipolares: transmiten señales desde los bastones, los conos y las cé-
lulas horizontales a las células amacrinas o ganglionares.

4.- Células amacrinas: transmiten señales directamente de las células bipolares

a las células ganglionares, u horizontalmente, entre los axones de las células
bipolares, las dendritas de las células ganglionares y otras células amacrinas,
o entre estas últimas y las células interplexiformes.

5.- Células ganglionares: reciben impulsos de las amacrinas y bipolares y transmiten

señales de salida desde la retina al cuerpo geniculado lateral y al mesencéfalo.

6.- Células interplexiformes: que emiten señales inhibitorias y controlan la disemi-

nación lateral de señales visuales por las células horizontales.

Las células de tipo glial de la retina son: astrocitos (células gliales situadas pa-
ralelamente a las fibras ópticas y a los vasos sanguíneos), glía perivascular, micro-
glia y glía de Müller. Finalmente, en el Epitelio Pigmentario Retinal (EPR), de tipo
monoestratificado, las células epiteliales forman un mosaico de unos 20 mm de
espesor, cuyas prolongaciones citoplasmáticas se entrelazan con los segmentos
externos de los fotorreceptores de manera que las células del epitelio pigmenta-
rio forman una unidad con los fotorreceptores. La degeneración de las células del
EPR conlleva inevitablemente la pérdida secundaria de fotorreceptores. Los dife-
rentes tipos de células retinales se organizan en capas estructuradas (Figura 3).
281

Figura 3. Inmunotinción de la retina neural de rata en la que se aprecian las distintas capas en las
que se organizan las células retinales. ONL, capa nuclear externa que contiene los cuerpos celula-
res con los núcleos de los conos y bastones; OPL, capa plexiforme externa donde se efectúan las
sinapsis entre las células bipolares, los fotorreceptores, células interplexiformes y células horizontales;
INL, capa nuclear interna que contiene los núcleos de células bipolares, horizontales, amacrinas,
interplexiformes, células ganglionares desplazadas y los de las células de Müller; IPL, capa plexiforme
interna donde ocurre la sinapsis entre las células bipolares, ganglionares, amacrinas e interplexifor-
mes; GCL, capa de células ganglionares, formada por los núcleos de la mayoría de las células gan-
glionares en varios estratos, células amacrinas desplazadas, núcleos de algunos astrocitos y sinapsis.
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

La pérdida de la visión asociada a las retinopatías más comunes, que inclu-

yen glaucoma, retinitis pigmentosa (RP), retinopatía diabética (RD), retinopatía
del prematuro (ROP) y degeneración macular asociada con la edad (DMAE),
ocurre a través de dos procesos: el desarrollo de anormalidades vasculares y/o
a la muerte neuronal, generalmente de fotorreceptores. Una excelente alter-
nativa terapéutica sería aquella que pudiera proveer a la retina de protección
neuronal y vascular.

Cuando la microarquitectura retinal se conserva, como en el caso de la RD

o DMAE, la aproximación terapéutica se enfoca en la restauración de los foto-
rreceptores dañados. El desarrollo de tratamientos efectivos requiere del aisla-
miento e identificación de células progenitoras o troncales con capacidad de
diferenciación hacia células de la retina; de la caracterización del mecanismo
de diferenciación e integración de las SC en el entorno permisivo de la retina y
finalmente de la optimización del proceso de restauración de circuitos retinales
funcionales. Hasta ahora, se han desarrollado protocolos experimentales que
han conseguido con éxito generar células retinales, como conos y bastones,
a partir de ESC humanas, de mono y de ratón (13), y a partir de iPSC humanas
(8). Algunas de estas células han podido ser trasplantadas en retinas dañadas
de ratón, donde se han integrado y diferenciado hacia fotorreceptores (14); en
282 modelos animales de RP y ceguera congénita, el trasplante de SC de diversos
orígenes ha sido eficaz tanto en la preservación como en la restauración de la
respuesta visual de los animales (15,16).

En el caso de anormalidades vasculares como las que se presentan durante

el desarrollo de la DR o ROP, se ha propuesto el uso de células progenitoras neu-
rales o vasculares que pudieran ejercer un efecto de rescate ante daño severo
como hipoxia o degeneración (17). En este sentido, algunos estudios han de-
mostrado que el trasplante de una población específica de células progenitoras
aisladas de la médula ósea previene completamente la degeneración vascular
y neuronal de la retina en un modelo de ceguera congénita y que además
estas células pueden ser manipuladas genéticamente de forma previa al tras-
plante, de manera que se convierten en un sistema celular de administración
de dosis fisiológicas de sustancias protectoras a la parte posterior del ojo (18,19).

Pero además, existe una tercera alternativa que se refiere a la inducción de los
mecanismos endógenos de reparación retinales. Es un hecho conocido desde
hace al menos 100 años, que algunas especies de anfibios y peces son capaces
de responder al daño retinal mediante la regeneración casi completa de este teji-
do. Actualmente se ha demostrado que en ambas especies, la respuesta al daño
conlleva a la generación de células progenitoras nuevas, en un caso derivadas
de células del epitelio pigmentario (20) y en el otro, derivadas de células de Müller
pre-existentes (21). La retina adulta de otras especies, incluyendo la retina adulta
humana, parece haber perdido la capacidad presente durante el desarrollo de
permitir la integración de neuronas en el tejido y, por el contrario, crea barreras
capitulo XII Las células troncales en el rescate de patologías del sistema nervioso

pro-inflamatorias y reactivas que impiden la regeneración de células a partir de

un trasplante. Sin embargo, diferentes aproximaciones experimentales han de-
mostrado que la retina de mamíferos, de hecho, posee una cierta capacidad de
regeneración aunque ciertamente limitada (22). El desciframiento de los meca-
nismos moleculares que subyacen a la respuesta retinal al daño en otras especies,
está llevando al desarrollo de estrategias de estimulación de estos procesos en
la retina de mamíferos, lo que evitaría problemas de rechazo del trasplante (22).

Perspectivas: una visión de futuro

El objetivo final de la medicina regenerativa ocular es, sin duda, la restauración

de la función visual en individuos cuyos tejidos pudieran haber sido dañados por
enfermedad o trauma. De los estudios experimentales se deduce que existen dife-
rentes estrategias que pueden utilizarse para conseguir este fin. Sin embargo, al día
de hoy no ha sido posible trasladar el conocimiento generado a través del estudio
de las SC oculares hacia terapias clínicas exitosas fundamentalmente debido a la
falta de reproducibilidad de resultados obtenidos en diversos sistemas experimen-
tales y, como en otras áreas de la medicina regenerativa, a deficiencias en los
procesos de migración, integración y supervivencia de las células trasplantadas.
283
Ante estas perspectivas, se ha hecho evidente la necesidad de abordar es-
tudios multidisciplinares en los que, por ejemplo, se combinan procedimientos
tradicionales de aislamiento y cultivo celular con técnicas innovadoras de inge-
niería de tejidos. De esta manera se está explorando la utilización de diferentes
biomateriales sólidos sobre los que se realiza el trasplante de SC de variado ori-
gen con el fin de eludir los problemas de integración y supervivencia celular con
diverso rango de éxito (23-26).

Por otra parte, el desarrollo reciente de iPSC humanas y el descubrimiento de su

capacidad de diferenciación hacia células fotorreceptoras (8, 27) abre la extraor-
dinaria posibilidad de realizar trasplantes autólogos, obteniendo las células terapéu-
ticas del propio paciente y acercando la investigación básica al área clínica (28).

Enfermedades del Sistema Nervioso Central y su tratamiento con células

troncales: Parkinson y Esclerosis Lateral Amiotrófica como ejemplos

Sin duda, el sistema más complejo en los animales es el Sistema Nervioso Central
(CNS, del inglés Central Nervous System), compuesto por la médula espinal, el
cerebelo y el cerebro (Figura 4). Es el cerebro, el órgano que nos define como in-
dividuos y nos permite procesar información para responder a estímulos externos.
Los tipos celulares que lo constituyen se clasifican genéricamente como neuro-
nas y células gliales. Dentro de las primeras existe una gran variedad en cuánto
a los neurotransmisores que sintetizan y secretan para comunicarse con otras
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

neuronas, a través de las sinapsis, estructuras altamente especializadas para fa-

vorecer el flujo de información. La naturaleza química de los neurotransmisores
es muy variada, desde aminas biogénicas (dopamina, noradrenalina, serotoni-
na, histamina), aminoácidos (glutamato, ácido gama-amino butírico, glicina),
acetilcolina, adenosín trifostato, péptidos e incluso el óxido nítrico gaseoso. Los
neurotransmisores pueden causar excitación o inhibición de las neuronas que
reciben la información. Muchas regiones del cerebro están enriquecidas en al-
gunos subtipos neuronales y se comunican con una o múltiples regiones dentro
y fuera del CNS. Las células gliales comprenden a los astrocitos (diez veces más
abundantes que las neuronas) y los oligodendrocitos, que se encargan de aislar
eléctricamente los axones para que el impulso nervioso llegue más rápido a su
destino final. Durante muchos años se pensó que los astrocitos cumplían exclusi-
vamente funciones de soporte mecánico y aporte de factores de supervivencia
para las neuronas, pero recientemente se les ha atribuido nuevas funciones, en-
tre ellas la de generar nuevas neuronas en el cerebro adulto.

284

Figura 4. Alteraciones responsables de los síntomas de la Enfermedad de Parkinson y de la Esclero-

sis Lateral Amiotrófica. El sistema nervioso central está constituido por el cerebro, el cerebelo y la
médula espinal. La Enfermedad de Parkinson es causada por la pérdida de neuronas dopaminér-
gicas de la substantia nigra, en la base del cerebro, que inervan al cuerpo estriado. Cuando hay
una disminución mayor al 80% de este tipo de neuronas, se presentan los síntomas clásicos: bradi-
cinesia (dificultad para iniciar los movimientos voluntarios), temblor en reposo y rigidez muscular.
La muerte de las neuronas motoras espinales ocasiona una pérdida de la innervación colinérgica
muscular y como consecuencia parálisis y atrofia muscular.
capitulo XII Las células troncales en el rescate de patologías del sistema nervioso

Desafortunadamente la mayor longevidad que ha alcanzado la raza huma-

na ha incidido en la aparición de enfermedades que afectan al CNS, como
las enfermedades de Alzheimer y Parkinson. Además, hay otros padecimientos
como la depresión, la Esclerosis Múltiple, la Esclerosis Lateral Amiotrófica, por
mencionar algunas que afectan a una proporción significativa de la población
mundial. Si bien la incidencia es menor que otro grupo de padecimientos como
la Diabetes, los infartos al corazón o el cáncer, los padecimientos neurodege-
nerativos afectan las funciones que nos distinguen de otras especies, repercu-
tiendo en las actividades cotidianas, tanto para los pacientes, como para sus
familiares. Una de las múltiples maneras de contender con estas enfermedades
es realizar trasplantes que reponen las células que han muerto. En esta sección
se revisarán hallazgos relacionados con la terapia celular en modelos animales
de enfermedades neurodegenerativas como el Parkinson y la Esclerosis Lateral
Amiotrófica. La pérdida de neuronas que liberan dopamina (NDA) y de las neu-
ronas motoras (NM), son responsables de los síntomas en estos padecimientos,
es por esta razón que se piensa que la reposición o protección de estos subtipos
neuronales podría incidir positivamente en la condición de los organismos en-
fermos. Estas neuronas se pueden diferenciar in vitro a partír de SC de diferentes
clases, para cada enfermedad hay evidencia de que distintas SC y/o su proge-
nie pueden revertir, en mayor o menor medida, las alteraciones presentes en los
modelos experimentales. Si los resultados con los modelos animales son positivos 285
y reproducibles, se podría pensar en trasladar tales tratamientos a la clínica en
el mediano o largo plazo, no antes de 10 años.

Enfermedad de Parkinson

La Enfermedad de Parkinson (PD, del inglés Parkinson´s Disease) fue descrita en

1817 por el médico inglés James Parkinson en su “Essay on the shaking palsy”.
Los síntomas motores, típicamente unilaterales al inicio, progresan a una condi-
ción bilateral de temblor en reposo, rigidez muscular en movimientos pasivos y
bradicinesia, caracterizada por dificultad para iniciar los movimientos volunta-
rios. Otros síntomas incluyen inestabilidad en la postura, pérdida de la expresión
facial, y alteraciones en la marcha y el equilibrio. A pesar de ser primordialmen-
te una enfermedad motora, en ocasiones se presentan alteraciones psiquiátri-
cas como depresión y demencia. Actualmente la PD es uno de los desórdenes
neurodegenerativos más comunes en personas de edad avanzada, afectando
aproximadamente al 1% de la población mayor a 60 años. Es causada por una
alteración de los ganglios basales en el cerebro, la pérdida continua e irrever-
sible de las NDA en la substantia nigra (SN) pars compacta, con una concomi-
tante disminución de los niveles de dopamina (DA) en el cuerpo estriado. Estos
síntomas motores se presentan cuando ha habido una pérdida mayor al 80% de
las NDA y llevan a una condición de incapacidad que afecta de manera impor-
tante al paciente y repercute en la dinámica familiar. La PD ocupa el segundo
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

lugar en la prevalencia enfermedades neurológicas, siendo la más alta para la

tercera edad, solo después de la Enfermedad de Alzheimer (29, 30).

El origen de la PD no se ha establecido de manera conclusiva, ya que el 90%

de los casos son esporádicos. El pequeño porcentaje restante se debe a la PD
familiar, causada por mutaciones en los genes a-Sinucleina, DJ-1, UCHL1, Parkina
y PINK1. Existen muchas teorías desligadas de la genética, acerca del origen de
la PD, como la exposición a metales pesados, a toxinas o insecticidas, aunque no
hay un agente causal plenamente identificado. Lo que es indudable es que las
NDA son células con un metabolismo oxidativo muy elevado. Prueba de ello es la
neuromelanina, resultado de la formación de derivados oxidados de dopamina y
que les proporciona a las neuronas de la SN su color característico (29, 30).

La alteración histopatológica que define a la PD es la presencia de los cuer-

pos de Lewy, constituidos por agregados proteicos en el cerebro de los pacien-
tes. Sin embargo, esta detección se hace post-mortem y por lo tanto el diag-
nóstico de la PD recae en la observación de las manifestaciones clínicas en los
pacientes. Una prueba que puede orientar en el diagnóstico y posteriormente
ser útil en el seguimiento de las personas afectadas es la Tomografía por Emisión
de Positrones (PET por sus iniciales en inglés). En esta técnica se evalúan distintos
parámetros del metabolismo y señalización de la DA, mediante la inyección de
286 compuestos radioactivos de vida muy corta, que tienen afinidad por las regio-
nes cerebrales de interés.

El tratamiento de los pacientes consiste en administrarles fármacos como la

levodopa, el precursor químico inmediato de la dopamina, así como sustancias
que activen a los receptores que reconocen a la dopamina o bien compuestos
que prolonguen la presencia de dopamina en las sinapsis. Este tratamiento, aun-
que accesible tiene efectos secundarios importantes y pierde su efectividad por-
que las NDA continúan disminuyendo en número, por lo tanto ya no hay células
que biosinteticen dopamina. Existen también procedimientos quirúrgicos como
el implante profundo de electrodos que estimulan al núcleo subtalámico. Aun-
que esta última técnica parece tener buenos resultados, no es fácil de realizar.
También se ha ensayado en la clínica la suplementación directamente al cere-
bro de factores neurotróficos (es decir, que favorezcan la supervivencia) para las
NDA remanentes, en particular el factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF
por sus iniciales, del inglés Glial-Derived Neurotrophic Factor). Sin embargo, com-
plicaciones colaterales han impedido que se siga usando esta aproximación.

Una de las opciones terapéuticas para contender con la PD es la terapia de

reemplazo celular, que se ha practicado en pacientes, consiste en introducir
NDA, provenientes del mesencéfalo ventral de fetos abortados donados para
investigación, en el núcleo caudado de personas con la PD. Las células se han
administrado en una gran variedad de esquemas, que cambian en el grado
de disociación de las NDA y en la cantidad injertada en cada paciente. Los
capitulo XII Las células troncales en el rescate de patologías del sistema nervioso

ensayos iniciales sugerían un efecto benéfico de los trasplantes hechos en la

zona del estriado; sin embargo, estudios multicéntricos en donde se controló el
efecto placebo (es decir, el efecto psicológico de saber que se está recibien-
do un tratamiento, lo que incide sobre el desarrollo de la enfermedad, aún sin
recibir dicho tratamiento) indicaron que los beneficios eran marginales (31, 32).
Más aún, en una proporción baja, los pacientes que recibieron estos trasplantes
desarrollaron discinesias (movimientos involuntarios) como un efecto colateral
al tratamiento. Todos estos ensayos han producido resultados variables y no se
ha podido establecer un procedimiento seguro y eficaz que pueda curar a los
pacientes. Por esta razón, se han desarrollado varios modelos experimentales en
animales para ensayar terapias para el tratamiento de la PD.

Modelos animales de la enfermedad de Parkinson

Los modelos experimentales más utilizados son los llevados a cabo en roedores
(ratones y ratas), a los que se les administra una neurotoxina con especificidad
de acción sobre las NDA. Si bien estos modelos reproducen la carencia de NDA
en la SN, los efectos conductuales son distintos a los que presentan los pacien-
tes. De hecho, los ratones son organismos muy pequeños en los que se dificulta
hacer pruebas conductuales, porque no son fáciles de manipular y no presen- 287
tan temblor o rigidez muscular después de la administración de 1-metil-4-fenil-
1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP). Se ha intentado seleccionar mutantes naturales
y también generar ratones modificados genéticamente de manera inducida
que presenten una disminución de NDA, pero no se ha conseguido tener un
modelo realmente reproducible con tales deficiencias.

Por otro lado, el modelo de ratas hemiparkinsonianas ha sido ampliamente

utilizado desde su descripción inicial (33). Este protocolo consiste en inyectar
uno de los hemisferios del cerebro con la toxina 6-hidroxidopamina (6-OHDA),
lo que ocasiona un desbalance en la cantidad de DA en cada hemisferio ce-
rebral, lo que puede evaluarse por pruebas conductuales como la medición
de rotaciones al inyectar subcutáneamente apomorfina o anfetamina, o bien
realizar pruebas no farmacológicas para medir el grado de acinesia (falta de
movimiento) del lado afectado por la lesión (Figura 5).
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

288 Figura 5. Inducción de deficiencia de dopamina análoga a la Enfermedad de Parkinson y re-

cuperación conductual después del trasplante de neuronas dopaminérgicas diferenciadas de
células troncales embrionarias en roedores hemiparkinsonianos. Las células troncales embrionarias
de ratón expresan Oct-4, éstas pueden diferenciarse a neuronas dopaminérgicas. La inyección
de 6-hidroxidopamina (6-OHDA) en un hemisferio del cerebro de rata ocasiona la pérdida de ter-
minales nerviosas dopaminérgicas (positivas a Tirosina Hidroxilasa, TH) y una asimetría motora que
se puede evidenciar por el número de rotaciones inducidas por apomorfina, o en el uso de las
extremidades delanteras en la prueba del cilindro (ver flecha en animal lesionado indicando falta
de movilidad). Al trasplantar las neuronas que secretan dopamina, se obtiene una recuperación
en ambas pruebas conductuales (lesionado + trasplante).

Sin embargo, uno de los modelos experimentales que recapitula más fielmen-
te las alteraciones motoras presentes en la PD es el producido mediante la ad-
ministración sistémica de la neurotoxina MPTP en monos. Esta toxina se comenzó
a utilizar porque personas drogadictas intentaron sintetizar meperidina y como
el MPTP es un subproducto de la síntesis de esta droga, al inyectarse esa mez-
cla, las personas desarrollaron un síndrome parkinsónico agudo. Se ha reporta-
do que la intoxicación con MPTP reproduce las lesiones histológicas, así como
las alteraciones conductuales y bioquímicas características de la PD idiopática,
tanto en humanos (34) como en primates no humanos (35, 36, 37). La administra-
ción de MPTP para producir monos parkinsonianos involucra mayores recursos,
pero induce rigidez, bradicinesia, temblor y alteraciones en la postura (Figura 6).
Una diferencia importante entre los pacientes y los modelos experimentales es
que la degeneración de las NDA es aguda en los animales, mientras que en las
personas la muerte neuronal es un proceso crónico.
capitulo XII Las células troncales en el rescate de patologías del sistema nervioso

Figura 6. El tratamiento de monos con la neurotoxina MPTP induce un síndrome parkinsónico. Mo-
nos Vertet (Cercopithecus aethiops) pueden tratarse con MPTP para que desarrollen deficiencias
motoras muy similares a los pacientes con PD. En la foto superior se aprecia un mono antes de la
adminstración de MPTP. En la fotografía inferior, el mismo mono presenta una postura arqueada y
la cola no se mantiene erguida (ver flechas). El tiempo para alcanzar el alimento se incrementa
después de la intoxicación con MPTP (gráfica derecha); estos animales presentan alteraciones
motoras como bradicinesia, temblor y rigidez muscular.

Diferenciación de células troncales a neuronas que secretan dopamina y su

trasplante en modelos de la enfermedad de Parkinson 289
Células troncales neurales del cerebro adulto (ANSC, por sus iniciales del inglés
Adult Neural Stem Cells): Existen 2 zonas en el cerebro adulto de mamíferos, in-
cluyendo al humano, que contienen SC que pueden generar neuronas: la zona
subventricular adyacente a los ventrículos laterales y la zona subgranular del giro
dentado del hipocampo (ver capítulo IV). La generación de NDA a partir de pre-
cursores endógenos, presentes en el cerebro adulto, podría ser posible si se en-
cuentran condiciones para favorecer este fenómeno. Recientemente, se ha de-
mostrado que la propia DA es un estimulante endógeno de la neurogénesis en la
zona subventricular y en el hipocampo in vivo, y que la generación de neuronas
está abatida en pacientes con PD, presumiblemente por la falta de DA (38). Las
ANSC generan una baja proporción de NDA in vitro, a menos que se modifiquen
genéticamente para que sobre-expresen el factor transcripcional Nurr1 (39).

Células troncales neurales (NSC) del CNS en desarrollo: Otra posibilidad para
obtener NDA es usar NPC del cerebro medio prenatal, la región en donde se
forman estas neuronas. NSC del mesencéfalo de rata se han diferenciado en
cultivo a NDA y al trasplantarlas en el estriado, indujeron la recuperación funcio-
nal de ratas hemiparkinsónicas (40). Estas NSC generan neuronas que expresan
tirosina hidroxilasa (TH, la enzima limitante en la síntesis de DA) transitoriamente,
permitiendo una amplificación pequeña de los precursores mesencefálicos y
dificultando su posible aplicación en la clínica. Por otro lado, una línea inmortali-
zada de NSC, derivada de cerebelo, es capaz de promover la supervivencia de
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

NDA en ratones tratados con la toxina MPTP, debido probablemente a agentes

neuroprotectores secretados por las células trasplantadas, ya que éstas no se
diferencian a neuronas positivas a TH in vivo (41).

Células troncales embrionarias y células troncales pluripotentes inducidas: Las

NSC multipotentes producen bajos porcentajes de diferenciación a NDA. Si la
población inicial de SC es pluripotencial, los porcentajes se elevan considerable-
mente. Existen varios protocolos para la diferenciación dopaminérgica de ESC
de ratón o humano (42, 43, 44). De manera interesante, las hormonas esteroides
estradiol y progesterona facilitan la diferenciación de ESC de ratón a NDA (45).
En ratas hemiparkinsonianas, NDA diferenciadas de ESC o iPSC, trasplantadas en
el estriado, producen una recuperación conductual y bioquímica de los sujetos
experimentales (46, 47, 48), que incluye la liberación de dopamina en el estriado,
una mayor cantidad de sitios de unión al transportador de dopamina y la norma-
lización de la capacidad de unión de los receptores dopaminérgicos (49).

Por otra parte, Takagi y colaboradores diferenciaron ESC de mono a NDA

mediante la formación de neuroesferas y posteriormente las trasplantaron en el
putamen de monos intoxicados con MPTP. Se reportó una mejoría en las con-
ductas motoras evaluadas, lo que se correlacionó con un aumento en la recap-
tura de 18F-fluorodopa mediante imágenes funcionales con PET, indicativo de
290 una mayor síntesis de dopamina en el estriado de los monos trasplantados (50).

La generación de iPSC ha abierto una gran gama de posibilidades, especial-

mente el reprogramar células de tejidos somáticos adultos a un estado pluripo-
tencial, que se podrían utilizar para producir el tipo celular afectado por la en-
fermedad y posteriormente injertar ese tejido histocompatible en los pacientes.
Otra posibilidad es generar iPSC para estudiar mecanismos de patogénesis con
células humanas (por ejemplo, cómo y por qué mueren las NDA al reprogramar
células de pacientes con la PD) y por último probar el efecto de drogas en células
humanas diferenciadas hacia tipos celulares de interés clínico (un ejemplo sería
cómo incrementar la secreción de insulina en células beta pancreáticas obteni-
das de iPSC de pacientes con Diabetes tipo I). La reprogramación de fibroblastos
obtenidos de pacientes con PD idiopática se ha conseguido recientemente. De
manera interesante, estas iPSC humanas pueden diferenciarse a NDA (51) y pro-
ducir recuperación funcional al trasplantarse en ratas hemiparkinsonianas (52).

Esclerosis lateral amiotrófica

La ALS es una enfermedad caracterizada por la muerte de las NM en el cerebro

y la médula espinal, lo que tiene como consecuencia atrofia muscular y una pa-
rálisis progresiva que resulta letal, generalmente 1 a 5 años después de su diag-
nóstico, en donde se deben descartar afecciones que ataquen exclusivamente
al músculo. La ALS afecta a 350 000 personas y causa 100 000 muertes por año
capitulo XII Las células troncales en el rescate de patologías del sistema nervioso

en el planeta. Similar a lo que ocurre en la PD, aproximadamente 90 % de los

pacientes con ALS son casos esporádicos. El porcentaje restante corresponde a
personas que tienen familiares afectados por este padecimiento, por lo que se
clasifica como ALS familiar (FALS, del inglés Familial Amyotrophic Lateral Sclero-
sis). El 20 % de los enfermos de FALS presentan mutaciones dominantes en el gen
de la enzima Superóxido Dismutasa 1 (SOD1), que convierte el anión superóxido
en peróxido de hidrógeno, que aunque oxidante, es menos dañino que el su-
peróxido (53). De manera interesante, el efecto tóxico de las formas mutadas
de esta enzima sobre las NM no parece relacionarse con una pérdida en la
capacidad de transformar al superóxido, sino con la propiedad de las enzimas
mutadas de agregarse y formar depósitos citoplasmáticos que de alguna forma
afectan de manera selectiva a este tipo de neuronas. Las alteraciones patológi-
cas en ambos tipos de ALS, la esporádica y la familiar, incluyen modificaciones
del citoesqueleto, aumento del glutamato extracelular, disfunción mitocondrial,
activación de la microglía y una mayor presencia de especies reactivas de oxí-
geno. Actualmente, el único tratamiento que es marginalmente útil es la ad-
ministración de riluzole, una droga con un mecanismo de acción desconocido
que retrasa ligeramente el progreso de la enfermedad (54).

Modelos animales de la esclerosis lateral amiotrófica 291

En contraste con lo que ocurre en la PD, existen modelos genéticos que repro-
ducen la muerte de las NM cuando se expresan formas mutadas de la SOD1
humana en roedores transgénicos. A pesar de que existen más de 100 mutacio-
nes relacionadas con la FALS (55), solamente algunas se han expresado trans-
génicamente en roedores. Interesantemente, la sustitución de glicina (G) por
alanina (A) en la posición 93 (G93A) en la SOD1 (SOD1G93A) humana, expresada
tanto en ratones como en ratas transgénicas, produce la degeneración de las
NM y la parálisis cuando los animales alcanzan un estado adulto (56, 57). Estas
mutaciones reproducen las que se presentan en pacientes con ALS. Sin em-
bargo, una complicación importante es el hecho que no parece ser necesario
que las NM expresen a la SOD1G93A humana, puesto que en estudios donde se
ha expresado esta forma mutada en células que no son neuronas, se observa
la degeneración de las NM (58). Estos roedores han sido útiles para realizar estu-
dios de terapia génica con virus que se inyectan en los músculos, que son trans-
portados retrógradamente y permiten la expresión del factor de crecimiento
vascular endotelial o el factor de crecimiento similar a la insulina, lo que permite
una mayor supervivencia de las NM y extiende la vida de los animales, aunque
finalmente los roedores fallecen por la parálisis (59, 60).
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

Diferenciación de células troncales a neuronas motoras

De manera similar a lo que ocurre con las NDA, las NM no pueden diferenciarse
fácilmente de precursores neurales provenientes de la médula espinal en desa-
rrollo (61, 62), y es más eficiente la diferenciación a partir de ESC de ratón (63) o
de humano (64), mediante la exposición a las señales que se requieren para la
formación de este tipo de neuronas durante el desarrollo de la médula espinal.
Estos hallazgos podrían ser importantes para el tratamiento sustitutivo de pade-
cimientos que cursan con neurodegeneración motora, como la ALS.

Terapia celular en modelos animales de la esclerosis lateral amiotrófica

La terapia celular no ha sido eficiente en aliviar la parálisis en modelos de ALS.

Como ya se mencionó, los modelos que se utilizan más comúnmente son roedo-
res que expresan formas mutadas de la proteína SOD1 humana. No obstante,
en estos modelos de FALS se ha reportado que el trasplante de varios tipos de SC
extiende la superviviencia de los animales, pero la parálisis se sigue presentan-
do. Por ejemplo, el trasplante intraperitoneal de médula ósea ocasionó un retra-
so en la aparición de la parálisis de ratones transgénicos SOD1G93A (65). Por otra
parte, el trasplante intraespinal de NSC humanas (66) mostró la diferenciación
292 de estas células a neuronas y su integración en el tejido hospedero, así como
un retraso en la parálisis. Injertando en la médula espinal de ratas SOD1G93A as-
trocitos diferenciados de NSC diseñadas para secretar GDNF, se encontró una
protección marginal de las NM (67). La diferenciación de ESC de ratón a NM y su
trasplante en la médula espinal de ratas FALS adultas mostró una recuperación
funcional transitoria en la prueba del cilindro giratorio (rota rod, Figura 7). A pe-
sar de que las NM sobrevivieron por una semana en las ratas transgénicas, al fi-
nal los animales trasplantados se paralizaron y no presentaron NM endógenas o
trasplantadas, sugiriendo un efecto trófico de las células trasplantadas sobre las
NM endógenas, puesto que las trasplantadas nunca extendieron axones hacia
fuera de la médula espinal (68). En un modelo de neurodegeneración motora
que consiste en la infección de ratas con el virus Sindbis, el cual presenta una
preferencia para dañar a este tipo de neuronas, se observó que el trasplante de
NM diferenciadas de ESC, combinando dibutiril AMP cíclico y rolipram, causó la
innervación de los músculos por las NM injertadas y una clara recuperación de
la parálisis en los animales trasplantados (69).
capitulo XII Las células troncales en el rescate de patologías del sistema nervioso

Figura 7. Diferenciación de células troncales embrionarias a neuronas motoras y su trasplante en

roedores transgénicos que expresan la forma mutada de Superóxido dismutasa 1, un modelo de
la Esclerosis Lateral Amiotrófica de tipo familiar. Las células troncales embrionarias de ratón se mo-
dificaron genéticamente para que expresen la Proteína fluorescente verde (GFP) al diferenciarse
a motoneuronas. Las células inician su proceso de diferenciación por la formación de cuerpos em-
brioides, que se muestran en contraste de fase y en fluorescencia. Las neuronas motoras diferencia- 293
das expresan la GFP y se pueden trasplantar en la región ventral de la médula espinal de las ratas
transgénicas. La prueba del rota rod se realiza previamente al trasplante, y también de manera
posterior a éste. En la prueba conductual, los animales deben desplazarse mientras el cilindro rota-
torio va aumentando de velocidad gradualmente y caen si no pueden caminar. Su caída activa un
cronómetro que mide el tiempo que la rata pudo mantenerse en movimiento.

Células troncales pluripotentes inducidas de pacientes con esclerosis lateral

amiotrófica

Recientemente se reportó la reprogramación de fibroblastos de pacientes con

una forma de lento progreso de la ALS (70). Estas iPSC pudieron diferenciarse in
vitro a NM, abriendo la posibilidad de realizar trasplantes autólogos de las célu-
las pluripotenciales diferenciadas, o bien, de realizar estudios de las causas de
la neurodegeneración motora en células humanas.

Conclusiones

Si bien es cierto que los avances en los últimos años nos permiten ver con optimis-
mo la aplicación de las SC o sus derivados en el tratamiento de diversas patolo-
gías, susceptibles de corregirse por terapia de reemplazo celular, también existen
muchos aspectos que se deben abordar antes de que estos tratamientos se ofrez-
can en la práctica clínica. Con excepción de los tratamientos que utilizan médula
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

ósea o sangre periférica movilizada para curar alteraciones hematológicas, no

existe hasta la fecha ningún otro tratamiento seguro y eficaz para curar otros pa-
decimientos incluyendo los que afectan al CNS. Cada vez con más frecuencia
se anuncian tratamientos que involucran “células madre” de cualquier origen y
que se encuentran poco regulados. Para evitar sorpresas, es recomendable que
el médico que ofrece estos tratamientos experimentales pueda proporcionar al
paciente literatura científica, revisada y criticada por otros científicos, en donde
se demuestre que la terapia tiene buenas posibilidades de éxito porque se ha
ensayado en modelos animales. También debe presentar una autorización del
comité de Bioética de la institución en donde se haya aprobado el tratamiento
y conseguir la validación por instancias federales para ofrecer tales tratamientos.

Agradecimientos

Las investigaciones en los laboratorios de los autores son auspiciadas por el Conse-
jo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) mediante proyectos de investiga-
ción y la red Farmed (M.L., I.V.), el Centro de Investigación y de Estudios Avanzados
(Cinvestav; M.L.), la Universidad Nacional Autónoma de México “(PAPIIT IN224210;
I.V.) y los National Institutes of Health (I.V.). Los autores agradecen a Aurelio Cam-
294 pos-Romo, Emmanuel Díaz-Martínez, Rodrigo López-González, Jeannette Niestroy
y Mónica Ramírez la contribución a las figuras incluidas en este capítulo.
capitulo XII Las células troncales en el rescate de patologías del sistema nervioso

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Capítulo XIII

Reprogramación de células diferenciadas

al estado pluripotencial

Karlen Gazarian

RESUMEN

En años recientes, un grupo de investigadores lograron desarrollar técnicas que

permiten reprogramar células diferenciadas hacia un estado de células pluripo-
tenciales, similares a células troncales embrionarias, y posteriormente obtener
de ellas células diferenciadas de cualquier tipo. Las células pluripotenciales ob-
tenidas con esta técnica fueron definidas como células troncales pluripotencia-
les inducidas (induced pluripotent stem cells, iPSC) y abrieron un nuevo campo
de estudio de los mecanismos fundamentales de la diferenciación, desdiferen-
ciación y transdiferenciación, con promesas de sustituir a las células troncales
de origen embrionario en la derivación de células destinadas a la terapia de
reemplazo. En este capítulo se describe el desarrollo de la metodología para la
obtención de iPSC, su contribución a la ciencia biomédica básica y las perspec-
tivas para su aplicación en la Medicina Regenerativa.

INTRODUCCIÓN

Durante el proceso de formación del óvulo se producen y se acumulan, dentro

del ovoplasma, factores reguladores que se asocian y controlan la pluripotencia-
lidad y que son importantes tanto para el desarrollo del embrión como para las
células troncales embrionarias (Embryonic Stem Cells, ESC) obtenidas del blasto-
cisto. La diferenciación embrionaria resulta en la formación de alrededor de 200
tipos de células presentes en los organismos adultos (1). Las ESC poseen dos ca-
racterísticas importantes: la autorrenovación (divisiones ilimitadas para mantener
su número y pluripotencialidad) y la capacidad de diferenciación bajo estímulos
específicos para formar células especializadas que constituyen a los tejidos y a
los órganos. El esquema de la Figura 1 muestra los niveles de potencialidad de
células troncales (SC) que inicia desde un estado totipotencial, pasando por es-
tados de pluripotencialidad y multipotencialidad, y terminando con un estado
final unipotencial (capaz de desarrollar solo un tipo de célula diferenciada). Las
ESC se derivan de la masa celular interna (ICM) del blastocisto (ICM à epiblas-
to) cuya pluripotencialidad tiene un plazo de unos días y termina en el estadio
previo a la implantación puesto que en esta etapa la mayoría de las células em-
piezan a diferenciarse formando tres capas embrionarias: ectodermo, endoder-
mo, mesodermo. Un pequeño grupo de células mantiene la pluripotencialidad
formando los progenitores de células germinales (primordial germ cells, PGC) los
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

cuales migran y se diferencian en las gónadas. Hasta el inicio de la década de

1980, los estudios de desarrollo y diferenciación eran muy limitados porque con-
sistían en observar el desarrollo normal de embriones in vivo o de aquellos que se
cultivaban por periodos cortos de tiempo. En 1981 Evans y Kaufman (2) aislaron y
cultivaron por primera vez a las células de la ICM del embrión murino en estadio
de blastocisto, y mostraron que éstas son capaces de proliferar sin diferenciación
aparente, manteniendo su estado pluripotencial (por este trabajo, en 2007, Martin
Evans fue laureado con el Premio Nobel en el área de Fisiología y Medicina, junto
con Mario R. Capecci y Oliver Smithies). Posteriormente, en 1998, James Thomson
y su grupo en el Instituto de Investigacion de Morgridge en Madison, Wisconsin,
EUA, aislaron SC pluripotenciales de blastocistos humanos (3,4).

300

Figura 1. Se representan los distintos niveles de potencialidad de células troncales durante el desa-
rrollo de mamíferos. El cigoto y los blastómeros del embrión de 8 células son totipotenciales, puesto
que pueden generar al embrión y a los tejidos extraembrionarios que permiten su desarrollo. Las
células troncales embrionarias (ESC) y las células troncales del epiblasto (EpiSC) son pluripotenciales
porque pueden diferenciar a todos los tejidos embrionarios. Posteriormente aparecen células multi-
potenciales y finalmente ocurre la diferenciación terminal. ICM, masa celular interna; Tr, trofoblasto;
Epi, Epiblasto; Hipo, hipoblasto; Ec, ectodermo; Me, mesodermo; En, endodermo; Lg, línea germinal.

Actualmente, se ha conseguido cultivar estas células pluripotenciales y se desa-

rrollaron métodos de diferenciación para obtener casi cualquier tipo de célula dife-
renciada y funcionalmente madura, tales como cardiomiocitos, células del sistema
nervioso central y periférico, células pancreáticas, etc (ver Capítulos II y XII).
capitulo XIII Reprogramación de células diferenciadas al estado pluripotencial

Por este potencial de generar células diferenciadas in vitro, las ESC humanas
podrían ser la mejor fuente de células para la Medicina Regenerativa, de no ser
por la fuerte controversia bioética, debida a que su aislamiento requiere la des-
trucción de embriones humanos. Por esta razón el interés en desarrollar, estudiar y
entender las fuentes de células pluripotenciales de origen no embrionario repre-
senta una tarea determinante en el progreso del la Medicina Regenerativa (5,6).

Desarrollo de la metodología para la reprogramación de células dife-

renciadas y la obtención de células troncales pluripotenciales induci-
das: reprogramación por transferencia nuclear

En 1952 Briggs y King demostraron que el núcleo de la blástula de Rana pipiens

transferido a un cigoto enucleado adquiere el potencial de realizar el desarrollo
del embrión (7,8). Estos trabajos extendidos por Gurdon y colaboradores en In-
glaterra (9,10) en otra especie anfibia, Xenopus laevis, presentaron las primeras
pruebas de la capacidad del núcleo de un animal de ser reprogramado hasta
el estado totipotencial, al dar origen a un individuo adulto (en este caso ranas
adultas) a partir de la transferencia de núcleos de células intestinales a ovocitos.
Posteriormente, en 1978 el autor de este capítulo y sus colaboradores (11) repor-
taron sobre la reprogramación del núcleo de la blástula y gástrula de un pez.
301
Ian Wilmut y Keith Campbell del Instituto Roslin (Edimburgo, Escocia), mediante
transferencia nuclear de una célula de mamífero completamente diferenciada
(en este caso de la glándula mamaria), obtuvieron la oveja “Dolly”, la primera
clonación de un mamífero adulto (12,13). Este resultado demostró que en mamí-
feros como en anfibios el núcleo de célula diferenciada, transferido al citoplas-
ma de un cigoto al que se le retira el núcleo mediante microcirugía, es capaz
de ser reprogramado hacia un estado totipotencial por factores de citoplasma
desconocidos hasta ese tiempo. Igual que en caso de las ESC, la importancia
de la clonación es exclusivamente científica y un embrión humano clonado no
puede ser fuente células para la Medicina Regenerativa, debido a cuestiones
éticas y morales acerca del uso de un óvulo humano para este fin (14). Además,
animales nacidos con esta técnica pueden sufrir de patologías debido a daños
en las estructuras de genes (en el caso particular de Dolly tenía artritis y cáncer
pulmonar). El salto trascendental que se consiguió con la clonación fue el motor
para la búsqueda de los factores que participan en la reprogramación al estado
embrionario, que después de 10 años diera como resultado el desarrollo de una
metodología para la reprogramación del núcleo de una célula diferenciada sin
la necesidad de involucrar al óvulo ni la formación de un embrión humano.
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

Identificación de los genes que determinan dos propiedades de las células tron-
cales embrionarias: autorrenovación y pluripotencialidad.

La autorrenovación de las ESC se basa en la división celular simétrica e ilimita-

da, que permite mantener el estado pluripotencial sin diferenciación (15). Hasta
hoy no se sabe por qué las células embrionarias son “inmortales” in vitro mientras
que in vivo su crecimiento y diferenciación es controlado. Este potencial que no
se usa en el desarrollo natural se evidencia no solo en cultivo, sino también en la
formación de teratomas cuando la célula se desarrolla en algún sitio ectópico (es
decir, en un sitio distinto al determinado naturalmente), especialmente cuando
se implantan en ratones deficientes en su sistema inmunológico (ver Capítulo II).

Los genes de pluripotencialidad fueron descubiertos, clonados y caracterizados

en el periodo entre 1990 y 2003. En total fueron identificados más de 100 genes invo-
lucrados en estos procesos (ver en la Figura 2, en donde se listan los representantes
más conocidos). Dos hallazgos notables de estos estudios fueron que (i) un grupo
de solo tres genes (Oct4, Nanog, Sox2) controlan el circuito total de los genes de
pluripotencialidad en ESC y que (ii) en este circuito transcripcional también juegan
un papel importante los genes conocidos por su contribución a la cancerogénesis,
tales como c-Myc y Klf4. A continuación se da una breve descripción del grupo de
genes de mayor relevancia en la autorrenovación y en la pluripotencialidad.
302
Oct4 (POU5F1). Pertenece a la familia POU de factores de transcripción es-
pecíficamente expresados en ESC, en el embrión temprano y en células germi-
nales. Fue originalmente designado como Oct3 (16) o como Oct4 (17). Su au-
sencia en embriones causa la muerte en útero en estadios de preimplantación.
Para simplificar la nomenclatura, de aquí en adelante se le denominará Oct4.
La función de Oct4 es importante para los primeros eventos de diferenciación
del embrión en estadios entre mórula y blastocisto. Los niveles de expresión de
Oct4 en el embrión temprano dictan si las células pertenecen a la ICM (nivel
alto) o al trofoectodermo (nivel bajo) (Figura 1). El papel de Oct4 (junto con
Sox2 y Nanog) en las células de la masa interna y de las células del epiblasto
(también denominado ectodermo primitivo) es preservar la pluripotencialidad.

Sox2. Es miembro de la familia Sox (SRY-related HMG-box), parte de una familia

de factores de trascripción expresados en ESC, en células germinales y algunas SC
adultas, específicamente del sistema nervioso (18). La ausencia de Sox2 en embrio-
nes causa la muerte debido al desarrollo fallido del epiblasto (19). Tal como Oct4,
Sox2 es indispensable para mantener la pluripotencialidad de ESC, pero con la dis-
tinción de Sox2 además tiene funciones en células que no son pluripotenciales.

Nanog. Se expresa específicamente en ESC manteniendo su autorrenova-

ción y pluripotencialidad (20, 21) La inhibición de la expresión de Nanog en
cultivos de ESC resulta inmediatamente en su diferenciación. Los blastocistos
deficientes en Nanog muestran morfología normal, pero la ICM solo produce
células parecidas al endodermo parietal.
capitulo XIII Reprogramación de células diferenciadas al estado pluripotencial

Lin-28. Fue descrito como un factor que controla el calendario del desarrollo en
el nematodo C. elegans, debido a que mutaciones en este gen llevan al desarrollo
precoz, aunque el mecanismo molecular de este fenómeno no ha sido bien enten-
dido. Se ha sugerido que puede estar actuando como un factor postranscripcional
debido a sus dominios de unión a RNA (CSD, Cold shock domain). Se ha observado
que Lin-28 puede ser prescindible para la reprogramación celular pero es de consi-
derable importancia para la autorenovación y para evitar la diferenciación (22, 23).

c-Myc. Es un conocido oncogén y un regulador de ciclo celular en varios

tipos de células tanto normales como tumorales. Actúa en la inhibición de la
expresión de genes supresores de tumores que controlan el paso de la fase G1
a la fase S en el ciclo celular.

Klf4. También conocido como gut-enriched Krüppel-like factor, pertenece a

una familia conservada de factores de transcripción con dedos de zinc, impor-
tante en la regulación de múltiples procesos biológicos tales como la diferencia-
ción, la proliferación y la apoptosis (24).

Los factores Oct4, Sox2 y Nanog regulan grupos de genes por medio de la
unión con los reguladores (promotores y enhancers de dichos genes). En el tra-
bajo de Boyer y cols. publicado en 2005 (25) fue propuesto el esquema de re-
gulación en forma de cascada (Figura 2). Junto a cada uno de los genes se ob- 303
serva el número de genes que tienen sitios de unión en promotores y enhancers
para el factor en cuestión. Toda esta información fue obtenida mediante aná-
lisis molecular de las regiones reguladoras y por su expresión en ESC. En células
diferenciadas, los genes de pluripotencialidad no se expresan, porque son silen-
ciados por factores de regulación epigenética que median la compactación
de la cromatina por la modificación de histonas y la metilación de secuencias
denominadas CpG presentes en sitios de regulación.

Figura 2. Número de genes regulados positiva y negativamente por Oct4, Sox2 y Nanog. Estos tres
factores son parte esencial del circuito de pluripotencialidad bajo el control de los factores. El
conjunto de genes de la parte superior derecha son activados y los de la parte inferior son repri-
midos por Oct4, Sox2 y Nanog. Es importante hacer notar que dentro de los genes activados se
encuentran los mismos tres factores de pluripotencialidad (ver explicación en el texto).
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

Shinya Yamanaka y su colaborador Takahashi de la Universidad de Kioto (Ja-

pón) fueron los primeros en lograr reactivar la expresión de los genes de pluripo-
tencialidad y autorrenovación en células diferenciadas. Para este experimento
utilizaron fibroblastos de ratón extraídos de fetos y de la cola (26).

La estrategia experimental utilizada en la primera reprogramación

El objetivo del experimento de Takahashi y Yamanaka fue inducir la expresión si-

multánea de un grupo de genes asociados con la pluripotencialidad en fibro-
blastos y observar la aparición de marcadores característicos de las ESC. Para
introducir estos genes los autores utilizaron un vector construido con elementos del
retrovirus Moloney Murine Leukemia Virus, que permite una infección múltiple de
casi cualquier tipo de célula diferenciada en replicación. El vector viral transfiere
el gen al núcleo de la célula, donde su RNA se copia por la enzima transcriptasa
reversa, formando DNA complementario (cDNA) y luego DNA de doble cadena,
el cual se integra en el genoma. El gen se expresa por acción de las RNA poli-
merasas de la célula hospedera, pero de manera transitoria, por procesos epi-
genéticos de silenciamiento aleatorio. Únicamente los vectores retrovirales (que
incluyen vectores lentivirales construidos a partir del virus de la inmunodeficiencia
304 humana) permiten la integración y expresión forzada de un gran número de ge-
nes en la misma célula con una elevada eficiencia, por lo tanto, esta herramienta
resultó ser clave en el éxito de la primera reprogramación.

Los autores iniciaron con 24 genes catalogados como los más importantes en la
pluripotencialidad y autorrenovación (Figura 2). Dentro de estos genes se encuentran:
(i) factores funcionalmente caracterizados como importantes para el mantenimiento
de ESC (Oct4, Sox2, Nanog, UTF1, Sall4, Sox15, Rex1); (ii) factores que promueven el
ciclo celular (con propiedades oncogénicas) importantes para la proliferación de las
ESC (c-Myc, Stat3, β-catenin, Grb2, KLF4, TCL1 y Eras); y (iii) factores que se expresan
exclusivamente en ESC, aunque funcionalmente no muy bien caracterizados (ECAT1,
ESG1, Fbx15, DNMT3L, ECAT8, GDF3, Dppa2, Dppa4, ECAT15-2, Fthl17, Stella).

Como reportero se generó un ratón transgénico que contenía una construc-

ción recombinante denominada β-geo, que contiene un gen de selección de
resistencia a neomicina (NEO, confiere resistencia al antibiótico G418), inserta-
do por recombinación homóloga en el locus del gen Fbx15. Dado que este gen
se activa exclusivamente en células pluripotenciales, todas las células del ratón
transgénico eran sensibles al antibiótico G418. La estrategia consistió en activar
la pluripotencialidad en células diferenciadas del ratón transgénico mediante la
expresión forzada de una combinación de los 24 genes seleccionados y de esta
manera activar el promotor Fbx15 esperando obtener células resistentes a G418.
En dicho caso, se esperaba la activación de los promotores de genes de pluripo-
tencialidad, que la célula mostrara cambios en su morfología y que se indujera la
expresión de marcadores de ESC.
capitulo XIII Reprogramación de células diferenciadas al estado pluripotencial

Una vez diseñada la estrategia, los autores utilizaron fibroblastos aislados de

embriones de ratones de 13.5 días de gestación, así como fibroblastos extraídos
de la cola. Infectaron estas células con 24 virus recombinantes, cada uno porta-
dor de uno de los genes seleccionados. A los tres días post-infección, cultivaron
las células infectadas en un medio que contenía el antibiótico G-418 para se-
leccionar células que expresen el gen NEO. Los investigadores encontraron unas
cuantas colonias resistentes al antibiótico con cambios de morfología. Posterior-
mente, verificaron el estado de otros genes de pluripotencialidad y encontraron
que se había inducido su expresión. Luego de este resultado, los investigadores
disminuyeron el número de genes transferidos por los vectores hasta alcanzar la
inducción de Fbx15 utilizando sólo cuatro de los 24 factores.

De esta manera los autores descubrieron que para la inducción de la pluripo-

tencialidad solo es necesaria la expresión forzada de los factores Oct4, Sox2, Klf4
y c-Myc. Para tener más evidencias de que las células tratadas se transformaron
realmente en células pluripotenciales, los autores propagaron estas células en las
condiciones requeridas para el mantenimiento de ESC e investigaron su poten-
cial de derivar las células diferenciadas bajo tres condiciones experimentales: (i)
formación in vitro de cuerpos embrioides; (ii) formación de teratomas in vivo en
ratones inmunodeficientes por trasplante subcutáneo de las células (ver Capítulo
II); (iii) por formación de quimeras después de ser inyectadas dentro del blasto- 305
cisto, al unirse estas células reprogramadas con la ICM y contribuir al desarrollo
de tejidos (ver Capítulo XIV). A las células pluripotenciales generadas con esta
metodología, los autores las nombraron induced pluripotent stem cells, iPSC. En
su primer reporte, publicado en el agosto de 2006, los autores fueron capaces
de demostrar la formación de cuerpos embrioides y la generación de teratomas,
sin embargo no fueron capaces de formar quimeras estables. Fue hasta julio del
siguiente año que el grupo de Yamanaka (27) y el de Jaenisch (28) aislaron líneas
de iPSC capaces de formar quimeras estables. Esto fue posible al reemplazar a
Fbx15 por Nanog como el sistema reportero para la selección de colonias efec-
tivamente reprogramadas. Antes de que terminara 2007 se reportó que las iPSC
pueden ser generadas de fibroblastos humanos (tanto embrionarios como adul-
tos) (29) y que una nueva combinación de genes (Oct4, Sox2, Nanog, Lin-28) era
capaz de lograr la reprogramación (30). De manera interesante, este grupo inclu-
ye a Nanog como un factor indispensable y excluye a c-Myc, un fuerte oncogén
que aumenta el potencial cancerígeno de las iPSC. A partir de este momento
varios laboratorios utilizaron o el complemento de Yamanaka (Oct4, Sox2, Klf4, c-
Myc) o el de Thomson (Oct4, Sox2, Nanog, Lin28).

Etapas de la reprogramación

En la Figura 3 se esquematizan las distintas etapas de reprogramación. En la pri-

mera fase, la expresión de los genes de reprogramación exógenos (provenientes
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

de vectores virales), resulta en la síntesis de sus proteínas respectivas a un alto nivel

(gracias a que su expresión está dirigida por promotores “fuertes”), y a su vez di-
chas proteínas activan los mismos genes dentro de la célula (genes endógenos).
Para una reprogramación exitosa la célula necesita un periodo determinado de
expresión de los genes exógenos mientras éstos inducen la expresión de los ge-
nes endógenos. Este periodo tiene una duración entre 10-12 días (Figura 3, parte
izquierda). Entonces el papel de los genes introducidos es arrancar la cadena
de eventos dentro la célula y luego deben apagarse. Los retrovirus tienen esta
propiedad de ser silenciado por mecanismos epigenéticos y por ello son vectores
de alta eficiencia muy adecuados para la reprogramación. Las proteínas produ-
cidas por ellos y por los genes endógenos se unen a los promotores de la batería
de genes involucrados en la pluripotencialidad, que incluye algunos oncogenes
ya que ambos mecanismos, pluripotencialidad y cancerogénesis, necesitan de la
proliferación y autorrenovación.

Oct4 interactúa con los promotores de 623 genes blanco, incluyendo Oct4,
Sox2, Nanog, LEFTY2/EBAF, CDX2, HAND1, DPPA4, GJA1/CONNEXIN43, FOXO1A,
CRIPTO/TDGF1, ZIC3, Ibx-15. Sox2 se une a promotores de 1271 genes; por su parte
Nanog se une a promotores de 1687 genes. Es notable que los tres factores coin-
ciden en la ocupación de 353 promotores (Figura 2). De estos genes blanco en
306 células pluripotenciales, aproximadamente el 50% sirven para autorrenovación
y pluripotencialidad, mientras que el otro 50% son genes específicos de linaje (la
mayoría son genes de homeodominio) que codifican factores de diferenciación
para las tres capas embrionarias y también para células extraembrionarias (Figu-
ra 2 y ref. 25). Esto quiere decir que Oct4, Sox2 y Nanog activan a los promotores
de genes que mantienen la pluripotencialidad y reprimen a los promotores de
genes específicos de diferenciación. Por lo tanto, el mismo grupo de reguladores
transcripcionales presenta una acción dual de activador/represor, activando el
circuito de pluripotencialidad y reprimendo el circuito de diferenciación.

La reprogramación de células inducida por la expresión de Oct4, Sox2 y Nanog

con la participación no indispensable de c-Myc, Lin-28 o Klf4 pasa por dos etapas:
la primera es reversible, es decir, la célula puede iniciar un cambio a nivel morfoló-
gico y adquirir algunas propiedades típicas de célula pluripotencial, tal como una
actividad elevada de la fosfatasa alcalina tejido inespecífica (TNAP) y la forma-
ción de colonias por el aumento en la proliferación celular, pero no es capaz de
pasar a un completo estado de reprogramación. La etapa reversible significa que
la expresión de Oct4 y Sox2 exógenos inició la activación de ciertos genes de la
batería de genes de autorrenovación. Para que este proceso continúe es necesa-
rio que inicien algunos eventos todavía no bien definidos, pero donde se sabe que
un factor clave para la irreversibilidad de la reprogramación es la expresión de
Nanog endógeno, además de la inducción de la expresión endógena de Oct4.

Reversibilidad durante la etapa I. Después de la activación del circuito de ge-

nes de autorrenovación, algunas células forman colonias de células parecidas a
capitulo XIII Reprogramación de células diferenciadas al estado pluripotencial

ESC y empiecen mostrar marcadores superficiales de la pluripotencialidad como:

SSEA-1 (típico de ESC de ratón), SSEA-4 (en ESC humanas), TRA1-60 y TRA1-81. Para
poder avanzar, las células ya requieren factores de crecimiento específicos para
ESC, tales como Factor inhibitorio de la leucemia (Leukemia Inhibitory Factor, LIF)
en células de origen murino y Factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF)
en células de origen humano. En esta etapa las colonias pueden regresar a un
estado diferenciado o continuar y expandirse. Menos del 0.1% de colonias pasan
a una etapa irreversible de la reprogramación y forman iPSC verdaderas.

Etapa II, comienzo del cambio irreversible. Una vez que genes introducidos
activan sus contrapartes en el genoma celular y, si la expresión de estos últi-
mos alcanza los niveles necesarios, la célula pasa a la etapa irreversible de la
reprogramación. Solo una parte de colonias formadas en la etapa anterior son
capaces de continuar su reprogramación, la mayoría o “regresa” a su estado
diferenciado o se elimina por apoptosis. Si la expresión de Nanog no alcanza el
umbral requerido, ya no habrá etapa irreversible. En este segundo periodo las
células tienen que (a) fortalecer la expresión de todos los miembros del circuito
pluripotencial, (b) alcanzar el ciclo celular embrionario, típico de las ESC y (c)
perder marcadores de diferenciación. Estos cambios ocurren en forma distinta
en las diferentes colonias y resultan en un espectro de diferentes líneas de célu-
las que alcanzan la etapa 3 del establecimiento de líneas de iPSC. 307
Etapa III. iPSC inmaduras. En los trabajos de reprogramación de los primeros
3 años los autores consideraban que la etapa 3 (para fibroblastos embrionarios
de ratón tres semanas después de inicio) ya termina el proceso de reprograma-
ción del genoma. Esta conclusión estuvo basada en la similitud de las siguientes
características entre las iPSC y las ESC:

1. Morfología tridimensional de colonias con bordes regulares.

2. Expresión de todo el conjunto de genes de pluripotencialidad.
3. Actividad elevada de TNAP.
4. Expresión de marcadores superficiales como SSEA-1 en células de ratón
y de SSEA-4, TRA1-60, TRA2-49, TRA1-81 en células humanas.
5. Elevada actividad de la telomerasa.
6. Ciclo celular corto (10-12 horas).
7. No producir proteínas de linaje específico.
8. Promotores de genes de pluripotencialidad libres de metilaciones.
9. Histonas con metilación preferencialmente de lisina 4 y/o 9.
10. Formar cuerpos embrioides con potencialidad para la generación de
las tres capas embrionarias.
Las iPSC de la etapa 3 usualmente manifiestan todos estas propiedades con
la diferencia que para alcanzar esta etapa diferentes tipos de células se repro-
graman con diferente eficiencia.
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

La eficiencia diferencial de reprogramación de células en las etapas I a III.

El porcentaje de células que se reprograman y alcanzan el estado de iPSC es
muy bajo. En los primeros experimentos de reprogramación de Takahashi y Ya-
manaka fue notable que los fibroblastos embrionarios de ratón se reprograman
con más facilidad que los fibroblastos de la cola de ratón adulto. Posteriormente
se aclaró que con el desarrollo del individuo la eficiencia del método de repro-
gramación baja y además, que las células funcionalmente maduras están me-
nos “dispuestas” a ser reprogramadas que las células progenitoras. Una de las
razones para esta diferencia en la eficiencia de reprogramación es que algunas
células progenitoras ya expresan Sox2, Klf4 o expresan altos niveles de c-Myc.

En estos casos las células no solo muestran una eficiencia elevada sino que pue-
den ser reprogramadas sin el uso de los factores que ya expresan. Un ejemplo de
esto son las SC neurales, las cuales pueden ser reprogramadas usando solo dos
factores, Oct4 y Nanog, debido al nivel elevado de expresión endógena de Sox2
y c-Myc. De los factores utilizados para reprogramación por la combinación de
Yamanaka y por la combinación de Thomson solo un factor, Oct4, es indispensable
para la reprogramación. Esto significa que para cada una de las células se pue-
de utilizar una combinación más eficaz, y refleja la heterogeneidad de las células
del organismo en relación a su capacidad de ser reprogramadas, lo cual implica
una variabilidad en su plasticidad. Una de las contribuciones más importantes de la
308
metodología de reprogramación a la ciencia básica fue la de permitir revelar e in-
vestigar la plasticidad de las células y clasificarlas mejor con base a esta propiedad
según su estado de diferenciación y su capacidad para desdiferenciarse.

Etapa IV. Consolidación de la reprogramación. Las iPSC de etapa 3, a pesar de

mostrar todos los marcadores de pluripotencialidad, pueden presentar reprogra-
mación incompleta. Las iPSC obtenidas a partir de células diferenciadas se ase-
mejan a las ESC en su perfil de expresión de marcadores y en su capacidad para
generar nuevas células diferenciadas. Sin embargo, ciertos aspectos de su natura-
leza deben ser estudiados con mayor profundidad con el fin de saber si realmente
las células derivadas de las iPSC son completamente normales y funcionales (es
decir, que sean capaces de integrarse con las células de un organismo). En los
años 2010 y 2011 fueron publicados los resultados de estudios comparativos del
estado global epigenético y de expresión del genoma de iPSC y ESC, con el uso
de microarreglos de DNA (31, 32), Con este análisis se pudo determinar que las iPSC
son más similares entre sí que con las ESC, y que las iPSC que han sufrido un mayor
número de pases en cultivo tienen un perfil más cercano a las ESC que las de pases
tempranos. Se encontró por ejemplo que 3920 genes se expresaban de manera
diferente entre iPSC y ESC, y que particularmente genes con un rol celular básico
como metabolismo, procesamiento de RNA, mitosis, etc., se expresan a un nivel
menor en las iPSC que en ESC. Además, algunos genes relacionados con la dife-
renciación son expresados en iPSC y no en ESC. Los datos sugieren que en las iPSC
tempranas no han silenciado de manera eficiente los genes específicos del linaje
del cual se originaron, y fallan en inducir a los genes importantes para producir un
capitulo XIII Reprogramación de células diferenciadas al estado pluripotencial

estado completamente indiferenciado. Sin embargo, cuando se comparan ESC

con iPSC de pases tempranos y de pases avanzados, se observa que en las últimas,
dichas diferencias comienzan a disminuir. Con todos estos datos se sugiere que las
líneas iPSC recién generadas deben seguir reprogramándose y reestructurándose
epigenéticamente en un periodo adicional, distinto para cada célula originaria. Es
decir que este proceso de “perfeccionamiento” de la reprogramación es distinto
para diferentes tipos de células somáticas: por ejemplo, las líneas iPSC derivadas de
fibroblastos de prepucio humano tienen un perfil más cercano a las ESC, seguidas
por las iPSC derivadas de SC adiposas, fibroblastos neonatales y las iPSC derivadas
de queratinocitos. Comparando líneas de iPSC de estas fuentes celulares, se en-
contró que 505, 2571, 5555, y 13670 genes respectivamente (de un total de 28322
genes humanos) fueron significativamente diferentes respecto a ESC. Este hallazgo
se relaciona directamente con el fenómeno de memoria epigenética del tejido de
origen, en el cual algunos marcadores de linaje se mantienen expresados luego de
la reprogramación. Esta memoria epigenética (33) es retenida en cierta medida
en las líneas de iPSC generadas a partir de diferentes tipos celulares; sin embargo,
es notable que tal memoria no aparece cuando las células somáticas adultas son
reprogramadas a células pluripotenciales por transferencia nuclear.

309

Figura 3. Etapas de reprogramación celular. Etapa I: en el día 0 se introduce el conjunto de genes

de reprogramación y en los días subsiguientes se verifica la expresión de los transgenes por RT-PCR
(a), se observa la formación de colonias bidimensionales (b) con actividad de fosfatasa alcalina
tejido inespecífica (TNAP, c), y la expresión del marcador SSEA-1 (d) al inicio de la reprogramación.
Etapa II: se observa la expresión de todos los marcadores de pluripotencialidad mediante ensayos
de inmunofluorescencia (e). En este ejemplo se muestran experimentos de reprogramación de
células endoteliales de la vena del cordón umbilical humano, que empiezan a expresar marcado-
res de pluripotencialidad. Los datos presentados en b, c y d forman parte del trabajo de tesis de
Maestría de Ricardo Cevallos; los datos en e fueron tomados de la tesis de Vladimir Juárez, ambos
del laboratorio del autor. Etapa III: las iPSC obtenidas en esta etapa son inmaduras y presentan
diferencias entre ellas y las ESC (f); estas distinciones se eliminan en pases posteriores de los cultivo,
en la Etapa IV. (g) las iPSC de la Etapa III y Etapa IV son capaces de formar cuerpos embrioides
con derivados de las tres capas embrionarias (ectodermo, mesodermo y endodermo).
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

Mecanismos epigenéticos

Una vez que las ESC pasan al estadio de epiblasto los genes de pluripotencialidad
se apagan y los genes necesarios para la formación de las tres capas embriona-
rias que definen los linajes celulares específicos —endodermo, ectodermo y mes-
odermo— (Figura 2) se activan uno tras otro, determinando los marcadores de
diferenciación. Aunque el mecanismo que induce esta transición todavía no está
claro, se sabe que eso ocurre como consecuencia de cambios a nivel epigené-
tico (modificaciones en los sitios de regulación y en la estructura de la cromatina:
metilación, acetilación y fosforilación de histonas permitiendo que los genes se
transcriban o no). La reprogramación debe finalizar con un estado epigenético
similar al de las ESC. Desde luego, para obtener evidencias de pluripotencialidad
en las células reprogramadas es necesario evaluar también el estado de estas
modificaciones en las histonas y en los promotores. El indicador más comúnmente
utilizado es la metilación de islas CpG de promotores de los genes de pluripoten-
cialidad, sobre todo de los genes Oct4, Sox2 y Nanog. Los promotores de estos
genes, normalmente metilados en células diferenciadas, aparecen libres de me-
tilación en las iPSC. En algunos casos los promotores pueden estar parcialmente
metilados, señalando que la reprogramación aún no se ha completado.

310
Potenciación de la reprogramación con moléculas orgánicas

En el 2008, Huangfu y colaboradores (34) reportaron por primera vez que la efi-
ciencia de reprogramación puede ser aumentada por medio de la adición de
ácido valproico, un conocido inhibidor de las deacetilasas de histonas (HDAC),
las cuales presentan una acción represora de la transcripción. No se sabe con
detalle cuáles son todos los blancos sobre los que actúa el ácido valproico, pero
se conoce que es capaz de inducir de forma indirecta la expresión de c-Myc al
permitir la transcripción de uno de sus reguladores positivos más importantes, el
factor β-catenina. Actualmente se conoce una notable cantidad de sustancias
que inhiben la actividad de HDAC. Algunas de ellas, como el butirato, muestran
una mejor capacidad potenciadora de la reprogramación respecto al valproa-
to mientras que otros, como la Tricostatina, tienen un efecto menor. Dentro de
las sustancias que influyen a nivel epigenético también se encuentra la molécu-
la Bix-01294, la cual inhibe a la histona metil transferasa G9a, y permite la repro-
gramación de progenitores neurales en ausencia de c-Myc y Sox2.

También se han encontrado moléculas potenciadoras de la reprogramación

que actúan inhibiendo o promoviendo rutas transduccionales y gracias a ellas
se han descubierto algunos mecanismos celulares importantes que están involu-
crados con la autorrenovación y pluripotencialidad. Moléculas como los inhibi-
dores del receptor de TGF-β ALK5, inhibidores de las ruta MEK1/ERK y ROCK/Rho,
inhibidores de GSK3β, entre otros, han sido utilizados como potenciadores de la
reprogramación.
capitulo XIII Reprogramación de células diferenciadas al estado pluripotencial

La importancia de estos hallazgos radica en la posibilidad de utilizar un menor

número de transgenes (sobre todo para eliminar la necesidad de incluir al onco-
gén c-Myc) o de aumentar la eficiencia de reprogramación al utilizar vectores
menos eficientes que los retrovirales.

Deficiencias de la metodología para la reprogramación

Las iPSC resuelvan dos problemas importantes para el desarrollo de la Medicina

Regenerativa: el problema de la bioética y el problema de disponibilidad ilimi-
tada de células para terapia, pero existe un nuevo obstáculo. La desventaja del
método de obtención de iPSC bajo el método convencional es el uso de vecto-
res retrovirales potencialmente mutagénicos. En particular, la inserción de genes
a través de retrovirus (35) puede resultar en tumorigénesis por inactivación de
genes supresores de tumores. Además, la integración de varias copias de los
genes de reprogramación reduce la probabilidad de silenciamiento aleatorio y
aumentan el riesgo de mantener una expresión estable de dichos transgenes, lo
cual es totalmente indeseable sobre todo para transgenes oncogénicos como
c-Myc. Por lo tanto se requiere de la aplicación de nuevas tecnologías para la
generación de iPSC con métodos sin alteraciones en el genoma.
311

Reprogramación sin el uso de vectores retrovirales

Adenovirus. Se han desarrollado varios métodos que evitan el uso de retrovirus,

sin embargo ninguna otra herramienta empleada hasta el momento ha sido
capaz de igualar la eficiencia obtenida con vectores retrovirales. El uso de ade-
novirus (36) como vector funcionó únicamente en combinación con vectores
retrovirales debido a que los adenovirus portadores de genes de reprograma-
ción individuales no son capaces de introducir eficientemente todos los factores
en la misma célula. Para solventar este problema, se utilizaron construcciones
policistrónicas con 2 o mas genes bajo de un mismo promotor. En un estudio pre-
pararon dos construcciones: la primera portadora de los genes Oct4, Sox2 y Klf4
arreglados de forma policistrónica (es decir, que contiene los RNA mensajeros
de las tres proteínas en una sola molécula que traduce a cada una por separa-
do), expresados bajo el promotor constitutivo de citomegalovirus, y la segunda
portadora sólo del gen c-Myc. Bajo esta combinación, la reprogramación solo
fue posible por medio de infecciones repetidas durante 4 o 5 días.

Transpason PiggyBac. Los transposones son fragmentos del genoma que mi-
gran de un sitio a otro y pueden llevar genes cercanos a su inserción a otro parte
del genoma y cambiar el mapa genético de la célula (37). En sus partes termi-
nales contienen secuencias especiales (secuencias repetitivas terminales) que
permiten salir y reintegrarse sin dejar alteraciones en los sitios de inserción. Esta
movilidad permite usar transposones como portadores de genes. El grupo de
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

Andras Nagy (38) utilizó una construcción con base en el transposon PiggyBac
que consistió de partes terminales del transposon, cuatro genes de ratón (c-Myc,
Klf4, Oct4 and Sox2) bajo el control transcripcional inducible TetOn (sistema de
inducción por adición de los antibióticos tetraciclina o doxiciclina) y el gen neo
que confiere resistencia al antibiótico G418. Su uso permite mejorar la eficiencia
en la generación de iPSC, comparado con otros vectores no integrables (39).

Proteínas recombinantes. El uso de factores de reprogramación en forma de pro-

teínas (40) permite evitar el uso de cualquier vector. Para hacer posible la transduc-
ción de proteínas recombinantes y lograr una reprogramación efectiva, es necesa-
rio expresar las proteínas adicionándoles un péptido con poli-arginina (este péptido
le confiere a la proteína una fuerte carga positiva que promueve la interacción
electroestática con los fosfolípidos de membrana que poseen carga negativa). Fi-
broblastos embrionarios de ratón fueron tratados durante 6 a 72 horas con varias
concentraciones [0.5-8 μg/ml] de los factores Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc (40). A partir
de las 6 hrs, las proteínas penetran en el núcleo y se mantienen estables dentro de la
célula por 48 horas. Se sabe que el proceso de reprogramación hacia iPSC requie-
re de la actividad proteica de 7-10 días, por lo que según el protocolo las células
deben ser tratadas varias veces con la mezcla de las proteínas (8 μg de cada una)
para mantener la concentración requerida en el núcleo y complementar con 1 mM
312 de ácido valproico. Posteriormente se retira el medio con las proteínas y se incuba
por 36 horas adicionales sólo con valproato. Se realizan 4 ciclos de inducción y las
células tratadas se transfieren a cajas con fibroblastos embrionarios de ratón irra-
diados o tratados con mitomicina para inhibir su división, que sirven como “células
alimentadoras” o feeders. Después de 30-35 días se empiezan a formar colonias con
morfología típica de ESC. Estas colonias presentan actividad de fosfatasa alcalina,
así como expresión de marcadores de pluripotencialidad. A diferencia del caso de
ratón, en donde se purificaron proteínas reprogramadoras generadas en bacterias
E. coli, para células humanas se crearon líneas celulares humanas (HEK293) que ex-
presaban de manera estable los factores de reprogramación con un dominio rico
en arginina. Esta técnica de reprogramación tiene algunas desventajas frente al
método de transducción retroviral, que incluyen la necesidad de grandes canti-
dades de material proteico, el tiempo prolongado que se requiere para completar
el proceso y la generación de impedimentos estéricos por parte del péptido de
poli-arginina al momento que los factores de reprogramación reconocen a sus se-
cuencias blanco en los promotores. Además, la generación de iPSC humanas por
proteínas recombinantes es menos eficiente y más lenta que en el ratón.

Potencial de las células troncales pluripotenciales inducidas de generar

células diferenciadas para estudios básicos y de Medicina Regenerativa

Durante la década anterior se pudieron establecer protocolos de diferencia-

ción de ESC. Estos métodos se aplican a iPSC para la derivación de células di-
capitulo XIII Reprogramación de células diferenciadas al estado pluripotencial

ferenciadas in vitro. Los resultados de estos experimentos fueron positivos y no

mostraron ninguna distinción entre los dos tipos de células pluripotenciales. Entre
las células de mayor interés para fines terapéuticos, obtenidas a partir de iPSC,
se incluyen neuronas, cardiomiocitos, células beta y mioblastos. A continuación
se describen algunos ejemplos de derivación celular a partir de iPSC:

Neuronas. Los experimentos de diferenciación bajo las condiciones especifi-

cadas para ESC muestran que las iPSC tienen la misma capacidad para derivar
células del sistema nervioso. Hargusa y colaboradores (41) generaron células
dopaminérgicas de ESC e iPSC humanas, y las trasplantaron en el núcleo estria-
do de ratas; 4 semanas después, las células trasplantadas se identificaron con
el marcaje de la molécula de adhesión neuronal NCAM humana. Se observó la
coexpresión de Tirosina hidroxilasa y el canal de potasio Girk2 que son marca-
dores propios de neuronas dopaminérgicas, específicamente afectadas en la
enfermedad neurodegenerativa de Parkinson. En todos los casos, independien-
temente de la línea celular, se encontraron trasplantes viables sin evidencia de
degeneración celular, ni formación de tumores.

Cardiomiocitos. Para la obtención de cardiomiocitos las iPSC y ESC fueron

propagadas en medios especiales para la preservación de la pluripotenciali-
dad con suero fetal bovino pero en soportes no adherentes, es decir, que permi-
ten el cultivo de células en suspensión. Las células formaron cuerpos embrioides 313
y después de unos 10 días se observaron contracciones en 5 a 10% de cuerpos
embrioides indicando la diferenciación a cardiomiocitos contráctiles. El análisis
con anticuerpos e inmunofluorescencia muestra que las células contráctiles di-
ferenciadas expresan marcadores específicos para células cardiacas (42).

De forma notable, el grupo de Yamanaka (43) generó cardiamiocitos sin la

generación previa de cuerpos embrioides, y en un periodo de tan solo 8 días.
Las iPSC y los controles de ESC fueron primero seleccionadas por la expresión
de Flk (receptor tipo 2 del factor de crecimiento vascular endotelial, VEGF); lue-
go de 3 días se formaron células endoteliales, las cuales fueron transferidas a
placas cubiertas con colágeno tipo IV. Luego de 6-8 días las células mostraron
características fenotípicas de cardiomiocitos.

Células dendríticas. Las células dendríticas son células especializadas en la

presentación de antígenos, utilizadas actualmente como portadores de vacu-
nas en inmunoterapias, especialmente en terapias anti-cancerosas. Sin embar-
go, su uso esta limitado por la baja disponibilidad de estas células y la baja
capacidad de producción de monocitos. Las iPSC son capaces de desarrollar
células dendríticas in vitro en cantidades necesarias para fines terapéuticos (44).

Fibroblastos. Hewitt y colaboradores (45) generaron fibroblastos a partir de

iPSC y no detectaron diferencias entre sus propiedades fenotípicas y patrones
de metilación de promotores génicos comparado con fibroblastos naturales.
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

Células hematopoyéticas. Carpenter y colaboradores (46) mostraron que las

iPSC son capaces de formar todos los elementos hematopoyéticos, incluyendo
a los linfocitos B.

Melanocitos. Los melanocitos epidermales juegan un papel importante en la

protección de la piel frente a los rayos UV. Ohta y colaboradores (47) generaron
líneas de iPSC a partir de fibroblastos dermales humanos, formaron cuerpos em-
brioides y los diferenciaron a melanocitos al cultivarlos en un medio suplementado
con Wnt3a, Stem Cell Factor y Endotelina-3. Siete semanas después formaron cé-
lulas que expresaban los marcadores de melanocitos MITF, tirosinasa, SILV y TYRP1.

Conclusiones

Los primeros aislamientos de células troncales pluripotenciales provenientes de

embriones se realizaron en 1981 (ratón), y en 1998 (humano), y su investigación
permitió descubrir que estas células preservan el potencial de derivar células di-
ferenciadas en condiciones de cultivo y pueden ser fuente de células para te-
rapia. Eso abrió un campo de gran importancia de estudios de mecanismos de
diferenciación en nivel molecular, genético, epigenético y celular. Estos avances
no pueden ser aprovechados en la Medicina Regenerativa por razones éticas, ya
314 que el aislamiento de células troncales implica la destrucción del embrión huma-
no, el cual guarda la potencialidad para desarrollarse en un individuo completo.

En 2006 empezó una nueva etapa que extiende y profundiza el conocimiento

sobre la pluripotencialidad inducida en células diferenciadas, debida a la expresión
de un grupo de genes reguladores de transcripción en el más alto nivel jerárquico y
que resulta en la generación de las iPSC. Estas células tienen el mismo potencial de
derivar a todos los tipos celulares del organismo, lo cual permitirá el advenimiento
de la Medicina Regenerativa personalizada, en la cual cada individuo es el posible
portador de una fuente de SC para aplicaciones terapéuticas. En este primer perio-
do, la metodología necesita perfeccionamiento para elevar su eficiencia y eliminar
a los vectores que introducen cambios genéticos. En este sentido, existen varias
alternativas en experimentación para resolver el problema de integración de ma-
terial genético. La metodología de reprogramación que opera con mecanismos
epigenéticos a nivel global es mucho más significativa que solo su aplicación ac-
tual para la obtención de iPSC, porque abre nuevas posibilidades de manejo con
factores y mecanismos de desdiferenciación, diferenciación y transdiferenciación.

Agradecimientos

Este trabajo ha sido financiado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología

(CB-2007 SEP-CONACYT, Proyecto 82794). Agradezco Ricardo Cevallos por su va-
liosa contribución en la discusión del problema y la preparación del manuscrito.
capitulo XIII Reprogramación de células diferenciadas al estado pluripotencial

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Capítulo XIV

Manipulación genética
para el estudio funcional de células troncales

Diana Escalante-Alcalde

RESUMEN

Este capítulo tiene como finalidad proporcionar un panorama histórico de como

se desarrollaron las técnicas más avanzadas de manipulación genética en los
mamíferos, describir como se realizan y proveer de algunos ejemplos en los que
esta metodología nos ha permitido entender la función de genes en la biología
de las células troncales.

INTRODUCCION

El ratón como modelo de estudio

El modelo animal por excelencia en estudios de Biología del desarrollo, de las

Células Troncales (SC, del inglés Stem Cells) y de enfermedades humanas es el
ratón. Esto se debe, a que presenta una gran similitud con el humano en cuanto
a su desarrollo embrionario y fisiología, además de su facilidad de manejo y ma-
nutención en comparación con otros modelos mamíferos. Su genoma es similar
en cuanto al número y organización de genes (1).

Los orígenes del ratón como modelo, datan del siglo 17 cuando reproductores
asiáticos (chinos y japoneses) desarrollaron una serie de líneas de roedores exó-
ticos basados en el color y textura de su pelaje y en rasgos conductuales entre
otros. En 1900 A. Lathrop fundó en EU el club de los “ratones de fantasía” al colec-
cionar y reproducir variedades de ratones con características extravagantes. Este
pasatiempo, lo convirtió en un negocio al vender o realizar cruzas de ratones con
esas características para algunos investigadores de la Universidad de Harvard (2).
Sin imaginarlo, contribuiría indirectamente a la fundación de uno de los centros
mas importantes en el estudio de la genética del ratón y el repositorio mas grande
de líneas de ratones en el mundo, los laboratorios Jackson ([Link]). Uno de
sus clientes fue precisamente W.E. Castle, quien adquirió ratones de su granja y
los usó en experimentos para probar las leyes de la herencia de Mendel. Castle,
fungiendo como director de la Institución Bussey, observó que la variación del
color del pelo es un rasgo heredable y realizó los primeros estudios que estable-
cieron las diferencias entre los diversos fondos genéticos en el ratón. Es por este
motivo, que a Castle se le considera el fundador de la genética de mamíferos (3).
Un discípulo de Castle, C.C. Little, fundador de los laboratorios Jackson, desarrolló
la primera cepa de cruza cerrada conocida como DBA, del inglés (Diluted Brown
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

non-Agouti) lo cual sentó las bases para el establecimiento del ratón de laborato-
rio moderno (4). También estableció la cepa de cruza cerrada C57BL a partir de
una hembra con número de identificación 57 de la granja de Abbie Lathrop (2).
Esta cepa es una de la mas empleadas por los genetistas y fue la primera cepa
en tener secuenciado su genoma (5).

Una cepa de cruza cerrada, se produce por la cruza entre hermanos por
al menos 20 generaciones consecutivas. Como resultado las cepas de cruza
cerrada son prácticamente homocigotas para todos sus alelos y su genotipo
es muy estable (6). Este sistema de cruza se ha empleado para originar la gran
variedad de cepas de cruza cerrada existentes en la actualidad. Cada cepa
tiene diferentes susceptibilidades para desarrollar cáncer, otras enfermedades
o poseer mutaciones específicas. Estas diferencias son genéticas y pueden ma-
pearse dentro del genoma por cruzas con otras cepas de cruza cerrada (ex-
perimentos de ligado genético). Por otro lado, las cepas de cruza abierta se
originan de esquemas de cruza azarosa por lo que en general son cepas con
alto vigor híbrido, es decir son mas longevas, mas resistentes a enfermedades,
tienen camadas mas grandes, poseen baja mortalidad neonatal, crecen mas
rápido y son de mayor talla. Dado que se originan de cruzas azarosas los ani-
males de cepas “abiertas” son genéticamente heterogéneos mientras que los
318 de cepas “cerradas” son genéticamente homogéneos. El fondo genético en el
que se investigue una mutación es fundamental. Muestra de esto, se describió
en un estudio en donde la desactivación dirigida del receptor del factor de cre-
cimiento epidérmico, presentó diferencias fenotípicas dependiendo del fondo
genético en donde se estudio la mutación. Mientras que en un fondo genético
la mutación causó letalidad embrionaria en la etapa de implantación en el
útero, en otro causó letalidad en etapas postnatales (7). Este estudio pone de
manifiesto la existencia de modificadores genéticas, es decir rasgos genéticos
que modifican la aparición de un fenotipo determinado.

Cultivo y manipulación de embriones

Otras metodologías que fueron fundamentales para el posterior desarrollo de

las técnicas de manipulación genética en ratones fueron: el establecimiento
de condiciones de cultivo que permitieran el desarrollo in vitro de embriones
en etapas de preimplantación (Figura 1) desde cigoto hasta blastocisto, la mi-
cromanipulación y microcirugía de embriones, y las técnicas para reintroducir
embriones en hembras subrogadas.
capitulo XIV Manipulación genética para el estudio funcional de células troncales

Figura 1. Representación gráfica del desarrollo pre-implantación en embriones de ratón. Las dos
estructura internas en el cigoto corresponden a los pronúcleos masculino y femenino. Los núcleos
de los blastómeros y células en etapas posteriores no se representan. E, estado de desarrollo indi-
cado en días de gestación después de la fertilización.

Hammond en 1948, fue el primero en lograr el cultivo y desarrollo de embrio-

nes de ratón de la etapa de 8 células hasta la de blastocisto en una mezcla
de clara de huevo y solución salina (8). No fue sino hasta 1968 que Whitten & 319
Biggers, establecieron un medio químicamente definido para el cultivo in vitro
de embriones desde la etapa de cigoto hasta su desarrollo en blastocistos, con
el piruvato de sodio como componente esencial (9). Esto permitió perfeccionar
las metodologías para transferir embriones al útero u oviducto de hembras su-
brogadas y lograr el desarrollo completo y viabilidad de organismos derivados
de embriones cultivados in vitro (10). Esto también catalizó, el desarrollo de téc-
nicas que permitieron manipular embriones. Inicialmente, A.K. Tarkowski estudió
el potencial de desarrollo de blastómeros individuales, al destruir uno de los blas-
tómeros de un embrión de ratón de 2 células, y observar el desarrollo del blastó-
mero restante (11). También logró hacer los primeros embriones quiméricos por
agregación de dos embriones “desnudos” de diferentes cepas, obtenidos de la
ruptura mecánica de la zona pelúcida empleando una micropipeta de vidrio
(12). Mas tarde Mintz y Nicholson lograron mejorar esta técnica por disolución de
la zona pelúcida, empleando pronasa o solución ácida de Tryrode y el contac-
to simple de dos embriones a temperatura fisiológica para su agregación (13).
También, en la década de 1960, se implementó la técnica de inyección de cé-
lulas embrionarias en blastocistos. Para realizar este procedimiento se requería
inicialmente de 5 microinstrumentos. En la actualidad se realiza con una micro-
pipeta de sostén y una de microinyección acopladas a micromanipuladores y
microinyectores controlados por inyección de aire o aceite (6).
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

TÉCNICAS DE MODIFICACIÓN GENÉTICA EN MAMÍFEROS

Ratones transgénicos

Estrictamente, los ratones transgénicos son individuos a los que se les introducen
secuencias exógenas de ADN, las cuales se integran en su genoma. Bajo esta
definición existirían dos tipos generales de organismos transgénicos, aquellos a
los que se les incorpora un transgen en un lugar no determinado del genoma y
a los que se les introduce el transgen de manera dirigida a un locus específico
por recombinación homóloga (ver siguiente sección). Por convención, solo a los
primeros se les denomina comúnmente ratones transgénicos y estos en general
son producidos por la introducción de material genético por microinyección a
uno de los dos pronúcleos del ovocito fecundado (Figura 2), aunque se pueden
derivar por otras metodologías (ver al final de esta sección).

320

Figura 2. Representación básica de la estructura de un transgen y microinyección de DNA en el pro-

núcleo masculino, este último es de mayor tamaño que el pronúcleo femenino, por lo que es mas
fácil realizar la microinyección. Is, secuencias intrónicas; la flecha indica el inicio de la transcripción.

Palmiter y Brinster a principios de los 80s describieron la generación de los prime-

ros ratones transgénicos por microinyección de DNA (14, 15). Estos investigadores
fusionaron los elementos que regulan la expresión (secuencia promotora o promo-
tor) del gen de la metalotioneína-1 (MT1, proteína que une una gran variedad de
metales) al gen que codifica para la hormona de crecimiento de rata o de huma-
no. Previamente, se había observado que la expresión de la MT1 era inducida por
cadmio o zinc, por lo que la región promotora de este gen debería responder al
tratamiento con dichos compuestos. Esta construcción fue microinyectada en ovo-
citos fertilizados de ratón y en algunos de los individuos que portaban el transgen, al
ser alimentados con zinc, se estimuló el crecimiento de los individuos produciendo
ratones gigantes. Estos trabajos demostraron la factibilidad de expresar secuencias
capitulo XIV Manipulación genética para el estudio funcional de células troncales

exógenas en organismos enteros y la conservación de la función de un gen en-

tre especies. Además abrió la posibilidad, entre otras, de corregir enfermedades
genéticas. Actualmente, esta estrategia es ampliamente usada en experimentos
para definir los efectos de la expresión incrementada o la expresión ectópica de un
producto génico empleando promotores generales (de expresión ubicua), tejido-
específicos (de expresión particular en un tipo celular o tejido) o inducibles (expre-
sados por la adición de un componente o compuesto específico).
La estructura básica de un transgen (Figura 2), está formada por la región
promotora fusionada al cDNA del gen de interés. Dicho gen puede codificar
para una proteína silvestre o contener mutaciones. La proteína a expresar pue-
de también funcionar como reportera, por ejemplo la expresión de una pro-
teína fluorescente. Para lograr una expresión eficiente del producto génico, a
las construcciones se les adiciona un tracto de adeninas en su extremo 3’ para
hacer estable el transcrito, y frecuentemente una región intrónica que provee
otros elementos regulatorios esenciales. El tipo de experimentos que se pueden
realizar empleando esta estrategia incluye: 1) La determinación de las secuen-
cias regulatorias que dirigen la expresión espacio-temporal de un gen, al fusio-
nar fragmentos del promotor con genes reporteros. 2) Los efectos de la sobre-
expresión de un producto génico. 3) El efecto de mutaciones que promuevan la
actividad constitutiva (dominante activa) o la pérdida de actividad (dominante
321
negativa) de la proteína. 4) Experimentos de rescate al reintroducir la función
de un producto génico que haya sido desactivado por algún tipo de mutación.
5) Ablación de células o estructuras por la expresión de productos tóxicos. 6)
Inactivar la función de un gen por la expresión de ARNs de interferencia. 7)
Producir e identificar nuevas mutaciones en genes. La manera en la que se pue-
den producir mutaciones en genes empleando esta última estrategia, se basa
en el hecho de que un transgen integrado de manera azarosa en el genoma,
ocasionalmente interrumpe la función de un gen. Al llevar a homocigosis dicha
mutación, por cruza entre dos portadores de la misma inserción, puede ser le-
tal u ocasionar anormalidades en estructuras del organismo, indicando que el
transgen interrumpió un gen fundamental para la viabilidad o para la correcta
formación de estructuras, respectivamente.
Sistemas más complejos de expresión se han creado en años recientes. Por
ejemplo los sistemas binarios de transgénicos, son sistemas en los que se crea
un animal transgénico que porta un transgen “activador” y otro que porta un
transgen “responsivo” a dicho activador (16). En estos casos la activación del
gen en el animal responsivo, depende de la cruza entre ambos animales trans-
génicos. Una variante de estos sistemas es la expresión condicionada del gen
responsivo por administración de algún fármaco al organismo. Por ejemplo, el
sistema basado en la expresión regulada por administración de tetraciclina o
antibióticos análogos (17). De estos sistemas existen dos versiones, una en la que
el antibiótico bloquea la transcripción de transgen responsivo y otra en la que el
antibiótico induce la transcripción del mismo (Figura 3).
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

Figura 3. Sistemas de expresión inducible por tetraciclina o antibióticos análogos. A) Sistema Te-
322 tOff. El transactivador transcripcional (TET-VP16) está formado por una fusión del represor de tetra-
ciclina con el dominio activador de la transcripción de la proteína VP16. Dicha proteína de fusión
reconoce y se une a 7 repetidos de secuencias del operador de tetraciclina (elementos respon-
sivos a tetraciclina, TetO7) localizados en el promotor de la construcción responsiva, induciendo
la transcripción del cDNA en ausencia del análogo Doxiciclina. La adición del antibiótico produ-
ce que el transactivador se separe del las secuencias del operador. B) Sistema TetOn. En éste el
dominio del represor se ha modificado (rTET-VP16) para que ocurra la unión a las secuencias del
operador en presencia del antibiótico induciendo la transcripción. TATA, promotor basal.

Existe otra forma en las que se pueden producir organismos transgénicos sin
la necesidad de microinyectar DNA al cigoto, la mediada por virus. Esta se basa
en la introducción e integración en el genoma del transgen con la ayuda de
virus como los lentivirus (18). Una solución de lentivirus, los cuales portan la cons-
trucción de interés, se introduce en el espacio perivitelino del cigoto. Dado que
los lentivirus se integran en el genoma, los organismos resultantes serán transgé-
nicos. Aunque el método parece muy promisorio y eficiente, la posibilidad laten-
te de que surjan nuevos virus con la capacidad de replicarse y ser infectivos es
una preocupación latente.

Modificación dirigida de un locus por recombinación homóloga en células tron-

cales embrionarias

Como se mencionó en el Capítulo II, las Células Troncales embrionarias (ESC, del
inglés Embryonic Stem Cells) fueron originalmente derivadas de las células de la
capitulo XIV Manipulación genética para el estudio funcional de células troncales

masa celular interna de blastocistos de ratón por Evans y Martin en 1981 de ma-
nera independiente (19, 20). La capacidad de contribuir a la generación de to-
dos los tipos celulares de un organismo adulto incluyendo sus células germinales,
es la característica fundamental que permitió que en años posteriores se pudie-
ran derivar ratones genéticamente modificados. Los primeros experimentos que
mostraron esta propiedad fueron publicados en 1984 por el grupo de Evans con
tres líneas diferentes de ESC (21). Estas células se microinyectaron en embriones
en la etapa de blastocisto, los cuales se dejaron desarrollar dentro de madres
subrogadas. Los ratones resultantes de este procedimiento fueron quiméricos,
es decir formados por células del blastocisto receptor y células derivadas de las
células introducidas. Además dichas células presentaron una elevada coloniza-
ción de la línea germinal de las quimeras, las cuales fueron capaces de transmi-
tir el genoma de las células introducidas.

En estudios llevados a cabo de forma independiente, los grupos de Smithies y

Capecchi demostraron que era posible la recombinación entre secuencias ho-
mólogas de ADN exógeno con las de células de mamífero en cultivo, abriendo
la posibilidad de modificar genes de manera dirigida (22-24). La combinación
de estas dos metodologías, refiriéndose a la modificación dirigida del genoma
por recombinación homóloga realizada en las ESC [25, 26], sentó las bases para
el establecimiento de líneas de ratones con mutaciones por diseño (ratones 323
“knockout”). Así pues, los primeros ratones con una modificación genética reali-
zada de manera dirigida, fueron publicados entre 1989 y 1990 por estos mismos
investigadores (27,28). Este desarrollo tecnológico, basado en investigación bá-
sica pura, representó un avance excepcional para la ciencia biomédica con-
temporánea, haciendo posible estudiar la función de casi cualquier gen en el
ratón. En la actualidad se han desactivado mas de 14 mil genes en el ratón,
lo cual han permitido elucidar como participan genes particulares en diversos
procesos del desarrollo, en la fisiología del organismo en general y en el estable-
cimiento de modelos animales de enfermedades humanas ([Link]
[Link]/mgihome/homepages/stats/all_stats.shtml#allstats_go). Las con-
tribuciones de Evans, Capecchi y Smithies los hizo, merecidamente, acreedores
del premio Nobel de Medicina y Fisiología en el 2007.

GENERACIÓN DE CÉLULAS TRONCALES EMBRIONARIAS Y ANIMALES CON MODIFI-

CACIONES GENÉTICAS DISEÑADAS

Recombinación homóloga en células troncales embrionarias de ratón

Uno de los requisitos fundamentales para modificar genéticamente ESC, con la

finalidad de generar animales, es que las células preserven su carácter de plu-
ripotencia. Esto se logra mediante el mantenimiento adecuado de las ESC, al
crecerlas sobre monocapas alimentadoras de fibroblastos embrionarios murinos
primarios, con medio de cultivo que contenga suero bovino fetal y el factor inhi-
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

bidor de leucemia (LIF) o con un medio mas definido conteniendo un inhibidor

de la cascada de señalización de las cinasas de proteínas activadas por mitó-
genos (MAPK) y un inhibidor de la cinasa de la sintasa de glucógeno-3 (GSK3)
(29, 30). Crecidas en algunas de estas condiciones las ESC deberían expresar en
su mayoría marcadores de pluripotencialidad como Oct-4 y Nanog.

Una construcción básica para realizar una modificación dirigida en el geno-

ma (Figura 4) consiste de dos brazos de homología (secuencias de DNA que
tienen gran similitud con las secuencias blanco) (31). Estas en general, son de
entre 5-10 kilobases de longitud y no deben ser menores a 1 kilobase. Un factor
fundamental es que el ADN fuente de la construcción deberá ser isogénico con
las ESC, es decir proveniente de la misma cepa. Por ejemplo si las ESC fueron
derivadas de blastocistos de la cepa 129Sv (una de las mas frecuentemente
empleadas para generar ESC), el ADN empleado para la construcción deberá
provenir de tejido de la misma cepa. Esto permitirá que la recombinación entre
las secuencias homólogas sea más eficiente. Las secuencias blanco deberán
flanquear a la región del gen que uno desea mutar (el gen completo, el extremo
5’ del gen o regiones esenciales para su función). Entre los brazos de homología
de la construcción se adiciona un marcador de selección positiva, es decir, un
producto génico que no se encuentra en las células blanco. Éste en general es
324 un producto génico dirigido por un promotor fuerte y eficiente en ESC, que le
confiere a las células blanco resistencia a un antibiótico. Dicha construcción se
introduce a una decena de millones de ESC, generalmente por el método de
electroporación. En este procedimiento, las células se someten en presencia del
la construcción, a una descarga eléctrica que facilita la incorporación del ADN.
El cultivo posterior en presencia del antibiótico, seleccionará a las células que in-
tegraron la construcción y formarán colonias clonales. Como el lector imagina-
rá, hay que identificar aquellas colonias en las que el evento de recombinación
homóloga entre la construcción y el locus blanco haya ocurrido. Esto se logra
por la detección de fragmentos de ADN de tamaños definidos que deben ser
diferentes de los obtenidos de un ADN no modificado. La construcción introdu-
ce sitios de restricción normalmente no existentes en el locus silvestre, por lo que
estos son empleados para distinguir entre los alelos modificados y sin modificar
(Figura 4). Para realizar una selección más eficiente de los eventos de recombi-
nación, se agrega a la construcción un casete de selección negativa (e.g. la
toxina de difteria o la cinasa de timidina en combinación con tratamiento con
ganciclovir) en el extremo de alguno de los brazos de homología. En el caso de
que la construcción completa se integre en algún sitio al azar dentro del geno-
ma la permanencia de este casete producirá que las células mueran.

Una vez corroborado el evento de recombinación deseado en algunas clo-

nas de ESC, las células pueden ser empleadas para generar ratones quiméricos,
previo al establecimiento de un cariotipo normal de las células.
capitulo XIV Manipulación genética para el estudio funcional de células troncales

Figura 4. Recombinación homóloga en células troncales embrionarias de ratón. A) Estrategia para

modificar de manera dirigida un locus. La construcción contiene dos casetes, uno de selección 325
positiva (+) y otro de negativa (–). También incluye sitios de restricción (marcas verticales) que
pueden ser empleados para identificar el evento de recombinación, para esto se utilizan sondas
de ADN (rectángulos rojos) que se encuentren fuera de los brazos de homología. Aunque las re-
giones de homogía (RH1 y RH2) se representan con cajas, en realidad las regiones de homología
completas solo excluyen a los casetes de selección (líneas punteadas). B) Representación gráfica
de un cultivo de ESC electroporadas con una construción y sometidas a una doble selección. Al
final de la selección cada colonia se expande en cultivo y a una porción de cada clona se le
extrae ADN, se digiere con la enzima de restricción apropiada, y se analiza por Southern blot en
cuales ocurrió la recombinación en ambos extremos de homología.

Generación de ratones quiméricos

Existen varias formas en las que se pueden generar ratones quiméricos con ESC
modificadas (Figura 5): 1) Se pueden microinyectar con ayuda de micromanipu-
ladores dentro del espacio perivitelino de embriones de 2-8 blastómeros intac-
tos. 2) Se pueden agregar con mórulas de ratón de 8 células (2.5 días de gesta-
ción) a los que se les ha removido la zona pelúcida. 3) Se pueden microinyectar
con ayuda de micromanipuladores dentro del blastocele de blastocistos de 3.5
días de gestación. Las células introducidas, si aún preservan su carácter de plu-
ripotenciales, se mezclarán con las células del embrión silvestre y contribuirán
a la formación de los diferentes tejidos del organismo incluyendo sus células
germinales. Los embriones manipulados se reintroducen 24 horas después del
procedimiento a hembras pseudopreñadas, para que continúen su desarrollo a
término y poder identificar el grado de quimerismo en los individuos resultantes.
Una hembra pseudopreñada se prepara cruzándola con un macho vasectomi-
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

zado, este procedimiento asegura que la hembra se encuentre hormonalmente

preparada para la implantación de un embrión, sin que sus propios ovocitos ha-
yan sido fecundados. Los embriones manipulados se reintroducen en oviductos
de ratonas de 2.5 o en los úteros de ratonas de 3.5 días de pseudopreñadas,
dependiendo si se emplearon mórulas o blastocistos (respectivamente) para la
formación de embriones quiméricos (6).

326

Figura 5. Evaluación de los efectos de la mutación dirigida de un gen. A) Procedimientos para

producir ratones quiméricos con células troncales embrionarias modificadas genéticamente: en
la parte de arriba por microinyección de células modificadas en el espacio perivitelino de un em-
brión de 4 células; en la parte media por agregación con mórulas de E2.5 antes del periodo de
compactación; abajo por microinyección de células en el blastocele de blastocistos. B) Esquema
de cruza para determinar si la quimera transmite la mutación por línea germinal y si la mutación
produce homocigotos anormales. +/+, individuos silvestres; +/–, indivuduos heterocigotos para la
mutación, –/–, individuos mutantes homocigotos.

Para poder identificar en un corto tiempo y después del nacimiento, los rato-
nes que tienen una amplia contribución de las ESC modificadas, se emplean cé-
lulas y embriones que provengan de cepas de ratones que les confieran a cada
uno una manera de identificación, en general asociado al color del pelaje. Por
ejemplo, si las ESC provienen de la cepa 129Sv, la cual tiene un pelaje café cla-
ro (agouti, dado por un patrón de bandas de pigmento amarillo y negro en el
pelo) y son introducidas en mórulas o blastocistos obtenidos de la cepa C57BL/6
(los cuales son de color café obscuro casi negro), se podrá identificar un par de
capitulo XIV Manipulación genética para el estudio funcional de células troncales

semanas después del nacimiento de la quimera cuánto contribuyeron las ESC

a la formación de la misma, por la proporción de pelaje café claro. Si la contri-
bución fue abundante, la quimera deberá cruzarse con una pareja C57; y si la
descendencia origina una progenie agouti significará que las ESC de la quimera
contribuyeron a la formación de la línea germinal y son capaces de transmitir
la modificación. Cuando todos los hijos de la quimera son por ejemplo agouti,
se dice que la quimera es 100% línea germinal, sin embargo solo el 50% de ellos
transmitirá la modificación. Esto se debe a que la alteración en las ESC solo ocu-
rre en uno de los dos alelos, por lo que después de la meiosis, solo la mitad de las
células germinales portarán el alelo modificado.

Como probablemente el lector notó, realizar el esquema de cruzas descrito pro-

duce que los hijos de la quimera tengan un fondo genético mixto (129Sv;C57BL/6).
Esto puede representar un problema para el análisis fenotípico de la descenden-
cia como se hizo notar en una sección anterior. Formas de evitar esta complica-
ción pueden ser: 1) Si se confirma que la quimera es capaz de transmitir por línea
germinal la mutación, ésta puede ahora cruzarse con parejas de la misma cepa
que dio origen a las ESC, conservando así el mismo fondo genético. 2) Alternativa-
mente se han derivado, de forma espontánea, líneas de ratones con mutaciones
en genes que controlan la pigmentación del pelo. Por ejemplo, Bradley derivó una
línea de ratones C57BL/6 con una mutación en el gen de la tirosinasa (que cataliza 327
la producción de melanina) lo cual produce que los ratones sean albinos (32). De
esta forma si se emplean ESC de origen C57BL/6 e inyectan en blastocistos C57BL/6
albinos, las quimeras tendrán parches de pelo negro y blanco (dependiendo del
grado de quimerismo) y los hijos que transmitan la modificación genética conser-
varán el mismo fondo genético al cruzarse con parejas C57BL/6 albinas.

Análisis fenotípico de las mutaciones diseñadas en animales

Una vez obtenidos animales con uno de los dos alelos mutados, si esto no pro-
duce ninguna alteración (e.g. haploinsuficiencia), se analiza la función de la
pérdida de la función del gen en homocigosis (Figura 5). Esto se logra mediante
la cruza de dos individuos que porten un alelo modificado. Como resultado, y
siguiendo las leyes de Mendel, el 25% de la progenie portará dos alelos silvestres,
el 50% un alelo silvestre y uno mutado y el 25% portará los dos alelos mutados. Si
la mutación en homocigosis es letal durante la etapa prenatal, existirá una des-
proporción en los genotipos de los individuos que nazcan. De ser asi, habrá que
identificar en que etapa ocurre la letalidad y los efectos fenotípicos que produ-
ce la mutación. Si los homocigotos nacen, puede suceder que ocurra letalidad
neonatal o que no exista ningún defecto aparente, aunque el individuo puede
tener defectos sutiles, por ejemplo conductuales (que solo podrían ser revelados
con pruebas específicas) o tener defectos de fertilidad (que sólo se harán evi-
dentes al momento de cruzarlos), entre otros (33).
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

Mutaciones dirigidas de manera condicionada

Existe un gran número de genes que cuando inactivados producen letalidad

embrionaria, ya que controlan procesos del desarrollo fundamentales. En estos
casos es difícil investigar la función del gen en etapas posteriores a la letalidad
o en la etapa adulta. Para contender con esta problemática se han creado es-
trategias experimentales que permitan desactivar de manera condicionada los
genes en los individuos. El sistema consiste de una enzima que promueve recom-
binación entre dos secuencias determinadas. Dentro de los sistemas disponibles,
el mas ampliamente usado es el denominado Cre/loxP (34) donde la recombi-
nasa es Cre y loxP la secuencia reconocida por ésta (Figura 6). La secuencia y
enzima no se encuentran naturalmente en mamíferos, ya que son originalmente
de bacteriófagos, por lo que se pueden emplear para controlar eventos de
recombinación dirigidos de manera específica al ser introducidos en células de
mamífero. La secuencia loxP consiste de 34 pares de bases, con una secuen-
cia núcleo asimétrica de 8 pares de bases (que le confiere direccionalidad)
flanqueada por dos juegos de secuencias palíndromes de 13 pares de bases
cada una. Cuando dos secuencias loxP se encuentran en la misma orientación,
la recombinasa Cre promueve una recombinación entre ellas, produciendo al
final que el segmento de DNA que se encontraba entre ambas secuencias se
328 escinda dejando como “huella” un sitio loxP. Si la secuencias loxP se encuentran
en dirección opuesta, la resultante será una inversión del fragmento de DNA en-
tre las secuencias. Para lograr mutar de manera condicionada un gen, se debe
preparar una construcción de manera similar a la que se describió previamente
pero con algunas modificaciones. Sitios loxP con la misma orientación deberán
ser introducidos en regiones intrónicas, flanqueando exones esenciales para la
función del producto génico, dejándolos intactos. El casete de selección posi-
tiva puede estar también flanqueado por secuencias loxP o secuencias análo-
gas para poder removerlo in vivo o in vitro en las ESC de ser requerido. Una vez
lograda la recombinación homóloga en el locus blanco de las ESC se deriva la
línea de ratones modificada como se describió previamente. La cruza de estos
individuos con ratones transgénicos que expresen la recombinasa Cre dirigida
por el promotor de elección, promoverá la escisión de los exones (Figura 6) de
manera dirigida sólo en aquellos tejidos donde se exprese Cre (16).
capitulo XIV Manipulación genética para el estudio funcional de células troncales

Figura 6. Desactivación condicionada de un gen. La construcción de recombinación homóloga con-

tiene casetes de selección positiva y negativa. El casete de selección positiva se encuentra flanquea- 329
da por un sitio loxP y dos frt para remover el casete de selección por la transfección con un vector que
exprese la recombinasa Flp, una vez que se han identificado las clonas recombinantes. Con dichas
célulasa troncales embrionarias modificadas se producen líneas de ratones como previamente se
mostró. La cruza con ratones que expresen la recombinasa Cre produce la desactivación del gen.

Existen formas de realizar de una manera mucho más estricta esta manipula-
ción empleando la expresión condicionada de la enzima (Figura 3) o por la ex-
presión de variaciones de Cre que solo son funcionales cuando se administra un
fármaco. Un ejemplo de esta última es CreER(t2), que es una fusión entre Cre y
el dominio de unión a ligando del receptor de estrógenos modificado para que
una muy eficientemente al antagonista de este receptor, el tamoxifen, y no a
las hormonas endógenas (35). En presencia de la droga, una chaperona (HSP70
o HSP90) se desacopla de la proteína de fusión permitiendo que esta última se
mueva hacia el núcleo donde actúa sobre los sitios loxP. Este sistema permite
modificar genéticamente a los individuos con letalidad embrionaria temprana
o en etapas adultas de una manera muy controlada.

Probablemente en este punto el lector ya haya anticipado que todas estas

metodologías pueden ser empleadas de forma individual o combinada, en ani-
males completos o en células en cultivo para analizar la función de productos
génicos (análisis funcional) en una gran variedad de procesos biológicos y pa-
tológicos. El estudio de las células troncales no es la excepción.
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

ALGUNAS APLICACIONES AL ESTUDIO DE CÉLULAS TRONCALES

Dentro de la gran variedad de aplicaciones que tienen las metodologías descritas,

a continuación se describen solo algunas que han tenido gran relevancia para el
entendimiento de la biología de las células troncales. Por ejemplo, la desactiva-
ción dirigida en ESC ha sido fundamental para establecer el papel protagónico de
los factores que confieren pluripotencialidad a estas. En 1998, el grupo de Austin
Smith y colaboradores demostraron que Oct4, un factor transcripcional abundan-
temente expresado en embriones tempranos y en células germinales, era esencial
para mantener el estado de pluripotencialidad (36). Los embriones deficientes en
Oct4, fueron capaces de desarrollarse hasta el estado de blastocisto pero no for-
maron células de la masa celular interna. Este hecho fue apoyado por la incapa-
cidad de lograr modificar por recombinación homóloga el segundo alelo en ESC
empleando un segundo marcador de selección positiva. En años subsecuentes,
grandes esfuerzos se realizaron para determinar otros genes que participan en el
mantenimiento del estado pluripotencial en células de la masa celular interna y
en líneas de ESC de ratón. De esta manera, se identificó nanog por experimentos
de expresión diferencial entre ESC y embriones preimplantación o células diferen-
ciadas. Los embriones knockout para dicho gen, recuperados a los 5.5 días de
gestación, carecen de derivados de la masa celular interna y cuando nanog es
330 sobre-expresado en ESC empleando un transgen, las células mantienen su estado
pluripotencial aún en ausencia de LIF (37, 38). Estos experimentos confirmaron que
este factor también participa en el mantenimiento del estado pluripotencial de las
células de la masa celular interna del embrión y de líneas de ESC.

En los casos donde el gen no participa en la pluripontecialidad de ESC, pero

que la mutación es letal en etapas tempranas del desarrollo, se pueden aplicar
al menos dos estrategias experimentales: 1) Derivar un alelo condicional de la
mutación o 2) Estudiar el potencial de diferenciación en ESC derivadas de blas-
tocistos mutantes diferenciándolas en ratones quiméricos o in vitro. En este sen-
tido, la aplicación de protocolos que permitan diferenciar de manera eficiente
a las células troncales hacia una gran variedad de linajes celulares, ha sido de
gran utilidad para observar efectos fenotípicos de mutaciones in vitro (39).

El seguimiento de linaje, empleando algunas de estas metodologías, ha sido

fundamental para probar el origen de las células troncales neurales adultas
(ANSC) y su destino. Un ejemplo de esto es el trabajo llevado a cabo por el gru-
po de A. Alvarez-Buylla (40). Para tratar de demostrar que las ANSC, correspon-
den a una población en la zona subventricular (SVZ) de los ventrículos laterales
del adulto con características de astrocitos, emplearon un ratón transgénico
que expresa el receptor del virus de la leucosis aviar dirigido por el promotor de
la proteína acídica fibrilar glial (GFAP, marcador de astrocitos). En este ratón sólo
las células que expresan el receptor pueden ser infectadas por ese tipo de retro-
virus. Si a este ratón se le inyectan en los ventrículos laterales virus que permitan
la expresión de un gen reportero, sólo las células que expresen el receptor serán
capitulo XIV Manipulación genética para el estudio funcional de células troncales

infectadas y expresarán la proteína reportera. Mas aún, si las células se están

dividiendo (los retrovirus infectan solo células en división) y presentan propie-
dades astrocíticas, expresarán la proteína reportera, la cual puede seguirse en
la progenie de las células infectadas. Esta estrategia permitió definir que efec-
tivamente un tipo de astrocito con capacidad proliferativa, corresponde a las
células troncales neurales de la SVZ del adulto y que éstas son capaces de dar
origen a neuroblastos migratorios en la corriente migratoria anterior y a neuronas
granulares y periglomerulares difererenciadas en el bulbo olfatorio del ratón.

La desactivación condicionada de genes en la SVZ del adulto, ha puesto

de manifiesto que mutaciones en supresores de tumores en combinaciones es-
pecíficas origina diferentes tipos de tumores en el cerebro. Empleando alelos
condicionales de Rb/p53, Rb/p53/PTEN o PTEN/p53, a los que se les inyecta en
los ventrículos laterales un adenovirus que expresa la recombinasa Cre, se ha
logrado mutar dichos genes en las ANSC de la SVZ del ratón adulto. Estos experi-
mentos determinaron que las CTA de la SVZ son las que originan los tumores, que
la desactivación de PTEN/p53 origina tumores tipo gliomas, mientras que desac-
tivación de Rb/p53/ o Rb/p53/PTEN tumores de neuroectodermo primitivo. Estos
modelos animales, permitirán entender la participación de estos supresores de
tumores en los fenotipos de tumores de cerebro y su patogénesis (41). Para los in-
teresados en conocer sobre las líneas de ratones transgénicas empleadas para 331
visualizar y manipular genéticamente las células neurogénicas adultas se puede
consultar la revisión reciente de Dhaliwal y Lagace (42).

Modificación genética dirigida en células troncales embrionarias humanas

Al igual que en el ratón, realizar recombinación homóloga en ESC o iPSC de

humano, puede constituir una herramienta muy poderosa para generar líneas
reporteras de linajes celulares, así como para reparar mutaciones o sobre-expre-
sar productos génicos. Desafortunadamente, a pesar de los grandes esfuerzos
para realizar modificaciones por diseño por recombinación homóloga en ESCh
ésta no ha resultado muy eficiente. El establecimiento reciente de una metodo-
logía, la edición de genoma mediado por nucleasas de dedos de zinc (ZFN) ha
surgido como una alternativa para realizar mutaciones por diseño en ESC e iPSC
de una manera eficiente (43). La técnica se basa en la ruptura de las dos ca-
denas de ADN en sitios dirigidos mediada por la ZFN, lo que facilita la recombi-
nación homóloga de una construcción donadora. Las ZFN se diseñan para que
sus dominios de dedos de zinc reconozcan sitios específicos que flanquean el
sitio a mutagenizar. La dimerización de los dominios de nucleasa de la proteína
cataliza la ruptura de la doble cadena de ADN. La adición de la construcción
donadora con homología a las secuencias aledañas al sitio de corte y la maqui-
naria endógena de reparación de ADN, promoverá la reparación mediada por
homología dando como resultado el locus modificado (Figura 7).
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

Figura 7. Edición de genoma mediado por nucleasas de dedos de zinc (ZFN). Se diseñan ZFN que
se unan a secuencias específicas por medio de sus dominios de unión al DNA. Si los dominios de
332 nucleasa están suficientemente cerca se producirá un corte de la doble cadena. En presencia
de una construcción con homología adyacente al sitio de corte, la maquinaria de reparación en-
dógena promoverá la recombinación de ésta con el locus blanco. La construcción introduce un
casete de selección positiva y puede introducir un gene reportero (Proteína fluorescente amarilla,
YFP por sus iniciales en inglés).

Conclusión

Las técnicas de manipulación genética, tanto en células in vitro como en or-

ganismos enteros, son herramientas poderosas para entender la Biología de las
Células Troncales.
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334
Capítulo XV

Aspectos bioéticos del estudio y uso de células troncales

Rubén Lisker

RESUMEN

Empieza por analizar las diversas formas de clonación en mamíferos y su re-

lación con las Células Troncales. Se comenta la posibilidad de convertirlas en
tejidos diversos para emplearlos como trasplantes específicos en pacientes con
padecimientos incurables en la actualidad. Dado que las Células Troncales se
obtienen de la destrucción de blastocistos humanos, ya sea formados con fines
de investigación, o sobrantes de esfuerzos de reproducción asistida, son objeta-
das desde el punto de vista ético por grupos conservadores que consideran que
desde el cigoto ya se es persona y no se deben manipular en ningún sentido.
Un análisis a fondo de la prohibición de la clonación en la Organización de las
Naciones Unidas dictaminada en 2005, a la que se sumó México, nos sugirió que
subyacen consideraciones meramente religiosas, que si bien son válidas para
algunos, no lo son para todos, menos en un país laico como el nuestro. Conside-
ramos como seudo científicas las razones que comúnmente se esgrimen para
objetar la investigación con Células Troncales y lo que es más, pensamos que
es falto de ética el no hacerla. Se analiza de forma breve el asunto de las cé-
lulas pluripotenciales inducidas, que no tienen problemas éticos hasta ahora y
parecen ser muy prometedoras, a pesar de ciertas dudas en relación a su plas-
ticidad real; sin embargo, se considera que debe seguirse trabajando con ellas.

INTRODUCCIÓN

Las “stem cells” (SC, células troncales en español) son las células precursoras
de todos los tejidos del organismo. Antes de referirme a ellas me parece mejor
tratar primero el tema de la clonación y ligar ambas cosas. El interés general
reciente por el fenómeno reproductivo en mamíferos se despertó en 1997 con
el informe del nacimiento de la oveja Dolly (1) por el procedimiento conocido
como clonación. Esto despertó el temor en la sociedad de que lo mismo pudie-
ra conseguirse en nuestra especie y generó numerosas opiniones sobre si era o
no correcto (ético) el intentar realizarlo. Es casi natural que los temores iniciales
fueron prematuros y exagerados, con visiones apocalípticas del futuro, partici-
pando en el debate personas con poca información científica sobre el parti-
cular y parece muy conveniente hacer algunas precisiones, antes de entrar de
lleno a los aspectos bioéticos del problema.
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

CLONACIÓN REPRODUCTIVA Y CLONACION TERAPEÚTICA

La palabra clonación fue acuñada por Webber en 1903 (2) para describir una
colonia de organismos derivados de manera asexual de un solo progenitor. Él
se refería a organismos vegetales, pero lo cierto es que se pueden clonar desde
genes hasta organismos completos y es una forma común de reproducción en
vegetales y organismos inferiores. La mitosis por ejemplo, división celular por la
que nuestro organismo crece a partir de la formación del cigoto (célula diploi-
de, en que la mitad de la información genética proviene de la madre y el resto
del padre) puede considerarse como una forma de clonación. En cambio, el
cigoto se forma de la unión de dos células haploides, el óvulo y el espermatozoi-
de, ambas producidas por la división celular conocida como meiosis.

Se pueden distinguir dos formas de clonación en mamíferos, la reproductiva y

la terapéutica. Ambas se esquematizan en la Figura 1, donde se comparan con
el proceso reproductivo normal usando como ejemplo el ratón (columna A). Se
puede observar como después de la fertilización se forma el cigoto y se convier-
te mediante divisiones sucesivas en un conjunto de células que progresa al esta-
dio de blástula o blastocisto, estructura hueca que tiene en su interior un grupo
de células adosadas a su pared interna, denominado masa celular interna. El
blastocisto es el que se implanta en la pared del útero para iniciar formalmente
336 el embarazo, lo que ocurre en nuestra especie alrededor de 6 días después de
la fertilización. Si todo va bien, meses después se tiene un recién nacido vivo. En
la clonación reproductiva (columna B de la Figura 1), el “cigoto” se obtiene por
lo que se llama transferencia nuclear, insertando el núcleo diploide de una célu-
la somática a un óvulo previamente enucleado, de tal suerte que toda la infor-
mación genética proviene del donador del núcleo, que puede ser un macho o
una hembra y es la forma en que se produjo Dolly y los demás mamíferos que se
ha logrado clonar a la fecha. El procedimiento es menos eficiente que el pro-
ceso reproductivo normal, ya que se alcanza el éxito en sólo alrededor de 1%
de las veces, mientras que en el primero es de alrededor de 50%, aunque existe
discusión sobre el particular. En la clonación terapéutica (columna C, Figura 1),
el inicio es igual que en la reproductiva, se forma el cigoto por transferencia
nuclear, pero difiere en que después de formado el blastocisto se destruye para
cosechar las células de la masa interna, cada una de las cuales se puede con-
siderar como una célula troncal embrionaria (ESC), con la capacidad de dife-
renciarse en diferentes tejidos y hasta en un embrión.
capitulo XV Aspectos bioéticos del estudio y uso de células troncales

337

Figura 1. Comparación del desarrollo normal de un ratón (A), con la clonación reproductiva (B) y
la clonación terapéutica (C). Ver texto para mayor explicación. La figura se modificó de la publi-
cada por Fischbach y Fischbach en 2004 (18).

Es importante hacer énfasis en que el proceso normal difiere de la clonación,

no sólo en que es natural y el cigoto se forma de la unión de un óvulo con el
espermatozoide, por lo que su información genética proviene de ambos proge-
nitores, mientras que en la clonación, ya sea reproductiva o terapéutica, el “ci-
goto” se forma in vitro por transferencia nuclear y toda la información genética
proviene del donador. La diferencia principal entre la clonación reproductiva y
la terapéutica, es que en la primera se intenta lograr un recién nacido vivo de la
especie con que se esté trabajando y en la segunda sólo se quiere obtener las
ESC con el propósito de diferenciarlas en tejidos específicos y usarlos como tera-
péutica en diversas enfermedades. De hecho, la diferencia es tan grande, que
hay quienes piensan que debería dejarse el término clonación para el esfuerzo
reproductivo, cuyo empleo en nuestra especie está por lo pronto prohibido de
manera universal y no usar esta palabra para describir la clonación terapéu-
tica que podría denominarse como “formación de cigotos por transferencia
nuclear”, que no sólo es más preciso sino la separa de la reproductiva, evitando
que de manera automática se estigmatice, al prohibirse legalmente “la clona-
ción” en los diversos ordenamientos al respecto.
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

CÉLULAS TRONCALES

Las SC se pueden clasificar según su plasticidad (capacidad de convertirse en

diversos tejidos) en totipotenciales como el cigoto, capaz de convertirse en un
embrión y tejidos extra embrionarios (placenta y cordón umbilical), pluripoten-
ciales como las células de las masa celular interna del blastocisto capaces de
convertirse sólo en el embrión y mono o multipotenciales, con la capacidad de
convertirse en uno o pocos tipos de células como las del cordón umbilical, que
son precursores de las células de la sangre.

Otra manera de clasificarlas, es según su origen en ESC cuando provienen

del embrión o en células troncales adultas (ASC, del inglés, Adult Stem Cells)
cuando se encuentran en tejidos adultos como la médula ósea o en el Sistema
Nervioso Central. Se considera que estas últimas por lo general tienen menor
plasticidad que las primeras, aunque si se ha comprobado de manera experi-
mental que se pueden convertir en células diferentes a las del tejido donde se
encontraron, como se discute en otros capítulos de esta obra.

En la práctica, las ESC se pueden obtener básicamente de dos fuentes. De

blastocistos construidos específicamente para este propósito dentro de algún
programa de investigación, o bien de embriones sobrantes de esfuerzos de repro-
338 ducción asistida, si se cuenta con el permiso expreso de los padres. Es común que
en reproducción asistida se guarden congelados muchos más embriones que los
que se utilizan y una vez cubiertas las necesidades del caso se guardan por al-
gunos años, hasta que se desechan por ya no ser requeridos por los propietarios
legales. Algunos piensan que en lugar de ello podrían usarse para fines de inves-
tigación repito, con el consentimiento de los padres, para averiguar si las células
de la masa interna, pueden en realidad diferenciarse en todos o cuando menos
algunos tejidos y usarse como trasplantes para curar enfermedades que por lo
pronto son intratables. En la Tabla 1 se señalan algunos de los padecimientos que
pudieran tratarse con esta estrategia, si finalmente se logra comprobar que esto
es factible, y la mera lectura de la lista deja muy clara la enorme trascendencia
médica y social que tendría el volver realidad esta terapéutica.

TABLA 1. Posibles usos de la clonación terapéutica

ENFERMEDAD TEJIDO REQUERIDO

Diabetes tipo 1 Células beta del páncreas

Infarto del corazón Fibras miocárdicas

Enfermedad de Alzheimer Tejido neural

Enfermedad de Parkinson Tejido neural

Sección de médula espinal Puentes de tejido neural

capitulo XV Aspectos bioéticos del estudio y uso de células troncales

CÉLULAS TRONCALES PLURIPOTENCIALES INDUCIDAS (iPSC)

El hecho de que existen objeciones éticas para el uso de células derivadas de

embriones, ha ocasionado la propuesta de diversas metodologías para obtener
SC con igual plasticidad que las embrionarias, pero éticamente correctas. De
las muchas que se han planteado, ninguna ha tenido aceptación generalizada
hasta que Yamanaka y colaboradores describieron en 2006 las celulas troncales
pluripotenciales inducidas (iPSC, del inglés induced Pluripotent Stem Cells). Estas
células se obtienen reprogramando células somáticas adultas en cultivo (3), si-
guiendo varias estrategias posibles, como se describe de manera detallada en
el capítulo XIII de este libro. En esencia se convierten células adultas en células
embrionarias pluripotenciales que pueden a su vez diferenciarse en cualquier
tejido del organismo, o sea que tienen una plasticidad igual o cercana a las ESC.

Estas células resultan muy atractivas ya que si se piensa emplearlas para pro-
ducir tejidos específicos con el propósito de trasplantarlos y curar enfermedades,
se puede obviar el problema del rechazo inmunológico, usando como fuente
original del tejido a trasplantar células del propio enfermo. El uso de las iPSC ha
progresado con rapidez y recientemente se anunció (4) que con ESC diferencia-
das hacia tejido neural, los laboratorios Geron de Manlo Park, California, recluta-
ron ya al primer enfermo para un ensayo clínico de ESC para tratar pacientes con
lesiones agudas de la médula espinal. Se trata de un estudio fase 1 a realizar en 10 339
enfermos para averiguar la seguridad y tolerancia de los pacientes al trasplante.

Son tan prometedoras estas células que muchos investigadores piensan que
hay que olvidarse de las ESC, sin embargo me parece que: 1) nadie sabe de
verdad si estas células son iguales a las embrionarias y de hecho, se publicó re-
cientemente (5) que las células reprogramadas tienen “memoria” del tejido de
donde se originaron, lo cual limitaría su potencial de uso; y 2) algunos conside-
ran que las ESC no constituyen problemas éticos graves (6) que deban evitar la
investigación en este campo y que de hecho es más falto de ética el no hacerlo
e impedir la investigación sobre la posibilidad de lograr curar o mejorar enferme-
dades actualmente devastadoras, que trabajar con ellas.

Por último, no quiero dejar de mencionar que las iPSC pueden utilizarse no
solamente como agentes terapéuticos a manera de trasplantes de tejidos es-
pecíficos, sino además pueden emplearse para hacer modelos in vitro de mu-
chas enfermedades de las que ahora sabemos poco, no sólo para conocer
su fisiopatología, sino además para buscar medicamentos útiles para su trata-
miento. Imaginen por ejemplo que de una biopsia de piel de un paciente con
enfermedad de Alzheimer, hacemos un cultivo de fibroblastos y transformamos
las células a tejido nervioso primitivo y se crecen en una caja de Petri. Podríamos
observar el desarrollo de las células a través del tiempo, conocer los cambios
que ocurren y de presentar alteraciones ir añadiendo distintas substancias para
averiguar si se detiene el proceso que en la persona viva lleva a la enfermedad.
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

PROBLEMAS ÉTICOS DE LAS CÉLULAS TRONCALES

Hay que empezar señalando que la investigación en células troncales sólo se

objeta desde el punto de vista ético cuando las células proceden de un tejido
embrionario. Nadie se inconforma con el uso de ASC y tampoco, hasta la fecha,
de las iPSC. Esta especificidad debe enmarcarse dentro de una pregunta clave
¿Cuándo se convierte en persona el óvulo fecundado?

Las dos posiciones extremas son: 1) la que considera que desde el momento
mismo de la fertilización del óvulo por el espermatozoide, según los grupos con-
servadores; y 2) la que considera que el cigoto no es diferente a ninguna otra
célula y que se puede escoger otro momento para considerarlo como persona,
por ejemplo al sobrevivir 24 horas después de nacer, como lo indica la ley mexi-
cana, y cuyo documento probatorio es el acta de nacimiento que nos avala
como personas y como ciudadanos. Naturalmente que hay posturas interme-
dias, que veremos más adelante.

Postura conservadora

El favorecer la postura de que se es persona desde el momento mismo de la ferti-

340 lización, tiene un fondo claramente religioso, compartido cuando menos parcial-
mente por varias religiones pero muy bien expresado por la cúpula de la iglesia
católica. En un libro reciente publicado por la Comisión Nacional de Bioética de
México (7), denominado “La clonación humana en la Organización de las Nacio-
nes Unidas”, su autora, la Dra. Lourdes Motta Rodríguez, destaca en sus reflexiones
finales que el texto de la declaración aprobada por las Naciones Unidas (ONU)
en marzo de 2005 prohibiendo por completo la clonación, no es suficientemen-
te claro y contundente, ya que en el preámbulo se refieren al artículo 11 de la
Declaración Universal sobre el Genoma Humano y los Derechos Humanos de la
propia ONU, en que se señala exclusivamente la prohibición de la clonación re-
productiva y no de la clonación terapéutica, calificándola como una práctica
contraria a la dignidad humana. Esta frase intriga, porque si bien es cierto que
todos entendemos el concepto, lo podamos o no explicar, aquí se refieren a que
una célula, el cigoto tiene ese atributo, lo que francamente desconcierta.

La parte final de la obra de Motta contiene 34 anexos que contienen las

propuestas realizadas por los diferentes países u organizaciones para preparar
la declaración sobre este asunto y la número 26 se llama “consideraciones de
la Santa Sede sobre la clonación humana”, que en una parte dice a la letra
“aquí la dignidad significa la valía intrínseca que comparten de manera co-
mún e igual todos los seres humanos, independientemente de sus condiciones
sociales intelectuales o físicas. Es esa dignidad la que nos obliga a respetar a
todos los seres independientemente de su condición y en especial si necesitan
protección o cuidado. La dignidad es la base de todos los derechos humanos.
capitulo XV Aspectos bioéticos del estudio y uso de células troncales

Estamos obligados a respetar los derechos de los demás porque en primer lugar
reconocemos su dignidad”. En contraste con esta idea Ruth Macklin, reconoci-
da profesora norteamericana de Bioética, publicó en 2003 un editorial (8) en el
que concluye que la dignidad es un concepto inútil. Dice que la literatura está
llena de referencias a la dignidad del hombre, con frecuencia relacionadas con
asuntos genéticos o técnicas reproductivas y un análisis minucioso de ellas le
convenció de que no son más que frases imprecisas sin ningún sentido adicional
de lo que va implícito en el respeto a las personas o a su autonomía.

En parte por el artículo de Macklin, el Consejo de Bioética del Presidente nor-

teamericano Bush, decidió analizar el asunto a fondo, solicitando a sus miembros
y algunos invitados que escribieran una serie de ensayos sobre la dignidad hu-
mana. El producto final fue una obra llamada “Bioética y el asunto de la Digni-
dad Humana” (9) publicado en 2008. Contiene las aportaciones de 23 profesio-
nales de la Bioética, que representan un amplio espectro de ideas, que va desde
el punto de vista laico hasta el religioso. Se expresan diversas opiniones, pero
la mayoría opina que “la dignidad Humana” en este contexto es un concepto
netamente religioso, relacionado directamente con la idea de un Dios creador.

En este orden de ideas, para la iglesia católica contemporánea el huevo fertiliza-

do ya es persona por considerar que es cuando ingresa el alma al cuerpo (equiva-
lente teológico de convertirse en persona) como lo expresaron en 1974 en la Decla- 341
ración sobre el Aborto, de la Congregación Romana para la Defensa de la Fe (10),
lo que es compartido al menos parcialmente por judíos (11) y protestantes (12). Es
necesario decir que esto no coincide con lo que pensaba Santo Tomas de Aquino
por ejemplo, uno de los grandes pensadores católicos de la historia, acerca de que
el alma entraba al cuerpo a los 40 días del embarazo en el varón y a los 90 días en
las mujeres. Este pensador no hubiera tenido problemas con la manipulación que
se hiciera con el blastocisto y menos con el cigoto, pero esto fue hace varios siglos.

Las posturas religiosas son desde luego legítimas, pero no se pueden discu-
tir ya que no están sujetas a un análisis lógico y simplemente se creen o no se
creen. Sin embargo, como México es un país laico, definido el laicismo como la
separación de la iglesia y el estado, los argumentos que emplean los grupos más
conservadores, para discutir estos asuntos, en particular a nivel legislativo, son
de naturaleza científica, o más bien, seudo científica. Los principales son dos: 1)
el cigoto tiene una constitución cromosómica completa, única e irrepetible; y 2)
el cigoto tiene la potencialidad de convertirse en un recién nacido y por tanto
merece el mismo respeto y tratamiento que cualquier ser humano.

Postura no conservadora

En relación a que el cigoto tiene una dotación cromosómica completa única e

irrepetible, podemos aceptar que es completa y única, pero no irrepetible. Hasta
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

el día 16 de la gestación el embrión puede dividirse en dos y dar lugar a dos seres
humanos genéticamente iguales, los gemelos monocigotos, que son dos personas
diferentes. Por otro lado los humanos, como todo ser viviente, son resultado de la
interacción entre su estructura genética y el medio ambiente en que se vive, siendo
lo primero lo más importante para ciertas características y para otras, lo segundo. Es
claramente exagerado el reducir al hombre sólo a lo genético e ignorar el efecto
del ambiente familiar, educativo y social en lo que acaba siendo cada quien.

El segundo argumento, el de que el cigoto tiene la potencialidad de con-

vertirse en persona, resulta poco convincente por varios motivos (13). Se puede
aceptar que todas las personas empezaron su formación como cigotos, pero
ello no significa que sean lo mismo que una persona. De hecho, no se suele con-
siderar como lo mismo un precursor que el producto final. Un huevo no es una
gallina, una semilla no es un árbol y del mismo modo un cigoto no es una perso-
na, ya que carece de los atributos que definen a una persona. La capacidad
de pensar y razonar es lo que nos distingue de todos los demás animales y para
ello es necesario que exista una corteza cerebral desarrollada con todas las co-
nexiones neuronales necesarias y eso no ocurre sino hasta después de la sema-
na 24 del embarazo (14,15). En este sentido puedo citar a grandes pensadores
del pasado, como John Locke, filósofo inglés del siglo XVII, quien definía a una
342 persona como un ser pensante, capaz de razonar y reflexionar, o el prusiano Em-
manuel Kant del siglo XVIII quien decía que para ser persona se requiere tener
conciencia y capacidad de elegir libremente. Darwin en su libro “The descent of
man, and selection in relation to sex” publicado en 1871 (16), dijo que de todas
las diferencias entre el hombre y otros animales, su sentido de lo moral es con
mucho lo más importante, para lo que se requiere poder razonar.

Visto el asunto de otro modo, en la discusión más tradicional acerca del mo-
mento en que se convierte en persona un cigoto, se han propuesto las siguien-
tes posibilidades entre otras: a) dos semanas después de la formación del cigoto
cuando se forma en el embrión la “estría primitiva” y ya no se puede dividir en
dos; 2) cuando la mujer embarazada empieza a sentir los movimientos del feto,
lo que ocurre alrededor de la semana 20 o 21; c) alrededor de la semana 23 - 24
cuando empieza a haber actividad cerebral; d) cuando el feto empieza a ser
viable fuera del útero con ayuda médica adecuada, alrededor de las 22 sema-
nas del embarazo. La opción c) corresponde a la que defendimos en el párrafo
anterior y es enteramente compatible con el criterio de muerte empleado para
decidir cuándo se le puede quitar un órgano a una persona y usarlo como tras-
plante. En otras palabras si el criterio de ausencia de función cerebral se usa
para diagnosticar la muerte de una persona, resulta lógico que su aparición en
un feto creciendo indique que ya es persona.

Todo lo dicho, debería ser suficiente para descartar a la potencialidad como un

elemento descalificador para del uso de ESC. Sin embargo podemos llevar el argu-
mento a sus últimas consecuencias, un tanto grotescas, diciendo que el considerar
capitulo XV Aspectos bioéticos del estudio y uso de células troncales

al cigoto formado por transferencia nuclear como persona, lleva implícito que cual-
quier célula del adulto, cuyo núcleo sea capaz de originar un organismo completo
(Dolly y demás mamíferos clonados), serían también personas. Esto haría que, si al
rascarse la piel se descaman células epiteliales, esto debería considerarse como un
asesinato múltiple, ya que cada una de ellas, “tiene la capacidad de producir una
persona”, o bien que debe castigarse al cirujano que hace una apendectomía por
cometer un genocidio. Qué decir de los trasplantes de órganos, ¿de veras se están
introduciendo muchas personas en potencia al individuo trasplantado?

Postura intermedia

Esta postura acepta que el cigoto es una célula especial, diferente a otras
por su potencialidad de convertirse en persona y que su “grado de persona”
depende del grado de avance del embarazo. Pienso que en la vida real así es
como lo conceptúa la sociedad, sin detenerse a meditar sobre esta cuestión.
Por ejemplo, la presencia de un retraso menstrual, que puede significar la pér-
dida temprana de un producto, se ve con indiferencia y a veces con alivio. Un
aborto espontáneo de fines del primer trimestre del embarazo, es siempre un
suceso negativo y doloroso, pero incomparable para la pareja, con la muerte
de un bebe de algunos meses o peor, pocos años de nacido. Para aquellos que
343
piensan que el cigoto es lo mismo que una persona, cada una de las situacio-
nes que recién describí deberían ser afectados por igual, ya que en todos los
casos se estaría perdiendo una “persona” y ello no ocurre así. En apoyo de esta
postura puedo citar una publicación de Tsai (17) que argumenta siguiendo a
Confucio, el gran filósofo oriental, que según el punto de vista gradualista, se
puede aceptar que el embrión joven es en potencia un ser humano con un
status especial, más que ninguno pero menos que todo. Interpreto esta frase en
el sentido de que no es igual un embrión a un recién nacido, cuando menos.

Quiero terminar con una pregunta sobre una situación imaginaria. Entra usted
a una oficina a realizar un trámite y observa que en la habitación hay una carriola
con un bebé pequeño y encima del mostrador está un paquete con la leyenda:
1000 blastocistos humanos para congelación inmediata. En ese momento se ini-
cia un temblor bastante fuerte y quiere salirse lo antes posible del lugar por temor
a que se colapse el edificio. Dado que es manco sólo puede llevarse consigo al
bebe o al paquete con blastocistos por congelar ¿A quién salvaría?

Conclusiones

Es necesario proseguir con la investigación de células troncales embrionarias,

para averiguar si se pueden diferenciar hacia los tejidos deseados y usarse como
trasplantes específicos para intentar resolver enfermedades ahora no curables
o de difícil manejo y que afectan a millones de personas. Consideramos que las
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

objeciones éticas al respecto, como su potencialidad para convertirse en per-

sonas son difíciles de sostener ante los enormes posibles beneficios para la Me-
dicina y la sociedad en general. Por otro lado la oposición tiene un fundamento
religioso, que no es de naturaleza universal, e imposible de defender en un país
laico como el nuestro. También se reconoce la necesidad de proseguir con las in-
vestigaciones con las células pluripotenciales inducidas, ya que no sólo no plan-
tean dilemas éticos para ningún grupo, pero tienen ventajas adicionales, como
solucionar con facilidad el problema de rechazo inmunológico si los tejidos deri-
vados de ellas se usan como trasplantes. No menos importante es la posibilidad
de lograr modelos in vitro de diversas enfermedades que permitan conocer a las
SC mejor y servan para probar el efecto de diversos medicamentos sobre ellas.

344
capitulo XV Aspectos bioéticos del estudio y uso de células troncales

REFERENCIAS
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Capítulo XVI

Células troncales y medicina regenerativa en México

Héctor Mayani, Mónica Lamas & Iván Velasco

RESUMEN

La investigación en células troncales (SC) inició en México hace poco más de 15

años y desde entonces, ha ido en continuo crecimiento. Hoy en día, hay poco
más de 20 grupos —tanto en la ciudad de México, como en diversas ciudades del
país— trabajando en la biología de las SC neurales, hematopoyéticas, mesenqui-
males, embrionarias, cancerosas, etc. El interés en las SC ha conducido al desarro-
llo de protocolos clínicos institucionales, en los que ya se han empleado fraccio-
nes celulares —conteniendo SC— para el tratamiento de diversas enfermedades.
Desafortunadamente, la charlatanería y el abuso —apoyados por la ignorancia y
la vulnerabilidad de cientos (o miles) de pacientes— también han encontrado un
nicho de acción en nuestro país. Es por lo tanto fundamental que se establezcan
programas institucionales y gubernamentales para apoyar la investigación —bio-
médica y clínica— en esta área, así como la educación médica, la divulgación y
la legislación. De esto dependerá el futuro de la medicina regenerativa en México.

INTRODUCCIÓN

Pocas veces en la historia de la ciencia, han ocurrido eventos que desaten el in-
terés no solo de los científicos trabajando en el campo de investigación en cues-
tión, sino de la sociedad entera, y que los hallazgos se discutan no solo en foros
científicos y médicos, sino en foros políticos, financieros, éticos y religiosos. Esto es
exactamente lo que ha ocurrido con el campo de las células troncales (SC) y,
consecuentemente, con la medicina regenerativa. Acorde con este interés, en
diversas partes del mundo se han creado desde programas de entrenamiento
hasta institutos completos dedicados al estudio de las SC y la regeneración tisular.

Esta explosión de interés mundial acerca de las SC ha llegado a nuestro país

con gran fuerza. Las SC han provocado gran expectación en nuestra sociedad,
en general, y en nuestra comunidad científica, en particular. Hoy en día, en el
radio o en la televisión oímos hablar frecuentemente acerca de las “células ma-
dre”, de la clonación y de los bancos de sangre de cordón umbilical. En muchos
medios impresos, ya sea una revista que se vende en el supermercado o en un
periódico de circulación nacional, leemos artículos y noticias sobre estos temas.

Por otra parte, en muy pocos años, el número de científicos trabajando en

nuestro país en esta área se ha incrementado de manera muy significativa; el
número de proyectos de investigación sometidos a convocatorias instituciona-
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

les y nacionales, como las del CONACYT, también ha crecido en gran forma y
los conceptos denominados “células troncales” y “medicina regenerativa” ya
aparecen como rubros independientes y prioritarios en dichas convocatorias.

Es importante, sin embargo, que no prevalezca la idea de que México “se aca-
ba de interesar en este tema” y que acaba de ingresar en él. En realidad, México
entró en esta área de la investigación biomédica hace más de 15 años, a través
de la participación y el trabajo de algunos investigadores. En ese entonces eran
muy pocos —y en general, pequeños— los grupos enfocados al estudio de las
SC; sin embargo, a lo largo de este tiempo dichos grupos han crecido y se han
fortalecido. Por otra parte, nuevos grupos se han creado a partir de la formación,
tanto en México como en el extranjero, de jóvenes investigadores. Esto, evidente-
mente, le ha dado un gran impulso a este campo de la ciencia nacional.

Con esta idea en mente, el presente capítulo tiene dos propósitos: el prime-
ro de ellos es presentar un panorama sobre la investigación en SC que se ha
desarrollado en nuestro país, incluyendo la organización del Grupo Mexicano
de Investigación en Células Troncales. El segundo consiste en describir la situa-
ción actual de la medicina regenerativa en México, analizando y reflexionando
acerca de los distintos aspectos, tanto positivos como negativos, que están pre-
sentes en esta controvertida área.
348

LA INVESTIGACIÓN SOBRE CÉLULAS TRONCALES EN MÉXICO

Como se mencionó anteriormente, la investigación en SC en México se inició

a mediados de la década de 1990. Uno de los grupos pioneros y con mayor
trayectoria es el del Dr. Luis Covarrubias, en el Instituto de Biotecnología de la
UNAM. El Dr. Covarrubias se ha dedicado al estudio de las SC neurales, emplean-
do modelos experimentales animales (ratón). Sus primeros estudios, publicados
en 1995 (1), coincidieron con la demostración de la existencia de células tronca-
les neurales (NSC) en el cerebro adulto. Al mismo tiempo, este grupo comenzó
a trabajar en la Biología de las SC embrionarias (ESC) de ratón, particularmente
en los mecanismos que regulan la muerte celular programada (apoptosis). Su
investigación se ha enfocado también en la búsqueda de sistemas experimen-
tales para obtener neuronas a partir de ESC (2). Otro aspecto en el que están
trabajando, es la plasticidad de diferenciación de las NSC, ya sea por efecto
del microambiente local, o por una reprogramación inducida (3).

El Grupo de Investigación en Hematopoyesis y Células Troncales (GIHCT) del

IMSS es otro de los grupos con más de 15 años trabajando en esta área. Este
grupo fue iniciado por el Dr. Héctor Mayani, quien trabajando con el Dr. Peter
Lansdorp (en Vancouver, Canadá), fue uno de los primeros en demostrar que
las SC hematopoyéticas (HSC) de la sangre de cordón umbilical (SCU) poseen
potenciales de proliferación y expansión muy superiores a los de las células he-
capitulo XVI Células Troncales y Medicina Regenerativa en México

matopoyéticas de sujetos adultos (4). Ésta fue una de las observaciones que
impulsaron el uso de la SCU en trasplantes hematopoyéticos en pacientes adul-
tos. En 1994 se formó oficialmente el GIHCT y desde entonces se ha dedicado
al estudio de las SC del sistema hematopoyético. Actualmente, el grupo está
integrado por cinco laboratorios independientes: el laboratorio de la Dra. Euge-
nia Flores-Figueroa, quien trabaja en la caracterización del microambiente en
el que se desarrollan las células troncales del sistema hematopoyético (5); el de
la Dra. Antonieta Chávez-González, cuya línea de investigación se centra en la
Biología Celular y Molecular de las células troncales leucémicas (6); el de la Dra.
Rosana Pelayo, interesada en la Biología del linaje linfoide del sistema hemato-
poyético y en las alteraciones —moleculares y celulares— que conducen a la
leucemia linfoblástica (7); el del Dr. Juan José Montesinos, cuya investigación
está enfocada en la Biología y manipulación de las MSC (8) y el laboratorio del
propio Dr. Mayani, quien se dedica al estudio de la biología y la expansión clíni-
ca de HSC de la sangre de cordón umbilical (9).

En 2003, el Instituto de Fisiología Celular de la UNAM, reclutó a 2 investigadores

que hasta la fecha trabajan con SC: la Dra. Diana Escalante-Alcalde y el Dr. Iván
Velasco. Coincidentemente, ambos realizaron su estancia posdoctoral en los
Institutos Nacionales de Salud (NIH por sus iniciales en inglés) de los EUA. Durante
esta estancia de investigación, la Dra. Escalante-Alcalde utilizó ESC para gene- 349
rar ratones knockout (esto es, carentes de un gen) de una enzima involucrada
en el metabolismo de lípidos. Recientemente ha reportado alteraciones morfo-
lógicas, bioquímicas y conductuales al conseguir la eliminación de esta enzima
exclusivamente en el CNS en ratones manipulados genéticamente (10). Por su
parte, durante su estancia postdoctoral, el Dr. Velasco formó parte del grupo de
investigación que describió —por primera vez— la generación de células capa-
ces de producir y secretar insulina y que son producidas a partir de ESC de ratón
(11). También participó en experimentos claves para demostrar que las neuro-
nas dopaminérgicas, generadas a partir de la diferenciación de ESC, podían
causar la recuperación funcional de ratas con un síndrome que se asemeja a la
enfermedad de Parkinson (12). Actualmente, el Dr. Velasco y su grupo continúan
trabajando en el estudio de ESC y NSC de roedores (13).

El grupo del Dr. René Drucker, también del Instituto de Fisiología Celular de la
UNAM, desde hace varios años ha estado interesado en el estudio de la neu-
rogénesis en el cerebro adulto y las células precursoras neurales que participan
en ella. Ellos han enfocado parte de su investigación a la caracterización de los
precursores neurales involucrados en la regeneración de tejido neural, ocurrida
en respuesta a cierto tipo de lesiones inducidas en el cerebro de ratas (14).

Hay que destacar que tanto el IMSS como la UNAM, han iniciado “megapro-
yectos” encaminados al estudio de las SC hematopoyéticas y neurales, respectiva-
mente, con la finalidad de crear programas de terapia celular (15,16). De hecho,
como parte de su programa, el IMSS creó ya un Banco de Células de SCU, el cual
 CELULAS TRONCALES Y MEDICINA REGENERATIVA

ha proporcionado más de 70 unidades que han sido empleadas en trasplantes

hematopoyéticos y se espera que en un futuro cercano, dicho Banco pueda pro-
veer unidades para ser empleadas en protocolos de medicina regenerativa. En la
UNAM, el Programa de Investigación Multidisciplinaria de Proyectos Universitarios
de Liderazgo y Superación Académica (IMPULSA) ha apoyado estudios relativos
a “Células troncales adultas, regeneración neuronal y enfermedad de Parkinson”.

En el Instituto de Investigaciones Biomédicas de la UNAM, el Dr. Horacio Mer-

chant ha desarrollado la escuela de Biología del desarrollo con mayor tradición
en el país. El interés del Dr. Merchant en la interacción entre las células germi-
nales y somáticas durante el desarrollo de la gónada (17, 18), lo han atraído de
manera natural al campo de generación de gametos a partir de SC. En el mismo
Instituto, el Dr. Jesús Chimal-Monroy se ha enfocado en los últimos años en el es-
tudio del desarrollo de las extremidades utilizando diversos animales experimen-
tales (19). Más recientemente, su grupo ha iniciado una línea de investigación
centrada en la regeneración de anfibios. Por su parte, el Dr. Karlen Gazarian, en
la misma dependencia universitaria, se ha enfocado a la reprogramación ce-
lular y la generación de SC pluripotenciales inducidas (iPSC) a partir de células
maduras de diferentes tejidos.

Recientemente se han establecido nuevos grupos de investigación, los cua-

350 les han empezado a generar resultados interesantes en esta área. Tal es el caso
del grupo de la Dra. Mónica Lamas, en el Cinvestav, quien está interesada en la
identificación, caracterización y manipulación de SC de la retina postnatal (20).
En la Universidad Autónoma del Estado de Morelos, el Dr. Jesús Santa-Olalla ha
iniciado varios proyectos encaminados al estudio de la biología y plasticidad las
SC neurales y la generación de estas células a partir de diversas fuentes.

En el Instituto Nacional de Rehabilitación, los doctores Clemente Ibarra y Cristina

Velasquillo han iniciado un programa de investigación sobre las MSC con el pro-
pósito de emplearlas en pacientes con trastornos óseos y articulares. Por su parte,
el Dr. Jaime Belkind-Gerson, del Instituto Nacional de Salud Pública, se encuentra
trabajando en la biología de las SC neurales entéricas (21), mientras que el Dr. Ale-
jandro García Carrancá, en el Instituto de Investigaciones Biomédicas de la UNAM
y el Instituto Nacional de Cancerología, está iniciando una línea de investigación
en SC cancerosas, empleando al cáncer cervico-uterino como modelo de estu-
dio. En la Facultad de Medicina de la UNAM, la Dra Martha Robles está estudiando
la participación de vías de señalización celular en cáncer de colon.

Es importante hacer hincapié en que varios grupos de investigación en SC se

han establecido en diferentes ciudades en el norte y noroeste del país. Tal es el
caso del grupo del Dr. Oscar González-Pérez (Universidad de Colima, Colima),
quien está trabajando en la caracterización de NSC adultas de roedores (22) y
humanos en el cerebro adulto; los doctores Ortuño Sahagún y Gudiño Cabrera,
en Guadalajara, trabajan en la diferenciación de precursores neurales (23,24);
capitulo XVI Células Troncales y Medicina Regenerativa en México

por su parte, grupos en Monterrey y San Luís Potosí están buscando establecer
nuevas condiciones para el cultivo de células troncales y progenitoras hemato-
poyéticas y adipocíticas (25-27).

Es muy probable que la información presentada aquí resulte incompleta,

pues, afortunadamente, cada vez son más los investigadores interesados en
esta área. Sin lugar a dudas, este campo de investigación seguirá creciendo
en nuestro país, con resultados muy favorables, tanto en el aspecto científico
como en el médico. Conscientes de ello, hemos iniciado el Grupo Mexicano
de Investigación en Células Troncales, encaminado al intercambio de ideas,
experiencia y reactivos entre los investigadores interesados en estos temas. Mu-
chos de los miembros de este grupo también pertenecen a la red Farmed, una
agrupación temática auspiciada por Conacyt para detonar sinergias y colabo-
raciones en el área de terapia celular.

MEDICINA REGENERATIVA

Los descubrimientos recientes en cuanto al extraordinario potencial de prolifera-

ción de las células troncales somáticas (i.e., su capacidad para generar grandes
cantidades de células maduras de tejidos específicos), a su plasticidad de diferen-
ciación (i.e., la capacidad de las SC de un tejido para generar células de otros teji-
351
dos) y a su versatilidad funcional —tanto in vivo como in vitro— han provocado que
el campo de la medicina regenerativa haya crecido de una manera extraordina-
ria durante la última década. Dicho crecimiento ha estado alimentado por la idea
de que, debido a su gran versatilidad, las MSC o las HSC pueden ser utilizadas para
tratar a pacientes con diferentes tipos de enfermedades. Si bien, esta afirmación se
sustenta en hallazgos reportados en la literatura científica, en ciertos casos se han
hecho extrapolaciones que muchas veces exceden a las propias evidencias.

Este entusiasmo hacia la medicina regenerativa se ha visto reflejado a nivel

mundial, tanto en países desarrollados como en aquellos en vías de desarrollo.
La buena noticia es que el crecimiento de esta área indudablemente traerá
beneficios a una gran cantidad de individuos que padecen enfermedades he-
matológicas, metabólicas, neurodegenerativas, oncológicas, etc. La mala, es
que en algunos países se ha incurrido en faltas éticas —derivadas de la desinfor-
mación y el mal uso de la información sobre las SC— que han permitido el cre-
cimiento de la charlatanería y el abuso de los pacientes, aún cuando algunas
veces los mismos pacientes no lo notan.

En efecto, la información acerca de las características funcionales de las SC

y su potencial uso en el tratamiento de diversas enfermedades, ha sido ma-
nejada, por muchos, de una manera confusa, errónea y hasta irresponsable,
creando falsas expectativas en todas aquellas personas afectadas por alguna
enfermedad que potencialmente pudiera ser tratada con terapia basada en
 el empleo de SC. La normatividad y la regulación en distintos países es muy di-
ferente, siendo muy estricta en algunos y demasiado laxa o inexistente en otros.
Esto ha provocado que en países donde no está aprobado el uso de SC para
terapias no convencionales y que en este momento se encuentran en estudio,
una gran cantidad de pacientes decidan viajar a otros países, donde sí es posi-
ble realizar dichos procedimientos.

Se ha calculado que tan solo en 2007, alrededor de 750,000 pacientes viviendo

en los EUA viajaron a otros países —principalmente el sureste de Asia, al norte de
México y a algunos países en Suramérica— para recibir tratamientos que no están
aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los EUA (FDA
por sus iniciales en inglés) (28). Ese número se incrementó en el 2010, calculándose
que fueron 1.6 millones las personas que viajaron al extranjero buscando algún tipo
de tratamiento. Este fenómeno ha recibido el nombre de “turismo médico” (28).

Actualmente, tanto en los países desarrollados como en los que están en

vías de desarrollo, la proporción de individuos mayores de 60 años de edad es
elevada, lo que ha resultado en un aumento en la frecuencia de pacientes
con enfermedades oncológicas y crónico-degenerativas, muchos de los cuales
no tienen la solvencia económica necesaria para buscar tratamiento. Por otro
lado, muchas de las terapias médicas no convencionales se encuentran en fase
352 experimental a través de protocolos controlados, a los cuales solo tienen acce-
so un número limitado de pacientes. Todo esto ha propiciado el que una gran
proporción de pacientes esté volteando hacia las clínicas que ofrecen “terapia
celular y medicina regenerativa” a costos moderados. Desafortunadamente,
este fenómeno se ha vuelto muy común en México.

¿Qué hacer ante este problema? Educación, información y legislación, estas

son las tres acciones que deben llevarse a cabo a la brevedad. Educación para
los médicos, ya que muchos de ellos no conocen con la profundidad necesaria
la literatura científica existente en este campo y son los primeros en pensar que di-
chas células pueden ser utilizadas de manera indiscriminada. Información para la
sociedad; la gente tiene el derecho a estar enterada sobre los estudios científicos
que apoyan o descartan el empleo de SC para ciertos padecimientos; la gente
tiene derecho a saber qué opinan los médicos y los científicos sobre estas nuevas
terapias. En este sentido, Internet constituye una peligrosa arma de doble filo que,
por una parte, tiene una capacidad extraordinaria de difusión de la información
y, por otra, en general no tiene la más mínima capacidad de filtración en cuanto
a la calidad, exactitud y veracidad de la información contenida en sus páginas.
En estas condiciones, se hace imprescindible instar a la sociedad a la selección
racional de la información contenida en la red a partir de páginas respaldadas
por instituciones o grupos bien fundamentados. El Grupo Mexicano de Investiga-
ción en Células Troncales ha recogido esta inquietud y elaborado la página de
Internet [Link]. Y por último, legislación, promovida y re-
gulada por el gobierno, para lograr que exista un control en cuanto al desarrollo
y la aplicación de los tratamientos médicos y evitar el abuso y el engaño. Dentro
de este contexto, resulta fundamental el papel de los comités científicos y de
bioética de las distintas instituciones nacionales, tanto públicas como privadas,
para dar cumplimiento a los lineamientos establecidos.

En cuanto a las terapias que ya se están llevando a cabo en México, es im-

portante mencionar que existen algunos grupos médicos que han empezado
a utilizar poblaciones celulares para el tratamiento de diversas patologías. Por
ejemplo, en el Hospital de Cardiología del CMN Siglo XXI del IMSS, en el CMN 20
de Noviembre del ISSSTE, en el Instituto Nacional de Cardiología y en el Hospital
OCA de Monterrey, se han tratado pacientes con trastornos cardiovasculares,
empleando células autólogas de la sangre periférica movilizada (29, 30). De
igual forma, en varias instituciones del sector salud, ya se han empleado las mis-
mas fracciones celulares en el tratamiento de trastornos vasculares en pacien-
tes diabéticos. Por otra parte, en el Hospital Universitario de la Universidad Autó-
noma de Nuevo León, en Monterrey, se está llevando a cabo un protocolo para
el tratamiento de niños con parálisis cerebral, empleando células de sangre de
cordón umbilical. En ese mismo hospital se han empleado fracciones celulares
enriquecidas en células que expresan el antígeno CD133 para el tratamiento de
pacientes con esclerosis lateral amiotrófica (31).

Como ya se dijo en capítulos anteriores, todavía no se conocen con detalle los 353
mecanismos por los que las SC, tanto mesenquimales como hematopoyéticas,
contribuyen a la regeneración de tejido cardiaco, endotelial, muscular o neural;
sin embargo, este tipo de procedimientos clínicos se ha extendido ampliamente
a nivel mundial y México no ha sido la excepción. ¿Es eso, bueno o malo? La
respuesta es difícil, pues entran en juego muchos factores. Una línea de pensa-
miento dice que ninguno de esos procedimientos debería llevarse a cabo en
pacientes, hasta que se hayan realizado en modelos animales y se tengan resul-
tados que demuestren que sí funcionan. Otra línea dice que solo deben realizarse
en pacientes que ya no tienen ninguna otra opción terapéutica (desahuciados),
previo consentimiento informado. Por último, hay quienes piensan que este tipo
de terapia ya está lista para ser aplicada en todo aquel que la requiera.

El sentir general de la comunidad científica es que todavía hay mucha inves-

tigación que debe hacerse para que la medicina regenerativa llegue a ser una
medicina segura, confiable y eficiente (32-34). Sin embargo, también es cierto
que de manera paralela a la investigación básica, es posible avanzar en la in-
vestigación clínica, en la medida en que los procedimientos estén bien funda-
mentados en la evidencia biomédica y que se hagan de una forma totalmente
ética, con responsabilidad, que los pacientes estén bien informados, que exista
una sólida justificación clínica, que haya transparencia —de tal forma que los
resultados del procedimiento puedan darse a conocer— y que el procedimien-
to sea desarrollado por médicos capacitados. En todo esto, los comités institu-
cionales de ética juegan un papel fundamental.
 En el escenario actual, las SC somáticas, particularmente las hematopoyé-
ticas y las mesenquimales, ya son una realidad. Las primeras han sido aplica-
das en la clínica desde hace 50 años, en el tratamiento de enfermedades del
sistema hematopoyético (ver Capítulo X). Las MSC, por su parte, están siendo
empleadas en el tratamiento de pacientes con trastornos óseos (osteogénesis
imperfecta), en pacientes que reciben un trasplante hematopoyético —para
disminuir la enfermedad de Injerto contra Hospedero— y en el tratamiento de
algunos trastornos autoinmunes y vasculares (ver Capítulo V).

El turno de las ESC en la clínica está empezando; de hecho, existe ya un protoco-

lo de investigación clínica Fase 1 (de la compañía biotecnológica GERON, en Ca-
lifornia, EUA), en el que, a partir de ESC, se generan oligodendrocitos (GRNOPC1),
los cuales se inyectarán en pacientes con lesión de médula espinal, con la finalidad
de que se regenere la presencia y la función de la población de oligodendrocitos.
Dicho protocolo está basado en estudios en modelos animales, los cuales dejaron
ver el potencial beneficio de este procedimiento. Finalmente, el turno de las iPSC
y otros tipos de SC (NSC) vendrá una vez que se tengan las evidencias necesarias
que sugieran su aplicación. El camino por delante es todavía largo y complejo.

354 Conclusiones

A pesar de contar con más de 15 años de haberse iniciado en nuestro país,

la investigación en SC es todavía un campo en crecimiento. En la actualidad,
existen grupos en diversas instituciones (UNAM, IMSS, UAEM, CINVESTAV, INCan,
INR, INSP y otras) trabajando en la identificación, purificación, caracterización
biológica, manipulación genética y expansión ex vivo, de diversos tipos de SC,
incluyendo hematopoyéticas, mesenquimales, neurales, embrionarias, cance-
rosas y pluripotenciales inducidas. La interacción entre todos estos grupos será
un catalizador para el mejor desarrollo de la investigación en SC en México.
Lo anterior permitirá lograr avances muy importantes en nuestro conocimiento
acerca de la biología de las SC, los cuales, indudablemente, incidirán en una
mejor aplicación de ellas en la clínica.

En cuanto a la medicina regenerativa, los esfuerzos institucionales en nuestro

país son todavía incipientes; sin embargo, han generado un gran interés por parte
de las autoridades correspondientes, lo que, seguramente, acelerará su desarrollo.
Ahora bien, uno de los principales retos en este campo, será crear programas de
educación médica, divulgación amplia y abierta a toda la sociedad y legislación,
para lograr que esta área se desarrolle en nuestro país con los estándares más altos.
Esto, evidentemente, con el único fin de brindar mejores opciones terapéuticas y
una mayor esperanza de vida, a los miles de pacientes mexicanos afectados por
alguna enfermedad oncológica, autoinmune, endócrina o crónico-degenerativa.
Agradecimientos

El Dr. Héctor Mayani es becario de la Fundación IMSS y su trabajo es apoyado

por la Coordinación de Investigación en Salud del Instituto Mexicano del Seguro
Social (IMSS) y el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT). La Dra.
Mónica Lamas es investigadora titular del Centro de Investigaciones y Estudios
Avanzados (Cinvestav) y recibe apoyo CONACYT. Las investigaciones del labo-
ratorio del Dr. Velasco son auspiciadas por el CONACYT mediante proyectos de
investigación y la red Farmed, la Universidad Nacional Autónoma de México
(Papiit IN224210) y los National Institutes of Health.

355
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 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO
Programa Universitario de Investigación en Salud

CELULAS TRONCALES
Y MEDICINA REGENERATIVA

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