Francisco Javier Guzmán Bernardo

ESTUDIO ANALÍTICO DE SULFAMIDAS,

COMPUESTOS ASOCIADOS Y PRODUCTOS DE
DEGRADACIÓN MEDIANTE NUEVOS
MÉTODOS DE SEPARACIÓN

I.S.B.N. Ediciones de la UCLM

84-8427-396-2

Cuenca, 2005
 UNIVERSIDAD DE CASTILLA-LA MANCHA
Facultad de Ciencias Químicas
Departamento de Química Analítica y Tecnología de Alimentos

ESTUDIO ANALÍTICO DE SULFAMIDAS,

COMPUESTOS ASOCIADOS Y PRODUCTOS DE DEGRADACIÓN

MEDIANTE NUEVOS MÉTODOS DE SEPARACIÓN

FRANCISCO JAVIER GUZMÁN BERNARDO

TESIS DOCTORAL
Ciudad Real, 2001
 Departamento de Química Analítica y Tecnología de Alimentos
Facultad de Ciencias Químicas

ESTUDIO ANALÍTICO DE SULFAMIDAS,

COMPUESTOS ASOCIADOS Y PRODUCTOS DE
DEGRADACIÓN MEDIANTE NUEVOS
MÉTODOS DE SEPARACIÓN

por

Francisco Javier Guzmán Bernardo

Visado en Ciudad Real, 7 de mayo de 2001

Fdo. Juan José Berzas Nevado

Catedrático de Universidad del
Departamento de Química
Analítica y Tecnología de
Alimentos de la Universidad
de Castilla-La Mancha

Trabajo presentado para optar al Grado de

Doctor en Ciencias Químicas

Fdo. Francisco Javier Guzmán Bernardo

Licenciado en Ciencias Químicas

Fdo. Gregorio Castañeda Peñalvo

Profesor Titular del
Departamento de Química
Analítica y Tecnología de
Alimentos de la Universidad
de Castilla-La Mancha
 DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA
Y TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS

JOSÉ MARÍA LEMUS GALLEGO, Profesor Titular de Universidad y

Secretario del Departamento de Química Analítica y Tecnología de
Alimentos de la Universidad de Castilla-La Mancha,

CERTIFICA:

Que el presente trabajo de investigación titulado

“Estudio analítico de sulfamidas, compuestos asociados y productos
de degradación mediante nuevos métodos de separación”
constituye la Tesis Doctoral que presenta D. Francisco Javier
Guzmán Bernardo para aspirar al Grado de Doctor en Ciencias
Químicas, y ha sido realizado en los laboratorios de este
Departamento bajo la dirección de los profesores Dr. D. Juan José
Berzas Nevado y Dr. D. Gregorio Castañeda Peñalvo.

Y para que conste, expido y firmo el presente certificado en

Ciudad Real a siete de mayo de dos mil uno.

Vº Bº

Fdo. María Dolores Cabezudo Ibáñez Fdo. José María Lemus Gallego
Directora del Departamento Secretario del Departamento
 En este momento, en el que está por concluir este trabajo de investigación, quiero
dar las gracias a todos aquellos que me han ayudado a llegar a este momento.

Al Dr. D. Juan José Berzas Nevado por depositar su confianza en mí para formar
parte de su equipo investigador y por darme apoyo de una manera decidida y constante
durante todo este período.

Al Dr. D. Gregorio Castañeda Peñalvo por haberse dedicado con una paciencia y
una entrega encomiables a mi formación en el ámbito científico y por haberme ofrecido su
amistad sincera desde el primer momento.

A mi familia y a Mari Luz, que siempre han estado muy próximos a mí y han hecho
suyos mis anhelos, ilusiones y contrariedades, brindándome su calor y ayudándome a
superar los momentos más difíciles.

A mis amigos, Agustín, Justo y Ángel, con quienes he vivido unos años plagados de
gratísimas experiencias que, por supuesto, siempre quedarán entre nosotros cuatro.

A mis compañeros del área de Química Analítica por haberme ofrecido un

compañerismo y afecto que tanto he disfrutado, y también a mis compañeros de la
Facultad de Ciencias del Medio Ambiente, con quienes tantas veces he arreglado el mundo
mientras tomábamos una taza de café.

A todos aquellos que, de alguna u otra manera, han contribuido a que esta tesis
llegara a buen puerto.

A todos ellos, muchas gracias.

 OBJETO DE LA TESIS

El objeto de esta Tesis Doctoral ha sido el de continuar incidiendo en el

conocimiento analítico de algunas sulfamidas y compuestos asociados, así como sus

productos de degradación y metabolitos, con la finalidad de optimizar nuevos

procedimientos de separación y determinación de los compuestos citados, en productos

comerciales de uso clínico y veterinario así como en fluidos biológicos, por

cromatografía líquida y por electroforesis capilar.

Parte importante del objeto de esta Tesis fue también el análisis de aquellos

parámetros que pueden incrementar la sensibilidad del detector UV-Visible de diodos

en línea en electroforesis capilar.

 Introducción 5

ANTECEDENTES HISTÓRICOS DE LAS SULFAMIDAS

La primera sulfamida que se sintetizó fue la sulfanilamida. Ya en 1908, Gelmo la

preparó como parte de un programa de investigación de colorantes azoicos. Durante

muchos años se utilizó sólo como producto intermedio en la industria de los colorantes. Su

actividad antibacteriana se descubrió un cuarto de siglo más tarde, después de una larga

serie de circunstancias interesantes. En 1932, Domagk (1) indicó que el prontosil rubrum,

sintetizado por Mietzsch y Klarer, era activo en infecciones producidas por estreptococos

β-hemolíticos, aunque hasta 1935 no fueron introducidas en la terapéutica (Prontosil). Por

este descubrimiento Domagk recibió el premio Nobel en 1938.

En 1935 un grupo de investigadores formado por Tréfouël, Nitti y Bovet bajo la

dirección de Fourneau, en el Instituto Pasteur de París, demostró, tal como se acepta en la

actualidad, que la agrupación azo del prontosil rubrum se reduce “in vivo” por la acción de

la azo reductasa, formando sulfanilamida, que es el producto activo (2).

NH2

SO2
H2N N N SO2 NH2 H2N NH2 +

NH2 NH2

NH2
Prontosil Rubrum Sulfanilamida

Figura 1. Reducción del Prontosil Rubrum

6 Introducción

Las sulfamidas o sulfonamidas, además de constituir el primer tratamiento eficaz

de las infecciones bacterianas, provocaron una revolución en quimioterapia al introducir y
comprobar el concepto de antagonismo metabólico que ha sido de gran utilidad en química
farmacéutica para explicar el mecanismo de acción de muchos fármacos y para diseñar
racionalmente nuevos agentes terapéuticos.
Con objeto de obtener nuevas sulfamidas, se han sintetizado, hasta el momento,

alrededor de 15.000 derivados análogos, relacionados con la sulfanilamida, en especial

relacionados con el ácido p-aminobenzoico, dentro del más intensivo y extenso programa

de modificación molecular. La posterior modificación de estos compuestos con nuevas

propiedades farmacológicas ha conducido a muchos fármacos nuevos: antibacterianos

(sulfanilamidas), leprostáticos (sulfonas), diuréticos (sulfonamidas heterocíclicas,

bencenodisulfonamidas, tiacidas), hipoglucemiantes (sulfonilureas), antimaláricos

(cloroguanida, cicloguanilo), fármacos antitiróidicos (propiltiuracilo, metimazol) y un

fármaco de utilidad en el tratamiento de la gota (probenecida).

Se designan con el nombre general de SULFAMIDA a todos aquellos compuestos,

con acción antibacteriana, que contienen la función sulfonamida R-SO2NH2, pero que, de

hecho, derivan del grupo para-amino-benceno-sulfonamida, en el que el radical R está

constituido por la anilina, y cuya fórmula es:

O
H2N S NH2
O
Figura 2. Fórmula de la para-amino-benceno-sulfonamida
Introducción 7

Este núcleo es la base de numerosos derivados, obtenidos por sustitución de los

grupos amino, tanto de la anilina como de la sulfonamida, por radicales. Como principio

general, para el mantenimiento de la acción antibacteriana no puede modificarse la

estructura fundamental de las sulfonamidas. Esto se explica por el hecho de que las

sulfonamidas son antagonistas competitivos del ácido p-aminobenzoico, por lo que su

estructura debe mantenerse muy similar a la de este metabolito esencial; es decir, debe

incluir las siguientes características: un anillo bencénico con sólo dos sustituyentes en

posición para, un grupo amino en la posición 4 ( o un grupo tal como azo, nitro, o amino

sustituido que “in vivo” puede dar lugar al grupo 4-amino) y un grupo 1-sulfonamido

monosustituido (excepto en las sulfonas y algunos derivados especiales). Los fármacos

relacionados con las sulfonamidas, pero que no poseen esta estructura fundamental pueden

ejercer acción antibacteriana por un mecanismo distinto.

El descubrimiento de las sulfamidas dio lugar a la quimioterapia microbiana puesto

que se trata de sustancias que se interponen en el metabolismo del microbio paralizando

todo anabolismo y no de simples bactericidas. Si bien han perdido algo de interés por la

aparición de los antibióticos, ya que estos últimos poseen un espectro antimicrobiano más

extendido y son de más fácil manejo, las sulfamidas conservan un elevado interés en

veterinaria, con la condición de utilizarlas correctamente, en especial si se tiene presente

que algunas tienen indicaciones precisas y no son reemplazables por antibióticos. Por ello

su uso sigue siendo muy amplio y variado.

La propiedad bacteriostática es debida a un fenómeno antivitamínico. Los

microbios, para su reproducción, necesitan de una vitamina, la vitamina H´ o ácido para-

amino-benzoico. Las sulfamidas son las antivitaminas y, por lo tanto, existe antagonismo

entre ambos cuerpos, que resulta de la identidad morfológica de sus moléculas. La

sulfamida ocupa el lugar del ácido p-aminobenzoico en los compuestos intermediarios del
8 Introducción

metabolismo microbiano, lo que origina su bloqueo. Este bloqueo es el que impide el

crecimiento y la división celular de las bacterias. Existe, pues, solamente bacteriostasis,

que se ejerce sobre las formas jóvenes, pero el organismo debe poner en juego sus defensas

para destruir los microbios. La acción bacteriostática de la sulfamida debe completarse por

la acción bacteriolítica de los leucocitos.

Si la concentración de sulfamidas es insuficiente, ya sea por el hecho de que la

dosis no haya sido bastante elevada, ya porque debido a su eliminación renal no se alcance

la tasa necesaria de medicamento, los microbios reemprenden su reproducción, siendo

necesaria entonces una mayor concentración. Si tal fenómeno se repitiera daría lugar a la

creación de una cepa sulfamidorresistente del germen considerado.

Las sulfamidas suelen suministrarse asociadas con otros compuestos que

intensifican su acción antibacteriana. Éste es el caso del trimetoprim (TMP), aislado en

1962, y de la pirimetamina (PMT), cuya asociación con determinadas sulfamidas fue

desarrollada originariamente como medicamento antipalúdico.

OCH3 N NH2
H2N N NH2 OCH3
N
N
OCH3 NH2
Cl
Trimetoprim Pirimetamina

Figura 3. Fórmulas de Trimetoprim y Pirimetamina

El mecanismo de acción es la interferencia con la producción de ácido fólico. En

combinación con una sulfamida y debido a la existencia de distintos puntos de ataque

sobre el metabolismo de las bacterias, se produce un bloqueo secuencial, dando lugar a un

Introducción 9

efecto bacteriano sinérgico debido a que, como las sulfonamidas, bloquean la misma ruta

metabólica. La combinación de la sulfamida con estos potenciadores produce, así, una

respuesta supra aditiva; es más eficaz contra un gran número de microorganismos y es

menos probable que permita la formación de resistencia bacteriana. El trimetoprim se

suele asociar, en proporción 1:5 (TMP:sulfamida), con sulfametoxazol, sulfadoxina y

sulfadiacina, mientras que la pirimetamina se suele asociar con sulfaquinoxalina (SQX) en

proporciones 1:3 (PMT:SQX).

Conviene destacar las sulfamidas de acción general que, cuando se administran por

la boca, se absorben por el intestino, pasan a la circulación y se reparten por todos los

tejidos y líquidos del organismo. Asimismo, pueden franquear ciertas placentas. Pero,

según la naturaleza de la sulfamida, se observa que algunas se concentran más

particularmente en la bilis y la orina. En la sangre, la sulfamida se combina con las

proteínas del plasma, pero esta combinación es lábil y la sulfamida activa se libera

progresivamente.

Estas sulfamidas se eliminan por la orina, en su mayor parte, libres o combinadas.

La eliminación es, por lo tanto, menos rápida cuando el porcentaje de la asociación de tipo

sulfamida-proteína es más elevado en la sangre.

Las sulfamidas pasan en parte a la orina en forma de derivados acetilados (la

acetilación tiene lugar en el hígado), los cuales son inactivos y, además, sobre todo para

ciertas sulfamidas, cristalizan dentro de los canales urinarios, provocando así grandes

problemas. Se puede contrarrestar este inconveniente bebiendo abundante agua y

administrando al mismo tiempo que la sulfamida, la vitamina PP (amida o ácido

nicotínico) o también administrando mezclas de tres o cuatro sulfamidas. Así, la

solubilidad respectiva de cada derivado acetilado no cambia mientras que las actividades
10 Introducción

de los productos se suman, con lo cual, para un efecto global idéntico, se disminuyen los

riesgos de bloqueo renal.

CLASIFICACIÓN DE SULFAMIDAS

Para clasificar las sulfamidas se han utilizado varios criterios: aplicación

terapéutica, estructura química y espectro de acción antibacteriana.

Según su principal aplicación terapéutica, aunque algunas de ellas poseen más de

una, se pueden clasificar en: sulfamidas sistémicas, sulfamidas intestinales, sulfamidas

urinarias, sulfamidas oftálmicas y sulfamidas para usos especiales.

Las sulfamidas sistémicas se usan en infecciones sistemáticas y, según la duración

de la acción, se pueden dividir en sulfamidas de acción rápida y de acción prolongada. Las

de acción rápida se absorben y se eliminan rápidamente, su vida media oscila entre 5 y 15

horas y las más utilizadas son: sulfacloropiridacina, sulfadiacina, sulfametacina,

sulfametizol, sulfafurazol, sulfameracina, sulfametizol, sulfametoxazol y las

trisulfapiridinas. Las de acción prolongada se absorben rápidamente y se eliminan

lentamente. Su vida media es de 35 a 40 horas, debido a lo cual deben usarse con sumo

cuidado pues pueden alcanzar una concentración peligrosa en la sangre. Las más utilizadas

son: sulfadimetoxina, sulfadoxina, sulfaleno, sulfameter, sulfametoxidiacina,

sulfametoxipiridacina, sulfametomidina, sulfamoxol, sulfaperin, sulfafenazol, sulfasomizol

y sulfasimacina.

Las sulfamidas intestinales se obtuvieron uniendo agrupaciones hidrófilas al grupo

amino libre con el fin de obtener formas muy solubles en agua. Debido a las agrupaciones

fuertemente hidrófilas, son mal absorbidas en el tracto gastrointestinal y por ello alcanzan

elevadas concentraciones en la luz del colon, donde la hidrólisis bacteriana libera la

Introducción 11

agrupación sulfanilamida. Las más utilizadas son la ftalilsulfacetemida, ftalilsulfatiazol,

sulfaguanol y el ácido sulfalóxico.

Las sulfamidas urinarias se absorben rápidamente y se eliminan lentamente por los

riñones, alcanzando así elevadas concentraciones en los mismos. Las principales son la

sulfacetamida, sulfacloropiridacina, sulfacitina, sulfadimetoxina, sulfaetidol, sulfafurazol,

sulfameter, sulfametizol, sulfametoxazol, sulfametoxipiridacina, sulfafenazol, sulfaurea y

la sulfisomidina. Las sulfamidas oftálmicas se aplican tópicamente y las principales son la

sulfacetamida sódica y la sulfisoxazol diolamina.

Otra forma de agrupar las sulfamidas viene determinada por su estructura química.

Las sulfamidas, denominadas también sulfanilamidas o sulfafármacos, poseen la estructura

general siguiente:

3 2 O
(4) (1) R'
4 1
RHN S N
O H
5 6

Figura 4. Estructura general de las sulfamidas

Este núcleo es la base de numerosos derivados, obtenidos por sustitución de los

hidrógenos aminados por radicales. Así, podremos efectuar la siguiente clasificación:

1.- Para-amino-benceno-sulfonamida o sulfanilamida.

H2N-C6H4-SO2-NH2

2.- Derivados obtenidos por la sustitución del hidrógeno del nitrógeno sulfamídico:

H2N-C6H4-SO2-NHR

3.- Derivados obtenidos por la sustitución de átomos de hidrógeno en el nitrógeno

anilínico y sulfamídico, conjuntamente.

RHN-C6H4-SO2-NHR
12 Introducción

4.- Derivados de tipo azoico, obtenidos por la formación de la sal de diazonio y la

posterior copulación con diversos reactivos.

R-N=N-C6H4-SO2-NH2

A continuación se presenta una tabla con las sulfamidas más utilizadas en la

industria farmacéutica y veterinaria.

Tabla 1. Sulfamidas
Nombre oficial Siglas Nombre Nombre químico
registrado
Sulfacetamida SCM Cetamide N-sulfanilacetamida
Sulamyd
Sulfapiridina SPR Dagenan N1-2-piridilsulfanilamida
Sulfadiacina SDC Coco-Diazine N1-2-pirimidinilsulfanilamida
Microsulfon
Pyrimal
Sulfameracina SMR N1-(4-metil-2-pirimidinil)-sulfanilamida
Sulfametacina SMT N1-(4,6-dimetil-2-pirimidinil)-sulfanilamida
(sulfadimidina)
Sulfacloropiridacina SCP Sonilyn N1-(6-cloro-3-piridacinil)-sulfanilamida
Sulfametizol SMTZ Thiosulfil N1-(5-metil-1,3,4-tiadiazol-2-il)-sulfanilamida
Ultrasul
Sulfametoxazol SMX Gantanol N1-(5-metil-3-isoxazolil)-sulfanilamida
Sulfaetidol SED Sul-Spansion N1-(5-etil-1,3,4- tiadiazol-2-il)-sulfanilamida
Sul-Spantab
Sulfisoxazol SSX Gantrisin N1-(3,4-dimetil-5-isoxazolil)-sulfanilamida, con
(diolamina) SK-Soxazol 2,2’-imino-bis(etanol)
Sodizole
Sosol
Soxomide
Sulfisocon
Sulfametoxipiridacina SMP Kynex N1-(6-metoxi-3-piridacinil)-sulfanilamida
Midicel
Sulfaleno SFL Kelficinz N1-(3-metoxi-2-piracinil)-sulfanilamida
Sulfameter SME Sulfa N1-(5-metoxi-2-pirimidinil)-sulfanilamida
Sulfadoxina SDX Fanasil N1-(5,6-dimetoxi-4-pirimidinil)-sulfanilamida
Fanasulf
Sulfadimetoxina SDM Madribon N1-(2,6-dimetoxi-4-pirimidinil)-sulfanilamida
Sulfamonometoxina SMM N1-(6-metoxi-4-pirimidinil)-sulfanilamida
Sulfaclomida SCL N1-(5-cloro-2,6-dimetil-4-pirimidinil)-sulfanilamida
Sulfacitina SCT Renoquid N1-(1-etil-1,2-dihidro-2-oxo-4-pirimidinil)-
sulfanilamida
Sulfasimacina SSM N1-(4,6-dietil-s-triacin-2-il)-sulfanilamida
Acetilsulfisoxazol Gantrisin N-(3,4-dimetil-5-isoxazolil)-N-sulfanilacetamida
Acetyl
Sulfasalacina SSC Azulfidina Ácido 5-[p-(2-piridilsulfamoil)-fenilazo]-salicílico
(Salazosulfapiridina)
Ftalilsulfacetamida N1-acetil-N4-ftalilsulfanilamida
Ftalilsulfatiazol Sulfatalidina Ácido 4’-(2-tiazolilsulfamoil)-ftalanílico
Succinilsulfatiazol Sulfasuxidina Ácido 4’-(2-tiazolilsulfamoil)-succinanílico
Mafenida MAF Sulfamylon α-amino-p-toluensulfonamida
Introducción 13

ANÁLISIS DE SULFAMIDAS

El elevado numero de sulfamidas diferentes utilizadas en la industria

farmacéutica y su amplio uso tanto en la práctica médica como veterinaria hace que

sean muy numerosos los trabajos encontrados en bibliografía que determinan

sulfamidas, sus potenciadores y algunos productos de su degradación y metabolitos,

bien de forma individual o conjuntamente. Estas drogas se pueden determinar

cuantitativamente en todo tipo de matriz, mediante un gran número de métodos, siendo

los instrumentales, sin lugar a dudas, los más utilizados y los que mayor interés

presentan.

Dentro de los métodos instrumentales, los métodos espectroscópicos de

absorción en el ultravioleta – visible, junto con los cromatográficos, han sido los que

han permitido analizar la mayoría de las sulfamidas, aunque también se han empleado,

con el fin de determinar estas drogas, técnicas de espectrofluorimetría molecular, así

como técnicas electroquímicas.

Los métodos cromatográficos han sido los más utilizados para el análisis de

sulfamidas, destacando por su importancia, dentro de ellos, la cromatografía líquida de

alta resolución (HPLC o LC), aunque también se han encontrado en bibliografía

métodos que utilizan la cromatografía de gases (CG) y la cromatografía en capa fina

(CCF).

La asociación sulfametoxazol-trimetoprim (SMX-TMP) es muy frecuente en

productos farmacéuticos y veterinarios por lo que se han propuesto diversos métodos para

la determinación conjunta de los dos componentes por HPLC en fluidos biológicos (3-6) y

en productos comerciales (7-9). Con bastante frecuencia se ha llevado a cabo la

determinación simultánea de TMP y SMX, bien en presencia de los productos de

14 Introducción

degradación de SMX en fluidos biológicos (10-14), bien en presencia de otras sulfamidas

como la sulfameracina (15) o sulfadiacina en compuestos farmacéuticos (16), o como la

sulfadimetoxina, en plasma de origen animal (17), o bien en presencia de otros compuestos

a los que suelen ir asociados en las formulaciones farmacéuticas como la epidrina y la

codeina (18). En todos los casos se utilizaron detectores UV.

Otro de los potenciadores que suele asociarse con las sulfamidas es la

pirimetamina. El gran uso que se hace, en la práctica médica y veterinaria de estas

asociaciones, ha propiciado que se propongan métodos por HPLC para la determinación

conjunta de PMT, sulfamidas, derivados acetilados de estas y de otros componentes que

suelen asociarse en las formulaciones farmacéuticas.

G.R. Rao y col. (19), en 1989, propusieron un método para la determinación

conjunta de sulfametoxipiridacina y TMP o PMT en formulaciones farmacéuticas,

utilizando una columna de acero rellena de fenil µBandapak, ácido metanóico-acetato

sódico (pH=4) como fase móvil y detección a 354 nm. Bajo estas condiciones los

excipientes de las muestras no presentaron interferencias y se obtuvieron recuperaciones

cuantitativas.

En nuestros laboratorios se ha venido trabajando en la determinación de sulfamidas

y sus potenciadores durante los últimos años, desarrollando nuevos métodos analíticos,

espectrofotométricos en la mayoría de las ocasiones, para su posterior aplicación en

productos comerciales farmacéuticos y/o zoosanitarios. Con este fin, se utilizó el método

de los espectros cocientes derivados (20), el método de las áreas de los espectros cocientes

y la espectrofotometría derivada por medidas en el punto de corte o zero-crossing.

Concretamente, se ha trabajado con las mezclas binarias de tipo sulfamida-

potenciador más comunmente utilizadas para la elaboración de productos farmacéuticos

y/o zoosanitarios, tales como SMX-TMP (21), SQX-PMT (22), SDC-TMP (23) y la
Introducción 15

mezcla ternaria formada por SQX-SMT-PMT (24). En todos los casos citados se

resolvieron las diferentes mezclas de sulfamidas y potenciadores utilizando los tres

métodos. Se obtuvieron mejores resultados en términos de reproducibilidad y

recuperaciones cuando se utilizaron espectros cocientes que cuando se realizaron las

determinaciones por espectrofotometría derivada con medida en el punto de corte.

En bibliografía se recogen numerosos trabajos de HPLC en los que se lleva a cabo

la separación e identificación de varias sulfamidas a la vez, en presencia o no de sus

productos de degradación, partiendo de distintos tipos de matrices como son: mezclas

sintéticas, productos farmacéuticos, fluidos biológicos, carnes, pescados etc.

R. Cross (25) y J. Wieling y col. (26) han propuesto métodos para la separación y

determinación conjunta de un gran número de sulfamidas en muestras sintéticas. El

primero de ellos consigue separar e identificar una mezcla de 22 sulfamidas utilizando una

columna C18 y detección a 270 nm, mientras que el segundo consigue separar e identificar

doce sulfamidas utilizando HPLC de fase reversa con una columna C18.

M. De Smet y col. (27), A.R. Long y col. (28) y F.M. El Anwar y col. (29),

propusieron diferentes métodos para la separación y determinación de 4, 7 y 3 sulfamidas,

respectivamente, en productos de uso farmacéutico y veterinario, usando en todos los casos

detección UV.

Sin embargo, recientemente se ha desarrollado enormemente la electroforesis

capilar (EC) y sus variantes, prácticamente inéditas hasta principios de los años noventa
en cuanto a análisis de sulfamidas se refiere. En la última década del pasado siglo, las
técnicas de electroforesis capilar fueron perfeccionándose paulatinamente hasta
conseguir poderes de separación comparables a los ofrecidos por HPLC. Este hecho,
junto con el bajo coste de mantenimiento, en los planos económico y medioambiental,
de los equipos de electroforesis capilar con respecto a los cromatógrafos de líquidos
16 Introducción

facilitó que estas técnicas se abriesen camino rápidamente dentro de los métodos de
separación.
Como inconveniente, hay que decir que las separaciones por electroforesis

capilar son menos sensibles que las de HPLC, debido a que los capilares tienen un paso

óptico muy reducido (entre 50 y 75 µm de diámetro interno), por lo que es necesario

modificarlos. Los capilares de burbuja y las células de flujo son los ejemplos más

comunes.

También, en la actualidad se vienen desarrollando nuevas técnicas

electroforéticas, como es la de amplificación de campo, que utiliza capilares

convencionales en las separaciones. En esta modalidad se practica una inyección de

larga duración y una posterior concentración de la muestra dentro del mismo capilar

antes de efectuar la separación.

El uso de la electroforesis capilar en zona (CZE) para la separación de

sulfamidas y/o sus potenciadores ha sido extenso desde la implantación de esta técnica a

nivel mundial. En lo que concierne a los sistemas de detección, la bibliografía recoge

una amplísima mayoría de trabajos donde se utiliza la espectrofotometría ultravioleta-

visible con una gran variedad de finalidades, desde la investigación básica, es decir, el

estudio de la naturaleza de la separación electroforética y los factores que le afectan,

hasta la determinación de estos compuestos en productos farmacéuticos y en medio

biológico.

Los primeros trabajos en separación de sulfamidas y compuestos asociados por

CZE datan de 1993. Ricci y Cross (30) compararon en términos operacionales la “nueva

técnica” con la celebérrima HPLC. Este trabajo, aunque meramente descriptivo, aporta

como ejemplo la separación de un grupo de sulfamidas y sus compuestos asociados por

las dos técnicas. La separación electroforética resultó ser claramente mejor que la
Introducción 17

cromatográfica y también más rápida. En cuanto a los anchos de pico, medidos a la

mitad de la altura, eran 6 veces menores en EC que en cromatografía líquida.

Los mismos autores (31) trabajaron en la separación de 22 sulfamidas y 3

inhibidores de la dihidrofolato–reductasa (DHFRI). Dos de éstos eran los típicos

potenciadores de las sulfamidas, pirimetamina y trimetoprim. Los datos experimentales

obtenidos en las separaciones en términos de movilidad con respecto al flujo

electroosmótico (FEO) se justifican con las estructuras químicas de las moléculas y

sobre todo, con sus pKa. Por lo tanto, el comportamiento tanto de las sulfamidas como

de los DHFRI se relaciona directamente con la diferente ionización que experimentan a

diferentes pH. Igualmente, se estudió y discutió la variación de los tiempos de

migración con la fuerza iónica del tampón y con el voltaje aplicado. Consiguieron

separar 18 de estas drogas, en 22 minutos, utilizando tampón fosfato de pH 7.5 y

aplicando un voltaje de 15 kV. El interés de este trabajo reside en que pone de

manifiesto la estrecha relación existente entre movilidad y pKa, pues no se estudian

aspectos cuantitativos, tales como reproducibilidad, linealidad de respuesta o

sensibilidad. Otra de las conclusiones de este trabajo fue que la puesta a punto de un

método en CZE es más rápido que en cromatografía líquida, aunque también se

menciona el hecho de que cuando existen compuestos neutros entre los analitos, éstos

no se pueden separar por CZE.

La aplicación de la electroforesis capilar en zona tiene una de sus limitaciones en

la magnitud del flujo electrosmótico. Esta limitación fue comprobada

experimentalmente utilizando una mezcla de sulfamidas (32). En este estudio se han

encontrado varias limitaciones en el pH para muchas sulfamidas cargadas

negativamente en presencia de analitos cargados positivamente, como los DHFRI. Las

limitaciones que se manifiestan a bajos pH se deben, bien a que el flujo electroosmótico

18 Introducción

es bajo, una situación que lleva a tiempos de análisis largos, o bien a que la ionización

no es suficiente para la separación entre las sulfamidas y las moléculas neutras. Las

limitaciones que se manifiestan a pH altos se deben, bien a que el flujo electroosmótico

es muy elevado y, por lo tanto, no hay suficiente tiempo para la separación, o bien a que

los grados de ionización de los diferentes analitos son muy similares, lo que hace que se

pierda selectividad por razón de la carga.

En 1994, Yao y Li (33) se fijaron como objetivo evaluar y comparar tres

métodos para determinar coeficientes de difusión por CZE, utilizando como modelo una

mezcla de cinco sulfamidas. La conveniencia de utilizar uno cualquiera de los tres

métodos frente a los otros dos se evaluó en función de la precisión, expresada en

términos de desviación estándar relativa y de la sencillez del procedimiento

experimental.

Un año más tarde, Jing y Cross (34) establecieron la correlación entre la

movilidad electroforética y la relación carga–radio iónico (Z/r), utilizando una mezcla

de 8 DHFRI, entre los cuales se encontraban PMT y TMP. La separación se realizó

aplicando un voltaje de 13 kV y utilizando tampón fosfato de concentración 250 mM

ajustado a pH 2.1. Así demostraron la naturaleza electrostática de la separación

electroforética. Además, a partir de los datos obtenidos, calcularon los pKa de los

compuestos en estudio, lo cual es indicativo de la gran influencia que ejerce el pH sobre

la carga de los analitos.

Los mismos autores (35) utilizaron la separación de nueve sulfamidas para

proponer, teórica y empíricamente, una ecuación que relacionaba la movilidad

electroforética (µef) con la inversa del cuadrado del radio hidrodinámico, cuando,

frecuentemente, la movilidad electroforética aparece como función de la inversa de éste

y no de la inversa de su cuadrado.
Introducción 19

También se comprueba la dependencia de µef con la inversa de la raíz cuadrada

de la fuerza iónica.

Lin y col. (36) introdujeron en 1997 como novedad la separación de 16

sulfamidas en sus formas catiónicas. Para ello, utilizaron tampón citrato de

concentración 500 mM ajustado a pH 2.1, aplicando un voltaje de 30 kV. Los resultados

de este estudio indicaron que el pH y la concentración de tampón eran dos importantes

parámetros de separación. Sin embargo, se reconoce que el pH tiene un efecto mayor en

la selectividad y la resolución que la concentración de tampón. A partir del tiempo de

migración observado, se calcularon las movilidades electroforéticas.

Debido a que a un pH tan ácido, el flujo electroosmótico es muy pequeño y a la

gran concentración de tampón antes mencionada, el tiempo de análisis llega a ser de 50

minutos.

En esta línea se enmarcan una serie de trabajos de Cross y Cao dedicados al

estudio del efecto de la fuerza iónica y del efecto Joule sobre las separaciones

electroforéticas. Una vez más, se utilizó un grupo de sulfamidas como compuestos a

separar. En uno de ellos (37) se utilizaron 5 sulfamidas con diferentes grados de

ionización como tests para el estudio de la modificación en la movilidad electroforética

causada por concentraciones crecientes de tampón fosfato de pH 7 (de 5 a 210 mM). Se

hicieron experimentos para evaluar por separado los efectos que ejercen la fuerza iónica

y la temperatura generada por efecto Joule sobre la ionización.

El efecto de altas concentraciones de tampón fosfato sódico (65 – 210 mM) en la

separación de 23 sulfamidas por electroforesis capilar en zona se examinó a pH 7 y 18

kV (38). En fosfato 65 mM, todos los analitos ionizados (21 de 23 sulfamidas) se

resuelven suficientemente para su monitorización. A altas concentraciones de tampón,

la resolución general mejora claramente dado el efecto salino que, sistemáticamente,

20 Introducción

hace que mejore el espacio de separación. Este efecto es superado progresivamente por

el efecto Joule incrementando las movilidades electroforéticas de los analitos que

migran lejos del detector.

En 1999 (39) clasificaron las sulfamidas en tres grupos, según sus equilibrios de

ionización: el grupo cuya ionización es como la del ácido sulfanílico, el grupo que

forma aniones con doble carga y el resto de las sulfamidas, que siguen la ionización de

la manera habitual (figura 5)

Un método basado en diseño de experiencias para la determinación de

sulfadiacina y pirimetamina, entre otras drogas antimaláricas, fue propuesto por Ng y

Toh (40). El planteamiento del esquema, denominado por sus autores “overlapping

resolution mapping” (ORM), obedecía a que se asumía que las variables químicas que

influían en la separación eran tan solo dos: pH y concentración de bromuro de tetrabutil-

amonio (TBA), que se utiliza para evitar la adsorción de los analitos cargados

positivamente por formación de pares iónicos con las cargas negativas de las paredes

del capilar. Las experiencias se llevaron a cabo aplicando un potencial de 15 kV y

utilizando mezcla de tampones fosfato y borato de concentraciones 0.05 M y 0.025 M

respectivamente. Así, se preparó un diseño factorial de 9 experiencias conforme con el

esquema citado variando simultáneamente el pH y la concentración de tampón. Estas

experiencias determinaron que las condiciones óptimas para la separación eran pH 7.50

y 9 mM de TBA. Posteriormente se comprobó la validez de la predicción realizando la

separación bajo las condiciones seleccionadas como óptimas.

Introducción 21

H H H H
a) + +
H N H H N H N

Ka,1 Ka,2

O S O O S O O S O
O H O- O-

b) - -
H ROOH H ROO H ROO
N N N

Ka,1 Ka,2

O S O O S O O S O

N N -N
H R H R R

c) H
+ H H H H
H N H N N

Ka,1 Ka,2

O S O O S O O S O
-
N N N
H R H R R

Figura 5. Equilibrios de disociación de las sulfamidas tipo a) ácido sulfanílico;

b) formadoras de especies doblemente ionizadas; c) resto de sulfamidas.

22 Introducción

En 1998, Wright y Dorsey (41) propusieron un método basado en la formación

de complejos por transferencia de carga de sulfamidas con Ag (I). Se trabajó en medio

no acuoso, disolviendo AgI en acetonitrilo al 100 %, y utilizando disolución de Ag (I)

35 mM. El voltaje aplicado y la temperatura de separación eran 10 kV y 30 ºC,

respectivamente. La formación de los complejos con Ag (I) mejoró la separación de las

sulfamidas, siendo ésta rápida y con excelentes resoluciones. También se observó que

los datos referentes a migración así como los referidos a selectividad resultaron ser

diferentes a los que se obtuvieron utilizando la misma reacción en medio acuoso.

Aunque no todos los compuestos están resueltos por la línea base en estas condiciones,

se demuestra cualitativamente la viabilidad de las separaciones aprovechando esta

forma de equilibrio químico.

Hows y Perret (42) utilizaron un grupo de 17 sulfamidas para comprobar la

eficacia de un cátodo, diseñado para minimizar el deterioro que se produce en el

electrolito a medida que se van realizando separaciones. El potencial aplicado era 15 kV

utilizando como fase móvil una mezcla de tampones dihidrogenofosfato 30 mM y

borato 10 mM, ajustando el pH a 6.75 con HCl.

Sin embargo, el uso de la CZE aplicado a la determinación de sulfamidas tanto

en productos farmacéuticos como en medio biológico ha sido hasta el momento menos

prolífica que en investigación básica, debido, tal vez, a la incapacidad de la técnica para

separar compuestos neutros, que, no teniendo por qué ser estrictamente sulfamidas, sí

que podrían ser sus potenciadores o sus compuestos asociados (vitaminas,

expectorantes...), los cuales se combinan con ellas habitualmente, según se explicó con

anterioridad.

No obstante, Wainright (43) utilizó capilares sin recubrimiento para la

separación tanto de sulfamidas como de otros antibióticos como penicilinas y

Introducción 23

cefalosporinas. La mezcla de sulfamidas, nueve en total, se consiguió separar en un

electrolito de separación que contenía tampón fosfato 30 mM y borato 10 mM,

ajustando el pH a7.0 y aplicando una rampa de voltaje de 240 V/cm en un capilar de 60

cm de longitud efectiva. Las condiciones optimizadas para la separación de las

penicilinas y de las cefalosporinas se utilizó para su determinación en fármacos,

obteniéndose coeficientes de variación de 1 % en tiempos de migración y 3 % en áreas

de pico. Sin embargo no se presentan aplicaciones para la separación de sulfamidas. Se

llegó a la conclusión de que era viable la utilización de esta técnica para el análisis en

productos farmacéuticos, habida cuenta de las reproducibilidades obtenidas.

En medio biológico, se conocen trabajos en diferentes matrices.

Ackermans y col. (44) determinaron 15 sulfamidas y TMP a pH 7.0 (tampón

fosfato:borato, 0.02 M:0.02 M) en extractos de carne de cerdo mediante un sencillo

pretratamiento consistente en practicar una extracción con acetonitrilo y posterior

centrifugación. A este pH, la matriz no interfiere en la posterior separación. Las

muestras fueron inyectadas hidrodinámicamente durante 10 segundos en un capilar de

50 µm de diámetro interno y 109.75 cm de longitud efectiva. Los límites de detección

estaban comprendidos entre 2 y 9 ppm, asumiendo que en el tratamiento de la muestra

se recuperaba el 100 % de la cantidad existente en ella.

En 1993, Jumppanen (45) y col. utilizaron un capilar de 50 µm de diámetro

interno y 60 cm de longitud efectiva para la monitorización de diuréticos en suero y

orina. Aquellos diuréticos que contienen grupos carboxílicos o sulfamídicos se

separaron a pH 10.6 con ácido 3-(ciclohexilamino)-1-propanosulfónico de

concentración 0.06 M. A este pH, estos diuréticos son aniónicos. El potencial aplicado

fue 25 kV y la temperatura fue de 20 ºC. Los resultados fueron validados frente a un

método de CG-MS. Este trabajo no se refiere a separación de sulfamidas como tales,

24 Introducción

pero sí a compuestos con agrupaciones químicas semejantes, por lo que podría

aprovecharse en la monitorización de estas drogas en muestras biológicas, como suero y

orina.

En esta misma línea, Veraart y col. (46) determinaron sulfamidas en suero y

orina utilizando preconcentración. En este trabajo, se utilizó la misma preparación para

determinar compuestos anfóteros, como las sulfamidas, en suero y orina, poniendo el

énfasis en la preparación, completamente automatizada, de la muestra, lo cual no había

sido descrito con anterioridad. La muestra (8 mL de orina o 1 mL de suero) se hizo

pasar por un cartucho de 50 mg de estireno y divinil-benceno. Se hizo un lavado con 1

mL de agua y 5 mL de acetonitrilo-fosfato 10 mM de pH 3 (20:80, v:v). Posteriormente

se eluyó con 0.7 mL de acetonitrilo. Estas fracciones se introdujeron en el sistema de

separación, constituido por un capilar de sílice fundida de 50 µm de diámetro interno y

de 40 cm de longitud efectiva. Como en otros casos, se utilizó tampón fosfato 20 mM

de pH 7.0 como electrolito de separación, siendo el voltaje aplicado 30 kV. Los límites

de detección fueron 10 – 30 µg/mL en orina y 500 µg/mL en suero. Tanto la

sensibilidad como la reproducibilidad son adecuadas para utilizar este método en

análisis clínico y en estudios metabólicos.

El principal inconveniente que presenta la detección ultravioleta-visible en

electroforesis capilar es que la pequeña longitud de paso óptico limita la sensibilidad,

como ya se ha explicado con anterioridad. Para obviar este problema, se pueden acoplar

equipos de EC a otro tipo de detectores. En algunos casos se ha recurrido a detección

por espectrometría de masas (MS) y en otros casos, a detección electroquímica.

Johansson y col. (47) utilizaron un equipo de EC comercial acoplado a un

espectrómetro de masas con una interfase de ionización a presión atmosférica (API)

para determinar benzodiacepinas y sus metabolitos en orina humana y para caracterizar

Introducción 25

sulfamidas. En el caso de las sulfamidas se utilizó un electrolito de separación

compuesto por acetato amónico 20 mM de pH 6.8 que contenía un 20 % (v/v) de

metanol. La separación se realizó a 26 kV. Se muestran los electroferogramas con

detección óptica y por espectrometría de masas de una muestra de 2 pmol (380 – 680

pg) de cada sulfamida. Se sugiere que el análisis de estas drogas en orina de caballos de

carreras es interesante para el control antidopaje en estos animales, pero no se aporta

ninguna aplicación en este sentido. Además, se utiliza la información estructural que

producía un acoplamiento EC-UV-MS-MS para la caracterización de la sulfametacina.

En este caso, todos los fragmentos esperados para la sulfametacina por MS-MS estaban

presentes comparados con los análisis previos por LC-MS-MS.

En 1992, Perkins y col. (48) compararon la cromatografía líquida capilar a

nanoescala (nCLC) con la CZE, utilizando un espectrómetro de masas de cuadrupolo

como detector, con una interfase de ionización por electroespray (ESI). Estas dos

metodologías se aplicaron a la separación y determinación de un grupo de sulfamidas,

siendo el acoplamiento CZE-ESI-MS más rápido y sensible. En este mismo trabajo se

dice que ambas técnicas proporcionan métodos de análisis complementarios. Los límites

de detección de estas técnicas están alrededor del orden de magnitud de 10-12 moles.

Pleasance y Thibault (49) acoplaron un equipo de electroforesis capilar a un

detector de MS para determinar antibióticos utilizados en la industria de la piscicultura,

entre los que se encontraban sulfamidas y potenciadores (en este caso, TMP). El hecho

de utilizar detección de masas se debe a que los niveles tolerables establecidos por los

organismos reguladores, alrededor de 0.1 ppm, demandaban el desarrollo de métodos de

alta sensibilidad y elevada selectividad. El acoplamiento coaxial de EC con API-MS

proporcionó una interfase más robusta y reproducible que la de unión líquida. En este
26 Introducción

trabajo no se dan límites de cuantificación, pero se dice que se puede confirmar la

presencia de sulfamidas en los niveles requeridos utilizando el acoplamiento EC-MS.

Tomando como base el trabajo anterior, Bateman y Locke (50) utilizaron el

mismo acoplamiento pero con una interfase diferente, de nano-electroespray (51). Para

comparar los resultados de este trabajo con los del anterior, se aplicó la monitorización

del ión característico, en este caso MH+ → 156. Los autores dan un ejemplo de una

muestra de leche a la que se había adicionado 6 sulfamidas en una concentración de 5

ppb. Los límites de detección para todas las sulfamidas estuvieron en el orden de

magnitud de las ppt.

Recientemente, en 1999, se ha propuesto un método para la separación y

determinación de sulfamidas en tabletas por electroforesis capilar en zona con detección

amperométrica (52). En este trabajo se determinan sulfadiacina, sulfametacina y

trimetoprim en preparados farmacéuticos. Se utilizó un capilar de sílice fundida de 75

cm de longitud y 25 µm de diámetro interno donde se inyectó la muestra en modo

electrocinético a 28 kV durante 10 segundos y posteriormente se llevó a cabo la

separación aplicando un potencial de 28 kV. El detector amperométrico consistía en un

disco de carbón de 500 µm de diámetro, que funcionaba como electrodo de trabajo,

polarizado a +1275 mV frente a un electrodo de Ag/AgCl/KCl 3M y un electrodo

auxiliar de platino. El electrolito de separación contenía tampón fosfato 20 mM ajustado

a pH 6.2. Los tres analitos se separaron en menos de 16 minutos y se consiguieron

límites de detección cercanos a 1 µM. Las recuperaciones en los fármacos fueron

cercanas al 100 % en todos los casos.

La introducción de la técnica de cromatografía capilar elecrocinética micelar

(MEKC o MECC) se debe a Terabe y colaboradores (53-55) y tuvo lugar en 1984.

Introducción 27

Supuso un gran avance en EC y actualmente es una de las modalidades más utilizadas

para la separación de moléculas neutras, aunque su aplicación a la separación a los

compuestos cargados también ha demostrado ser de gran eficiencia, especialmente en la

separación de moléculas pequeñas. Este método combina el mecanismo de separación

de la cromatografía con el movimiento electroforético y electroosmótico de los analitos

y de la disolución, según se explica en el apartado dedicado a esta modalidad de la

presente Memoria (pág. 82).

En el análisis de sulfamidas por MEKC se vuelve a constatar que la detección

ultravioleta–visible es la más ampliamente empleada.

En 1992, Fu y col. (56) utilizaron esta técnica para separar un grupo de

vitaminas hidrosolubles, sulfamidas, cefalosporinas y analgésicos antipiréticos. La

separación tenía lugar en un capilar de sílice fundida de 45 cm de longitud y 50 µm de

diámetro interno, utilizando como electrolito de separación tampón fosfato–borato y

dodecilsulfato sódico como agente micelar. Los autores proclaman como conclusión el

gran futuro que tiene esta técnica en el área del análisis de medicamentos.

En este sentido, ese mismo año, Dang y col. (57) propusieron la separación de

siete sulfamidas y trimetoprim en un capilar de 50 cm de longitud y su determinación en

tabletas que los contenían. Las separaciones se realizaron a 12 kV. Se utilizó tampón

fosfato-borato 25 mM ajustado a pH 8.5, SDS 100 mM como agente micelar y TBA 10

mM como modificador. Se analizaron medicamentos que contenían bien la mezcla

binaria SMX-TMP o bien la mezcla ternaria SMX-SMT-TMP. Las recuperaciones

fueron, en todos los casos, cercanas al 100 %.

En nuestros laboratorios se ha estudiado la determinación de sulfamidas y sus

compuestos asociados por MEKC en productos veterinarios (58). Se puso a punto un

método para la determinación de sulfaquinoxalina, sulfametacina, pirimetamina y

28 Introducción

menadiona utilizando un capilar de sílice fundida de 57 cm de longitud y 75 µm de

diámetro interno. El electrolito de separación estaba compuesto por tampón borato 30

mM ajustado a pH 9.2, SDS 40 mM como agente micelar y acetonitrilo al 6% como

modificador orgánico. Los límites de cuantificación se estimaron alrededor de 1 mg/L

para todos los componentes. Lo más llamativo de este estudio fue que los resultados

encontrados en las aplicaciones a productos veterinarios no se correspondían con los

valores etiquetados en la mayoría de ellos, tanto en el aspecto cualitativo como en el

cuantitativo.

También se ha aplicado esta técnica al análisis de sulfamidas en comestibles,

pero más recientemente. Así, en 1997 se optimizó un método para la separación

simultánea de sulfamidas, DHFRI y antibióticos beta-lactámicos (59). La separación

tiene lugar en un capilar de sílice fundida de 60 cm de longitud y 50 µm de diámetro

interno. El electrolito de separación estaba compuesto por tetraborato sódico 20 mM

ajustado a pH 8.5 y SDS 100 mM. Estas condiciones se obtuvieron por medio de un

determinado diseño de optimización, que permite una considerable reducción de las

separaciones requeridas, del tiempo que se emplea y de la generación de datos que

pueden ser analizados estadísticamente para proporcionar información de las

interacciones entre parámetros experimentales, que se pueden utilizar en posteriores

separaciones.

En 1995, Ozaki et al. (60) pusieron a punto un método en el que se acoplaba la

MEKC con MS, utilizando un surfactante de alto peso molecular e ionización por

electroespray como interfase. La separación se llevó a cabo utilizando tampón formiato

amónico 10 mM de pH 7, que contenía 10 % de metanol y 1 % de surfactante (v:v).

Este sistema se aplicó a la separación de una mezcla de 5 sulfamidas. Se comparó la

Introducción 29

separación con un detector UV frente a la del sistema MEKC-ESI-MS, siendo la

primera mejor que la segunda en términos de resolución.

Un grupo de drogas antimaláricas y sus metabolitos fueron determinados junto

con pirimetamina, por CZE a pH bajos y por MEKC a pH altos (61). En este trabajo se

utilizó la técnica de amplificación de campo en CZE con buenos resultados. También se

examinó el efecto que tenía la inyección de la muestra en un disolvente orgánico, como

el metanol. Este tipo de disolventes favorecen el “stacking” de los analitos, resultando

de ello una disminución en los límites de detección. El método fue aplicado a la

determinación de algunas de estas drogas en orina, entre las que se encuentra la

pirimetamina.

En 1996, Wrigth y col. (62) aprovecharon que las sulfamidas son capaces de

formar complejos lábiles con Ag (I) para establecer dos métodos, uno por CZE y otro

por MEKC para la separación de 5 y 9 sulfamidas respectivamente. En ambos métodos

se utilizó un capilar de sílice fundida de 47 cm de longitud y 50 µm de diámetro interno.

La separación por CZE se llevó a cabo aplicando un potencial de 20 kV y utilizando

como electrolito una disolución tampón de acetato de pH 4, que contenía 80 mM de

AgNO3 y un 15% de acetonitrilo. Para la separación por MEKC se seleccionó como

óptimo un electrolito compuesto por una disolución tampón de ácido 4-(2-hidroxietil)-

1-piperacinetanosulfónico (HEPES) ajustada a pH 7, que contenía 25 mM de AgNO3 y

25 mM de SDS como agente micelar.

Por otra parte, Lin y col. (63) estudiaron la separación de un grupo de 13

sulfamidas por CZE y MEKC. En este trabajo, meramente cualitativo, se concluye que

el orden de migración de las sulfamidas en CZE depende de la relación carga/masa y de

los valores de pKa. En MEKC, se demostró que el orden de migración venía

30 Introducción

determinado por el pKa y por las constantes de formación de las asociaciones sulfamida-

micela.

También se han utilizado ciclodextrinas en el análisis de sulfamidas con la

misma finalidad que se utiliza el SDS en MEKC. Las ciclodextrinas (64) son unas

dextrinas obtenidas a partir del almidón mediante la acción de un enzima procedente de

microorganismos del género Bacillus. Estos enzimas son las

ciclodextrinaglucosiltransferasas, que son capaces de romper la estructura de la amilosa

y ocasionar su ciclación. Hay ciclodextrinas α, β y γ, según sean 6, 7 u 8 las moléculas

de glucosa que formen el ciclo. Análogamente, se han obtenido derivados de ellas. Las

glucosas que forman parte de las ciclodextrinas disponen hacia el interior los grupos

alcohólicos secundarios provocando la existencia de una cavidad con carácter

hidrófobo. Los grupos alcohólicos primarios quedan dispuestos hacia el exterior y, en

ese caso, tienen carácter hidrófilo. Debido a estas características las ciclodextrinas

permitirán la solubilización de sustancias con carácter hidrófobo en medios acuosos

consiguiendo su estabilización.

Las ciclodextrinas se pueden emplear como selectores quirales en EC

(65). Cuando los enantiómeros entran en la ciclodextrina interaccionando con ella puede

suceder que uno de ellos presente menor movilidad electroforética que otro porque haya

formado un complejo más estable con la ciclodextrina. La conclusión que se extrae es

que el tamaño de la cavidad de la ciclodextrina es crucial para la separación.

Para el caso del análisis de sulfamidas, se ha utilizado únicamente β-

ciclodextrina (β-CD) con el fin de eluir los compuestos neutros. Se han publicado

trabajos aplicados tanto a investigación básica como a productos farmacéuticos y a

muestras biológicas utilizando mayoritariamente la detección ultravioleta-visible.

Introducción 31

Figura 6. Estructura de las ciclodextrinas

Un método basado en diseño de experiencias para la determinación de ocho

sulfamidas, fue propuesto por Ng y col. (66, 67). El planteamiento del esquema fue del

tipo “overlapping resolution mapping” (ORM), que estos mismos autores ya habían

empleado en trabajos anteriores (40). En este caso, se asumía que las variables que

influían en la separación eran tan solo dos: pH y concentración de β-CD. Así, se preparó

un diseño factorial conforme con el esquema citado y se hicieron nueve experiencias

preliminares, variando simultáneamente el pH y la concentración de β-CD. Estas

experiencias determinaron que las condiciones óptimas para la separación eran pH 6.5 y

2 mM de β-CD. Posteriormente se comprobó la validez de este método realizando la

separación.

En 1999 se propuso un método para la separación de sulfanilamida,

sulfametacina, sulfameracina, sulfadiacina, sulfametizol y sulfafurazol por EC (68). Las

muestras se inyectaban en un capilar recubierto de 50 cm de longitud y 50 µm de

diámetro interno y se separaban a 15 kV con un electrolito compuesto por una mezcla

equimolar de tampones fosfato y borato 50 mM de pH 6.4, que contenía 2 mM de β-

32 Introducción

CD. Se obtuvo un límite de detección de 1 ppm para la sulfameracina y una respuesta

lineal a la concentración entre 1 y 50 ppm.

En cuanto a aplicaciones en productos farmacéuticos podemos citar el trabajo de

Ng y col. que, en 1993, separaron una mezcla de siete sulfamidas utilizando EC con β-

CD como modificador (69). Se discute la influencia de la concentración de β-CD y del

pH sobre la migración de las sulfamidas. Las condiciones óptimas de separación fueron

la utilización de tampón fosfato:borato (0.05 M ambos) de pH 7 y 10 mM de β-CD,

aplicando un voltaje de 15 kV.

En este trabajo se utiliza la β-CD para formar complejos de inclusión con las

sulfamidas que no están cargadas al pH de la separación, pero no para separar isómeros.

Se aplicó este método para la determinación de sulfadiacina y trimetoprim en fármacos

diferentes. Las recuperaciones estuvieron entre el 95 y 100 % y las desviaciones

estándar relativas alrededor del 1.2 %.

Por lo que se refiere a aplicaciones en medio biológico, Lin y col. (70)

propusieron un método para separar 13 sulfamidas en leche. Utilizaron la técnica de

CZE en capilares de sílice fundida de 44 cm de longitud y 50 µm de diámetro interno.

La separación se llevaba a cabo a 20 kV y 25 ºC utilizando fosfato:borato (50mM

ambos) de pH 6.85. En este trabajo se demuestra que la adición de ciertos

modificadores, entre los que está la β-CD en concentración 0.5 mM, permite la

resolución de los picos de sulfatiazol y sulfametoxipiridacina en el seno de una rápida

separación de las trece sulfamidas. También se calculan las constantes de formación de

los complejos de inclusión formados por las sulfamidas con las ciclodextrinas.

Por comparación de un electroferograma obtenido de una muestra de leche

desproteinizada y otra muestra, también de leche desproteinizada pero dopada con

sulfamidas, se puede ver que los picos de las sulfamidas no están afectados por la
Introducción 33

matriz, por lo que se indica que se podría aplicar este método para el análisis de estas

sulfamidas en leche. Sin embargo, no se dan datos cuantitativos al respecto.

Determinación de sulfamidas y metabolitos.

Otro aspecto fundamental en el problema de la determinación de sulfamidas y

potenciadores en medio biológico es que éstas pueden sufrir reacciones en el interior de

los organismos vivos para dar lugar a otros compuestos similares denominados

metabolitos.

Las reacciones metabólicas más frecuentes en el campo que nos ocupa son las de

acetilación y las de hidroxilación de estos compuestos. Así, para el análisis en medio

biológico hay que tener en cuenta que podemos encontrar el principio activo sin

modificar coexistiendo con su correspondiente metabolito o metabolitos.

La dificultad de trabajar en medio biológico debido a las interferencias de la

matriz hace que, en muchas ocasiones haya que recurrir a tratamientos de la muestra

previos a la separación propiamente dicha, con el objeto, bien de eliminar interferentes

o bien de concentrar los analitos.

Otra dificultad añadida es la obtención de los metabolitos. Estos productos no

suelen constar en los catálogos comerciales de los principales fabricantes y es necesario

solicitarlos a empresas que trabajan directamente con ellos en investigación. Cuando

esto no es posible, hay que recurrir a la síntesis en el laboratorio, lo cual no garantiza la

pureza del producto.

Tal vez por estas razones, los trabajos circunscritos a este área sean menos

numerosos que los concernientes a sulfamidas y compuestos asociados en general.

34 Introducción

En este sentido, aunque las técnicas de separación constituyen una poderosa

herramienta para los fines propuestos, la bibliografía recoge pocos trabajos referentes a

la determinación de estos metabolitos por estas técnicas. Se da la circunstancia de que

en ninguno de estos trabajos citados ha sido utilizada la electroforesis capilar, sino que

la técnica separativa más ampliamente utilizada ha sido la cromatografía líquida de alta

resolución.

L. Nordholm y L. Dalgaard (71) propusieron un método para determinar TMP en

presencia de sus productos de degradación, en orina, utilizando una columna LiChrosorb

RP-18, una fase móvil compuesta por hidrógenosulfato de tributilamonio en acetonitrilo-

dihidrógeno fosfato de pH 7.5 (17:3) y detección UV a 254 nm, que fue comparada con

detección electroquímica a 700 mV, usando un electrodo de referencia de Ag/AgCl. En

ambos casos los límites de detección alcanzados fueron de 0.1 mg/L.

B. Conway (72) describió un procedimiento para la extracción y posterior

determinación de sulfametacina en alimentos para animales, utilizando una columna de

tipo C18, una mezcla de acetato amónico (con un 3% de ácido acético):acetonitrilo:agua

(6:9:25) como fase móvil y con detección a 272 nm. Poco después J. Houglum y col. (73)

propusieron un nuevo método para la extracción y separación de SMT en alimentos de

animales. Este autor propone, previamente, una extracción con metanol, una posterior

separación utilizando una columna C18 y fase móvil compuesta por metanol-ácido acético

con 0.1% de cloruro de tetrabutilamonio (1:4). La detección se lleva a cabo midiendo la

absorbancia a 280 nm. En 1987, N. Haagasma y col. (74) propusieron un nuevo método

para la determinación de SMT y sus N-acetil y amino metabolitos en tejidos animales. Este

método implicaba la extracción de los compuestos de interés. Concretamente, se hizo una

extracción con dicloruro de metilo y una posterior preconcentración sobre una columna de
Introducción 35

sílice (para SMT y el N-acetil derivado) y en un cartucho de fluorisil (para el amino

derivado).

E. Ishikuro, en 1989 (75) propuso un método para la determinación de SQX en

alimentos utilizando, tras extracción con dimetilformamida, una columna C18, un detector

UV que medía la absorbancia a 252 nm y una fase móvil compuesta por metanol-tampón

fosfato de pH 7 en proporciones (7:13). Anteriormente, en 1984, J.C. Eppel y col. (76)

habían determinado sulfaquinoxalina y su N-acetil derivado en muestras de plasma y de

orina utilizando las mismas condiciones.

L. Pou Clave y col. (77) y N.E. Basci y col. (78) propusieron en 1990 sendos

métodos para la determinación, en sangre, de sulfametoxazol y de sulfametoxazol en

presencia de sus metabolitos, respectivamente. Ambos autores procedieron, primeramente,

a una desproteinización de la muestra con ácido perclórico, el primero, y con ácido tricloro

acético, el segundo, utilizando posteriormente una columna C18 y detección UV para llevar

a cabo la determinación. Los intervalos de respuesta lineal estaban comprendidos entre 3 y

500 mg/L y entre 3 y 200 mg/L, respectivamente. Por su parte, Basci comparó los

resultados obtenidos por el método propuesto con los obtenidos utilizando el método de

Bratton-Marshall, encontrándose altos coeficientes de variación en el método

colorimétrico, con respecto a los encontrados por HPLC, para pequeñas concentraciones

de metabolito.

Malish y col. (79) propusieron un método por HPLC con detección por barra de

diodos en línea para la determinación de sulfamidas, entre las que estaban SMT y su N4-

acetilmetabolito, nitrofuranos y algunos antiparasitarios.

Se utilizaron dos métodos cromatográficos diferentes. En uno de ellos se

utilizaba una columna RP-18, con un tamaño de partícula de 5 µm que tenía 250 mm de

longitud y 4.6 mm de diámetro. La fase móvil estaba compuesta por tampón de pH 4.8 y
36 Introducción

acetonitrilo:agua y se aplicaba un gradiente que viene detallado en el trabajo. El caudal

de fase móvil era 1.5 mL/min y la temperatura del horno, 40 ºC. En el otro caso, se

utilizó una columna capilar RP-18 con un tamaño de partícula de 3 µm que tenía una

longitud de 120 mm y 2 mm de diámetro. Se utilizó la misma fase móvil que en el caso

anterior, pero con un gradiente diferente. El caudal de fase móvil era 0.5 mL/min y la

temperatura del horno, 45 ºC. Se obtuvo como resultado que el uso de la cromatografía

capilar produce tiempos considerablemente más cortos, ahorro de disolventes, picos

más estrechos y posiblemente una mejor separación de las interferencias.

Excepto para la sulfanilamida, todos los límites de detección y determinación

fueron encontrados por debajo de 100 µg/kg, que es el nivel de tolerancia que la Unión

Europea fijó para drogas de origen sulfamídico en todos los tejidos y en leche (80).

De todas las sulfamidas de polaridad intermedia estudiadas, sulfatiazol tendía a

tener recuperaciones del 80 %, cuando las del resto eran próximas al 100 %. Esto se

debe a que el sulfatiazol puede asociarse con azúcares reductores, formando bases de

Schiff en un primer paso (81). De todas maneras, los datos que se presentan están dentro

de los requerimientos de la Unión Europea en términos de recuperaciones y precisión.

Ya en 1990, Rychener y col. (82) determinaron residuos de sulfamidas y sus N4-

metabolitos en carne, hígado y riñones por HPLC. Lógicamente, hubo de optimizarse un

procedimiento de extracción de los compuestos antes de su separación. En este caso, se

sometió a extracción una muestra de 10 g con 40 mL de acetona. El sobrenadante se

filtró y el residuo sólido se volvió a someter a extracción con otros 40 mL de acetona.

Los dos extractos se juntaron y se les adicionó 60 mL de HCl 0.125 M. Para eliminar las

grasas, se extrajo con hexano (2 × 50 mL). A la fase acuosa se le adicionó una alícuota

de 10 mL de tampón acetato de pH 5.2 y se extrajo con acetato de etilo dos veces, una

con 40 mL y otra con 60 mL, sucesivamente. Los extractos se juntaron nuevamente y se

Introducción 37

evaporaron a 45 ºC y 180 mbar hasta obtener 2 mL de extracto. Seguidamente se

evaporaron con 15 mL de etanol a 50 ºC y 40 mbar hasta sequedad y el residuo

resultante se disolvió en diclorometano. Esta disolución se hizo pasar por una columna

de silica gel desactivada por elución con 40 mL de acetona-diclorometano (3:2) y el

eluido, tras adición de 100 µL de una disolución de una sulfamida al 0.002 % como

patrón interno, se evaporó a 45 ºC y 300 mbar. El residuo se disolvió en 0.3 mL de

disolución hidroalcohólica al 50 % para la separación cromatográfica. La columna

utilizada fue una Superspher 100 RP-18 de 12.5 cm de longitud y 4 mm de diámetro,

adaptada a una precolumna Lchrospher 10 RP-18 de 4 mm de longitud y 4 mm de

diámetro. Ambas columnas estaban rellenas con partículas de 5 µm de diámetro. La fase

móvil empleada estaba compuesta por tampón acetato de pH 4.0 y acetonitrilo en

proporción 81:19, siendo el caudal de fase móvil 2 mL/min. Asimismo, también se

utilizó como columna cromatográfica una Nucleosil 5SA de 20 cm de longitud y 4 mm

de diámetro con partículas de 5 µm de tamaño en su interior. En este caso, se utilizó un

caudal de 1.5 mL/min de una fase móvil compuesta por una mezcla 1:1 de acetonitrilo

al 18 % en agua y una disolución que contenía tampón fosfato y acetonitrilo en

proporción 21:4, y ajustada a pH 2.0. En ambos casos, la detección se llevó a cabo con

barra de diodos en línea a 270 nm. Las recuperaciones obtenidas iban del 50 al 80 %,

mientras que los límites de detección estuvieron entre 50 y 100 ppb.

En 1992, T. Okamura y col. (83) determinaron sulfametoxazol y su N-acetil

derivado en orina utilizando una extracción de fase sólida. Así, los compuestos de interés

fueron extraídos de la orina utilizando dos cartuchos Sep-pak C18 conectados en serie y el

extracto fue analizado por HPLC con detección UV.

R. Van der Hoeven (84), en 1982, propuso un método para la determinación de

sulfametoxazol, sulfametacina y de sus metabolitos N-acetilados en suero. Para ello

38 Introducción

procedió a la desproteinización de la muestra con HClO4 y utilizó una columna

µBondapak RP C18 para llevar a cabo la separación de los analitos. K. Rona y col. (85) en

1988, determinaron conjuntamente sulfasalacina, sulfapiridina y sus metabolitos acetilados

e hidroxilados en fluidos biológicos utilizando una extracción con posterior elución en un

cartucho de Sep-Pak C18, una columna C18 y detección a 254 nm.

Endoh, Takahashi y Nishikawa realizaron la determinación de sulfamidas, sus

N4-acetil metabolitos y cocidiostáticos diaminopirimidínicos en tejidos de pollo (86).

Concretamente, los compuestos estudiados eran sulfamonometoxina, sulfadimetoxina,

sulfaquinoxalina, sulfadiacina y sulfametoxazol, sus N4-acetil metabolitos y los

coccidiostáticos diaverdina, ormetoprim y trimetoprim. Se determinaron por HPLC en

una columna de acero inoxidable de 25 cm de longitud y 4.6 mm de diámetro de

Nucleosil 5 C18 con una fase móvil que contenía tampón fosfato 10 mM y acetonitrilo

en una proporción 41:9 cuando se ajustaba a pH 5 o 17:3 cuando se ajustaba a pH 5.9,

siendo el caudal 1 mL/min. El esquema de preparación de la muestra involucra

extracción de los tejidos con acetonitrilo, lavado del extracto con hexano, lavado en una

columna de alúmina de 30 cm de longitud y 15 mm de diámetro y elución con

H2O:MeCN (85:15) o H2O:MeOH (50:50). El extracto de acetonitrilo se analizó con

cloranfenicol como patrón interno, con una fase móvil de pH 5 y detección a 240 nm. El

extracto de metanol se analizó con acetanilida como patrón interno con una fase móvil

de pH 5.9 y detección a 270 nm. Los trece analitos dieron respuesta lineal a la

concenteración entre 0.1 y 50 µg/mL, lo que equivale a 0.02 – 10 µg/g en tejido. Los

límites de detección iban de 0.02 a 0.05 µg/mL.

Furusawa y Mukai propusieron en 1994 un método para la determinación

simultánea de residuos de sulfamonometoxina, sulfadimetoxina y sus N4-acetil

metabolitos en alimentos de origen animal (87). Se estudió en carnes de vacuno, cerdo,

Introducción 39

pollo y en huevos. Se realizó un tratamiento de la muestra basado en la extracción con

25 mL de acetonitrilo al 90 % y 20 mL de hexano y posterior centrifugación a 2100 g

durante 10 minutos. Tras la correspondiente filtración, se repetía la extracción dos veces

más y se juntaban los sobrenadantes. Esta fase líquida se secaba sobre sulfato sódico

anhidro y se volvía a filtrar. El filtrado resultante era el que se hacía pasar por una

columna de alúmina de 30 cm de longitud y 15 mm de diámetro interno. Así, las

sulfamidas y sus metabolitos se eluían con 20 mL de acetonitrilo al 90 %. Tras llevar a

sequedad, el residuo se disolvió en 1 mL de fase móvil y se inyectaron 20 µL en la

columna cromatográfica del tipo RP-18. La fase móvil estaba formada por tampón

fosfato 0.5 M de pH 5 y acetonitrilo en proporción 3:1 y el caudal era 1 mL/min. La

detección se realizó a 270 nm. En estas condiciones, los compuestos objeto de este

estudio se separaron en 12.4 minutos. Aplicando este procedimiento se obtuvieron unos

límites de detección de 0.01 ppm para todos los compuestos. Las recuperaciones de

todas las muestras fueron superiores al 80 % con desviaciones estándar relativas que

oscilaban entre 0.4 y 5 %.

También se han utilizado otro tipo de detectores diferentes al ultravioleta-visible

para aumentar la sensibilidad. Von Baer y col. (88) determinaron sulfamidas y sus N4-

acetilmetabolitos en suero y orina por cromatografía líquida utilizando detección

amperométrica. Los N4-acetilderivados fueron sintetizados basándose en el

procedimiento descrito por Vree y col. (89). La pureza de los productos se comprobó

por espectroscopia infrarroja y resonancia magnética nuclear y también por HPLC y

detección visible-ultravioleta. En este caso, el pretratamiento de la muestra es más

sencillo que en los casos anteriores, aunque igualmente necesario. Las muestras de

suero u orina se mezclaban con tampón fosfato 0.2 M de pH 3.0, y se hacían pasar por

una columna Extrelut 1, eluyendo con diclorometano. El extracto se evaporó hasta

40 Introducción

sequedad y el residuo se disolvió en la fase móvil. Porciones de la solución se

analizaron por HPLC en una columna RP18 Superspher de 12.5 cm de longitud y 4 mm

de diámetro con un relleno cuyo tamaño de partícula era 4 µm. La fase móvil que se

utilizó fue metanol:fosfato 67 mM ajustado a pH 6.7 en proporción 1:3 (v:v). El caudal

de la fase móvil era 1 mL/min. Se utilizó detección amperométrica a 1.00 y 1.25 V

frente a un electrodo de Ag/AgCl. Las rectas de calibrado resultaron ser lineales entre

0.15 y 8 mM y los límites de detección fueron de 10 a 30 nM, es decir, alrededor de 2.5

ppb.

En 1994, Balizs y Benesch (90) compararon la determinación de cuatro

sulfamidas y sus N4-acetil metabolitos en tejido muscular utilizando cromatografía

líquida con detección ultravioleta y espectrometría de masas. Desarrollaron un método

por LC-MS que validaron para el análisis de sulfatiazol, sulfadiacina, sulfameracina y

sulfametacina y sus N4-acetilmetabolitos en músculo de cerdo tratado previamente con

un complejo polisulfamídico, que contenía las cuatro drogas. El proceso de

pretratamiento requería extracción con cloroformo-acetona, seguido de extracción en

fase sólida con cartuchos de sílice Sep-Pak. Paralelamente, se validó un método de

cromatografía líquida y detección ultravioleta-visible utilizando el mismo

procedimiento para el pretratamiento. A los tejidos se les adicionaron concentraciones

de estas drogas en un intervalo comprendido entre 20 and 100 µg/kg. Como patrón

interno se utilizó sulfametacina marcada con 13C. Las muestras se analizaron mediante

LC-MS con termoespray. Los límites de detección llegaron a ser inferiores a 25 µg/kg y

los límites de cuantificación para la mayoría de las sulfamidas se estimaron en torno a

100 µg/kg. Las muestras reales se analizaron por los dos métodos de cromatografía

líquida y se encontró que las concentraciones de las sulfamidas eran similares. Sin
Introducción 41

embargo el método de LC-MS resultó más conveniente para análisis confirmatorios

debido a su especificidad.

Recientemente, en 1999, Roenn y col. (91) han propuesto un método por HPLC

para la determinación de cotrimoxazol (TMP:SMX, 1:5) en niños tratados de malaria.

El método arroja unos límites de detección de 0.1, 1 y 1 µg/mL para trimetoprim,

sulfametoxazol y su acetilsulfametoxazol, respectivamente.

Habida cuenta de la gran variedad de procedimientos analíticos para la

determinación de sulfamidas y sus metabolitos por HPLC, en la siguiente tabla se

enumeran, a modo de resumen, los diferentes métodos comentados.

Tabla 2. Determinación de sulfamidas y sus metabolitos por HPLC

Ref. Compuestos Muestra Columna Detección

71 TMP y productos de degradación Orina RP-18 UV-Vis
72, 73 SMT Alimentos para animales C18 UV-Vis
74 SMT y N-Acetil y aminometabolito Tejidos animales C18 UV-Vis
75 SQX Alimentos C18 UV-Vis
76 SQX y N-Acetilmetabolito Plasma y orina C18 UV-Vis
77 SMX Sangre C18 UV-Vis
78 SMX y metabolitos Sangre C18 UV-Vis
79 SMT y N4-acetilmetabolito RP-18 y UV-Vis
RP-18
capilar
82 Sulfamidas y N4-Acetilmetabolitos Carne, hígado y riñones RP-18 y UV-Vis
Nucleosil
5SA
83 SMX y N-Acetilmetabolito Orina C18 UV-Vis
84 SMX, SMT y N-Acetilmetabolitos Suero RP C18 UV-Vis
85 SSC, SPR e hidroxi y acetil metabolitos Fluidos biológicos C18 UV-Vis
86 SMM, SDM, SQX, SDC, SMX y Tejidos de pollo C18 UV-Vis
N4-Acetilmetabolitos
87 SMM, SDM y N4-Acetilmetabolitos Carne de vacuno, cerdo, RP-18 UV-Vis
pollo y huevos
88 Sulfamidas y N4-Acetilmetabolitos Suero y orina C18 Amperom.
90 STZ, SDC, SMR, SMT y Músculo de cerdo C18 UV-Vis y
N4-Acetilmetabolitos Masas
91 TMP, SMX y Acetil-SMX Niños con la malaria

La otra técnica de separación empleada para la determinación de sulfamidas y

sus metabolitos ha sido la cromatografía de gases.

42 Introducción

La determinación de sulfamidas por cromatografía de gases acoplada a detección

por emisión atómica fue realizada por Chiavarino y col. (92) en 1998. Este trabajo

describe el uso de la detección por emisión atómica (AED) (93) para la determinación

simultanea de nueve sulfamidas, separadas por cromatografía de gases concvencional,

una vez convertidas en sus N1-metilderivados. El detector de emisión atómica se basa en

un plasma de helio inducido por microondas donde los analitos se transforman en

átomos, iones y radicales en diferentes estados de excitación. Cuando se desactivan,

emiten fotones que se detectan por medio de un espectrómetro, produciendo un espectro

de emisión elemental. La intensidad de varias líneas puede registrarse simultáneamente

para generar una serie de varios cromatogramas específicos. En bibliografía se están

encontrando cada vez más aplicaciones de CG-AED (94,95). Se tomaron nueve

sulfamidas y se convirtieron en sus respectivos N1-metil derivados por tratamiento con

diazometano. Estos derivados fueron determinados por CG en una columna de sílice

fundida de 12.5 m de longitud y 0.22 mm de diámetro interno. Se utilizó He como gas

portador (1.5 mL/min) y un programa de temperatura desde 75 ºC hasta 290 ºC a 20

ºC/min. La identificación y cuantificación simultánea se logró con el uso de un detector

de emisión atómica. Las rectas de calibrado fueron lineales entre 3 y 80 mg/L de

sulfamida. La determinación de sulfamidas fue posible con el uso de 2-amino-

benzotiazol como patrón interno. La capacidad del detector de emisión atómica se

comparó con las detecciones por FID y MS. Se menciona el hecho de que el detector

FID no da más información de la identidad química del analito que la basada en el

tiempo de retención. CG-MS ofrece como principal ventaja la identificación cualitativa

de los analitos gracias a su espectro de masas. Sin embargo, la determinación

cuantitativa de sulfamidas está limitada por falta de linealidad en la respuesta, con

desviaciones que dependen del compuesto específicamente. El método podría aplicarse

Introducción 43

a la determinación de sulfamidas y sus metabolitos en muestras biológicas, sin embargo,

no se muestra ninguna aplicación en este sentido.

Utilizando esta técnica, Matusik y col. (96) determinaron

desaminosulfametacina, sulfametacina y N4-acetilsulfametacina con detector de captura

electrónica y posterior confirmación con detección por espectrometría de masas. En este

caso, las sulfamidas se extrajeron de muestas procedentes de carne de ternera y tejidos

de ganado porcino con cloroformo:acetona. Tras el proceso de extracción al que se

somete a la muestra y previo a la separación, se propone una derivatización de los

analitos, metilándolos con diazometano como reactivo. Una vez realizada la

derivatización, se inyectaron las muestras en una columna de vidrio de 6 pies de

longitud y 2 mm de diámetro. La separación se llevó a cabo operando a 280 ºC ó 288

ºC, cuando se utilizaban N2 o Ar-CH4, respectivamente, como gases portadores, en el

caso de la detección por captura electrónica. Los intervalos de linealidad para la

desaminosulfametacina, N4-acetilsulfametacina y sulfametacina derivatizadas fueron de

0.08 a 3.0 ppm, de 0.02 a 3.0 ppm y de 0.05 a 0.5 ppm, respectivamente. La

identificación fue realizada por medio de la detección por ionización química y

espectrometría de masas.

Determinación de sulfamidas, potenciadores y sus productos de degradación.

Los productos de degradación son aquellos que se forman a partir de los

productos principales debido a reacciones químicas. Las causas de la aparición de

productos de degradación pueden ser múltiples.

1. Envejecimiento de los productos principales

2. Conservación en ambientes húmedos o no protegidos de la luz

44 Introducción

3. Hidrólisis de los productos principales

4. Reacciones químicas entre varios de estos productos principales.

5. Alteración de las condiciones de conservación, especialmente temperatura y

pH

6. Acción bacteriana

La acción de alguno de estos factores o de la combinación de varios de ellos

hace que aparezcan estos subproductos. En el caso de las sulfamidas, al ser éstas

altamente estables en un amplio intervalo de pH, es difícil que a partir de cualquiera de

ellas se pueda generar un producto de degradación extremando las condiciones de

acidez o basicidad. Así, es necesaria la acción de varios factores de los anteriormente

citados para que se produzca la degradación de este tipo de compuestos. Sin embargo,

no por ello hay que dejar de considerar la importancia que la aparición de estos

productos puede tener, de cara al control de la calidad en la industria farmacéutica,

donde las sulfamidas continúan utilizándose como agente terapéutico.

En esta memoria se ha abordado, concretamente, el problema de la

determinación de los productos de degradación que podrían generarse en fármacos que

contienen una de las combinaciones más ampliamente utilizadas de sulfamida y

potenciador, como es la combinación entre sulfametoxazol y trimetoprim.

En bibliografía se han encontrado pocas referencias que estudien este problema

analítico. Sin embargo merece la pena destacar alguna de ellas. Así en 1986, Deshpande

y col. (97) utilizaron la cromatografía en capa fina para proponer un método de

separación para varias drogas y antibióticos, entre los que se encontraban

sulfametoxazol, trimetoprim y 3,4,5-trimetoxibenzaldehído, que es uno de los productos

de degradación de trimetoprim. Se utilizó un analizador Iatrosan TH-10 equipado con

Introducción 45

Chromarods S II como fase estacionaria y detección por ionización en llama. Las fases

móviles utilizadas fueron ácido acético al 1%-metanol (4:1) para la separación de

trimetoprim y sulfametoxazol y diclorometano-metanol-amoníaco (80:19:1) para la

separación de sulfametoxazol y 3,4,5-trimetoxibenzaldehído. Se dan los valores de RF.

Por otra parte, Cho y Gemperline (98) utilizaron un método de reconocimiento

por espectroscopia en el infrarrojo cercano, que aplicaron a sulfametoxazol y a mezclas

de éste con sus principales productos de degradación.

Moore y Brouwer (99) monitorizaron por HPLC la estabilidad de

sulfametoxazol y trimetoprim en suero analizando la influencia de la temperatura en un

amplio intervalo, de –20 a 37 ºC.

Bergh y Breytenbach centraron su estudio en la degradación de trimetoprim

(100). Así, idearon un método por HPLC y detección ultravioleta-visible para la

separación de éste y cinco de sus principales productos de degradación en tabletas, con

el fin de monitorizar la estabilidad del trimetoprim. La degradación del trimetoprim se

consiguió calentando la materia prima a reflujo en medio ácido o exponiendo

suspensiones de trimetoprim en varias disoluciones reguladoras a la luz directa del sol.

Estas tabletas se disolvieron en etanol al 95 %, se filtró la disolución y se diluyó. La

disolución resultante se inyectó en el sistema cromatográfico. Se utilizó como fase

móvil una mezcla de agua-tetrahidrofurano-propanol-metanol-acetonitrilo-ácido acético

(31:25:20:15:5:1) y la detección se realizó a 271 nm. Con este procedimiento se separó

el TMP de cinco de sus principales productos de degradación, sin que otros compuestos

habitualmente presentes en estas tabletas interfirieran, como por ejemplo

sulfametoxazol, metil 4-hidroxibenzoato y propil 4-hidroxibenzoato. El método es

indicador de la estabilidad del trimetoprim porque ninguno de los productos de

degradación interfirieron en el pico de éste. En este trabajo se da la recta de calibrado

46 Introducción

para el trimetoprim en presencia de sus productos de degradación, sin embargo no se

dan datos acerca del intervalo de linealidad ni de la sensibilidad del método.

En esta línea, estos mismos autores mejoraron su método para determinar el

trimetoprim en presencia de los cinco productos de degradación (101). La mejora

consistió en que se utilizó una columna de acero inoxidable de 25 cm de longitud y 4.6

mm de diámetro de Partisil ODS-3 (10 µm de diámetro) porque, mientras que el método

anterior estaba libre de interferencias por los productos de degradación, cuando se

utilizaba una columna para estudios cinéticos en muestras que contenían trimetoprim en

varias disoluciones reguladoras, se observaba una clara distorsión del pico. La fase

móvil contenía disolución de acetato amónico de pH 6.9 y acetonitrilo al 25 % en

proporción 3:1. La detección se realizó a 254 nm para que no se produjeran

interferencias en la determinación de trimetoprim en tabletas o suspensiones. El

intervalo de linealidad fue de 1 a 500 ppm y las recuperaciones obtenidas fueron

superiores al 99 %.

En el año 1993, Smyth y Chabala (102) se enfrentaron al serio problema de la

estabilidad de estas drogas, ya sean como materias primas o como formulaciones,

debido a que se almacenan a temperaturas más altas y durante más tiempo de lo que

sería conveniente. Además, pueden comprarse bastante más baratas e importarse con

una pureza menor que la deseada. Este trabajo investiga acerca de problemas que se

pueden encontrar en el análisis orgánico relacionados con estabilidad de las drogas,

como es el caso de trimetoprim y sulfamidas que se asocian con él para potenciar su

actividad. Se comparan métodos para la resolución de los problemas analíticos que se

plantean. Por polarogarfía diferencial de pulso (DPP), se encontró que, además del pico

del trimetoprim, se observaban tres picos más, que se asignaron a diferentes productos

de degradación. En este caso, se encontró que el método por DPP era suficientemente
Introducción 47

selectivo para la detección de impurezas y productos de degradación del trimetoprim.

Por otro lado, se propuso un método por HPLC, utilizando una columna Supercosil

LC18 de 25 cm de longitud y 4.6 mm de diámetro, rellena con partículas de 5 µm de

diámetro. La fase móvil era metanol:agua (70:30, v:v) y la detección se realizaba a 254

nm. Aplicando este método se logró determinar la sulfamida que acompaña al

trimetoprim, generalmente sulfametoxazol, pero no los productos de degradación de

éste. Desgraciadamente no se dan resultados cuantitativos.

Como ya se ha comentado, la reducción de la primera sulfamida, el prontosil

rubrum, que produce su escisión, puede darse en otras sulfamidas cualesquiera puesto

que sus estructuras químicas son muy similares entre sí y están sujetas a reactividades

parecidas, de tal manera que, si esta reducción se produce antes de que la azorreductasa

actúe sobre la sulfamida, la sulfanilamida aparecerá como un producto secundario de la

sulfamida, es decir, un producto de degradación.

El hecho de que todas las sulfamidas puedan reducirse o degradarse para generar

sulfanilamida hizo que fijásemos nuestra atención en aquellos procesos degradativos no

enzimáticos que pudieran producir esa reacción. Como se ha explicado anteriormente,

son varios los factores que pueden afectar a la estabilidad de un analito en el seno de

una disolución y cuando algunos de ellos se combinan, pueden dar lugar a que parte de

nuestro analito sufra un proceso degradativo que hay que conocer y evaluar.

Por lo tanto, el problema que se plantea es la determinación de sulfamidas y sus

productos de degradación, orientada al análisis rutinario del control de calidad de

preparados farmacéuticos. Según lo expuesto anteriormente, sea cual sea la sulfamida

que se incluya como principio activo en el fármaco, siempre va a existir la posibilidad

de encontrar sulfanilamida como producto de degradación.

48 Introducción

Concretamente, hemos centrado nuestra investigación en una de las

combinaciones más utilizadas en la práctica farmacéutica, como es la combinación

sulfametoxazol-trimetoprim y hemos prestado especial atención a los trabajos que

aparecen en bibliografía relativos a la determinación de sulfametoxazol en presencia de

sulfanilamida, ya como una sulfamida más, ya como producto de degradación.

Uno de ellos es el de Robinson y col. (103), que, sobre la base de un trabajo

anterior de Cobb y Hill (104), elaboraron un método por HPLC en fase normal para el

estudio del sulfametoxazol y su determinación en fármacos. Prepararon dos tipos de

tabletas de 500 y 1000 mg de sulfametoxazol y además adicionaron excipientes muy

comunes en la industria farmacéutica, como lactosa, ácido esteárico y lauril sulfato de

sodio. El estudio se hizo en colaboración entre ocho laboratorios diferentes que

analizaron las mismas tabletas por el mismo método. El procedimiento utilizado

consistió en extraer el sulfametoxazol de las tabletas con metanol y adicionar

sulfameracina como patrón interno. La columna analítica era de acero inoxidable de

250 mm de longitud y 4.6 mm de diámetro, rellena con partículas de 5 µm de diámetro.

La fase móvil estaba compuesta por isooctano:diclorometano:2-

propanol:acetonitrilo:ácido acético en proporciones 70:25:5:5:0.5. El caudal de fase

móvil era 2 mL/min y la detección se realizaba a 254 nm. En conjunto, los resultados

obtenidos muestran que la exactitud y la precisión del método propuesto son

satisfactorias aparte de las variaciones registradas en el equipo cromatográfico

comercial empleado en cada laboratorio. La respuesta del detector fue lineal hasta 3.0

µg de sulfametoxazol inyectado. Las recuperaciones estuvieron entre 98 y 102 %.

En lo que se refiere a determinación de impurezas, únicamente se cita la

posibilidad que tiene este método para resolver una mezcla de sulfametoxazol en

presencia de sus productos de degradación, sulfanilamida y ácido sulfanílico, generados

Introducción 49

por hidrólisis en medio ácido. Según se indica, esto se conseguiría incrementando las

proporciones de 2-propanol y de acetonitrilo de la fase móvil en un 50 %, por ejemplo,

un incremento desde 5 partes hasta 7.5 u 8 partes de cada uno. Bajo estas condiciones,

el tiempo de retención de la sulfanilamida es de 20 minutos, aunque con ligera pérdida

de resolución para la separación del compuesto principal y del estándar interno.

En el trabajo de Li (105) se propone un método para la determinación de

sulfametoxazol, sulfadiacina y trimetoprim por HPLC en fase inversa, utilizando

sulfanilamida como patrón interno. El método se aplicó en preparados farmacéuticos de

amplio uso. Se utilizó una fase móvil compuesta por tampón fosfato de pH 7 y

concentración 50 mM y metanol en proporción 102:33 (v:v). el caudal de fase móvil era

1 mL/min y la detección se realizaba a 240 nm. Las recuperaciones estuvieron en todos

los casos cercanas al 100 %.

Una de las reacciones más características de las sulfamidas que, además, se ha

utilizado para su determinación es la reacción de diazotación y posterior acoplamiento

con el reactivo de Bratton-Marshall, es decir, el dihidrocloruro de N-(1-

naftil)etilendiamia (NED). Esta reacción, combinada con detección espectrofotométrica

ha sido uno de los procedimientos más populares (figura 7)

NH2 +
N N NH CH2 CH2 NH2

NaNO2 NED

pH = 1
SO2 SO2 N N SO2 NH R
NH NH
R R

Figura 7. Diazotación de sulfamidas y acoplamiento con dihidrocloruro de

N-(1-naftil)etilendiamia.
50 Introducción

En el trabajo de García Álvarez y col. (106) se pone a punto un método

cromatográfico en fase inversa para la determinación de sulfamidas en preparados

farmacéuticos previa derivatizacion pre-columna para formar el colorante azoico con

NED, donde se utiliza dodecil sulfato sódico y pentanol como eluyente micelar. La

derivatización pre-columna mejoró la resolución en los cromatogramas e incrementó la

selectividad en la determinación de mezclas de sulfamidas en presencia de otras drogas.

La reacción de derivatización se realizaba en un medio micelar de SDS a pH 1 y ello

llevaba a un procedimiento simple y rápido para el control de este tipo de compuestos

en preparados farmacéuticos. Aunque se estudiaron ocho sulfamidas, comentaremos

solamente los datos obtenidos para sulfametoxazol y sulfanilamida. Se estudió la

repetibilidad para disoluciones de dos concentraciones diferentes, 1 y 20 ppm. Se

encontró que la precisión de la respuesta de la sulfanilamida era peor que la del

sulfametoxazol en ambos casos (2.6 y 1.4 % frente a 6.3 y 4.3 % para 1 y 20 ppm de

sulfametoxazol y sulfanilamida, respectivamente). Por otra parte, se hizo un estudio de

las recuperaciones en mezclas sintéticas binarias y ternarias de distintas sulfamidas así

como en productos farmacéuticos. En el caso de la mezcla binaria de sulfametoxazol y

sulfanilamida, así como en los medicamentos que las contienen, las recuperaciones

fueron próximas al 100 % y las áreas de pico presentaron desviaciones estándar

relativas nunca superiores al 2.6 %.

La determinación de compuestos en medio biológico suele implicar un

tratamiento de la muestra antes de su análisis. Este tratamiento puede constar de varias

etapas y se puede llegar a perder parte del analito de nuestro interés por fenómenos

como la coprecipitación, entre otros.

Long y colaboradores (107-110) demostraron que, mezclando material biológico

con material de empaquetamiento de las columnas C18, se puede preparar una columna
Introducción 51

de la cual eluir los analitos de interés de una manera selectiva. Basándose en este

principio, propusieron la primera aplicación de la metodología de dispersión en fase

sólida de la matriz (MSPD) para la extracción rápida de un grupo de sulfamidas en

muestras de leche, su posterior separación por HPLC y su cuantificación con detector de

barra de diodos en línea (111). Entre esas sulfamidas se encontraban sulfametoxazol y

sulfanilamida. En este trabajo, las muestras de leche se ponían en contacto con el

material C18 en un simple mortero, donde se agitaba todo hasta su completa

homogeneización y se adicionaba sulfameracina como patrón interno. La matriz

resultante se metía en una jeringa y se comprimía hasta alcanzar un volumen de 4.5 mL.

Esta “columna resultante” se lavó primero con 8 mL de hexano. Seguidamente, las

sulfamidas se eluyeron con 8 mL de diclorometano. Este extracto se llevó a sequedad y

posteriormente se volvió a disolver en metanol:ácido fosfórico 17 mM (1:4, v:v). Tras 5

minutos en ultrasonidos, la disolución se centrifugó a 13600 g durante 5 minutos y se

filtró el sobrenadante para su inyección en el sistema cromatográfico. Se utilizó una

columna derivatizada con octadecilsilano y una fase móvil compuesta por ácido

fosfórico 17 mM y acetonitrilo en una proporción 90:10 (v:v). El caudal de fase móvil

cambió de 1 a 2 mL/min a partir de t = 5 min. Los límites de detección estuvieron entre

31.25 y 62.5 ng/mL, según la sulfamida. Sin embargo, las recuperaciones obtenidas

fueron algo bajas, 73.1 y 89.4 % para sulfanilamida y sulfametoxazol, respectivamente.

Es evidente que la cromatografía líquida es ideal para la separación de

sulfamidas por el gran poder de separación que proporciona esta técnica. Sin embargo,

cuando el objetivo es la determinación de bajas concentraciones de las mismas, la

detección ultravioleta-visible no es suficiente. Una manera de mejorar la sensibilidad

sería utilizar reacciones de derivatización para hacer que las sulfamidas presenten
52 Introducción

fluorescencia. Concretamente, para la determinación de sulfametoxazol, se ha descrito

una reacción con o-ftalildialdehído (OPA) en combinación con β-mercaptoetanol (ME)

utilizando análisis por inyección en flujo (112). Sobre esta base, los mismos autores

propusieron en 1996 (113) la separación de un grupo de sulfamidas, entre las cuales se

encontraban sulfametoxazol y sulfanilamida, utilizando cromatografía líquida en fase

inversa. La separación se llevó a cabo utilizando un gradiente de fase móvil, compuesta

por acetonitrilo:agua. La columna analítica era de acero inoxidable y tenía 15 cm de

longitud y 0.46 de diámetro interno y estaba rellena de partículas con un tamaño de 5

µm. También se utilizó una precolumna empaquetada con la misma fase estacionaria.

En cuanto al detector, las longitudes de onda de excitación y de emisión fueron 302 y

412 nm, respectivamente. La derivatización post-columna utilizando OPA y ME se

realizó con una bomba peristáltica, un célula de flujo, tubos de politetrafluoroetileno de

0.8 mm de diámetro y varias conexiones.

Figura 8. Esquema del montaje para la determinación de sulfamidas utilizando

derivatización post-columna. P = bomba de HPLC; V = válvula de inyección; PC =

pre-columna; CA = columna analítica; BP = bomba peristáltica; R = reactor; T =

termostato electrónico; D = fluorímetro; O = ordenador; W = desecho.

El procedimiento se aplicó a diferentes tipos de alimentos, como tejidos, huevos

y leche. Este método presenta la ventaja de que el tratamiento de la muestra previo a la

Introducción 53

separación no necesita muchos pasos, simplemente dos extracciones sucesivas con

ácido tricloracético y posterior inyección de la muestra en el cromatógrafo. Por su parte,

la linealidad, precisión y recuperación fueron satisfactorios.

Los límites de detección para sulfanilamida y sulfametoxazol estuvieron en

torno a 50 µg/kg para tejido, leche y huevos, cuando, como ya se ha comentado, la

Unión Europea ha adoptado para las sulfamidas un nivel residual máximo de 100 µg/kg

en comestibles de origen animal (114).

Sin embargo, Stoev y Michailova (115) obtuvieron unos límites de detección por

debajo de 1 µg/kg utilizando un método por HPLC con derivatización precolumna por

reacción con fluorescamina.

El tratamiento propuesto para la muestra era sencillo, como en el caso anterior.

Las sulfamidas se aislaron de la carne o del riñón, primero con acetato de etilo y

después con acetona. Se juntaron las fases orgánicas y se evaporaron a vacío a 50 ºC. El

residuo se disolvió en agua y, tras 1 minuto de ultrasonidos, se sometió a tres

extracciones sucesivas con cloruro de metileno. Las fases orgánicas se mezclaron y se

llevaron nuevamente a sequedad. El residuo se disolvió en 0.25 mL de fluorescamina al

0.1 % en acetona y 0.25 mL de K2HPO4 1 M para su posterior inyección en el sistema

cromatográfico. Se utilizó una columna analítica de 25 cm de longitud y 4 mm de

diámetro, rellena con partículas de 5 µm de diámetro. Se utilizó una fase móvil,

compuesta por acetonitrilo:agua (35:65, v:v), de pH 3.0, que contenía 0.01 M de

K2HPO4 y cuyo caudal era 1.5 mL/min. Las longitudes de onda de excitación y de

emisión se fijaron a 405 y 490 nm, respectivamente. Aunque las recuperaciones no

fueron buenas (54–87 %), el límite de detección, estimado como concentración

resultante de una relación señal-ruido de 5, fue 0.05 µg/kg. Análogamente, se estimó

que el límite de cuantificación para las sulfamidas en carne era 0.2 µg/kg. Únicamente
54 Introducción

para sulfaquinoxalina era 1 µg/kg. Estos límites de cuantificación mejoraron bastante

los que se habían descrito hasta el momento (116, 117) y desde luego, son mucho

menores que el nivel residual mínimo que tiene adoptado la Unión Europea.

Agbaba y col. (118) describieron un método densitométrico simple, exacto y

rápido para la determinación simultánea de cotrimoxazol (SMX:TMP, 5:1) y trazas de

sus impurezas en fármacos por cromatografía en capa fina (CCF). La separación

cromatográfica se llevó a cabo en placas de 20 × 10 mm recubiertos con una capa de

250 µm de sílica gel 60, en las cuales se aplicó 1 µL tanto de muestras como de

patrones. El desarrollo de las placas se hacía con cloroformo-n-heptano-etanol (9:9:9,

v:v:v) a una distancia de 90 mm. Cada placa albergaba 14 muestras y 5 patrones. El

detector densitométrico se fijó a 260 nm. Los calibrados fueron ajustados a un

polinomio de segundo grado y cubrían unos intervalos de 500-2500 ng y 100-500 ng

por inyección para sulfametoxazol y trimetoprim, respectivamente. Los límites de

detección para sulfanilamida y ácido sulfanílico fueron 4.5 y 4.1 ng/µL,

respectivamente, lo que equivale a nivel de impurezas del 0.01 %, y los límites de

cuantificación fueron 13.5 y 12.4 ng/µL, respectivamente, lo que equivale a nivel de

impurezas del 0.03 %. Los límites de cuantificación para sulfametoxazol y trimetoprim

fueron estimados en 19 y 16 ng/µL, respectivamente.

Anteriormente, en 1985, Tammiletho (119) utilizó la cromatografía en capa fina

de alta resolución para la determinación de sulfametoxazol y trimetorprim en

preparados farmacéuticos, utilizando sulfanilamida como patrón interno. También se

utilizó detección densitométrica, pero en este caso no se dieron límites de detección y de

cuantificación, sino recuperaciones para estas drogas en los respectivos medicamentos,

siendo éstas cercanas al 100 %.

Introducción 55

Además de las técnicas de separación se han utilizado otras técnicas

instrumentales para la determinación de sulfametoxazol en el seno de un grupo de

sulfamidas en presencia de sulfanilamida, ya sea ésta como analito o como producto de

degradación.

Se han descrito algunos métodos espectrofotométricos para tal propósito. En uno

de ellos, se utiliza la espectrofotometría diferencial, basada en la utilización de

diferentes espectros de absorción correspondientes al mismo compuesto, obtenidos a

dos pH diferentes (120). Este método se aplicó en la determinación de las mezclas

binarias de sulfamidas sulfametoxazol-sulfaquinoxalina y sulfatiazol-sulfametoxazol.

Además, se realizó la determinación de sulfametoxazol, sulfaquinoxalina y sulfatiazol

en presencia de sulfanilamida adicionando una cantidad constante de ésta (6.6 µg/mL) a

muestras que contenían diferentes cantidades de sulfamidas. Las recuperaciones fueron

en la mayoría de los casos cercanas al 100 %.

Punta Cordero y col. (121) llevaron a cabo la determinación extracto-

espectrofotométrica de ácido sulfanílico y un grupo de sulfamidas en productos

farmacéuticos con 1,2-naftoquinona-4-sulfonato de potasio.

Narita y col. (122) determinaron sulfametoxazol utilizando una reacción de

diazotación de aminas seguida de acoplamiento, a pH 4.4, con 2,4,6-triaminopirimidina

al 0.1 % y oxidación del resultante derivado azoico a un triazol fluorescente mediante el

uso de N-bromosuccinimida al 2 % en NaOH como oxidante. Así, obtuvieron un límite

de detección de 40 ng/mL y un intervalo de linealidad de 0.04 a 1 µg/mL. Se sugiere

que el método podría ser empleado en la determinación de sulfanilamida y

sulfaguanidina, pero debido a que esta reacción de derivatización no es selectiva, no se

podría realizar la determinación de uno de estos compuestos en presencia de otro

aplicando este método.

56 Introducción

Yao y col. (123) aprovecharon la buena respuesta que dan las sulfamidas en su

forma de sal cuaternaria como especies electroactivas frente a los electrodos de

membrana para la determinación de algunas de ellas. En lo que concierne al

sulfametoxazol, el límite de detección se estimó en 10 µM.

Mann y col. (124) emplearon la espectroscopia Raman para la determinación de

componentes minoritarios en sólidos incoloros de alta pureza. Muestras de

sulfametoxazol que contenían ácido sulfanílico y sulfanilamida como impurezas se

utilizaron como tests. Los límites de detección encontrados fueron estimados en torno a

1 g/kg.

Por último, en 1992, Nie y col. (125) realizaron la determinación de

sulfanilamida, sulfacetamida, sulfadiacina y sulfametoxazol mediante un sensor

piezoeléctrico. El método se aplicó en tabletas y en soluciones oftálmicas, estando los

resultados de acuerdo con los proporcionados por los métodos de la farmacopea.

Introducción 57

INTRODUCCIÓN A LA ELECTROFORESIS CAPILAR

La electroforesis capilar (EC) es una técnica relativamente nueva para la

separación y análisis de compuestos químicos que está siendo utilizada cada vez más

por analistas de los campos de la química analítica y bioquímica. Una revisión de los

artículos publicados en los últimos años sobre la misma, muestra un crecimiento

exponencial en el número de artículos existentes, lo que refleja la expansión y

aceptación de la técnica.

La EC complementa otras técnicas de separación, como son la cromatografía

líquida de alta resolución (HPLC o LC), la cromatografía de gases (CG) y la

electroforesis en gel (EG). Algunos de los métodos usados en HPLC y EG podrían

adaptarse a EC debido a sus ventajas, entre las que se incluyen la alta eficiencia y las

rápidas separaciones, las columnas baratas y la larga vida, la pequeña cantidad de

muestra requerida y el bajo consumo de reactivos.

Además, la EC puede ser aplicada para la separación de una gran variedad de

muestras como son compuestos polares iónicos, polares no iónicos, así como

compuestos apolares y no iónicos. También se puede aplicar al análisis de biomoléculas

de altos pesos moleculares.

La mayoría de los artículos iniciales trataron los aspectos teóricos de los

principios de la EC. En la actualidad la EC es considerada como una técnica exacta,

precisa y un método independiente de análisis y es utilizada de forma rutinaria en la

industria, en la Universidad y en laboratorios gubernamentales.

Sin embargo, al ser una técnica de reciente implantación, no existen demasiados

libros publicados sobre ella si la comparamos con los escritos en HPLC.

58 Introducción

Definición de electroforesis y principios generales de la técnica

La electroforesis ha sido definida como el movimiento diferencial de especies

cargadas eléctricamente en un medio líquido conductivo, normalmente acuoso, bajo la

influencia de un campo eléctrico. La descripción de los principios de la electroforesis se

remontan al siglo antepasado, cuando Kohlrausch (126) obtuvo las ecuaciones básicas

de la migración de un ion en disolución de electrolito en 1897.

Fue introducida como técnica de separación por Tiselius en 1937 (127), cuando

situó una muestra de proteínas entre dos disoluciones tampón en un tubo y, aplicando

posteriormente un campo eléctrico, encontró que los componentes de la muestra

migraban en una dirección a una velocidad que dependía de la magnitud y del signo de

sus cargas y de sus respectivas movilidades. Gracias a este trabajo, Tiselius recibió el

premio Nobel. Este autor llevó a cabo su experimento en una disolución libre, lo cual

limitaba mucho la eficiencia de la separación, debido fundamentalmente a la difusión

térmica y a la convección. Con el fin de suprimir la convección producida por efecto

Joule, la electroforesis se empezó a realizar en medios anticonvectivos, como papeles y

geles de poliacrilamida y agarosa. Desde entonces la EG ha sido una técnica

ampliamente utilizada para la separación de macromoléculas biológicas, tales como

proteínas y ácidos nucleicos. Sin embargo, la EG generalmente presenta problemas

derivados de bajas eficiencias, altos tiempos de análisis, dificultades en la

automatización y detección. Además de ser muy laboriosa, el consumo de reactivos y

de tiempo es elevado e incluso pueden darse interacciones entre la muestra y la matriz

del gel que pueden afectar a la separación.

Debido a estos problemas, se hicieron algunos intentos para llevar a cabo la

electroforesis en disolución libre sin la necesidad de un medio estabilizante que

Introducción 59

eliminara la convección. Una alternativa fue la utilización de tubos finos o capilares.

Así Hjerten, en 1967, llevó a cabo la primera separación electroforética utilizando un

tubo abierto de cristal de cuarzo de un diámetro interno de 1-3 mm y recubierto

internamente con metilcelulosa para prevenir la electroósmosis (128). La convección

fue reducida haciendo rotar el tubo alrededor de su eje longitudinal. La detección fue

realizada con un detector UV que registraba a lo largo del tubo. Esta técnica de

electroforesis en zonas libres fue aplicada a una gran variedad de muestras entre las que

se incluyen proteínas, ácidos nucleicos o incluso virus.

Posteriormente, a mediados de 1970, Everaerts y colaboradores (129)

desarrollaron la isotacoforesis capilar en tubos abiertos de diámetro submilimétrico

basándose en lo que se ha venido a llamar efecto anticonvectivo de la pared que se

ocasiona como consecuencia de la alta capacidad de disipación de calor que se obtiene

en los tubos de pequeño diámetro interno debido a la alta proporción entre la superficie

de disipación y el diámetro interno del capilar. Además, estos autores usaron tubos de

teflón en lugar de tubos de vidrio, lo cual tenía como ventaja la eliminación del

fenómeno de electroósmosis, que podía perturbar la separación por isotacoforesis

capilar. A partir de aquel momento se han venido fabricando equipos instrumentales

para esta técnica, sin embargo el interés por la misma ha sido escaso en comparación

con otras.

En 1974, Virtanen (130) llevó a cabo experiencias por electroforesis en zona

utilizando tubos de vidrio de 200-500 µm de diámetro interno utilizando detección

potenciométrica. Algunos años después, Milkers, Everaerts y Verhgeen (131) realizaron

separaciones por electroforesis capilar en zona utilizando tubos de teflón de un diámetro

interno de 200 µm de diámetro interno y un detector conductimétrico. Con este montaje,

consiguieron separar y detectar 16 pequeños iones en 10 minutos.

60 Introducción

Los estudios anteriores demuestran que los principios generales de la

electroforesis capilar en zona son conocidos hace mucho tiempo. Pero hasta la década

de los 80 los dos principales problemas quedaban sin resolver; por un lado, la baja

sensibilidad de los sistemas de detección y por otro, el fenómeno de electroósmosis.

En el año 1981, Jorgenson y Luckacs describieron separaciones utilizando por

primera vez un tubo capilar de diámetro menor que 100 µm como celda electroforética

(132). Esto les permitió realizar separaciones usando los mismos principios que en la

electroforesis convencional, pero con mayor rapidez y eficiencia (133). En lugar de

intentar suprimir el fenómeno de la electroósmosis usando capilares eléctricamente

inertes, aprovecharon este fenómeno que se genera en capilares de pequeño diámetro

interno para mover los analitos a lo largo del capilar con mucha menor dispersión de la

que se observa en cromatografía líquida. Además, describieron las relaciones existentes

entre los parámetros operacionales y la calidad de la separación demostrando el

potencial de la técnica. Desde ese momento tan solo transcurrieron ocho años hasta la

aparición del primer instrumento comercial de electroforesis capilar y, de entonces acá,

se ha desarrollado exponencialmente el uso de esta técnica. Este hecho queda reflejado

en la gran cantidad de monografías sobre EC (134-138) y en el número de publicaciones

en revistas científicas que utilizan esta técnica como principio de separación (139-142),

que supera los 6000 (Analytical Abstracts, 1980-2000). En los siguientes años se

llevaron a cabo algunas innovaciones en cuanto a los sistemas de detección y al

desarrollo de algunas subtécnicas de la electroforesis capilar en zona que la han

conducido a ser una poderosa técnica de separación, especialmente para compuestos

biológicos y farmacológicos.
Introducción 61

TEORÍA DE LA ELECTROFORESIS

Aspectos teóricos de la electroforesis capilar

La separación por EC se basa en la diferencia de velocidad de los solutos en el

seno de un campo eléctrico. Para comenzar vamos a considerar la migración de un

compuesto cargado en el seno de una disolución de electrolito a dilución infinita, donde

no tengan lugar interacciones iónicas.

Si aplicamos un campo eléctrico homogéneo, el compuesto cargado i es

acelerado por una fuerza (Fe) proporcional al campo eléctrico aplicado (E)

Fe = qi E

Debido a que el ion se encuentra en un medio acuoso, que tiene una viscosidad

(η), la fuerza de rozamiento (Fr) que se opone a su movimiento dependerá de una

constante (k), de la viscosidad del medio (η) y de la velocidad de migración del ion en

el medio (vi).

Fr = k η vi

De acuerdo con la ley de Stokes la constante k puede ser sustituida por 6πr para

una partícula esférica. Para partículas no esféricas y pequeños iones, el valor numérico

es inferior a 6.

Fr = 6πri η vi

donde ri es el radio del ion solvatado o, en este caso, hidratado.

62 Introducción

Si la aceleración causada por la fuerza eléctrica (Fe) es compensada por la fuerza

de rozamiento se alcanzará un estado de equilibrio en el que las fuerzas serán iguales y

de sentido contrario y el ion se moverá con una velocidad constante vi.

Fr = Fe

q
vi = E
6πrη

De acuerdo a la ecuación anterior, la velocidad de migración del ion es

directamente proporcional al campo eléctrico aplicado. A este factor de

proporcionalidad se le denomina movilidad electroforética absoluta del ion (µe) que se

puede expresar como:

qE
v 6rπ η q
µe = i = =
E E 6rπµ

Es decir, que para un determinado ion, la movilidad electroforética absoluta sólo

depende de la viscosidad del medio. Hemos de destacar que tanto la velocidad como la

movilidad electroforéticas pueden ser positivas o negativas dependiendo del signo de la

carga del ion. De esta ecuación se deduce que pequeñas partículas altamente cargadas,

tienen altas movilidades electroforéticas y viceversa.

En la práctica se trabaja en presencia de otras especies en la disolución de

electrolito. Las interacciones electrostáticas a las que se ve sometido un ion en la

disolución de electrolito afectan a la movilidad electroforética de dicho ion. Estos iones

en disolución se rodean de contraiones de carga opuesta, que crean una atmósfera

iónica. Para considerar estos efectos sobre la movilidad, se cambia la carga teórica del

ion por una carga efectiva (menor) del ion y el radio hidrodinámico del ion por el radio

efectivo del mismo, incluyendo su atmósfera de contraiones. Así, obtenemos una

Introducción 63

movilidad efectiva que depende no sólo de la viscosidad del medio sino también de las

interacciones iónicas que ocurren en disolución.

Como consecuencia, la movilidad efectiva será siempre inferior a la movilidad

absoluta calculada anteriormente.

Para determinar la movilidad electroforética es necesario conocer el tiempo que

tarda la molécula desde que es introducida en el capilar hasta su llegada al detector. A

este tiempo se le llama tiempo de migración y depende directamente de la longitud del

capilar e inversamente de la movilidad electroforética y del campo eléctrico aplicado.

Si sólo se considerase la movilidad electroforética, no se explicaría

completamente el comportamiento migratorio dentro del capilar, ya que dicho

comportamiento depende también del flujo electroosmótico (143-145).

El fenómeno de electroforesis y el flujo electroosmótico.

El flujo electroosmótico (FEO) o electroósmosis es un fenómeno básico en todas

las separaciones y se produce al aplicar un voltaje a un sistema líquido que está en

contacto con una superficie cargada. Generalmente, los capilares se fabrican de sílice

fundida, si bien, materiales no iónicos, como el teflón, también exhiben flujo

electroosmótico, que resulta probablemente de la adsorción de aniones sobre la

superficie.

Cuando la sílice está en contacto con una disolución acuosa, su superficie se

hidroliza para dar lugar a grupos silanol. Estos grupos pueden estar cargados

positivamente como SiOH2+, neutros SiOH o tener carga negativa como SiO-

dependiendo del pH de la disolución acuosa. Los contraiones, cationes en la mayoría de

los casos, tienden a ser adsorbidos en la pared por atracciones de tipo electrostático para
64 Introducción

compensar el defecto de cargas. Se forma así, según el modelo de Stern, una doble capa

rígida de iones adsorbidos y a la que se superpone una doble capa difusa de iones.

Este sistema de doble capa origina un potencial eléctrico en la interfase entre la

pared y la disolución de electrolito. El potencial de la doble capa rígida decrece

linealmente con la distancia, mientras que el potencial de la doble capa difusa, conocido

como potencial zeta, lo hace exponencialmente.

Cuando se aplica una diferencia de potencial a lo largo del capilar, los cationes

que forman parte de la doble capa difusa son atraídos hacia el cátodo y como éstos están

solvatados, arrastran en su movimiento al resto de la disolución que hay en el capilar

hacia el cátodo. Si bien el punto exacto de la ionización de la sílice fundida es difícil de

determinar, se ha observado que el flujo electroosmótico comienza a tener un valor

significativo a partir de pH 4.

Los beneficios del flujo electroosmótico

El principal efecto beneficioso del FEO es el hecho de que se consigue un perfil

de velocidades plano, lo cual se traduce en picos estrechos.

La magnitud del flujo electroosmótico puede ser expresada en términos de

movilidad o velocidad.
εζ
v FEO = E; v FEO = µ FEO E
4πη

ε: constante dieléctrica del electrolito ζ: potencial zeta

η: viscosidad de la disolución E: campo eléctrico aplicado

Introducción 65

a) Perfil plano b) Perfil laminar

Figura 9. Perfil de velocidades del FEO según el régimen del flujo.

Mientras que el FEO normalmente es beneficioso para la separación, éste

necesita ser controlado, puesto que valores elevados pueden producir la elución de los

compuestos antes de que se produzca la separación o bien valores muy bajos pueden

conducir a tiempos de análisis elevados o incluso que no eluyan determinados

compuestos. Así, los parámetros que nos van a permitir el control del flujo

electroosmótico son:

1. Campo eléctrico. Al aumentar éste, aumenta la velocidad del FEO como se

describe en las ecuaciones.

2. El pH del tampón de separación. Ajustando el pH se puede actuar sobre la

carga de la pared del capilar. Cuanto más altos sea el pH, habrá mayor desprotonación

de los grupos silano y mayor densidad de carga por lo que el potencial zeta será mayor

y como consecuencia aumenta la µFEO y la vFEO. A pH neutro, el FEO ya es capaz de

arrastrar todas las especies al cátodo.

3. Fuerza iónica o concentración del tampón. Ésta afecta al espesor de la doble

capa ya que al aumentar la concentración de iones disminuye el espesor de la doble capa

difusa. Como consecuencia el potencial zeta también disminuye y en definitiva el FEO

es menor (146).
66 Introducción

4. Adición de disolventes orgánicos. Influyen sobre la viscosidad de la

disolución y sobre el potencial zeta. Metanol, etanol e isopropanol, en concentraciones

de 10 a 20 % reducen el FEO, sin embargo, el acetonitrilo ha demostrado producir el

efecto contrario (146).

5. Temperatura. Provoca cambios en la viscosidad del electrolito (de un 2 a 3%

por grado centígrado) haciendo que aumente la velocidad del FEO al aumentar la

temperatura.

6. Adición de polímeros neutros hidrofílicos. Se adsorben sobre la pared del

capilar disminuyendo la FEO y también aumentan la viscosidad por lo que su acción se

ve intensificada.

7. Recubrimiento interno del capilar. Se realiza con compuestos que se enlazan

de forma covalente a su superficie y el resultado es la supresión del FEO.

Una vez estudiados los principios teóricos de la electroforesis, así como los del

FEO y los factores de que depende, vamos a suponer un sistema constituido por dos

electrodos y un capilar de sílice fundida relleno de electrolito de pH básico (9.2) y en el

cual se ha introducido, en el extremo en contacto con el ánodo, una muestra constituida

por cationes, aniones y especies neutras.

Si se aplica una diferencia de potencial entre ánodo y cátodo, los iones migrarán

a lo largo del capilar con una determinada velocidad electroforética que dependerá de la

relación q/r de cada ion, obteniéndose finalmente un electroferograma como el que se

muestra en la figura 10.

Introducción 67

+ FEO - -
+

Se
ña

Tiempo de migración

Figura 10. Electroferograma tipo para una disolución que contiene aniones,

cationes y especies neutras

Los aniones de menor tamaño tienen mayor velocidad electroforética que los de

mayor tamaño, por eso oponen mayor resistencia al FEO y tardan más tiempo en eluir.

Los compuestos neutros avanzan todos juntos a igual velocidad electroforética que es la

velocidad del FEO. Los cationes se ven impulsados por el FEO y como los más

pequeños son los que tienen mayor velocidad electroforética serán los primeros en salir

y los mayores los últimos en salir. Así, el tiempo necesario para ser eluido un ion viene

determinado por su movilidad y por la del FEO.

La movilidad aparente de un ion se define como

µ A = µ i + µ FEO

y puede ser obtenida a partir de su tiempo de migración y otros parámetros

experimentales.
VA l lL
µA = = =
E t m E t mV

l: longitud del capilar desde el extremo de la inyección hasta el detector.

L: longitud total del capilar tm: tiempo de migración V: voltaje aplicado

68 Introducción

Puesto que la movilidad del FEO es fácilmente calculable usando un marcador

neutro (DMSO, acetona, fenol, metanol) a partir del electroferograma se puede extraer

rápidamente la movilidad efectiva de un determinado ion:

µ i = µ A − µ FEO

También se puede poner en función de los tiempos de migración como:

1 1 L
µ li =  − 
 t m t mm  V

donde tmm es el tiempo de migración del marcador.

Hay que destacar que los aniones tendrán movilidades negativas ya que se

oponen al FEO y los cationes, positivas pues van en el mismo sentido.

El tampón de separación

La selección del tampón de separación es extremadamente importante para la

separación. Existen numerosas publicaciones donde se hace referencia a la influencia de

la concentración de tampón y el FEO (147, 148). El pH del tampón de separación es un

parámetro crítico a la hora de la separación. Puede estar comprendido entre 2 y 12

debido a la alta estabilidad de los capilares de sílice fundida.

La elección del pH dependerá del tipo de soluto a separar, ya que éste puede

afectar a la carga de los solutos y, por tanto, a su movilidad electroforética así como a la

movilidad del FEO, alterando así la separación de los compuestos.

Después del pH, la fuerza iónica del tampón es una herramienta poderosa para

mejorar la eficiencia, resolución y selectividad de la separación ya que influye sobre la

movilidad de los analitos y sobre la movilidad del FEO por afectar al espesor de la

doble capa difusa y por tanto al potencial zeta (ζ). Además influye en la intensidad de
Introducción 69

corriente que atraviesa el capilar y, por lo tanto, en el calor generado por efecto Joule.

Por ello hay que seleccionar tampones cuyos iones presenten baja conductividad, como

Tris, borato, histidina, ácido 3-[ciclohexilamino]-1-propanosulfónico (CAPS), cuyos

iones son voluminosos y como consecuencia pueden ser usados en altas concentraciones

sin generar corrientes demasiado altas aunque presentan la desventaja de que estos

tampones suelen presentar fuerte absorción en el UV.

Para aumentar la selectividad del sistema, se puede añadir al tampón una serie de

aditivos tales como disolventes orgánicos, que añadidos al electrolito alteran la

polaridad y la viscosidad de la fase móvil. Como consecuencia, se modifica la

movilidad electroosmótica de los iones y la movilidad del FEO. La adición al tampón de

surfactantes, selectores quirales o agentes formadores de complejos puede alterar

también la selectividad y el tiempo de análisis.

Parámetros determinantes de la separación

Una separación analítica se lleva a cabo para obtener, en un tiempo razonable,

información cualitativa y cuantitativa acerca de la muestra.Así, los parámetros más

relevantes que dan idea del correcto funcionamiento de una separación electroforética

son el tiempo de migración, la eficiencia, la selectividad y la resolución.

El tiempo de migración (tm) de un analito es el tiempo que éste tarda en

recorrer la longitud efectiva del capilar (l) y se obtiene directamente del

electroferograma. Éste puede ser descrito en función de los parámetros experimentales

como:

lL
tm =
(µ l + µ FEO )V
70 Introducción

La eficiencia de un sistema electroforético se mide por el número de platos

teóricos (N) alcanzados por el capilar y se puede calcular a partir de la siguiente

expresión:

2
 t  l ( µ e + µ FEO )V
N = 5.54 m  ; N =
 w1 / 2  2 DL

donde w1/2 es el ancho del pico a la mitad de su altura y D es el coeficiente de difusión

del soluto

La selectividad es la capacidad del sistema para separa solutos que están

próximos entre sí y se mide a través de la distancia entre dos máximos consecutivos. La

selectividad viene dada por la siguiente expresión:

t m 2 − t mFEO
α=
t m1 − t mFEO

La forma más eficiente para influir sobre ella es cambiar el pH de la disolución.

La resolución (R) es el parámetro más importante a la hora de la separación.

Nos indica lo bien separados que están dos compuestos. Se puede calcular a partir del

electroferograma usando la ecuación:

2(t m 2 − t m1 )
R=
w1 + w2

Pero también se puede expresar como:

1 1
 V  2 l  2
R = 0.177 ∆µ    
(
 D µ + µ EOF )  L

Introducción 71

De esta ecuación podemos deducir que la resolución aumenta con el voltaje pero

no aumenta tanto como lo hace la eficiencia que es directamente proporcional al voltaje.

Así, hemos de usar voltajes lo más altos posibles para llevar a cabo la separación ya que

produce separaciones más rápidas, con altas eficiencias.

En cuanto a la movilidad del FEO, hemos de destacar que altas movilidades que

antes producían altas eficiencias, ahora producen bajas resoluciones. La mayor

resolución se obtendrá cuando la movilidad del FEO sea igual y en sentido contrario a la

movilidad electroforética media de los iones pero si tenemos en cuenta el tm (medio):

lL
t m (medio) =
µ + µ FEO

Si
µ = − µ FEO

entonces el tm tendería a infinito, lo cual no es práctico. Por lo tanto, se debe mantener

un µFEO que dé tiempos de análisis lo más pequeños posible siempre que exista una

resolución entre los picos.

La resolución depende también de las movilidades electroforéticas de los

analitos y será tanto mayor cuanto mayor sea la diferencia entre ellas. Esta diferencia se

puede aumentar al optimizar el pH del electrolito de separación o bien mediante la

adición de modificadores orgánicos al electrolito de separación, lo cual puede causar

diferencias en las movilidades y, por lo tanto, aumentar la resolución y la selectividad

del sistema.
72 Introducción

Factores que afectan al desarrollo de la separación

El alto poder de resolución de la EC se debe fundamentalmente a que los efectos

dispersivos pueden ser controlados con la nueva instrumentación, por lo que es

importante comprender estos efectos dispersivos para estimar su influencia sobre la

separación y conseguir disminuirlos al máximo.

El ensanchamiento de los picos en EC es la suma de una serie de efectos que

contribuyen a éste. Suponiendo un pico gaussiano, el ensanchamiento puede ser

expresado en términos de la variante espacial δ2. Así, la varianza total será la suma total

de una serie de varianzas debidas a determinadas fuentes de dispersión.

δ 2t = δ 2D + δ 2A + δ 2J + δ 2E + δ 2I + δ 2W + δ O2

D: difusión I: inyección

A: adsorción W: cambio de la zona de detección

J: efecto Joule O: otros.

E: electrodispersión

Difusión. En EC la muestra se introduce en un capilar. La zona donde está

contenida la muestra se va ensanchando por ambos lados debido a una diferencia de

concentración entre la zona de muestra y el electrolito de separación. Se obtiene así un

perfil de concentración semejante a una curva gaussiana.

Adsorción. La principal causa de adsorción sobre las paredes de sílice fundida

son las interacciones iónicas entre compuestos catiónicos y las propias paredes, que

presentan cargas negativas. Dependiendo de la intensidad de esta interacción, se pueden

Introducción 73

obtener picos asimétricos, o bien, puede ser que exista una total adsorción del analito en

las paredes, en cuyo caso no se obtendrían picos.

Efecto Joule. Cuando una corriente pasa a lo largo del capilar, parte de la energía

eléctrica es convertida en calor. Como consecuencia de este calor, aumenta la

temperatura dentro del capilar, creándose un gradiente de temperatura desde el centro

hacia la pared del capilar y que es eliminada a través de las paredes de éste.

Matemáticamente, puede ser descrito por la siguiente ecuación:

Qr12  1  r2  1  r3  1  1 
∆TT =  ln  + ln  +  
2  K 1  r1  K 2  r2  r3  h 

Q: calor generado por efecto Joule. r1: radio interno del capilar

r2: radio externo del capilar. r3: radio externo de la poliamida

k1 y k2: conductividades térmicas de la sílice y de la poliamida, respectivamente (k1 >

k2)

h: velocidad de transferencia térmica desde el capilar.

Como consecuencia de la corriente eléctrica, el calor se genera homogéneamente

a lo largo del interior del capilar. Mientras que el perfil de temperatura dentro del

capilar es parabólico, el perfil de temperatura a lo largo de las paredes del capilar y de

un medio envolvente es logarítmico.

Para obviar este fenómeno, se puede eliminar el calor de la superficie del capilar

a través de un sistema de refrigeración que puede ser por una corriente forzada de aire o

mediante el uso de un líquido refrigerante. Este control de temperatura es necesario no

sólo para eliminar el calor sino para mantener el capilar a una temperatura constante
74 Introducción

durante la separación, incluso en ausencia de efecto Joule, para asegurarnos la

reproducibilidad de las medidas.

Longitud de la muestra inyectada. Es importante que la longitud de la muestra

inyectada sea lo más pequeña posible. Si ésta es mayor que la dispersión causada por la

muestra, la eficiencia (149) y la resolución se verán sacrificadas. Una regla práctica

consiste en inyectar una longitud de muestra inferior al 1-2 % de la longitud total del

capilar.

Electrodispersión. Ocasiona la dispersión de los picos electroforéticos debido a

la diferente composición del tampón y la muestra inyectada, lo cual da origen a dos

zonas de diferente conductividad y, por lo tanto, de campo eléctrico. Cuando la zona de

muestra presenta una mayor movilidad que la del electrolito (11a), el borde anterior de

la zona de la muestra será difuso y el borde posterior será picudo. Análogamente,

cuando la zona de la muestra presenta una menor movilidad que la del electrolito (11c),

el borde anterior de la zona de la muestra será picudo y el posterior será difuso. Caso de

que tanto la muestra como el electrolito tengan la misma conductividad (11b), no

existirá ninguna deformación del pico debido a la electrodispersión.

Figura 11. Electrodispersión derivada de la diferencia de conductividad entre la

disolución de la muestra (verde) y el electrolito (amarillo)

Introducción 75

ASPECTOS INSTRUMENTALES Y OPERACIONALES DE LA

ELECTROFORESIS CAPILAR.

En la figura 12 se muestra el diseño básico de un equipo de electroforesis

capilar.

Figura 12. Diseño básico de un equipo de electroforesis capilar.

Para comenzar una separación, el capilar se rellena con el tampón o electrolito

de separación, después se inyecta la muestra en el lado opuesto al detector y

seguidamente el capilar se sumerge en dos viales que contienen el electrolito de

separación a la vez que los electrodos. Finalmente se aplica una diferencia de potencial

entre ambos electrodos y comienza la separación.

Inyección de la muestra

La inyección de la muestra en el capilar se puede hacer mediante una gran

variedad de métodos, pero los dos más importantes son la inyección hidrodinámica y la

inyección electrocinética.

La inyección hidrodinámica se puede llevar a cabo mediante la aplicación de una

presión al vial, en el que se introduce en el extremo inicial del capilar, o bien, haciendo
76 Introducción

vacío sobre el extremo final del capilar, o bien, por gravedad elevando el vial que

contiene la muestra unos centímetros por encima del vial de salida.

Figura 13. Modos de inyección hidrodinámica.

La inyección electrocinética supone un modo alternativo a la introducción de la

muestra en electroforesis capilar. Se basa en el hecho de que al aplicar una diferencia de

potencial aparece un movimiento electroforético y electroosmótico en el capilar.

Introducción 77

Figura 14. Inyección electrocinética.

El nivel de concentración detectable en EC es del orden de mg/L. Para las

determinaciones en fármacos, estos límites pueden ser suficientes pero cuando se trabaja

con fluidos biológicos interesa detectar cantidades inferiores.

En la práctica actual, se ha intentado suplir esta limitación mediante el empleo

de técnicas de preconcentración previas a las separaciones elecroforéticas o bien

mediante preconcentraciones “en columna” durante o antes de la separación

propiamente dicha (150). Estas técnicas, de amplificación de campo, son el Stacking

(FASS) (131) y la inyección de grandes volúmenes de muestra (LVSS) (151).

Fuente de alto voltaje

Se utilizan fuentes de corriente continua, capaces de aplicar un voltaje entre 1 y

30 KV con una regulación de voltaje de ± 0.1% para mantener una alta reproducibilidad

del tiempo de migración. Debe tener la capacidad de cambiar la polaridad y es

preferible que este cambio se haga directamente desde el correspondiente programa

informático.
78 Introducción

Capilar

Los capilares que se utilizan en una separación electroforética han de ser

química y eléctricamente inertes, transparentes a la radiación UV-Visible, robustos a la

vez que flexibles y baratos. La mayor parte de estos requerimientos los reúne la sílice

fundida, por lo que gran mayoría de los capilares que se utilizan en EC están hechos de

sílice. Uno de los mayores problemas que presenta la sílice fundida es su baja

flexibilidad, por ello los capilares van recubiertos de una capa de poliamida que protege

al capilar y le confiere una gran flexibilidad. La ventana de detección se consigue hacer

fácilmente quitando unos milímetros de la poliamida utilizando una llama o una

resistencia eléctrica.

Otro material que se suele utilizar es el teflón, que es transparente a la radiación

UV, no requiere ventanas especiales y, aunque no presenta carga, exhibe FEO. Sin

embargo, es difícil obtener capilares de teflón con un diámetro interno homogéneo.

Además, presenta problemas de adsorción similares a los de sílice y bajos coeficientes

de transferencia térmica, inconvenientes que han hecho que su uso sea más limitado.

Los capilares de sílice que se utilizan en EC suelen tener un diámetro interno

entre 25 y 100 µm y un diámetro externo entre 350 y 400 µm. La longitud efectiva suele

oscilar entre los 10 cm, para capilares rellenos de gel y los 100 cm de los capilares que

se utilizan para la resolución de muestras muy complejas. No suelen utilizarse capilares

más largos porque hacen que aumente considerablemente el tiempo de análisis sin una

mejora apreciable de la eficiencia.

Introducción 79

Sistemas de termostatización del capilar

Existen sistemas de flujo de aire (a una velocidad de unos 10 m/s) o de líquido.

Aunque el sistema por líquido suele ser algo mejor también supone una instrumentación

más complicada y de mayor coste, por lo que en muchas ocasiones se prefiere la

termostatización por flujo de aire, que se muestra igual de eficiente, siempre y cuando

no se superen valores de 5 (W/m) durante la separación.

Sistemas de detección

La electroforesis es bastante parecida a la cromatografía líquida en el hecho de

que los solutos se eluyen del sistema por un tubo en forma líquida. Así, no es

sorprendente que la mayor parte de los detectores utilizados en HPLC lo sean también

en EC.

El detector UV es uno de los más utilizados en EC. Como sabemos, las

absorbancias dependen de la posibilidad de la existencia de grupos cromóforos en la

molécula a la longitud de onda de trabajo, del pH del tampón de separación, de la

concentración y de la longitud de paso óptico.

El hecho de que la longitud del paso óptico de la celda en EC es

aproximadamente el diámetro interno del capilar limita mucho la sensibilidad de la

técnica. Para aumentar la longitud de paso óptico se pueden utilizar ventanas de

detección en forma de Z, de burbuja (152, 153) o bien celdas de multirreflexión, donde

el incremento de paso óptico es proporcional al número de reflexiones, con las que se

pueden conseguir longitudes de paso óptico de hasta 1 cm. También se pueden utilizar

capilares rectangulares, donde la absorbancia puede ser multiplicada por 20.

80 Introducción

Los sistemas más utilizados son los que se muestran en la tabla 3.

Tabla 3. Métodos de detección.

Método LOD* (M) Ventajas e inconvenientes

Absorción UV-Vis 10-5 – 10-8 -Universal

-La batería de diodos en línea ofrece
información espectral
Fluorescencia 10-7 – 10-9 -Sensibilidad
-Requiere, en general, derivatización

Fluorescencia inducida por LASER 10-14 – 10-16 -Muy sensible

-Caro
-Requiere, en general, derivatización
Amperometría 10-10 – 10-11 -Sensible
-Selectivo, pero suele usarse con analitos
electroactivos
-Requiere modificaciones electrónicas y en
el capilar
Conductividad 10-7 – 10-8 -Universal
-Requiere modificaciones electrónicas y en
el capilar
Espectrometría de masas 10-8 – 10-9 -Alta sensibilidad e información estructural
-Acoplamiento EC-MS complicado

Métodos indirectos 10 – 100 veces -Universal

menos que un -Menor sensibilidad que los directos
método directo
Otros Radiactividad, índice de refracción, dicroísmo circular, Raman...

* LOD: Límite de detección

Figura 15. Celdas de detección que aumentan el paso óptico.

Introducción 81

MODALIDADES DE ELECTROFORESIS CAPILAR

Las principales modalidades descritas dentro de la electroforesis son las que se

enuncian a continuación.

- Electroforesis capilar en zona (CZE).

- Cromatografía electrocinética micelar (MEKC).

- Electroforesis capilar en gel (ECG).

- Isoelectroenfoque (IEF).

- Isotacoforesis capilar (ITFC).

- Electrocromatografía capilar (CEC).

En el trabajo experimental que se refleja en esta memoria, se han utilizado las

dos primeras modalidades de la lista anterior, las cuales pasamos a comentar

brevemente.

Electroforesis capilar en zona

La CZE es uno de los modos más ampliamente usados debido a la simplicidad

de operación y a su gran versatilidad. Su nombre puede conducir a errores debido a que

también la MECK y la CGE son modos zonales, por lo que a veces se le denomina

también EC en disolución libre.

Para llevar a cabo una separación por EC se rellena el capilar con tampón, se

inyecta la muestra y se sumergen ambos extremos del capilar en sendos viales que

contienen tampón y comienza la separación aplicando una diferencia de potencial (10-

30 KV) entre ánodo y cátodo.

82 Introducción

Una vez aplicada la diferencia de potencial, los cationes migrarán hacia el

cátodo separándose en distintas zonas dependiendo de su velocidad electroforética y, si

existe FEO, los aniones en la mayor parte de los casos serán empujados por éste hacia el

detector (hacia el cátodo) separándose también en distintas zonas según sus velocidades

electroforéticas.

Los aniones, puesto que tienden a migrar en sentido contrario al FEO, salen a

tiempos más elevados que éste, siendo los primeros aquellos que, a igual carga,

presentan mayor tamaño y que, a igual tamaño, presentan menor carga. Hay que resaltar

que en algunas ocasiones el flujo puede invertirse mediante la adición de aditivos

haciendo que vaya desde el cátodo al ánodo.

Cromatografía electrocinética micelar

Este método combina el mecanismo de separación de la cromatografía con el

movimiento electroforético y electroosmótico de los analitos y de la disolución. El

desarrollo de la MEKC fue un gran avance en la EC puesto que proporciona un método

para la separación de compuestos neutros así como de compuestos cargados (iónicos).

Fue introducida por Terabe y colaboradores (53 – 55) en 1984 y desde entonces es uno

de los métodos más utilizados en la EC. Está basada en el reparto del soluto entre las

micelas y el tampón de separación.

Los detergentes, también denominados surfactantes, son moléculas que

contienen un grupo iónico (hidrofílico) en un extremo de la molécula y una región

hidrofóbica al otro extremo (que puede ser una cadena alquílica). Dependiendo del tipo

de grupo electrofílico, los surfactantes se pueden calisficar en aniónicos (grupos

Introducción 83

sulfónicos o carboxílicos), catiónicos (grupos de alquil amonio) anfolíticos (tienen a su

vez grupos aniónicos y catiónicos) y no iónicos (grupos polietoxi).

Cuando un detergente está en disolución a una concentración superior a su

concentración micelar crítica, éste forma micelas, que son agregados moleculares,

normalmente de forma esférica, en los que el grupo hidrofílico está orientado hacia el

exterior y los grupos hidrofóbicos hacia el interior de la misma, generando en el interior

de ésta una cavidad altamente hidrofóbica (Figura 16). Se denomina número de

agregación al número de la moléculas de éste que constituye una micela y depende del

tipo de surfactante.

Figura 16. Estructuras de micelas aniónicas y catiónicas

En la MECK, se añade al tampón de separación un surfactante por encima de su

concentración micelar crítica, con lo cual se originan dos fases, una acuosa y otra

micelar.

Si inyectamos una muestra formada únicamente por compuestos eléctricamente

neutros en un sistema constituido por un surfactante que forme micelas aniónicas y

donde la movilidad electroforética de las micelas sea superior a la del FEO, éstas serán

atraídas hacia el ánodo al aplicar el campo eléctrico, pero el FEO las impulsará hacia el

cátodo. Los compuestos hidrofílicos permanecerán en el tampón y no entrarán en la

84 Introducción

cavidad hidrofóbica de la micela, por lo tanto migrarán a la misma velocidad que el

FEO. Las moléculas muy hidrofóbicas entrarán en las micelas y no tendrán ninguna

tendencia a salir de ellas, por lo que su tiempo de migración coincidirá con el de las

micelas (tmic).

Las moléculas que son parcialmente solubles en las micelas se distribuirán entre

éstas y el tampón estableciéndose un equilibrio entre ambas fases según una constante

de reparto. Éstas saldrán en un tiempo comprendido entre el tiempo del FEO y el tiempo

micelar y que vendrá determinado por su hidrofobicidad, es decir, el tiempo que estos

permanecen en la micela. A la diferencia entre el tiempo al que salen las micelas y al

que sale el flujo se conoce como ventana de retención.

Para determinar el tiempo micelar, normalmente, se utiliza una sustancia

altamente hidrófoba como el Sudán III, Sudán IV y también el amarillo OB. Para

determinar el tiempo del FEO se suele utilizar una sustancia hidrófila que no se

introduce en la micela como es el metanol.

La resolución en MECK entre dos picos adyacentes puede ser expresada en

función de la eficiencia, selectividad y retención como:

 t 
 1 − FEO 
N  α − 1  K '2
1/ 2
t mc
Rs =    
4  α  1 + K ' 2  t FEO 
1 + t K '1 
 mc 

Donde N es la eficiencia expresada como el número de platos teóricos, α es la

selectividad (K’2/K’1) y los subíndices 1 y 2 son los referentes al primer y al segundo

soluto.

Según Foley, el factor de capacidad óptimo para obtener la máxima resolución

por unidad de tiempo, viene dado por un valor comprendido entre 1.2 y 2.
Introducción 85

Además de la concentración del tampón, un gran número de efectos tienen

influencia sobre la separación en MECK, como son la naturaleza del surfactante, la

temperatura del tampón y la utilización de aditivos como los modificadores orgánicos.

La naturaleza del detergente puede afectar a la resolución, ya que ésta influye sobre K’,

α y la relación tFEO/tmc. Además, la resolución puede verse influida por la adición de

modificadores orgánicos al tampón.

Normalmente, una muestra puede contener analitos cargados y neutros, de tal

manera que, cuando se procede a su separación por MECK, los neutros se separarán en

función de su distribución entre el tampón y la micela y los que presentan carga, en

función de sus movilidades o en función de sus interacciones con las micelas

dependiendo de su carga y de la carga de las micelas.

La temperatura tiene un efecto importante en la separación en MECK debido a

varios aspectos que se enumeran a continuación. En primer lugar porque las micelas

sólo se forman cuando se sobrepasa una temperatura micelar crítica denominada punto

de Kraft, independientemente de la concentración del surfactante. En segundo lugar, la

temperatura influye en el coeficiente de partición del soluto. Un aumento de

temperatura provoca una disminución del coeficiente de partición. En tercer lugar,

influye sobre el factor de capacidad K’ y en la eficiencia de manera inversamente

proporcional y por último, un aumento de temperatura disminuye el tiempo de análisis

y, normalmente, la resolución.
86 Introducción

INTRODUCCIÓN A LA CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN

La cromatografía puede definirse como una técnica de separación de los

componentes de una mezcla, basada en la velocidad de desplazamiento diferencial de

los mismos y que se establece al ser arrastrados por una fase móvil (líquida o gaseosa) a

través de un lecho cromatográfico que contiene la fase estacionaria, la cual puede ser

líquida o sólida.

La cromatografía es, probablemente, la más versátil de las técnicas de

separación; es aplicable a cualquier mezcla soluble o volátil. De hecho las técnicas de

separación suelen dividirse en dos grandes grupos: cromatográficas y no

cromatográficas. La elección de una técnica cromatográfica concreta dependerá de la

naturaleza y cantidad de muestra, del objetivo de la separación y de las limitaciones del

tiempo y equipo disponible.

Puede hacerse una primera distinción entre las técnicas cromatográficas

atendiendo a la integración continua o no del sistema de detección. Así, la

cromatografía plana no conlleva un sistema de detección continuo, mientras que

cualquier cromatógrafo de líquidos o gases lleva incorporado dicho sistema, siendo, por

tanto, auténticos instrumentos.

Las dificultades de la modalidad clásica, a baja presión, de la cromatografía

líquida en columna, tales como la lentitud, poca eficacia en la capacidad de

discriminación y número de solutos que pueden separarse, necesidad de la intervención

casi constante del operador e imposibilidad de aplicar detección continua, motivaron

que las aplicaciones de esta técnica fueran restringidas, en contraste con el espectacular

desarrollo de la cromatografía de gases.

Introducción 87

Para que la cromatografía líquida en columna sea competitiva con la

cromatografía de gases, es preciso, dada la diferencia de viscosidad de la fase móvil y

su capacidad para atravesar lechos empaquetados, trabajar a presiones elevadas en lugar

de utilizar sólo la fuerza de la gravedad.

Ello permite reducir el tamaño de la partícula de la fase estacionaria y por tanto

aumentar la eficacia separativa. Por otro lado, reduce drásticamente la duración de la

separación, equiparándola con la necesaria para una separación por cromatografía de

gases, y permite una detección continua del eluido.

Las espectaculares aplicaciones de la configuración de la cromatografía líquida

en columna a presión elevada, cubriendo aspectos inabordables o poco recomendables o

prácticos en cromatografía de gases (compuestos iónicos, muy polares, termolábiles, no

volátiles, fases acuosas de muestras, etc.) la han convertido, junto con la electroforesis

capilar, en una técnica analítica muy utilizada en áreas tales como la Bioquímica,

Contaminación, Alimentación, Clínica, etc. Su desarrollo comercial comenzó en los

setenta, y se consolidó en los ochenta.

Entre las denominaciones que ha recibido esta modalidad y que hacen referencia

a sus características propias (alta resolución, alta eficacia, rapidez y alta presión) la

utilizada con mayor frecuencia es la que hace referencia a su alta resolución:

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN, cuyas siglas en español,

CLAR, o en inglés, HPLC, son las más frecuentemente encontradas en la literatura

hispana y anglosajona respectivamente, si bien, últimamente se viene utilizando

simplemente CL o LC.
88 Introducción

Principios básicos

La cromatografía, que es hoy en día la principal técnica analítica de separación,

se encuentra regida por factores termodinámicos y cinéticos. Los aspectos

termodinámicos son los que determinan las características de retención y selectividad

del sistema cromatográfico y corresponden a los equilibrios de distribución de los

solutos entre la fase móvil y la fase estacionaria. En cuanto a los aspectos cinéticos,

consideran el tiempo para el que se alcancen los sucesivos equilibrios entre las fases en

el tiempo de contacto y la velocidad de desplazamiento diferencial de la mezcla de

solutos en el lecho cromatográfico.

Aunque tanto los aspectos termodinámicos como los cinéticos influyen en todo

el proceso cromatográfico, son los termodinámicos los que determinan básicamente la

situación del pico, mientras que los cinéticos influyen decisivamente en el

ensanchamiento de los mismos.

Concepto de plato teórico

La eficacia del sistema se ha venido asociando históricamente en cromatografía

al concepto de plato teórico definido como la porción del lecho cromatográfico en el

que se alcanza el equilibrio de distribución. La altura equivalente del plato teórico

(AEPT o H) se define como:

AEPT = H = L/n

Donde L es la longitud de la columna y n el número de veces que se alcanza el

equilibrio y que coincide con el número de platos teóricos de la columna. Esta teoría

asume para el método cromatográfico lo que ocurre en una extracción líquido – líquido
Introducción 89

en contracorriente, donde el plato teórico es equivalente a una unidad de extracción. La

teoría considera que la fase móvil fluye de modo discontinuo entre los platos y que la

relación de distribución es independiente de la concentración, sin tener en cuenta la

influencia de la difusión axial del soluto ni la velocidad de flujo de la fase móvil.

La realidad experimental se describe mejor mediante las llamadas teorías de

velocidad o del plato dinámico en las que se tienen en cuenta la influencia de la difusión

axial, la velocidad del flujo de la fase móvil, el tamaño de partícula del lecho y el

espesor de la fase estacionaria. Al contrario de lo que sucede en la teoría clásica, la

AEPT no es constante sino que varía con los parámetros citados.

Retención cromatográfica

La causa de la diferente movilidad de los solutos – analitos inicialmente en la

fase móvil, en un sistema cromatográfico, es su diferente tendencia a ser retenidos en la

fase estacionaria, en relación con su tendencia a permanecer en la fase móvil. En

definitiva, es la distribución desigual de los solutos entre ambas fases la razón principal

de su separación cromatográfica. Esta distribución está regida por el correspondiente

equilibrio heterogéneo en unas condiciones determinadas en el sistema cromatográfico.

Una vez alcanzado el equilibrio en cada plato teórico, la constante de

distribución que lo rige es:

concentracion de soluto en fase estacionaria

KD =
concentración de soluto en fase móvil
90 Introducción

ASPECTOS INSTRUMENTALES Y OPERACIONALES DE LA CROMATOGRAFÍA

LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN

La cromatografía líquida de alta resolución se desarrolla en los denominados

cromatógrafos de líquidos que tienen categoría de instrumento, ya que proporcionan

información sobre la composición de la materia al tener un detector continuo integrado

en el sistema dinámico cromatográfico.

En la figura 9 se muestra un diagrama esquemático de los componentes de un

cromatógrafo de líquidos, entre los que se distinguen:

Sistemas de bombeo

Un aspecto básico en HPLC es la consecución de un sistema de suministro de

forma continuada de la fase móvil a presión suficiente como para que pase a través de

una fase estacionaria con un pequeño tamaño de partícula y fuertemente empaquetada,

constituyendo, por tanto la bomba de alta presión un componente esencial de los

cromatógrafos de líquidos. Los principales requerimientos exigidos a este tipo de

bombas son: que ofrezcan un rango suficientemente amplio de presiones, velocidades de

flujo variables y reproducibles al menos al 95 %, que el flujo se encuentre libre de las

pulsaciones debidas a su propio mecanismo y que presenten una elevada resistencia a la

corrosión de los distintos disolventes habitualmente empleados.

Introducción 91

Sistema de inyección

En la actualidad el sistema de introducción de la muestra más utilizado en esta

técnica se basa en el uso de válvulas de inyección equipadas con los denominados

bucles de muestras intercambiables que proporcionan una imprecisión en el volumen de

la muestra inyectada al sistema de tan solo algunas décimas por cien.

Columna cromatográfica

Es la parte esencial del cromatógrafo de líquidos ya que en ella, a través de

diferentes mecanismos (adsorción, partición, cambio iónico, etc.), tiene lugar la

separación o discriminación entre analitos e interferentes.

Detector

Se trata de un módulo del cromatógrafo de líquidos, situado a la salida de la

columna, que proporciona de forma continua información acerca de la composición del

flujo que circula a su través. Generalmente origina una señal eléctrica continua, que

debidamente amplificada y registrada, constituye el denominado cromatograma, del que

se extrae información cualitativa y cuantitativa de la muestra inyectada.

Los detectores más utilizados en HPLC son detectores ópticos (de absorción

visible – ultravioleta, de fluorescencia, de refractometría) y detectores electroquímicos

(potenciométricos, culombimétricos, etc.)

92 Introducción

Integrador o procesador

La obtención de datos cromatográficos mediante un simple registrador es hoy

día, solamente válido para comprobar el funcionamiento del cromatógrafo, para

experiencias preliminares, etc. Pero la extracción de información cualitativa y/o

cuantitativa de un cromatograma registrado mediante la intervención humana directa o

indirecta es una opción lenta, tediosa y sujeta a un gran número de errores. Así, debido a

la necesidad de limitar la intervención humana y aumentar la precisión en la

identificación y cuantificación, unido a que los cromatógrafos son cada vez más

eficaces y pueden discriminar entre un gran número de solutos de propiedades muy

semejantes, hace imprescindible el empleo de un sistema electrónico o informático que

realice la misión asignada al registrador simple y al operador humano.

La opción más simple y barata son los denominados “integradores” que son unos

módulos imprescindibles en la versión más simple de los cromatógrafos de líquidos.

Mucho más interesante es el empleo de un microprocesador con memoria que acumula

el conjunto de datos sin tratar y posteriormente mediante la aplicación de distintos

procedimientos matemáticos extrae la información deseada.

Figura 9. Esquema de un cromatógrafo tipo.

Introducción 93

Las características de los cromatógrafos de líquidos utilizados en nuestro estudio

se han detallado al principio de esta Memoria, en la sección de “instrumentos

utilizados”.

PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS

Llamamos cromatograma a la representación de la respuesta o señal del sistema

de detección continuo o discontinuo en función del tiempo, volumen del eluyente o

distancia en el lecho cromatográfico. El cromatograma contiene información analítica

relativa a la muestra o del funcionamiento del sistema cromatográfico. Los parámetros

que definen el comportamiento de un soluto en un sistema cromatográfico de elución y

que sirven de base para cálculos analíticos se detallan a continuación.

Tiempo de retención (tR). Tiempo que transcurre desde la inserción de la

muestra hasta su salida por el detector.

Factor de capacidad o de retención (K). Es el parámetro más comúnmente

usado para caracterizar el comportamiento de un sistema cromatográfico y su retención.

Viene dado por:

tR − t 0 t R
K= =
t0 t0

donde tR es el tiempo de retención del compuesto y t0 es el tiempo muerto o tiempo

transcurrido desde la inserción a la salida de un trazador no retenido en el sistema. En

un sistema multicomponente, los valores de K deberían encontrarse entre 1 y 10.

94 Introducción

Factor de separación (α). Es un parámetro definitorio de la selectividad

cromatográfica entre dos analitos, definido como:

tR 2 K 2
α1 / 2 = =
tR1 K 1

Sin embargo, este factor no es decisivo para asegurar la separación completa de

los picos ya que no tiene en cuenta el ensanchamiento de banda y por tanto, los posibles

solapamientos.

Resolución cromatográfica (Rs). Este parámetro sí que considera el posible

ensanchamiento y solapamiento de picos. Dicho parámetro es más utilizado que el

anterior y se define como:

tR 2 − tR1
Rs =
(Wb1 + Wb 2) / 2

Donde Wb1 y Wb2 son los anchos de banda de ambos picos. En una separación

considerada satisfactoria es normalmente aceptado un valor de RS de 1, correspondiente

a una separación entre picos del orden del 94 % aunque para que exista una resolución

prácticamente total (resolución a línea base), RS debe ser superior a 1.5.

Así pues, el objetivo que perseguimos con la elección de la fase móvil adecuada

es conseguir que los factores de capacidad de los analitos tengan valores adecuados,

comprendidos entre 1 y 10, y que la resolución entre los diferentes picos sea igual o

superior a 1.
Introducción 95

MODALIDADES DE CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA

La cromatografía líquida en columna tiene una gran variedad de alternativas

según la naturaleza de la fase estacionaria, como se muestra en la Tabla 4. En ella, la

fase estacionaria activa más frecuente es un sólido, además de actuar como soporte

inerte en la cromatografía de partición.

Tabla 4. Tipos básicos de cromatografía líquida.

Nombre Fase estacionaria activa

Partición Líquido retenido por un soporte sólido

Adsorción Sólido con propiedades superficiales

Cambio iónico Sólido con propiedades cambiadoras de iones

Afinidad Sólido con propiedades de retención bioespecíficas

Exclusión por tamaños Sólido con porosidad controlada

El fundamento de actuación de la fase estacionaria es distinto, dependiendo del

tipo de cromatografía que utilicemos. Así, dicho fundamento es físico-químico en

cromatografía de adsorción, basado en la actividad superficial de la misma que retiene

con mayor o menor “fuerza” a los solutos. En la cromatografía de partición clásica, es la

absorción el fundamento de la retención de la fase estacionaria líquida.

Como es bien sabido, tanto en la cromatografía líquida de partición como en la

de adsorción, podemos distinguir dos modalidades básicas, dependiendo de la

naturaleza de las fases móvil y estacionaria. Dichas modalidades son:

- Fase normal: en ella la fase móvil es de naturaleza no polar, mientras que la

estacionaria es fundamentalmente polar.

96 Introducción

- Fase invertida o reversa: en ella la fase móvil es de naturaleza polar y la

estacionaria no polar. Es la que actualmente tiene mayor importancia pues

más de un 85 % de las aplicaciones en HPLC se basan en esta alternativa.

Cromatografía de partición en fase reversa

A continuación pasamos a describir algunos aspectos relativos a la fase

estacionaria y a la fase móvil en cromatografía de partición en fase reversa.

1. Fase estacionaria

En el tipo de cromatografía utilizado en esta Memoria (partición en fase

reversa), dependiendo de la relación entre el soporte sólido inerte y la fase estacionaria

activa podemos distinguir dos tipos básicos:

- Fase estacionaria adsorbida, esto es, retenida por interacción físico-química

del disolvente con los sitios activos del soporte sólido.

- Fase estacionaria ligada, es decir, cuando se establece un anclaje químico

entre el soporte sólido y las moléculas de la fase estacionaria líquida.

El tipo de empaquetamiento de columna utilizado para el desarrollo de este

trabajo como fase estacionaria es sílice sometida a la incorporación química, por

silanización, de una cadena hidrocarbonada larga C18 (fases ligadas).

La retención en cromatografía de fases ligadas no polares se debe, de manera

casi exclusiva, a las interacciones hidrofóbicas no específicas soluto – fase estacionaria,

es decir, al carácter hidrofóbico o hidrocarbonado del soluto. Su casi universalidad en

Introducción 97

relación con el tipo de soluto se fundamenta, por lo tanto, en el hecho de que todas las

moléculas orgánicas tienen regiones hidrofóbicas más o menos amplias en su estructura

y son capaces de interaccionar con la fase estacionaria.

La columna que hemos utilizado tiene un tamaño de partícula de 3 µm de

diámetro, 0.46 cm de diámetro interno y 15 cm de longitud.

2. Fase móvil

La naturaleza de la fase móvil es el factor clave para la discriminación entre

solutos en HPLC, como ocurre con la temperatura en cromatografía de gases.

Las propiedades básicas que nos interesan de la fase móvil son la fuerza o

capacidad de desplazamiento de los solutos y su selectividad, basadas en las

interacciones específicas entre el soluto y la fase móvil, ya sea de tipo polar, de

formación de enlaces de hidrógeno, o mediante equilibrios secundarios provocados al

variar su composición (ácido – base, formación de complejos o pares iónicos, adición de

complejos metal – ligando o reactivos quirales para separar isómeros ópticos, etc).

En cromatografía de fase invertida, dado que la retención de los solutos en la

fase estacionaria ocurre fundamentalmente a través de su zona no polar, la relación entre

fuerza o capacidad de desplazamiento y polaridad de la fase móvil es inversa. Así, el

agua es el eluyente con mínimo poder de elución y debe mezclarse con disolventes

menos polares para eluir solutos fuertemente retenidos por la fase estacionaria no polar.

En general, la estrategia en las separaciones cromatográficas consiste, bien en ajustar la

fuerza de la fase móvil a un nivel constante para que la retención de los solutos en la

fase estacionaria y su tiempo de permanencia en la columna sea el adecuado, o bien en

modificar la composición de la fase móvil hasta conseguir la selectividad necesaria para

lograr la discriminación entre solutos requerida.

98 Introducción

En el caso de compuestos orgánicos fácilmente ionizables, como es el caso de

los compuestos estudiados en esta Memoria, la utilización de fases móviles constituidas

por mezclas de agua y un disolvente menos polar (metanol, acetonitrilo...) daría como

resultado retenciones de estos solutos en la fase estacionaria muy pequeñas o incluso

nulas. En estos casos, la capacidad de desplazamiento de la fase móvil puede ser

modificada mediante los siguientes mecanismos:

1. Utilización de disoluciones reguladoras que pueden producir dos

efectos:

i. Supresión iónica

ii. Reducción de la solubilidad del soluto en la fase móvil,

también conocido como supresión de la solubilidad.

2. La presencia de un contraión de naturaleza orgánica que se puede

añadir a la fase móvil con el fin de formar un par iónico hidrofóbico,

incrementando de esta forma la retención del soluto en la fase estacionaria.

Supresión iónica

Para separar compuestos iónicos, caracterizados por poseer retenciones muy

bajas, modificar el pH de la fase acuosa mediante un amortiguador podría ser una

solución para aumentar l retención del soluto en la fase estacionaria. Ajustando el pH en

la fase móvil de forma que éste inhiba, total o parcialmente, la disociación de los grupos

ácidos o básicos de estos compuestos podríamos aumentar la afinidad de los solutos por

la fase estacionaria.

El valor de pH adecuado dependerá en gran parte de los valores de pKa de los

grupos ionizables.
Introducción 99

No es aconsejable la utilización de fases móviles cuyos pH sean inferiores a 2.5

ni superiores a 7.5 debido a que pueden producir efectos hidrolíticos catalizados por

protones o hidroxilos, que pueden dañar irreversiblemente la estructura de la fase ligada,

lo que limita la utilización de esta técnica para grupos muy ácidos, como es el caso de

grupos sulfónicos.

Supresión de la solubilidad

Otra forma de separar cromatográficamente compuestos iónicos, como se ha

dicho anteriormente, es controlar la solubilidad del soluto en la fase móvil mediante el

conocido efecto salino. Dicho fenómeno consiste en favorecer la extracción de un

determinado soluto por adición de sales a la fase acuosa, es decir aumentando la fuerza

iónica de la misma. Dicho efecto aplicado a una técnica como la cromatografía líquido-

líquido con fases ligadas se basa en que al aumentar la fuerza iónica de la fase móvil,

disminuye la solubilidad del soluto en la misma y aumenta en la fase estacionaria, de

forma que conseguimos aumentar la retención de los compuestos iónicos.

Formación de pares iónicos

Se trata de otro tipo de cromatografía para separar compuestos iónicos. Se basa

en la eliminación de la carga del soluto mediante la formación de un par iónico, con un

contraión de naturaleza orgánica o inorgánica que se añade en la fase móvil. De esta

forma, la carga final del contraión conjugado con el soluto resulta muy pequeña, con lo

cual tenemos un conjunto hidrofóbico de baja polaridad.

Contraión + Soluto hidrofílico → Par iónico hidrofóbico

100 Introducción

Un aspecto importante de este tipo de cromatografía es la naturaleza del

contraión, que puede ser de tres tipos:

a) Inorgánico (ClO4-, H2PO4-)

b) Orgánico de polaridad intermedia (ácidos alquilsulfónicos, tetrabutilamonio)

c) Orgánico de escasa polaridad en la zona no ionizable (alquilsulfonatos de

cadena larga, dioctilamonio, etc).

La selección de los mismos depende del tipo de analito. Es preferible que sea

univalente, aprótico, soluble en la fase móvil, que no participe en equilibrios adicionales

y no corrosivo para el sistema cromatográfico. Los más empleados son:

a) Para solutos aniónicos:

i. Aminas cuaternarias (tetrametil-, tetrabutilamonio)

ii. Aminas terciarias (trioctilamina)

b) Para solutos catiónicos:

i. Alquil y aril sulfonatos

ii. Ácido perclórico

iii. Alquil y lauril sulfato

La concentración óptima del contraión en la fase móvil es difícil de predecir, por

lo que es conveniente optimizarla en cada aplicación. Además, son aspectos importantes

el pH y porcentaje del disolvente orgánico de la fase móvil.

Por tanto, para lograr una buena discriminación entre solutos mediante esta

técnica cromatográfica es necesario optimizar cada uno de los parámetros anteriormente

nombrados.
Introducción 101

ANÁLISIS ESTADÍSTICO ELEMENTAL

Las técnicas matemáticas que se han aplicado en la presente Memoria pueden

incluirse dentro del grupo de las técnicas estadísticas básicas o elementales.

El análisis estadístico elemental incluye una gran variedad de parámetros que

van desde aquellos que tratan de evaluar la exactitud y la precisión de una

determinación hasta los relacionados con los cálculos de rectas de regresión, límites de

detección y cuantificación. De los utilizados en la presente Memoria se va a hacer sólo

una breve mención puesto que son suficientemente conocidos.

Parámetros estadísticos descriptivos clásicos

- Media aritmética. Es la suma de todas las medidas dividida por el número de

determinaciones

n
∑ xi
i =1
x=
n

- Desviación estándar, s. Es la medida más utilizada de la variabilidad y viene definida

por la fórmula:

n
∑ ( xi − x ) 2
i =1
s=
n −1

- Varianza. Es el cuadrado de la desviación estándar.

102 Introducción

- Coeficiente de variación, C.V. también es conocido como desviación estándar relativa,

cuyas unidades se expresan en porcentaje y viene definido por:

s
C.V .(%) = × 100
x

- Amplitud total, At. También se denomina intervalo y es otra medida de la dispersión

que viene definida por la diferencia entre el valor máximo y el mínimo

At = x máx − x min

- Intervalo de confianza del la media. Conocer este intervalo implica en qué intervalo se

puede decir que está incluido el valor verdadero, para un intervalo de confianza dado.

s
µ = x±t
n

Test estadístico t de Student

Se ha utilizado para determinar si la ordenada en el origen de las rectas de

calibrado propuestas es despreciable.

El valor de t viene dado por:

(x − µ )
t cal =
s
n

Si el valor absoluto de tcal es menor que un cierto valor crítico, que es el valor de

t tabulado para (n – 1) grados de libertad y a un nivel de significación α, entonces se

acepta la hipótesis nula, esto es, se concluye que al nivel de significación escogido y

con ese tamaño de muestra, no existen diferencias estadísticamente significativas entre

el valor medio calculado y el valor verdadero, µ. En el caso de la ordenada en el origen,

Introducción 103

el valor verdadero µ será cero y x será el valor de la ordenada en el origen de la recta de

calibrado.

Métodos de correlación

En muchas ocasiones, dos o más variables se miden en los mismos objetos o

individuos y es importante encontrar una medida cuantitativa de la relación entre estas

variables dependientes. Con este fin se pueden utilizar la covarianza y el coeficiente de

correlación, puesto que ambos expresan cuantitativamente la relación lineal entre

variables. En general, se prefiere utilizar el coeficiente de correlación, r, puesto que es

independiente de las escalas de medida escogidas, el cual viene dado por la ecuación:

r=
∑ [(xi − x )(yi − y )]
( ) ( )
1/ 2
 2  2 
 ∑ xi − x  ∑ y i − y  
  

El coeficiente de correlación puede tomar valores entre –1 y +1. El máximo

valor absoluto de correlación es uno y se encuentra cuando entre ambas variables existe

una correlación perfecta. Cuando no existe correlación el valor de r es cero, aunque esto

no significa que estas dos variables no estén relacionadas sino que no lo están

linealmente. Debe tenerse en cuenta que el cálculo de r generará siempre un valor aun

cuando la relación entre los datos sea claramente de carácter no lineal, por lo que

siempre es necesario representar gráficamente los puntos, ya que, si no es así, del

cálculo de r se puede deducir erróneamente una relación de carácter lineal.

Cuando tenemos más de dos variables aleatorias es interesante utilizar la matriz

de correlación, donde se representan las correlaciones entre todos los pares posibles de
104 Introducción

variables. Resulta así una matriz cuadrada con igual número de filas que de columnas e

igual número de variables, donde los elementos de la diagonal son todos 1 mientras que

los elementos de fuera de la diagonal tienen valores entre –1 y +1.

Rectas de calibración (Regresión por mínimos cuadrados)

En las técnicas de análisis instrumental la concentración de una muestra no

puede ser medida directamente, sino que es determinada a través de la medida de una

cantidad física o señal, y. La condición para poder relacionar esta medida es que haya

una relación empírica o teórica no ambigua entre ella y la concentración, x. Para la

mayoría de las técnicas analíticas dicha relación se expresa mediante la siguiente

ecuación:

y = α + βx + ε

donde α y β representan los valores verdaderos de los parámetros denominados

ordenada en el origen y pendiente, respectivamente, y ε es el valor de error aleatorio

asociado a la respuesta, y. Dado que α, β y ε representan valores verdaderos,

conceptualmente éstos nunca podrán calcularse con total certeza. En la práctica

hallaremos estimaciones de estos valores. Dichas estimaciones se representan mediante

los términos a, b y e. Así, para n pares de valores concretos (xi, yi) se posee la relación:

yi = a + bxi + ei i = 1, 2,..., n

El problema del establecimiento del modelo consiste en hallar las estimaciones a

y b. Como sabemos, en todo proceso de calibración se considera la existencia de errores

ei en las respuestas yi. Los valores ei reciben el nombre de residuos y representan las

diferencias entre los valores yi observados y los valores de y predichos por el modelo.
Introducción 105

Por el contrario, se considera que las variables independientes utilizadas en el

establecimiento del modelo, xi, están libres de error o éste es muy pequeño comparado

con los ei. Esta condición es realista en los problemas de calibración, donde se considera

que los errores cometidos al preparar los patrones de calibración son significativamente

más pequeños que los errores de medida.

Las estimaciones a y b de la mejor recta en la cual se haya minimizado la

influencia de estos errores, ei, se puede calcular mediante diversos criterios

matemáticos, pero normalmente se utiliza el método de mínimos cuadrados, que

minimiza la suma de los cuadrados de los residuos.

∑ ei 2 = ∑ [yi − (a + bxi )]
2

mediante la derivación de esta expresión respecto a a y b e igualando a cero, se obtienen

las expresiones de la pendiente y la ordenad en el origen presentadas a continuación:

b=
∑ (xi − x )(yi − y )
∑ (xi − x )
2

a = y − bx

donde x e y son los valores medios del conjunto de valores de x e y, respectivamente.

La recta de regresión calculada se utiliza para estimar la concentración de las

muestras problema por interpolación. La precisión de la estimación depende del error de

la medida de la muestra y del intervalo de confianza de la curva de calibración, lo cual

está relacionado con la incertidumbre de las estimaciones a y b. A partir de las

106 Introducción

expresiones de la pendiente y la ordenada en el origen se pueden calcular sus

desviaciones estándar, Sa y Sb que vienen dadas por:

1/ 2
 ∑ xi 2 
Sa = S y / x  2
 n∑ ( xi − x) 
Sy/x
Sb =
{∑ ( xi − x ) 2 }
1/ 2

donde x es la media aritmética de los valores del eje de abscisas y Sy/x es la estimación

de la desviación estándar de los errores de las respuestas o residuos:

1/ 2
 ∑ ( y i − yˆ i ) 2 
Sy/x = 
 n−2 

siendo ŷi los valores de las respuestas calculadas de acuerdo con el modelo.

Los valores de Sa y Sb se pueden utilizar para calcular los límites de confianza

para la pendiente y la ordenada en el origen. Así, en esta Memoria, los límites de

confianza para la pendiente estarán dados por b ± tSb, donde el valor de t se obtiene para

un nivel de confianza deseado y (n-2) grados de libertad. De manera similar los límites

de confianza para la ordenada en el origen están dados por a ± tSa.

Para estimar si los puntos experimentales se ajustan bien o no al modelo

propuesto de línea recta, se calcula el coeficiente de correlación, que se diferencia de los

de regresión en que se utiliza para investigar la relación entre dos variables aleatorias y,

por tanto, con errores en ambas. Sin embargo, el coeficiente de correlación es válido

para evaluar la linealidad en métodos de regresión porque está relacionado con el

coeficiente de regresión a través de las desviaciones estándar de las variables. No

Introducción 107

obstante, es más útil calcular el coeficiente de determinación, r2, puesto que en la recta

de regresión tiene el significado de la parte de variación de y que es explicada por x; así,

si r2 = 0.98 significa que el 98 % de la variación puede ser explicada por x y sólo un 2%

permanecería sin ser explicada si ajustamos a un modelo lineal.

Comparación de las pendientes de dos rectas de calibrado

Cuando tenemos dos pendientes empíricas, b1 y b2, y se trata de decidir si son

iguales o no, existe un test estadístico que nos permite realizar esta comparación.

En primer lugar, se aplica la prueba de la F para evaluar si las varianzas de las

dos pendientes son iguales. Se calcula un valor F que viene dado por la siguiente

expresión:

S b1 2
F=
Sb2 2

Este valor experimental de F se compara con un valor teórico (Ft) que es calculado para

un número adecuado de grados de libertad (n1-1 y n2-1) para un nivel de confianza dado.

Si F es menor que Ft no hay una diferencia estadísticamente significativa entre las

varianzas estimadas de los residuos de ambas líneas.

El test se realiza calculando una varianza estimada conjunta de las pendientes de

las dos rectas de calibrado, Sb1,22, a través de la siguiente ecuación:

2 2
2 (n − 2) S b1 + (n2 − 2) S b 2
S b1, 2 = 1
n1 + n2 − 4

y comparando el valor de tcalculado

b1 − b2
t calculado = 1/ 2
  1 1 
 S b1, 2 2  + 
 ∑ i1 ∑ i 2 2 
  ( x − x 1 ) 2
( x − x ) 2 
108 Introducción

con el valor de ttabulado con n1 + n2 - 4 grados de libertad para el intervalo de confianza

elegido. Si el tcalculado es menor que el ttabulado se asume que no existen diferencias

significativas entre las pendientes de ambos calibrados.

Si existe una diferencia estadísticamente significativa entre las varianzas

estimadas de los residuos de ambas rectas, el test se lleva a cabo calculando otro valor
de t:
b1 − b2
t=
( S b1 2 + S b 2 2 )1 / 2

siendo b1, b2, Sb12 y Sb22 las pendientes de las respectivas rectas de calibrado y sus

respectivas varianzas. En este último caso, el valor de tcalculado se compara con el valor

teórico de t:

t1 S b12 + t 2 S b 2 2
t=
S b1 2 + S b 2 2

donde t1 y t2 son los valores teóricos, obtenidos a partir de las tablas para un nivel de

significación elegido y n1-2 y n2-2 son los grados de libertad respectivos. Si tcalculado es

menor que t no existen diferencias estadísticamente significativas entre las pendientes.

PARTE EXPERIMENTAL
MATERIAL Y DISOLUCIONES
Material y disoluciones 113

INSTRUMENTACIÓN UTILIZADA

Equipos de electroforesis capilar

1. Equipo Beckman P/ACE 5500 con detector de diodos en línea, controlado por

un ordenador equipado con el programa Beckman P/ACE para el registro y tratamiento

de los datos.

2. Equipo Beckman MDQ con detector de diodos en línea, controlado por un

ordenador con el programa Beckman MDQ para el registro y tratamiento de los datos.

En estos equipos se utilizan capilares Beckman de sílice fundida de 50 cm de

longitud efectiva, cuyos diámetros interno y externo son, respectivamente, 75 y 375 µm,

alojados en una carcasa con una ventana de detección de 800 × 100 µm.

Equipos de HPLC

1. Cromatógrafo Shimadzu LC-10A con detector de diodos en línea SPD-M10A,

equipado con un sistema de doble bomba, que permite trabajar en gradiente. El inyector

es una válvula Rheodyne 7725 con un bucle de 20 µL. El sistema cromatográfico está

controlado por un ordenador Silicon 486/33 equipado con el programa CLASS-LC 10,

que permite controlar tanto el registro como el tratamiento de los datos.

2. Cromatógrafo Waters serie 35 con detector de longitud de onda variable

Waters 486, equipado con un sistema de cuádruple bomba, que permite trabajar en

gradiente. El inyector es una válvula Rheodyne modelo 7125 con un bucle de 20 µL. El

sistema está controlado por un ordenador NEC 386/25 equipado con el programa Water

Baseline, que permite tanto el registro como el tratamiento de los datos.

114 Material y disoluciones

La columna analítica utilizada en cromatografía es una Kromasil C18 de 150 mm

de longitud y 4.6 mm de diámetro interno, con un tamaño de partícula de 5 µm.

Medidas de pH

Las medidas de pH realizadas en todos los estudios presentados se obtuvieron

con un equipo digital Crison, modelo 74, con una sensibilidad de ± 0.01 unidades de

pH, que está provisto de un electrodo combinado de vidrio y Ag/AgCl.

Balanzas

Las cantidades necesarias para preparar las disoluciones de los analitos se

obtuvieron por pesada en una balanza Sartorius MC1, con resolución para 0.01 mg.

Para preparar las disoluciones que no eran de analitos se utilizó un granatario

Sartorius basic, con resolución para 0.1 g.

Aparato de purificación de agua

El agua utilizada en la preparación de todas las disoluciones fue obtenida

mediante el sistema de purificación Elix/Milli-Q.

Material y disoluciones 115

DISOLUCIONES UTILIZADAS

Disoluciones de analitos

Se consideran analitos todos los compuestos químicos estudiados en este trabajo

para ser determinados, es decir, sulfamidas, compuestos asociados, productos de

degradación y metabolitos. He aquí las características de las disoluciones utilizadas en

este trabajo.

Compuesto Procedencia Disolvente Concentración (mg/L)

Sulfametacina sódica Sigma H2O 100
Sulfaquinoxalina sódica Sigma EtOH : H2O (50:50) 100
Menadiona Merck EtOH : H2O (50:50) 100
Pirimetamina Sigma EtOH 100
Trimetoprim Sigma EtOH : H2O (50:50) 100
Sulfametoxipiridacina Sigma HCl 1M + H2O 100
Sulfametoxazol Sigma EtOH : H2O (50:50) 100
Sulfadimetoxina sódica Sigma H2O 100
Bromhexina, clorhidrato Sigma EtOH : H2O (10:90) 100
Sulfadiacina sódica Vorquímica H2O 100
Guayacol potásico Sigma H2O 100
Ácido trimetoxibenzóico Sigma EtOH : H2O (50:50) 150
Sulfanilamida Sigma EtOH : H2O (50:50) 150
Ácido sulfanílico Sigma H2O 150
Trimetoprim-1-óxido Roche EtOH : H2O (50:50) 220
Trimetoprim-3-óxido Roche EtOH : H2O (50:50) 210
N4-acetil-sulfametoxazol Roche EtOH : H2O (50:50) 210
116 Material y disoluciones

Disoluciones reguladoras

Se prepararon disoluciones de concentración 100 mM de fosfato, borato y citrato

a partir de sus correspondientes sales sódicas añadiendo HCl o NaOH hasta alcanzar el

pH deseado en cada caso.

Disolución de dodecilsulfato sódico (SDS)

Se prepararon disoluciones de SDS de concentración 200 mM a partir del

reactivo sólido, proporcionado por Sigma. La dilución exacta de las mismas

proporciona disoluciones de menor concentración.

Otras disoluciones y disolventes utilizados

Disoluciones de hidróxido sódico y ácido clorhídrico de diferentes

concentraciones, utilizadas en el estudio del pH y preparadas a partir de reactivos de

calidad analítica.

Los disolventes utilizados fueron de calidad “para análisis” en electroforesis

capilar y “HPLC” en cromatografía líquida.

 CAPÍTULO I

DETERMINACIÓN DE SULFAQUINOXALINA,

SULFAMETACINA, PIRIMETAMINA Y MENADIONA

EN PRODUCTOS ZOOSANITARIOS

POR CROMATOGRAFÍA ELECTROCINÉTICA MICELAR

Capítulo I 119

I.1. INTRODUCCIÓN

Las sulfamidas son agentes antibacterianos y antiinfecciosos, utilizados

ampliamente en medicina y en veterinaria porque se absorben rápidamente.

En la actualidad, los productos comerciales tanto para uso médico como para uso

veterinario contienen, frecuentemente, sulfamidas combinadas con otros compuestos que

incrementan su actividad, llamados potenciadores. La acción terapéutica de estas

combinaciones puede completarse con vitaminas, expectorantes u otros compuestos

asociados.

La sulfaquinoxalina (SQX) es una sulfamida cuyo radical R’ está constituido por la

quinoxalina (benzopiracina), siendo R un átomo de H. Se absorbe fácilmente por el tracto

gastrointestinal y produce niveles sanguíneos persistentes. Bacteriostático respecto a un

gran número de microbios intestinales, tiene la particularidad de presentar una gran eficacia

contra la coccidiosis de las aves. Frecuentemente se utiliza asociada a un potenciador, la

pirimetamina (PMT), en proporciones 3:1 y se excreta en parte por la orina y en parte por

las heces. No obstante, existen productos veterinarios que presentan asociada otra

sulfamida, la sulfametacina (SMT) y una vitamina, la menadiona (MEN) o vitamina K3, por

lo que se consideró de interés incluir estos dos últimos compuestos en este trabajo para su

determinación conjunta.

El interés por abordar la resolución de esta mezcla radica en el gran uso que se hace

de ella en la práctica veterinaria. El presente estudio se ha realizado con la finalidad de

establecer nuevos métodos analíticos que permitan la determinación simultánea, rápida y

económica de SQX, SMT, PMT y MEN utilizando el gran poder de resolución de la

electroforesis capilar.
120 Capítulo I

CH3
N
H2N SO2NH CH3 H2N SO2NH
N

SMT
SQX

O
N CH3
Cl NH2
N
H2N
O

PMT MEN

Figura I.1. Estructuras químicas de SMT, SQX, MEN y PMT.

La estabilidad de las disoluciones de SQX, SMT y PMT y el efecto del pH sobre sus

espectros de absorción ha sido ampliamente estudiado en nuestros laboratorios. A modo de

resumen, se comentan a continuación algunos aspectos en cuanto a estabilidad de las

disoluciones y cálculo de pKa por métodos espectrofotométricos, ya realizados en nuestros

laboratorios.
Capítulo I 121

I.1.1. Estabilidad de las disoluciones de sulfaquinoxalina, sulfametacina, menadiona y

pirimetamina

En primer lugar se estudió el comportamiento en disolución de cada una de las

drogas. Así, se estudió el disolvente apropiado, la estabilidad de sus disoluciones y la

influencia que ejerce el pH sobre los espectros de absorción UV-VIS de cada una de las

drogas.

1. Estabilidad de las disoluciones de sulfaquinoxalina

Se preparó una disolución en etanol-agua al 50% de SQX (10-3 M), estudiándose su

estabilidad a través de disoluciones diluidas de concentración 4×10-5 M y que fueron

preparadas diariamente a partir de la anterior. Se observó que los espectros de absorción, así

obtenidos, se mantenían invariables durante un mes.

Por otra parte, se prepararon disoluciones diluidas de SQX (4×10-5 M) con un

contenido del 10% de etanol a diferentes valores de pH, ácido, neutro y básico, a las que se les

estudió su estabilidad en estos medios registrando sus espectros cada 15 minutos, los cuales no

mostraron variaciones apreciables durante, al menos, dos horas.

2. Estabilidad de las disoluciones de sulfametacina

Se preparó una disolución en etanol agua al 50% de SMT (10-3 M), estudiándose su

estabilidad con el tiempo a través del registro diario de los espectros de absorción de

disoluciones diluidas, de concentración 4×10-5 M, observándose que son estables al menos

durante un mes.

Posteriormente se procedió a estudiar la estabilidad de las disoluciones diluidas (4×10-5

M) de SMT en distintos porcentajes de etanol. Para ello se prepararon tres disoluciones de

SMT conteniendo 10, 25 y 50 % de etanol, registrándose sus espectros de absorción cada 15

122 Capítulo I

minutos durante aproximadamente dos horas. Se pudo observar que, para el espacio de tiempo

estudiado, los espectros de absorción permanecían invariables o bien no mostraban cambios

apreciables.

3. Estabilidad de las disoluciones de pirimetamina

Se prepararon disoluciones de concentración 10-3 M de PMT en etanol-agua al 10, 50 y

96%, a las que se les estudió la estabilidad diariamente haciendo diluciones 1:25 y registrando

posteriormente su espectro de absorción UV-VIS. Se observó que los espectros obtenidos para

las muestras con 10 y 50 % de etanol mostraban modificaciones apreciables al segundo día,

mientras que la disolución preparada en 96 % de etanol presentaba espectros que no

mostraban variaciones apreciables al menos durante 18 días.

Se estudió la estabilidad de las disoluciones diluidas de PMT (4×10-5 M) con un

contenido en etanol del 10 % (v:v) a diferentes valores de pH. Para ellose registraron los

espectros de absorción de cada una de las muestras cada 15 minutos y se comprobó que en

todos los casos, los espectros no presentaron variaciones apreciables durante al menos una

hora.

4. Estudio de la estabilidad de las disoluciones de menadiona

Se preparó una disolución en etanol al 96 % de MEN (100 mg/L) a la que se le estudió

la estabilidad aprovechando las separaciones electroforéticas que se iban efectuando día a día.

Las muestras, que se preparaban por dilución 1:5 a partir de la disolución madre, se inyectaban

en el equipo de electroforesis capilar y, gracias al sistema de diodos en línea, se iban

almacenando diariamente los espectros de absorción UV-VIS correspondientes a MEN. Se

observó que durante un período de un mes las disoluciones preparadas a partir de la disolución

madre de MEN presentaban espectros de absorción invariables.

Capítulo I 123

I.1.2. Influencia del contenido de etanol

En este trabajo se ha utilizado la sal sódica de la SMT, lo cual hace posible la

preparación de sus disoluciones en agua y evita la necesidad de emplear disolventes orgánicos.

Los otros tres compuestos estudiados son poco solubles en agua, siendo necesaria la presencia

de algún disolvente orgánico, que permita la preparación de disoluciones estables. Como la

variación del contenido de etanol puede modificar los espectros de absorción, es necesario

estudiar la influencia que ejerce este disolvente y seleccionar el porcentaje óptimo.

Se prepararon, en 50% de etanol, muestras independientes de SQX y PMT de

concentración 10-3 M, a partir de ellas se prepararon por dilución (1:25) muestras de

concentración 4×10-5 M que contenían distintos porcentajes de etanol (10, 25, 50 y 80%). Los

máximos de los espectros de absorción de SQX no mostraron variaciones apreciables al variar

el porcentaje de etanol en las muestras, mientras que los espectros de PMT mostraron un

ligero desplazamiento batocrómico a la vez que un ligero desplazamiento hipsocrómico al

disminuir el porcentaje de etanol de la muestra.

En el caso de MEN, se observó que solamente se disolvía completamente en etanol al

96% (v:v), por lo que no se estudió la influencia del contenido en etanol sobre sus

disoluciones.
124 Capítulo I

I.1.3. Influencia del pH sobre los espectros de absorción

Se prepararon, por separado, disoluciones de 500 ml con concentraciones de 10

mg/L de SMX, SMT, MEN y PMT. El pH se ajustó adicionando pequeñas cantidades de

disolución de NaOH o HCl, de concentración variable, sobre los 500 ml de disolución, de

tal manera que el error por dilución resultó despreciable. Finalmente, se registraron los

espectros de absorción entre 200 y 350 nm frente a un blanco.

Utilizando los datos obtenidos en el apartado anterior, se procedió a determinar las

constantes de ionización de SQX, SMT y PMT. Para ello se utilizaron dos métodos

espectrofotométricos, el de Stenstrom y Goldsmith (154) y el de Wilson y Lester (155). En

el caso de MEN, no se observaron características ácido–base. Igualmente, en la bibliografía

consultada no aparece ningún valor de pKa para esta molécula. Los valores medios de pKa

obtenidos por los dos métodos se muestran a continuación en la tabla I.1 y se comparan con

los encontrados en bibliografía (31)

Tabla I.1. Valores de pKa para SQX, SMT y PMT.

Stenstrom y Goldsmith Wilson y Lester Bibliografía

SQX 6.70 6.68 6.7

SMT 7.56 7.56 7.4

PMT 6.66 6.66 7.0

Capítulo I 125

I.2. ESTUDIO DE LOS PARÁMETROS EXPERIMENTALES

I.2.1. Estudios preliminares

Se prepararon disoluciones madres de 100 mg/L de SQX en etanol-agua (25:75), de

SMT en agua y de MEN y PMT en etanol al 96 % (v:v). A partir de éstas y por dilución se

preparó, en un matraz de 25 mL, una disolución, que llamaremos “A”, y que contenía 40,

30, 20 y 20 mg/L de SQX, SMT, MEN y PMT respectivamente. Esta disolución “A” se

utilizó para optimizar todos los parámetros, químicos e instrumentales, que influyen en la

separación.

El equipo utilizado fue un Beckman P/ACE 5500, dotado con un detector de diodos

en línea, y controlado por ordenador. Las separaciones se llevaron a cabo en un capilar de

sílice fundida de 50 cm de longitud efectiva, 75 µm de diámetro interno, y 375 µm de

diámetro externo, con recubrimiento de poliamida. Para su refrigeración por líquido, el

capilar estaba alojado en una carcasa con una ventana de detección de 100 × 800 µm.

PMT

MEN

SMT

SQX

1 3 5 7 9 11 13
pH

forma forma forma

catiónica neutra aniónica

Figura I.2. Esquema de la ionización de SMT, SQX, MEN y PMT en función del pH
126 Capítulo I

Debido a los diferentes valores de pKa de las moléculas en estudio (Tabla I.1), no se

pudo encontrar ningún pH al cual todas ellas estuviesen ionizadas, bien como cationes, bien

como aniones (Figura I.2). Las sulfamidas, SQX y SMT, se encuentran en su forma

aniónica a los valores de pH superiores a sus pKa. Por el contrario, PMT se encuentra en su

forma neutra por encima de su pKa, ya que éste corresponde a la desprotonación de los

grupos amino cuaternarios. En cuanto a MEN, se puede afirmar que permanece en su forma

neutra a lo largo de toda la escala de pH, ya que es totalmente insoluble en agua, y que no

presenta en su estructura ningún grupo químico con características de tipo ácido-base.

Por esta razón se tuvo que acudir al empleo de la técnica de MEKC para plantear la

separación, de manera que los analitos ionizados se separasen de acuerdo a su relación

carga/radio y que los analitos neutros se separasen en función de sus constantes de afinidad

con un agente micelar. En el caso que nos ocupa, se seleccionó el dodecilsulfato sódico

(SDS) como agente micelar por ser el que se utiliza comúnmente en MEKC.

Como se ha comentado anteriormente, se necesita un pH básico para que las

sulfamidas se desprotonen y adquieran carga negativa. Debido a su pKa1 = 9.2, el tampón

borato proporciona un pH suficientemente básico para este fin, por lo que fue seleccionado

inicialmente para fijar el pH. Así, las separaciones preliminares fueron efectuadas

utilizando tampón borato ajustado a pH 9.2, lo cual asegura que su capacidad reguladora es

máxima. Además, el borato es un tampón recomendado para EC porque genera baja

corriente.
Capítulo I 127

I.2.2. Influencia del modificador orgánico

Inicialmente, se realizaron separaciones de la muestra tipo “A” a 20 kV y 25 ºC,

utilizando como electrolito de separación 20 mM de tampón borato de pH = 9.2 y 30 mM

de SDS. En estas condiciones, SMT y SQX no aparecían bien resueltos por lo que se

decidió incorporar al electrolito de separación una cierta cantidad de modificador orgánico

y observar su influencia.

En electroforesis capilar hay veces que conviene mejorar la selectividad de la

separación. Para ello se suele adicionar al electrolito un modificador orgánico que facilite la

disolución de los analitos más apolares en el electrolito, disminuyendo así la adsorción de

los mismos sobre la pared del capilar. Además, el modificador orgánico puede alterar la

constante dieléctrica (ε) del electrolito de separación y variar el coeficiente de reparto del

analito entre la micela y el electrolito que la envuelve.

Los disolventes orgánicos que se utilizaron en este estudio fueron etanol y

acetonitrilo, y su concentración se varió para obtener porcentajes entre el 3 y el 15 % (v:v)

en el electrolito de separación.

Cuando se utilizó el etanol se observó que los picos de SMT y SQX quedaban

parcialmente solapados en todo el intervalo de concentraciones estudiado y, además, en

algunos de los casos presentaban hombros. Por el contrario, los picos de PMT y MEN

aparecían bien resueltos pero eran considerablemente anchos.

Cuando se estudió el efecto del acetonitrilo, se observó que para una concentración

del 6 % mejoraba la resolución entre SMT y SQX a la vez que desaparecían los hombros

que mostraban (Figura I.3)

128 Capítulo I

Además, los picos de PMT y MEN aparecían bien separados y sus anchos

disminuían considerablemente. Asimismo, se observó que al aumentar el contenido en

disolvente orgánico, los tiempos de migración de los analitos aumentaban, tanto en

presencia de metanol como de acetonitrilo. Este comportamiento puede explicarse porque

un aumento del disolvente orgánico provoca un aumento en la viscosidad del electrolito de

separación, disminuyendo considerablemente la velocidad del flujo electroosmótico, lo que

origina que los tiempos de migración de los compuestos sean mayores, de manera que

aumentan los tiempos de análisis. En cuanto a los anchos de pico, la disminución de las

movilidades de los analitos como consecuencia de la adición de un disolvente orgánico

conlleva, a su vez, un aumento de la dispersión del analito por difusión, por lo que

aumentan los anchos de pico. Este efecto es más acusado en presencia de etanol que en

presencia de acetonitrilo.

Teniendo en cuenta tiempos de migración, anchos de pico y forma de los

electroferogramas se seleccionó como óptima una concentración de acetonitrilo del 6 % en

el electrolito de separación ya que, trabajando en estas condiciones, se conseguían buenas

resoluciones entre SMT y SQX en un corto tiempo de análisis.

Capítulo I 129

Tabla I.2. Tiempos de migración de los analitos a diferentes concentraciones de

modificador orgánico en el electrolito de separación (20 mM borato pH 9.2 y 30 mM SDS)

Porcentaje de disolvente orgánico (%)

0 3 6 9 12 15
FEO EtOH 3.870 4.284 4.850 6.014 6.198 7.113
MeCN 3.870 4.120 4.409 4.630 4.933 5.249
Tiempos de migración (min)

SMT EtOH 5.434 6.018 6.968 8.455 9.265 10960

MeCN 5.434 5.829 6.319 6.801 7.452 8.202
SQX EtOH 5.480 6.094 7.063 8.562 9.369 11.066
MeCN 5.480 5.896 6.398 6.891 7.552 8.328
MEN EtOH 7.614 8.104 9.155 10.631 11.314 12.777
MeCN 7.614 7.970 8.426 8.698 8.828 8.923
PMT EtOH 9.769 11.139 13.445 >15 >15 >15
MeCN 9.769 11.038 12.453 13.491 13.861 14.117

30
6 % Acetonitrilo
SQX 6 % Etanol
25 SQX

20

15
mAu

SMT

10 SMT

6.0 6.5 7.0 7.5

Tiempo de migración (min)
Figura I.3. Detalle de la resolución de SQX y SMT utilizando 6 % de etanol y acetonitrilo

como modificadores orgánicos.

130 Capítulo I

I.2.3. Influencia de la concentración de SDS

Como se explicó en el capítulo de introducción teórica, la modalidad de

cromatografía electrocinética micelar se basa en la presencia en el electrolito de separación

de un surfactante que tenga la capacidad de formar agregados micelares. Tal es el caso del

SDS, que presenta esta capacidad a concentraciones superiores a 10 mM.

Cuando hay agregados micelares en el medio electroforético, las moléculas neutras,

que en CZE se moverían en el campo eléctrico a la velocidad del flujo electroosmótico,

pueden interaccionar con las micelas, que actúan a modo de fase pseudo-estacionaria.

Como la parte exterior de las micelas presenta carga, negativa en este caso, éstas migrarán

en el campo eléctrico como un compuesto aniónico más, pero con una velocidad aparente

muy baja, llevando en su seno el analito en su forma neutra. El tiempo de residencia de los

compuestos dentro de la micela condicionará la posición del analito neutro dentro de la

“ventana de detección” o “ventana de trabajo”

La influencia de la concentración de SDS en el electrolito de separación sobre el

tiempo de migración se muestra en la figura I.4. Todos los electroferogramas fueron

registrados utilizando un potencial de 20 kV, una temperatura de 25 ºC y un electrolito de

separación compuesto por tampón borato 20 mM, y 6 % (v:v) de acetonitrilo, en el que la

concentración de SDS se fue variando desde 0 hasta 80 mM. Los resultados muestran que

un aumento en la concentración de SDS no afecta sensiblemente a los tiempos de migración

de SQX y SMT. La pequeña variación en los tiempos de migración de estos dos

compuestos se debe a que, al aumentar la concentración de SDS se modifica también la

fuerza iónica del electrolito de separación, disminuyendo el potencial zeta de la doble capa

y, como consecuencia, la velocidad del FEO, lo cual provoca un ligero aumento de los
Capítulo I 131

tiempos de migración de SQX y SMT. Este comportamiento puede explicarse porque, a

este pH, SQX y SMT presentan carga negativa al igual que las micelas, produciéndose

repulsiones electrostáticas que evitan la interacción entre ambos. Por el contrario, la

concentración de SDS ejerce una influencia notable sobre los tiempos de migración de

MEN y PMT ya que estos compuestos están en su forma neutra al pH de la separación, por

lo que interaccionan con las micelas del medio. Esto se constata al observar que, a medida

que aumenta la concentración de SDS, los tiempos de migración de MEN y PMT aumentan

notablemente.

Mientras que para bajas concentraciones de SDS los tiempos de migración de MEN

y PMT son bajos, llegando a solapar con los de SMT y SQX, a medida que se aumenta la

concentración de SDS aumentan las interacciones de los primeros con los agregados

micelares, produciendo un claro efecto de diferenciación de sus tiempos de migración.

Cabe destacar el efecto que la concentración de SDS tiene sobre PMT, ya que

incluso a bajas concentraciones produce un cambio en la selectividad de la separación,

pasando de tener el menor tiempo de migración al mayor cuando la concentración de SDS

es 15 mM. En vista de los resultados de este estudio y para posteriores experiencias, se

seleccionó como óptima una concentración de 40 mM de SDS en el electrolito, porque en

estas condiciones se consiguen picos estrechos, bien resueltos y en un tiempo de análisis

aceptable.
132 Capítulo I

Tabla I.3. Variación de los tiempos de migración con la concentración de SDS

SDS (mM) Tiempo de migración (min)

FEO SMT SQX MEN PMT

0 4.008 5.730 5.730 4.008 4.008

15 4.301 6.158 6.242 6.387 10.367
30 4.496 6.517 6.600 8.750 13.296
40 4.600 6.708 6.796 10.021 14.721
50 4.712 6.933 7.025 11.296 16.246
60 4.676 7.196 7.300 12.821 18.146
70 4.710 7.383 7.496 14.075 19.675
80 4.740 7.463 7.604 15.512 >20

20.00
FEO
SMT
SQX
15.00 MEN
Tiempo de migraci n (min)

PMT

10.00

5.00

0.00

0.00 20.00 40.00 60.00 80.00

Concentración de SDS (mM)

Figura I.4. Influencia de la concentración de SDS en los tiempos de migración

Capítulo I 133

I.2.4. Influencia de la concentración del tampón

El efecto que produce sobre una separación electroforética la variación de la fuerza

iónica del medio no tiene por qué seguir una regla fija. En la gran mayoría de los casos, un

aumento de la concentración de tampón supone un aumento en los tiempos de migración,

mejorando la resolución y evitando, en algunos casos, distorsiones en los picos del

electroferograma debido a efectos de electrodispersión. Sin embargo, un aumento de la

concentración del tampón también ocasiona altas intensidades de corriente que recorren el

capilar generando mucho calor por efecto Joule y puede provocar el ensanchamiento de los

picos y pérdida de resolución.

Para optimizar este parámetro, se prepararon diferentes disoluciones de electrolito

de separación que contenían 40 mM de SDS, 6 % (v/v) de acetonitrilo y tampón borato de

concentraciones entre 10 y 40 mM. Las separaciones correspondientes se realizaron a 20

kV y 25 ºC.

En esta ocasión, dado que los tiempos de migración de los compuestos SMT y SQX

eran tan próximos, el tiempo de análisis se podría sacrificar a favor del parámetro crítico,

que resultó ser la resolución entre estos dos compuestos. En los electroferogramas

obtenidos, solamente a partir de una concentración de 20 mM de borato, los picos de estos

dos compuestos aparecieron sin solapamiento alguno.

Dentro de este comportamiento, se puede ver en la tabla I.4 que la máxima

resolución de SQX y SMT se produce para una concentración de 30 mM.

134 Capítulo I

Tabla I.4. Influencia de la concentración del tampón borato. Tiempos en minutos y

anchuras medidas al 50 % de la altura de los picos.

Concentración de Borato (mM)

10 20 30 40
FEO tm 4.325 4.554 4.821 5.046
SMT tm 6.050 6.637 7.225 7.767
Ancho 0.030 0.030 0.031 0.055
SQX tm 6.117 6.725 7.333 7.912
Rs 1.123 1.516 1.792 1.282
Ancho 0.029 0.029 0.031 0.034
MEN tm 8.879 9.863 10.946 12.067
Rs 20.877 14.381 9.417 14.682
Ancho 0.037 0.044 0.051 0.059
PMT tm 12.488 14.337 16.667 19.413
Rs 51.093 55.664 58.847 87.060
Ancho 0.042 0.051 0.061 0.078

En lo que concierne al ancho de pico, medido al 50 % de la altura, se puede ver que

a concentraciones mayores de 30 mM empezaba a aumentar sensiblemente, a la vez que

disminuía la altura del pico, particularmente aquellos con mayores tiempos de migración,

cosa que no es deseable con las miras puestas en la posterior integración de esos picos para

el análisis cuantitativo.

Esto se explica porque para una concentración de 30 mM de tampón se obtiene una

corriente de 48.7 µA lo cual produce una importante cantidad de calor por efecto Joule que

es difícil eliminar por medio del sistema de refrigeración.

Capítulo I 135

Finalmente, el aumento de fuerza iónica se tradujo en aumento de los tiempos de

migración y, por consiguiente, del tiempo de análisis, llegando a ser éste de casi 20 minutos

cuando la concentración es de 40 mM.

En consecuencia, y a la vista de los resultados, se consideró como óptima una

concentración de tampón borato en el electrolito de 30 mM porque, aunque el tiempo de

análisis sea algo elevado, la resolución de SQX, que en esta separación es crítica, es

máxima, mientras que a concentraciones mayores, se pierde resolución y además los picos

empiezan a ensancharse.

I.2.5. Efecto de la temperatura

Una vez optimizadas las variables químicas de la separación, abordamos la

optimización de las variables instrumentales, comenzando con la temperatura.

La temperatura se relaciona con la viscosidad del medio electroforético. De este

modo, un aumento de la temperatura disminuye la viscosidad, por lo que aumenta la

velocidad del FEO y, como consecuencia, la movilidad aparente de los compuestos. Todo

ello acorta el tiempo de análisis, aunque a veces a expensas de perder resolución. El

intervalo de trabajo suele oscilar entre 20 y 50 ºC, y aunque es habitual trabajar a

temperatura ambiente, lo más importante es mantenerla constante. Durante el proceso de

separación, se estudió el efecto de la temperatura en la migración de los compuestos. Para

ello, se utilizó como electrolito de separación una disolución que contenía tampón borato

30 mM de pH 9.2, SDS de concentración 40 mM y 6 % (v:v) de acetonitrilo. Todos los

electroferogramas se registraron a 25 kV, pero a diferentes temperaturas, comprendidas en

el intervalo de 20 a 40 ºC.
136 Capítulo I

Como se preveía, una aumento de la temperatura produjo una disminución de los

tiempos de migración y por consiguiente, del tiempo de análisis. Así, se puede ver que a

40ºC, la separación termina en menos de 11 minutos. Sin embargo, considerando que en el

electrolito hay un componente tan volátil como el acetonitrilo, se corría el riesgo de su

evaporación si la temperatura era elevada. Por otro lado, se observó que en todo el intervalo

de temperatura estudiado, los picos de SMT y SQX aparecían perfectamente separados, si

bien la máxima resolución de la SQX se producía a 20 ºC, disminuyendo gradualmente a

medida que aumentaba la temperatura de separación. Ante esta situación, hubo que

encontrar una solución de compromiso que tuviera en cuenta ambos factores.

La influencia de la temperatura sobre las anchuras de los picos no se consideró

significativa y la pequeña disminución que se observa se puede deber a que cuanto mayor

es la temperatura, menor es la viscosidad del medio y los tiempos de retención se acortan,

disminuyendo así la dispersión. Finalmente se seleccionó como óptima una temperatura de

30 ºC porque se consigue una resolución buena en un tiempo de análisis aceptable.

Capítulo I 137

Tabla I.5. Influencia de la temperatura

Temperatura (ºC)
20 25 30 35 40
FEO tm 5.549 4.950 4.517 4.117 3.737
SMT tm 7.871 6.954 6.275 5.692 5.200
Ancho 0.032 0.029 0.027 0.025 0.023
SQX tm 7.988 7.054 6.363 5.771 5.267
Rs 1.908 1.746 1.690 1.604 1.340
Ancho 0.032 0.029 0.027 0.025 0.024
MEN tm 12.233 10.321 8.921 7.767 6.804
Rs 13.284 15.736 17.055 9.868 3.398
Ancho 0.059 0.051 0.046 0.043 0.040
PMT tm 18.146 15.321 13.225 11.467 10.042
Rs 54.06 15.558 52.100 71.769 72.854
Ancho 0.066 0.055 0.047 0.040 0.033

20.00
FEO
SMT
SQX
Tiempo de migración (min)

15.00
MEN
PMT

10.00

5.00

0.00

20.00 25.00 30.00 35.00 40.00

Temperatura de separacion (ºC)

Figura I.5. Influencia de la temperatura en los tiempos de migración.

138 Capítulo I

I.2.6. Estudio de la influencia del voltaje sobre la separación

Como ya se ha expuesto anteriormente, cuanto mayor sea el voltaje aplicado

mayores eficacias se obtienen y más cortos tiempos de análisis aunque ello conlleva una

disminución de resolución, debida a la mayor producción de calor.

En principio, el máximo voltaje que se puede aplicar viene dado por el punto en el

cual se pierde la linealidad en la representación de la ley de Ohm, es decir, la

representación de la intensidad que atraviesa el capilar relleno del electrolito de separación

cuando se varía el voltaje desde valores muy bajos hasta 30 kV. Este máximo valor

depende de las características de la disolución tampón, siendo los valores más frecuentes

para el trabajo en electroforesis capilar voltajes hasta 30 kV, intensidades de corriente hasta

300 µA y potencias hasta 6 W.

De igual manera, la aplicación del voltaje requiere hacerlo de manera gradual, es

decir, aplicar una rampa de voltaje. Se sabe que hay una relación directa entre voltaje

aplicado y calor generado. Aplicando una rampa de voltaje progresiva y adecuada se puede

evitar un calentamiento brusco del capilar, de manera que se evite un calentamiento

instantáneo de la zona de muestra que provoque su dilatación y, como consecuencia, la

pérdida de la misma.

Para optimizar el voltaje, se llevaron a cabo separaciones de la muestra “A”

utilizando como electrolito de separación una disolución que contenía tampón borato 30

mM de pH 9.2, SDS de concentración 40 mM y 6 % (v:v) de acetonitrilo. Todos los

electroferogramas se registraron a 30 ºC, pero aplicando diferentes voltajes, comprendidos

en el intervalo de 5 y 30 kV. La representación gráfica de la Ley de Ohm probó que existía

Capítulo I 139

linealidad entre voltaje aplicado y corriente generada hasta 15 kV, como se puede ver en la

figura I.6.

100.00

80.00
Corriente (microamperios)

60.00

40.00

20.00

0.00

0 10 20 30
Voltaje (kV)

Figura I.6. Influencia del voltaje en la corriente obtenida.

El criterio de optimización del voltaje aplicado fue la resolución entre SQX y SMT,

siendo a 20 kV (en 0.4 minutos) cuando ésta es máxima, según se indica en la tabla I.6.

En cuanto a la rampa de voltaje, se realizaron separaciones a 20 kV con diferentes

rampas en un intervalo comprendido entre 0.2 y 0.8 minutos. La rampa de voltaje que

proporcionó mayor resolución fue la de 0.4 minutos y por ello fue seleccionada como

óptima (Tabla I.7).

140 Capítulo I

Tabla I.6. Influencia del voltaje sobre la resolución de SQX y SMT

Voltaje (kV) 10 15 20 25

Resolución 1.526 1.589 2.920 1.294

Tabla I.7. Influencia de la rampa de voltaje en la resolución de SQX y SMT

Tiempo (min) 0.2 0.4 0.6 0.8

Resolución 1.484 2.818 1.720 1.639

Sin embargo, en estas condiciones el tiempo de análisis era demasiado largo, 15

minutos, por lo que se decidió aplicar una segunda rampa de voltaje una vez empezada la

separación.

Tras varias experiencias, se decidió aumentar el voltaje hasta 30 kV en 0.4 minutos

al alcanzar los 5 minutos en la separación como único medio de disminuir el tiempo de

análisis sin perjudicar la resolución entre SQX y SMT. Lógicamente el aumento de voltaje

aplicado a un tiempo de análisis superior al tiempo de migración de estos compuestos, no

interfería en su resolución. Obviamente tampoco interfería en la resolución de los otros dos

compuestos, MEN y PMT.

Capítulo I 141

I.2.7. Efecto del disolvente de la muestra

Se estudió cómo afecta el disolvente en que se encuentre la muestra sobre la

resolución, dado que la de SQX es crítica. Teniendo en cuenta que estas muestras se

preparan por dilución de las madres, en todos los casos contendrán 12 % de etanol. Se

prepararon tres tipos de muestra:

1. Muestra en disolución hidroalcohólica al 12 % (v:v).

2. Muestra diluida en tampón borato 20 mM de pH 9.2 al 10 % (v:v).

3. Muestra diluida en electrolito de separación al 10 % (v:v).

En el caso de la muestra disuelta en el electrolito de separación, se observó que los

picos de SMT y SQX no aparecen bien resueltos y que los de MEN y PMT son bastante

más anchos que en los otros dos casos.

Este comportamiento puede explicarse debido a que cuando se disuelve la muestra

en electrolito de separación, la fuerza iónica en la zona de muestra aumenta y por lo tanto,

no se producirá una compresión de los compuestos en el límite de la zona de muestra con la

zona del tampón, impidiendo así la compresión en los picos. Este fenómeno afecta de

manera importante a la resolución entre SQX y SMT, que es el parámetro crítico en esta

separación. Por el contrario, cuando se utilizaron como disolventes tampón y agua no se

observaron diferencias en las resoluciones de SQX con respecto a SMT.

Por esta razón, se decidió que las muestras se preparasen por simple dilución de las

madres, manteniendo constante el porcentaje de etanol al 12 %.

142 Capítulo I

Finalmente, en la tabla I.8 se muestran las condiciones químicas e instrumentales

optimizadas para la separación de SQX, SMT, MEN y PMT. Asimismo, en la figura I.7 se

muestra un electroferograma de una muestra tipo “A” utilizando el método optimizado y

registrado a 214 nm.

Tabla I.8. Método optimizado para la separación.

Capilar Sílice fundida: 57 cm longitud × 75 µm diámetro interno

Electrolito Borato (pH = 9.2) 30 mM : SDS 40 mM : 6 % (v/v) acetonitrilo

Temperatura 30 ºC

Voltaje 20 kV en los 5 primeros minutos y posteriormente 30 kV hasta el final

Detector Barra de diodos en línea

Ventana detección 800 × 100 µm

Capítulo I 143

30.0
SQX
25.0
MEN
20.0

15.0
mAu

PMT
SMT
10.0

5.0

0.0

-5.0

0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0

Tiempo de migración (min)

Figura I.7. Electroferograma de una muestra tipo “A” utilizando el método optimizado y

registrado a 214 nm.

30.0
SQX
25.0
20.0 SMT
15.0
mAu

10.0
5.0
0.0
-5.0

5.6 5.8 6.0 6.2

Tiempo de migración (min)

Figura I.8. Detalle de la resolución entre sulfaquinoxalina y sulfametacina

144 Capítulo I

I.3. ASPECTOS CUANTITATIVOS

I.3.1. Límites de detección y cuantificación.

El límite de detección es un número, expresado en unidades de concentración que

describe la concentración más baja del analito que un analista puede decir que es

estadísticamente diferente de un blanco analito.

La definición que adoptó la I.U.P.A.C. en 1975 dice que “el límite de detección

expresado como una concentración CL, se deriva de la medida más pequeña YL, que puede

ser detectada con una certeza razonable, para un procedimiento analítico dado” (156). Este

concepto fue aclarado posteriormente por la ACS que dice que “el límite de detección es la

concentración más baja de un analito que un procedimiento analítico puede detectar con

seguridad”(157). En la definición del límite de detección, la IUPAC establece ese nivel de

seguridad según las siguientes expresiones:

YL = YB + (K SB)

YB: Valor medio de la señal del blanco

SB : Desviación estándar del blanco

K : Factor numérico escogido según el nivel de confianza deseado. El uso de un valor de

K=3, recomendado por la IUPAC, nos da un nivel de confianza del 99.86 % si el error

debido a la señal del blanco sigue una distribución normal.

El límite de detección CL es, por tanto, la concentración del analito que da una señal

que es tres veces la desviación estándar del blanco:

CL = (YL + YB) / m

m: pendiente de la recta de calibrado

Capítulo I 145

si sustituimos YL por su valor obtendremos:

CL = 3 SB / m

Por otra parte, se define el límite de cuantificación como la concentración del

analito que da una señal que es diez veces la desviación estándar del blanco:

CQ = 10 SB / m

A la región de concentraciones comprendida entre CL y CQ se la denomina “región

de detección”, mientras que la “región de determinación o de cuantificación” comienza en

el valor del límite de cuantificación, CQ.

Aunque la IUPAC propone las fórmulas citadas anteriormente para el cálculo de los

límites de detección y de cuantificación, se pueden establecer estos límites a partir de los

datos obtenidos para la recta de calibrado. Así, los límites de detección se calculan

partiendo de la fórmula

Y – YB = 3 SB

Y : predicción del valor de Y por la recta de regresión

YB : señal de una muestra en blanco o “señal de fondo”

SB : desviación estándar del blanco

Al final, la fórmula que permite deducir el límite de detección de la recta de

regresión es:

CL = YB + 3 SB

YB : ordenada en el origen

SB = SY/X = [Σ(yi – y)2/(n-2)]1/2

yi : valores de y obtenidos de la recta de regresión.

146 Capítulo I

De igual forma, el límite de determinación o cuantificación se calcula mediante la

siguiente expresión:

CQ = YB + 10 SB

En las técnicas de separación tales como cromatografía y electroforesis capilar la

forma más extendida para establecer estos límites es en función del ruido de la línea base a

nivel del tiempo de retención o de migración del analito de interés. Kevin D. Altria

particulariza para la electroforesis capilar los conceptos de límite de detección y

cuantificación en su libro “Capillary electrophoresis Guidebook. Principles, operation and

applications”, según el cual, el límite de detección (LOD) denota el nivel mínimo

detectable de impurezas. El LOD se define (158) a menudo como la concentración de

muestra que produce un pico con una altura tres veces el nivel del ruido de la línea base. El

LOD puede también expresarse como el menor pico que se puede detectar como porcentaje

área/área del electroferograma cuando se determina la pureza, por ejemplo, es posible dar

un LOD del 0.1 % de un enantiómero en presencia del principal componente.

Estos niveles de LOD dependerán de la absorbancia del analito, del diámetro interno

del capilar y de la carga de la muestra.

El límite de cuantificación (LOQ) da cuenta de la menor cantidad de impureza que

se puede medir de manera exacta y precisa. El LOQ puede calcularse (159) como diez

veces el ruido de la línea base. Normalmente, el análisis de réplicas de una muestra en

concentraciones iguales al LOQ produce un valor de desviación estándar relativa próxima

al 10 %.

El procedimiento utilizado en esta Memoria para establecer los límites de detección

y de cuantificación tanto en electroforesis capilar como en cromatografía líquida de alta

resolución se basa en el método del ruido de la línea base. Se estimó la fluctuación de la

Capítulo I 147

línea base registrando la respuesta del detector frente a un blanco a lo largo de un intervalo

de tiempo equivalente a diez veces el ancho de pico. Así, el LOD se obtuvo como la

concentración de muestra que produjo un ancho de pico tres veces la fluctuación de la línea

base y el LOQ se calculó como la concentración de muestra que produjo un ancho de pico

diez veces la fluctuación de la línea base. Así, se obtuvieron límites de detección y

cuantificación en torno a 300 µg/L y 1 mg/L, respectivamente, para cada uno de los

componentes.

I.3.2. Linealidad de la respuesta

Como es sabido, en análisis cuantitativo se utiliza la Ley de Beer cuando la

detección es espectrofotométrica, como en este caso. Sin embargo hay que determinar cuál

es el intervalo donde se cumple, es decir, dónde están sus límites. Obviamente, el límite

inferior lo da el límite de cuantificación, mientras que, para altas concentraciones de

analito, aparece una desviación de la linealidad que toma la forma de pendiente decreciente

en la recta de calibrado. El intervalo de linealidad está limitado principalmente por la luz

dispersada que llega al detector, ya que, en el caso ideal, toda la luz debería pasar por el

centro del capilar, y no por la pared.

En todos los casos, para realizar los cálculos se obtuvieron los resultados usando

áreas de pico corregidas obtenidas al dividir el área de cada pico por el tiempo de migración

del compuesto. La determinación de cada compuesto fue realizada a la longitud de onda

correspondiente a su máximo de absorción, es decir, 263, 252, 250 y 210 nm para SMT,
148 Capítulo I

SQX, MEN y PMT, respectivamente. Para seleccionar esta longitud de onda se utilizaron

los espectros de absorción UV-Visible obtenidos con el detector de diodos en línea.

El estudio de la linealidad se realizó inyectando muestras de SMT, SQX, MEN y

PMT disueltas en agua (conteniendo 12 % de etanol) en un rango de concentraciones entre

2 y 80 mg/L con un tiempo de inyección constante de 5 segundos

En las rectas de calibrado obtenidas puede verse una buena relación lineal entre

concentración y área de pico corregida y también que las ordenadas en el origen resultaron

ser despreciables, según el estadístico t de Student para un nivel de significación de 0.05.

En la figura I.9 se representan las áreas corregidas de los compuestos frente a las

concentraciones. Las ecuaciones de las rectas obtenidas por mínimos cuadrados se

muestran en la tabla I.9 y se puede apreciar que la linealidad obtenida es satisfactoria y que

las ordenadas en el origen son despreciables en todos los casos.

15000

SMT
SQX
10000 MEN
Area corregida

PMT

5000

0 15 30 45 60 75 90
Concentracion (mg/L)

Figura I.9. Rectas de calibrado.

Capítulo I 149

Tabla I.9. Ecuaciones de las rectas de calibrado e intervalos de linealidad.

Ecuación r2 Intervalo lineal (mg/L)

SMT A = -17 (± 89) + 120.7 (± 1.9) × C (mg/L) 0.9998 2 – 80

SQX A = 52 (± 190) + 164.4 (± 4.2) × C (mg/L) 0.9995 2 – 80

MEN A = -94 (± 122) + 183.3 (± 2.7) × C (mg/L) 0.9998 2 – 80

PMT A = -56 (± 149) + 229.9 (± 5.3) × C (mg/L) 0.9997 2 – 45

I.3.3. Repetibilidad y reproducibilidad del método

Para llevar a cabo el estudio de la repetibilidad del método descrito anteriormente se

preparó una muestra tipo “A” y se hicieron once separaciones consecutivas en las

condiciones químicas e instrumentales elegidas como óptimas.

Para evaluar la reproducibilidad entre diferentes días, se preparó una muestra igual

que la anteriormente citada y se hicieron dos series de once separaciones cada una, en días

consecutivos. En ninguna de las dos series se obtuvo una desviación estándar relativa

superior al 1.1 %, lo que indica el alto grado de precisión y fiabilidad del método

propuesto.

En cuanto a la reproducibilidad, se compararon las varianzas de las series según el

test estadístico F de Snedecor para pruebas de dos colas, que se aplica en este caso porque

se trata de dilucidar si las varianzas entre las series de diferentes días son significativamente

diferentes. Así, se encontró que no existían diferencias significativas entre las series para un

intervalo de confianza del 95 %.

150 Capítulo I

Los resultados obtenidos, en términos de medias (x), desviaciones estándar (S) y

porcentajes de desviación estándar relativa (% DER) se muestran en la tabla I.10.

Tabla I.10. Repetibilidad y reproducibilidad del método.

Serie 1 Serie 2

x S % DER x S % DER S12/S22 F (0.05)

SMT 1737 19 1.1 2201 12 0.54 2.5 3.717

SQX 8025 30 0.37 7862 22 0.28 1.8 3.717

MEN 10816 88 0.81 10130 56 0.55 2.5 3.717

PMT 17669 95 0.54 16206 88 0.54 1.2 3.717

I.4. APLICACIONES

El método propuesto se utilizó para la determinación de los compuestos estudiados en

seis preparados comerciales ampliamente utilizados en veterinaria.

Debido a la alta viscosidad de los productos comerciales, no es posible tomar un

volumen exacto de éstos con una pipeta. Por esta razón se decidió tomar la cantidad de

producto necesaria para llenar hasta enrase un matraz aforado de 10 mL. Este

procedimiento permite, además, calcular el peso de un volumen conocido de producto, de

tal manera que se pueden dar resultados en unidades de peso/peso o peso/volumen, según

venga especificado en cada uno de los productos comerciales.

Capítulo I 151

Estos 10 mL de producto comercial se llevaron a un matraz de 250 mL y se diluyeron

con etanol hasta la marca. Posteriormente se tomaron alícuotas de 1 mL (para Coccivet y

Coccilina) y 0.5 mL (para Cocciamín, Cocichemical, Coccirex y Quinoxipra-P) que fueron

transferidas a un matraz de 25 mL, donde se les adicionó etanol hasta alcanzar el 12 % y

agua desionizada hasta enrase. Estas disoluciones fueron inyectadas en el sistema de

separación para obtener los electroferogramas correspondientes.

Figura I.10. Esquema de preparación de las muestras

A partir de estos electroferogramas y basándonos en el uso de patrones que contenían

mezclas de SMT, SQX, MEN y PMT, disueltas también en el mismo medio

hidroalcohólico, se obtuvieron los porcentajes de recuperación para cada compuesto en

cada preparado comercial, tomando el área corregida como señal analítica.

El método seguido a la hora de cuantificar cada uno de los compuestos en los

preparados veterinarios se basó en las inyecciones sucesivas de patrones y muestras, según

la secuencia:

PATRÓN 1 - MUESTRA 1A - PATRÓN 2 - MUESTRA 1B - PATRÓN 1

152 Capítulo I

Los patrones 1 y 2 eran dos disoluciones independientes que contenían diferentes

concentraciones conocidas de SQX, SMT, MEN y PMT según el producto a analizar. Por

su parte, las muestras 1 A y 1 B se inyectaron por triplicado y se calculó la media arimética

de las áreas de pico corregidas.

Las áreas corregidas de los patrones fueron utilizadas para obtener los factores de

respuesta de cada compuesto atendiendo a la expresión:

F = [(AP1/CP1) + (AP2/CP2 )]/2

Para calcular la concentración de las muestras multiplicamos el factor de respuesta

por el área corregida promedio de cada compuesto.

CM1 = AM1/F

F: factor de respuesta; A: área corregida; P: patrón; C: concentración; M: muestra

En la tabla I.11 se muestran los resultados obtenidos, que se expresan como

concentraciones encontradas y porcentaje de recuperación para cada uno de los compuestos

con respecto a las concentraciones indicadas en las etiquetas de los productos. En todos los

casos, los datos corresponden a la media de tres determinaciones.

Capítulo I 153

Tabla I.11. Concentraciones encontradas (g/L)* y recuperaciones (%) obtenidas en

productos comerciales.

Producto y etiquetado Encontrado Recuperación

Cocciamin SQX 50 28.71 ± 0.31 57.5

PMT 15 8.32 ± 0.20 55.3
Cocichemical SQX 50 29.62 ± 0.84 59.1
PMT 15 0.0 0.0
Coccilina SQX 39 3.13 ± 0.10 80.3
PMT 1.3 0.913 ± 0.043 68.2
SMT 0 0.8018 ± 0.0057 0.0

Coccirex SQX 44 42.01 ± 0.86 95.4

PMT 12 10.20 ± 0.36 85.2

Coccivet SQX 36 32.32 ± 0.64 89.8

PMT 9 8.31 ± 0.12 92.1
MEN 50 0.0 0.0
Quinoxipra-P SQX 50 48.71 ± 0.89 97.4
PMT 15 14.20 ± 0.42 94.6

*Las unidades de concentración en Coccilina son g/100g.

Como puede observarse, en muchos casos las recuperaciones están muy alejadas de

lo indicado en las etiquetas de los productos comerciales. A continuación se destacan

algunos aspectos que pueden aclarar el porqué de estas bajas recuperaciones:

1. A lo largo del procedimiento de preparación de las muestras en el análisis de

Cocciamin y Coccilina, no se observó precipitado ni turbidez alguna ni posibles pérdidas

que pudieran justificar las recuperaciones encontradas, lo que implica que éstas son

consecuencia de sus propios contenidos.

154 Capítulo I

2. En Coccivet y Cocichemical no se cuantificaron ni menadiona ni pirimetamina

porque no se registraron sus picos en los electroferogramas correspondientes. Este hecho

puede deberse a que ninguno de ellos esté presente como compuesto puro, sino como

derivado soluble, dado que estos productos veterinarios son suministrados a las aves en el

agua de bebida. A este respecto, se consultó con los laboratorios responsables de la

comercialización de estos productos.

Con respecto a menadiona, vitamina incluida en Coccivet, se recibió como respuesta

que no se utilizaba dicha vitamina como tal, sino su derivado bisulfito sódico. Sin embargo,

se comprobó mediante adiciones estándar que tampoco aparecía el mencionado derivado en

este producto. En la figura I.11 se muestra un electroferograma de Coccivet

correspondiente a una muestra en el proceso de cuantificación.

En lo que concierne a la explicación de la ausencia de pirimetamina en

Cocichemical, fue imposible establecer contacto con el laboratorio responsable de su

comercialización. En la figura I.12. se muestra un electroferograma de Cocichemical

correspondiente a una muestra en el proceso de cuantificación.

3. Se encontró sulfametacina en Coccilina, aunque no estaba etiquetada. Su presencia

se confirmó por superposición de los espectros del pico en la muestra y en un patrón de

sulfametacina y también por el método de las adiciones estándar. En la figura I.13 se

muestra un electroferograma de Coccilina correspondiente a una muestra en el proceso de

cuantificación.
Capítulo I 155

Muestra MEN
20.00
Patrón
mAu

10.00

0.00

7.00 7.20 7.40 7.60 7.80

Tiempo (minutos)

Figura I.11. Detalle del pico de MEN obtenido en el análisis cuantitativo de Coccivet.

15.00
Muestra PMT
Patrón
10.00
mAu

5.00

0.00

9.60 9.80 10.00 10.20 10.40

Tiempo (minutos)

Figura I.12. Detalle del pico de PMT obtenido en el análisis cuantitativo de Cocichemical
156 Capítulo I

20.00
SQX
Muestra
Patrón

10.00
mAu

SMT

0.00

5.60 5.80 6.00 6.20

Tiempo (minutos)

Figura I.13. Detalle de los picos de SMT y SQX obtenidos en el análisis cuantitativo de

Coccilina

Estas bajas recuperaciones registradas en general crearon la necesidad de poner a

punto un nuevo método de contraste para confirmar o desmentir los datos obtenidos hasta el

momento. Se pensó en desarrollar un nuevo método utilizando la técnica de cromatografía

líquida de alta resolución, aplicada a las mismas muestras que el ya comentado de

electroforesis capilar y posteriormente comparar resultados por ambos métodos.

 CAPÍTULO II

DETERMINACIÓN DE SULFAQUINOXALINA,

SULFAMETACINA Y PIRIMETAMINA

EN PRODUCTOS ZOOSANITARIOS

POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA

Capítulo II 159

II.1. INTRODUCCIÓN

Los resultados experimentales obtenidos en la determinación, por electroforesis

capilar, de sulfaquinoxalina, sulfametacina, menadiona y pirimetamina no fueron los

esperados, si atendemos a la información de la composición que consta en las etiquetas de

los diferentes productos comerciales analizados.

Es por esto por lo que se decidió poner a punto un nuevo método por LC para

comparar los resultados con los del ya propuesto por electroforesis capilar descrito en el

capítulo anterior.

La única variante en cuanto al planteamiento del problema analítico reside en que en

este capítulo no se incluye en el estudio la Menadiona, o vitamina K3, porque se consideró

suficientemente demostrado que no estaba presente en Coccivet, ni en su forma pura ni

como derivado bisulfito sódico.

Por lo tanto, este capítulo, que está íntimamente relacionado con el anterior, está

dedicado a poner a punto un nuevo método por cromatografía líquida para resolver la

mezcla ternaria formada por SQX, SMT y PMT en los productos veterinarios ya citados en

el capítulo anterior. Los resultados obtenidos por este método se comparan con los

obtenidos por el método de electroforesis capilar, que ocupa el primer capítulo de esta

Memoria.
160 Capítulo II

II.2. ESTUDIO DE LOS PARÁMETROS EXPERIMENTALES

II.2.1. Estudios preliminares

Nuestro grupo de investigación publicó recientemente un método

espectrofotométrico para la determinación de SMT, SQX y PMT en productos veterinarios

(24). En este trabajo, se emplea el método desarrollado por J. J. Berzas y col. (20), válido

para resolver mezclas ternarias, que consiste básicamente en utilizar conjuntamente el

método de los espectros cocientes derivados con la medida de la señal en el punto de corte

o “zero-crossing” de los espectros tratados. Los resultados de las determinaciones fueron

comparados con los que se obtuvieron utilizando dos métodos alternativos, uno de

calibración multivariante PLS-1 y otro de cromatografía líquida de alta resolución. Este

último método utilizaba NaH2PO4 (pH 3.0) 0.1 M:acetonitrilo (7:3) como fase móvil y una

columna Nova-Pack C18. La muestra se inyectaba siempre mediante un bucle de 20 µL, el

caudal de fase móvil era de 1 mL/min y la detección se llevaba a cabo a una única longitud

de onda, 270 nm. Partiendo de esa base, en este capítulo se ha utilizado la cromatografía

líquida en fase reversa para estudiar la separación de SQX, SMT y PMT en una columna

Kromasil C18 cuyas dimensiones son 150 mm de longitud × 4.6 mm de diámetro interno,

con un tamaño de partícula de 5 µm, mientras que la columna utilizada en el mencionado

trabajo tenía 3 µm de tamaño de partícula. Por esta razón, el método allí descrito tuvo que

ser replanteado en algunos aspectos.

La utilización de la columna Kromasil C18 como fase estacionaria tiene la limitación

de no poder trabajar fuera del intervalo de pH que va de 2 a 8, ya que se puede dañar el

Capítulo II 161

relleno de la misma, como advierte el fabricante. En lo que concierne a la fase móvil, en

cromatografía de partición en fase reversa es habitual el empleo de mezclas de agua o

tampón y un disolvente orgánico, generalmente metanol o acetonitrilo, el cual modifica la

capacidad de elución de la fase móvil, presentando deferente selectividad.

Así, inicialmente se preparó una disolución que contenía 2 mg/L de cada

compuesto, y que llamaremos “Z”, por dilución exacta de las respectivas disoluciones

madre y se comenzaron a realizar las separaciones utilizando tampón fosfato de pH 3 en la

fase móvil y metanol y acetonitrilo como disolventes orgánicos.

El equipo que se utilizó fue un Shimadzu LC10 con detector de diodos en línea

SPD-M10A, equipado con un sistema de doble bomba. La inyección se realizó mediante

una válvula Rheodyne 7725 con un bucle de 20 µL.

Antes de llevar a cabo la primera separación de cada serie, la fase móvil era filtrada

con un equipo de filtración Millipore y purgada con helio durante 10 minutos para eliminar

los gases disueltos.

Inicialmente se observó que los picos obtenidos cuando se utilizó metanol eran más

anchos que cuando se utilizó acetonitrilo, por lo que se seleccionó éste como disolvente

orgánico en la fase móvil.

Asimismo, en estas experiencias preliminares se observó falta de reproducibilidad

en el tiempo de retención y en las áreas de PMT, mientras que en el caso de las dos

sulfamidas no se observaron anomalías de este tipo. Según la figura II.1, la PMT, cuyo pKa

es 7.0, presenta carga a pH 3. Esta carga puede estar interaccionando con la matriz de la

fase estacionaria, lo que podría explicar su comportamiento. Por su parte, SQX (pKa = 6.7)
162 Capítulo II

y SMT (pKa = 7.4) no presentan carga a este pH, por lo que no les afectan estas

interacciones electrostáticas.

PMT

SQX

SMT

2 4 6 8
pH
forma forma forma
neutra aniónica catiónica

Figura II.1. Esquema de la ionización de SMT, SQX y PMT en función del pH

Para solventar este inconveniente se introdujo en la fase móvil un anión

voluminoso, el perclorato, con la finalidad de formar un par iónico con la PMT, que

podríamos esquematizar como PMT+ClO4-, y evitar así la interacción de ésta con los grupos

ionizables de la columna.

Con la adición de perclorato, se solucionaron las dificultades mencionadas, sin

embargo, el pico de PMT presentaba colas. Esto es debido a que, dado que el par iónico

PMT+ClO4- tiene carga neta nula, su afinidad por la fase estacionaria es muy alta. Para

solucionar este problema, hubo que disolver la muestra en un 10 % (v:v) de fase móvil, tras

lo cual, se consiguió un pico más simétrico.

Capítulo II 163

Sentadas estas bases, se tomó como fase móvil tampón fosfato de pH 3, conteniendo

ClO4- y acetonitrilo, con un caudal de 1.5 mL/min como condiciones iniciales para la

posterior optimización de la separación de la mezcla “Z”.

En esta modalidad cromatográfica la fase móvil está compuesta por una fracción

acuosa convenientemente tamponada y un disolvente orgánico para establecer el equilibrio

de partición hasta conseguir la resolución apropiada sin que el tiempo de desarrollo del

cromatograma sea excesivo.

Por tanto, es necesario optimizar el valor de pH, la concentración de perclorato, la

concentración de tampón y la proporción de disolvente orgánico en la misma.

II.2.2. Optimización del pH de la fase móvil

Para optimizar este parámetro, se preparó por dilución directa de las disoluciones

madre, una disolución tipo “Z” que contenía un 10 % (v:v) de fase móvil. Se inyectaron

alícuotas en el sistema cromatográfico, obteniéndose los correspondientes cromatogramas

con fases móviles constituidas por una fracción acuosa tamponada con fosfato de

concentración 0.1 M a distintos valores de pH, conteniendo 10 mM de perclorato sódico y

una fracción orgánica, constituida por acetonitrilo en proporción 70:30 (v:v). Todos los

cromatogramas fueron obtenidos manteniendo un caudal de fase móvil constante de 1.5

mL/min y midiendo como señal analítica la absorbancia a las longitudes de onda de

máxima absorción de cada uno de los compuestos.

A partir de los cromatogramas obtenidos se midieron los tiempos de retención para

los distintos valores de pH.

164 Capítulo II

En la tabla II.1 se resumen los resultados obtenidos. Se puede observar que a los

cuatro valores de pH estudiados, los tiempos de retención no sufren variaciones apreciables,

siendo el tiempo de análisis siempre inferior a 6 minutos.

Tabla II.1. Influencia del pH en los tiempos de retención.

pH SMT PMT SQX

3 2.348 4.098 5.693

4 2.373 4.110 5.694

5 2.373 4.259 5.563

6 2.326 4.819 4.820

6.0
Tiempo de retenci n (min)

5.0

4.0

SMT
3.0 PMT
SQX

2.0

3.0 4.0 5.0 6.0

pH

Figura II.2. Influencia del pH en los tiempos de retención.

Capítulo II 165

Se observó que, al aumentar el pH el tiempo de retención de SMT permanecía

invariable, mientras que el tiempo de retención de SQX aumentaba y el de PMT disminuía,

registrándose un solapamiento de estos compuestos.

La explicación de este comportamiento se encuentra en la relación que existe entre

el intervalo de pH de trabajo y los pKa de los distintos compuestos estudiados.

En el caso de la SMT, cuyo pKa es 7.4, la constancia del tiempo de retención se

debe a que, en el intervalo de pH estudiado (de 3 a 6) no adquiere fracción de carga, es

decir, se mantiene en su forma neutra.

En el caso de SQX, la disminución del tiempo de retención cuando el pH aumenta

se explica por la misma razón. En el intervalo de pH estudiado se encuentra en su forma

neutra, ya que su pKa es 6.7. Por lo tanto, a partir de pH 4.7 empieza a adquirir cierta

fracción de carga, lo cual hace a la molécula más polar y queda menos retenida en la fase

estacionaria, acortando su tiempo de retención.

Por su parte, la PMT interacciona con el perclorato sódico, según se comentó en el

apartado correspondiente, confirmando que en el intervalo de pH estudiado, se encuentra en

su forma catiónica. No obstante, el aumento en su tiempo de retención al aumentar el pH

obedece a que, al acercarse el pH a su pKa, que es 7.0, la molécula va perdiendo fracción de

carga y, por lo tanto va cobrando mayor afinidad por la fase estacionaria y menos por el

contraión suministrado, el perclorato. Esto hace que su tiempo de retención aumente con el

pH.

Finalmente, se seleccionó como óptimo el pH 3 porque, dentro del intervalo

estudiado, el tampón fosfato muestra su máxima capacidad reguladora a este pH.

166 Capítulo II

II.2.3. Influencia de la concentración de perclorato

Como ya se ha comentado anteriormente PMT se encuentra como catión al pH al

que estamos trabajando. En general, cuando los solutos tienen carga eléctrica, su polaridad

es muy elevada y para reducir la carga efectiva, una de las técnicas que se utilizan se basa

en añadir un agente que provoque la formación de un par iónico, con lo que la carga final

del agente conjugado con el soluto disminuye mucho y resulta, por tanto, un compuesto de

polaridad inferior al soluto ionizado. Por lo general, puesto que el complejo formado

(muestra problema–contraión) ha de ser soluble en la fase orgánica del eluyente, dichos

compuestos suelen ser voluminosos. En nuestro caso, necesitamos un contraión aniónico

para formar el par iónico con PMT.

Hemos utilizado perclorato como contraión, cuya concentración en la fase móvil es

la que vamos a optimizar en este apartado.

Para realizar este estudio se preparó por dilución directa de las disoluciones madre

una muestra de tipo “Z” que contenía un 10 % (v:v) de fase móvil. Se inyectaron alícuotas

de 20 µL en el sistema cromatográfico, utilizándose como fase móvil tampón fosfato de pH

3.0 y acetonitrilo en proporción 70:30 (v:v), variando únicamente la concentración de

perclorato. El caudal de fase móvil se mantuvo en 1.5 mL/min y se midió la absorbancia a

las longitudes de onda de máxima absorción de cada uno de los compuestos.

A modo de ejemplo, en la figura II.3 se muestran dos cromatogramas

correspondientes a la separación de dos muestras de SQX, SMT y PMT en ausencia de

contraión perclorato (a) y cuando la concentración de éste en la fase móvil es 20 mM (b),

registrados a la longitud de onda de máxima absorción de PMT, es decir, 210 nm.

Capítulo II 167

a)

60
PMT
50

40

30
mAu

SQX
20
SMT
10

0 2 4 6 8
Tiempo de retención (min)

b)

40
PMT
30
SQX
20
mAu

SMT
10

-10

0 2 4 6 8
Tiempo de retención (min)

Figura II.3. Cromatogramas de muestras de SQX, SMT y PMT, cuando la

concentración de NaClO4 es (a) 0 y (b) 20 mM ( λ=210 nm)

168 Capítulo II

La figura II.4 muestra la influencia de la concentración de perclorato en los tiempos

de retención. Como se esperaba, a medida que aumentaba la concentración de perclorato, el

tiempo de retención de la PMT aumentaba también, mientras que los tiempos de retención

de las sulfamidas permanecían prácticamente inalterables. Este comportamiento confirma

que, a pH 3, la PMT se encuentra en su forma catiónica y forma el correspondiente par

iónico PMT+ClO4-.

Como se puede observar, una concentración de 10 mM de perclorato proporciona la

mejor separación entre los picos en un corto tiempo de análisis, por lo que se seleccionó

como óptima esta concentración de perclorato para continuar las experiencias.

Capítulo II 169

Tabla II.2. Influencia de la concentración de perclorato sódico.

Perclorato (mM) Tiempo de retención (min)

SMT PMT SQX

0 2.328 2.974 5.607

10 2.348 4.098 5.693

20 2.327 4.804 5.548

30 2.325 5.614 5.614

40 2.319 6.352 5.556

50 2.303 6.865 5.472

8.0
SMT
PMT
SQX
Tiempo de retencion (min)

6.0

4.0

2.0

0 10 20 30 40 50
Concentracion de perclorato sódico (mM)

Figura II.4. Influencia de la concentración de perclorato.

170 Capítulo II

II.2.4. Influencia de la fuerza iónica en la fase móvil

Como norma general, un aumento en la fuerza iónica del tampón produce el

conocido efecto salino, que consiste en que, al aumentar la concentración de iones en la

fase móvil, ésta se va saturando poco a poco, dificultando cada vez más la disolución de los

analitos previamente adsorbidos en la fase estacionaria. Lógicamente, este comportamiento

se traduce en un aumento de los tiempos de retención y en un ensanchamiento de los picos.

La fuerza iónica ejerce también su influencia sobre la dispersión de la muestra. A

altas concentraciones de tampón se dificulta la dispersión de la muestra más que a bajas

concentraciones, lo que hace disminuir la anchura de pico.

En definitiva, un aumento de la fuerza iónica puede aumentar o disminuir los

anchos de pico y, en consecuencia, variar la eficacia de la separación. Tanto es así, que

estos efectos pueden llegar a anularse entre sí, por lo que este parámetro puede tener una

influencia neta sobre los anchos de pico que puede ser nula.

Este estudio se realizó con el fin de comprobar cómo influye la fuerza iónica de la

fase móvil en la retención de los compuestos estudiados.

Para ello se preparó una muestra de tipo “Z” de la misma manera que en el apartado

anterior y se inyectó en el sistema cromatográfico manteniendo las condiciones

cromatográficas anteriormente seleccionadas, en las que se variaba únicamente la

concentración de la disolución reguladora en la fase acuosa de la fase móvil entre 20 y 100

mM. Todos los cromatogramas fueron obtenidos manteniendo un caudal de fase móvil

constante de 1.5 mL/min y midiendo como señal analítica la absorbancia a las longitudes de

onda de máxima absorción de cada uno de los compuestos.

Capítulo II 171

Los resultados obtenidos aparecen en la figura II.5, donde se muestra la influencia

de la concentración de tampón en los tiempos de retención y puede verse que, a medida que

la concentración de tampón aumenta, el tiempo de retención de PMT disminuye levemente,

mientras que no se registraron efectos dignos de mención en el caso de SQX y SMT.

Recordemos que, a este pH, las sulfamidas en estudio se encuentran en su forma

neutra, mientras que la PMT se encuentra en su forma ionizada. Al aumentar la fuerza

iónica del tampón en la fase móvil, aumenta la proporción H2PO4-/ClO4- porque se

mantiene constante la concentración de contraión perclorato en 10 mM. Este hecho puede

hacer disminuir la afinidad de PMT por el contraión perclorato en beneficio del

hidrógenofosfato. Esta competitividad podría llegar a anular la asociación iónica entre PMT

y perclorato a altas concentraciones de tampón.

En los casos de SMT y SQX, el aumento de la concentración de tampón de la fase

móvil no tuvo efecto significativo sobre sus tiempos de retención, es decir el efecto salino

no fue suficiente para modificar sensiblemente las afinidades de estos dos compuestos por

sendas fases. Como conclusión, se seleccionó 40 mM como concentración óptima de

tampón porque se consideró suficiente para mantener el pH a 3 y también porque a esta

concentración se producía la mejor resolución de los tres picos.

172 Capítulo II

Tabla II.3. Influencia de la concentración del tampón

Fosfato (mM) Tiempos de retención

SMT PMT SQX

20 2.265 5.257 5.381

40 2.259 4.672 5.362

60 2.292 4.469 5.443

80 2.301 4.256 5.466

100 2.303 4.098 5.472

6.0

5.0
Tiempo de retencion (min)

4.0

3.0

2.0
SMT
1.0 PMT
SQX
0.0

20 40 60 80 100
Concentracion de fosfato (mM)

Figura II.5. Influencia de la concentración de fosfato en los tiempos de retención.

Capítulo II 173

II.2.5. Influencia de la concentración de acetonitrilo

Dentro de los parámetros químicos que influyen en una separación cromatográfica,

la composición de la fase móvil es de una importancia capital. La proporción de fracción

orgánica de la fase móvil determina fuertemente los tiempos de retención de los analitos y,

en consecuencia, el tiempo de análisis. En cromatografía líquida en fase reversa, la fase

móvil es más polar que la fase estacionaria y la polaridad de la fase móvil se fija variando

las proporciones de la fracción acuosa, en este caso tampón fosfato (pH 3.0), y de la

fracción orgánica, en este caso, acetonitrilo.

Cuanto mayor es la proporción de fracción orgánica de la fase móvil, mayor

afinidad tendrán por ella los analitos que se encuentran adsorbidos en la fase estacionaria y,

en consecuencia, sus tiempos de retención disminuirán, lo cual implica necesariamente una

disminución en el tiempo de análisis.

Para realizar este estudio, se preparó por dilución directa de las disoluciones madre

una disolución de tipo “Z” que contenía 10 % (v:v) de fase móvil y se inyectaron alícuotas

de 20 µL en el sistema cromatográfico. Por éste fluía una fase móvil cuya fracción acuosa

estaba formada por solución reguladora H3PO4/H2PO4- de pH 3.0 y concentración 40 mM,

que contenía 10 mM de perclorato sódico y cuya fracción orgánica era acetonitrilo,

desarrollándose los correspondientes cromatogramas para cada una de las proporciones de

disolvente orgánico ensayadas, comprendidas en el intervalo de 30 a 40%.

Todos los cromatogramas fueron obtenidos manteniendo un caudal de fase móvil

constante de 1.5 mL/min y midiendo como señal analítica la absorbancia a las longitudes de
174 Capítulo II

onda de máxima absorción de cada uno de los compuestos. Los datos obtenidos se

muestran en la tabla II.4.

Tabla II.4. Influencia de la concentración de acetonitrilo

% CH3CN Tiempos de retención (min)

SMT PMT SQX

30 2.315 4.812 5.654

35 1.975 3.081 3.798

40 1.727 1.940 2.809

6.0
Tiempo de retencion (min)

5.0
SMT
4.0 PMT
SQX

3.0

2.0

1.0

30 35 40
Porcentaje de acetonitrilo

Figura II.5. Influencia del porcentaje de acetonitrilo en la fase móvil en los tiempos

de retención.
Capítulo II 175

Para todos los componentes, se observó que cuando la proporción de acetonitrilo

aumentaba, el tiempo de retención de los compuestos disminuía, acortándose así el tiempo

de análisis.

También se puede observar que mientras que la separación entre los picos de SQX y

PMT se mantiene constante, los picos de PMT y SMT tienden a converger en un tiempo

próximo a dos minutos.

En la figura II.5 se muestra la influencia del porcentaje de acetonitrilo en la fase

móvil sobre los tiempos de retención. Considerando la resolución entre los picos y el

tiempo de análisis, se seleccionó como óptimo un porcentaje de acetonitrilo de 35%.

II.2.6. Influencia del caudal de la fase móvil.

Como es sabido, la cromatografía es una técnica analítica de separación con un doble

fundamento, termodinámico y cinético. Ya se ha comentado que los aspectos

termodinámicos son los que rigen el equilibrio de distribución o reparto de los

solutos/analitos entre las dos fases, móvil y estacionaria, por tanto, son responsables de

características cromatográficas tan importantes como retención y selectividad. Los aspectos

cinéticos juegan en cromatografía un doble papel, por una parte, debe considerarse el

tiempo en que se alcanza el equilibrio de distribución en cada porción del sistema y, por

otra parte, la velocidad de desplazamiento diferencial de la mezcla de solutos en el lecho

cromatográfico, que es la responsable última de la separación. Sobre ella influyen aspectos

termodinámicos y aspectos cinéticos físicos relacionados con la dispersión axial, flujo a

través del medio poroso, etc.

176 Capítulo II

Las características cinéticas del proceso son claves para definir el ensanchamiento de

banda o ancho de pico que es el que determina, en definitiva, la eficacia del sistema

cromatográfico. En general, los términos que contribuyen a ésta corresponden a la difusión

por remolino, difusión longitudinal y a la resistencia a la transferencia de materia en la fase

móvil y estacionaria que, a su vez, van a depender de la velocidad de flujo o del caudal de

la fase móvil a través de la fase estacionaria.

Con objeto de elegir el caudal de la fase móvil más apropiado, se ha estudiado cómo

influye esta variable en la eficacia del sistema cromatográfico para los tres compuestos

estudiados, reflejado en la resolución y en el tiempo de análisis.

Para la optimización de este parámetro, se preparó una muestra de la forma habitual y

se insertó en el sistema cromatográfico manteniendo las condiciones optimizadas en

apartados anteriores, en las que únicamente se variaba el flujo de la fase móvil entre 1 y 2

ml/min. No se tuvieron en cuenta mayores caudales debido a que las altas presiones

alcanzadas en el sistema cromatográfico podrían llegar a disparar los sistemas de seguridad,

parándose de este modo el equipo.

Los resultados obtenidos se encuentran en la tabla II.5. Como era de esperar, los

tiempos de retención disminuían al aumentar el caudal de fase móvil. Sin embargo, al

disminuir el tiempo de retención de los tres compuestos, la resolución entre PMT y SMT

disminuyó considerablemente.

Teniendo en cuenta estos resultados y con el fin de mantener buenas resoluciones

entre picos, se seleccionó como óptimo un caudal de 1.5 mL/min, con el cual la separación

se completa en menos de cuatro minutos.

Capítulo II 177

Tabla II.5. Influencia del caudal de fase móvil en los tiempos de retención.

Caudal (mL/min) Tiempo de retención (min)

SMT PMT SQX

1.0 2.964 3.966 5.692

1.5 2.086 3.182 3.904

2.0 1.494 1.990 2.863

II.2.7. Método cromatográfico propuesto

De los estudios realizados anteriormente, se propuso el método cromatográfico que

se esquematiza en la tabla II.6. En la figura II.6 se muestra un cromatograma obtenido

utilizando el método propuesto para la separación de una muestra de 2 mg/L de SQX, SMT

y PMT, registrado a 270 nm. Se puede ver que todos los picos están bien resueltos en un

tiempo de análisis del orden de 4 minutos.

Tabla II.6. Método cromatográfico propuesto.

Columna Kromasil C18

Fase móvil 40 mM fosfato (pH 3.0), 10 mM ClO4- : Acetonitrilo (65:35)

Caudal 1.5 mL/min

Volumen inyectado 20 µL

Detección Barra de diodos en línea

178 Capítulo II

10.00
SMT

8.00

6.00
SQX
mAu

4.00
PMT
2.00

0.00

-2.00

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0

Time (min)

Figura II.6. Cromatograma de una muestra de 2 mg/L de SQX, SMT y PMT registrado a

270 nm.
Capítulo II 179

II.3. ASPECTOS CUANTITATIVOS

En el proceso de optimización del método, lo más importante es dar con las

condiciones que permitan una separación con buenas resoluciones en un tiempo de análisis

razonable. Para evaluar estos parámetros en las separaciones que se han realizado en la

mencionada etapa habría bastado con monitorizar la señal a una única longitud de onda. Sin

embargo, a la hora de cuantificar, es necesaria la máxima sensibilidad en la señal analítica

de medida, por lo que en esta etapa de análisis cuantitativo, las medidas se realizaron a las

longitudes de onda de máxima absorción de cada uno de los compuestos, que se obtuvieron

a partir de sus espectros de absorción UV-Visible. Así, las longitudes de onda

seleccionadas fueron 263, 252 y 210 nm para SMT, SQX y PMT, respectivamente.

II.3.1. Límites de detección y de cuantificación

Los límites de detección y cuantificación, LOD y LOQ, respectivamente, se

establecieron por medio del método del ruido de la línea base. Se estimó la fluctuación de

la línea base registrando la respuesta del detector frente a un blanco a lo largo de un

intervalo de tiempo equivalente a diez veces el ancho de pico. Así, el LOD se obtuvo como

la concentración de muestra que produjo una altura de pico equivalente a tres veces la

fluctuación de la línea base y el LOQ se calculó como la concentración de muestra que

produjo una altura de pico equivalente a diez veces la fluctuación de la línea base. Así, se

obtuvieron los límites de detección y cuantificación que figuran en la tabla II.7.

180 Capítulo II

Tabla II.7. Límites de detección (LOD) y de cuantificación (LOQ) en mg/L.

SMT SQX PMT

LOD 0.048 0.054 0.051

LOQ 0.16 0.18 0.17

II.3.2. Rectas de calibrado e intervalo de linealidad

La linealidad de la respuesta se estudió inyectando una serie de patrones según el

método cromatográfico optimizado. Las rectas de calibrado se establecieron de tal manera

que la concentración correspondiente al límite de cuantificación fuese el punto de menor

concentración y donde el punto de mayor concentración fuese unas 20 veces más

concentrado. A la vista de sus espectros ultravioleta-visible, para cada componente se

representó el área de pico y su altura, a la longitud de onda de máxima absorción en cada

caso.

En las rectas de calibrado obtenidas puede verse una buena relación lineal entre

concentración y las áreas y alturas de pico y también que las ordenadas en el origen

resultaron ser despreciables, a la vista de los intervalos de confianza, calculados utilizando

el estadístico t de Student para un nivel de significación de 0.05.

En la figura II.7 se representan las áreas y alturas de pico frente a las

concentraciones de cada uno de los compuestos. Las ecuaciones de las rectas obtenidas por

mínimos cuadrados se muestran en la tabla II.8, pudiéndose apreciar la buena linealidad

Capítulo II 181

obtenida, como lo demuestra el coeficiente de determinación r2, para el intervalo de

concentraciones indicado en la misma tabla.

Tabla II.8. Rectas de calibrado. Concentraciones (en mg/L) frente a alturas (H)

y áreas de pico (A).

Ecuación r2 Intervalo lineal

(mg/L)

SMT H = 0.83 (± 0.90) × 103 + 7.656 (± 0.19) × 103 × C 0.9991 0.2 – 11.5

A = 2.5 (± 6.3) × 103 + 54.62 (± 1.3) × 103 × C 0.9994 0.2 – 11.5

PMT H = -1.24 (± 1.26) × 103 + 15.63 (± 0.67) × 103 × C 0.9985 0.2 – 4.0

A = -3.4 (± 6.1) × 103 + 133.5 (± 5.0) × 103 × C 0.9992 0.2 – 2.0

SQX H = 0.32 (± 0.41) × 103 + 6.616 (± 0.20) × 103 × C 0.9992 0.2 – 4.4

A = 2.2 (± 6.1) × 103 + 67.9 (± 2.8) × 103 × C 0.9986 0.2 – 4.4

182 Capítulo II

(a)
SMT
100000 PMT
SQX

75000
Altura

50000

25000

0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0

Concentración (mg/L)

(b) 1000000
PMT
SQX
800000 SMT

600000
Area

400000

200000

0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0

Concentración (mg/L)

Figura II.7. Rectas de calibrado en función de las alturas (a) y de las áreas de pico (b)
Capítulo II 183

II.3.3. Repetibilidad y reproducibilidad

Para llevar a cabo el estudio de la repetibilidad del método descrito anteriormente se

preparó una muestra que contenía de tipo “Z” en un matraz de 25 mL y se hicieron once

separaciones consecutivas en las condiciones químicas e instrumentales elegidas como

óptimas.

Para evaluar la reproducibilidad entre dos series, se preparó una muestra en un

matraz de 25 mL y se hicieron dos series de once separaciones cada una en días

consecutivos. Se compararon las varianzas de las series según el test estadístico F de

Snedecor para pruebas de dos colas y se encontró que no existían diferencias significativas

de precisión entre las series para un nivel de significación de 0.05.

De la misma manera que se evaluaron las reproducibilidades de áreas y alturas de

pico, se estimó la reproducibilidad sobre los tiempos de retención en once separaciones

realizadas en días diferentes. Especial atención merece la PMT que, gracias a la formación

del par iónico con perclorato, consiguió mantener estable su tiempo de retención. En cuanto

a SMT y SQX se puede ver que las reproducibilidades de los tiempos de retención

resultaron ser excelentes. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla II.9 en términos

de media aritmética (x), desviación estándar (S) y porcentaje de desviación estándar

relativa (% DER).
184 Capítulo II

Tabla II.9. Repetibilidad y reproducibilidad del método.

Día 1 Día 2

x S % DER x S %DER S12/S22 F (0.05)

Altura

SMT 29125 337 1.1 28952 566 1.9 2.8 3.717

SQX 44361 1119 2.5 43377 977 2.2 1.3 3.717

PMT 54781 1750 3.2 50299 1846 3.7 2.1 3.717

Área

SMT 2122142 7282 3.43 212527 5754 2.71 1.60 3.717

SQX 245653 8213 3.34 248598 6690 2.69 1.51 3.717

PMT 435598 45892 10.53 407289 27136 6.66 2.86 3.717

Tiempo de retención (min)

SMT 1.969 0.005 0.26 1.960 0.003 0.17 2.8 3.717

SQX 3.053 0.011 0.36 3.040 0.006 0.18 3.36 3.717

PMT 3.862 0.008 0.20 3.850 0.010 0.27 1.56 3.717

Capítulo II 185

II.4. APLICACIONES

Se aplicó el método cromatográfico optimizado a los mismos productos veterinarios

que en el capítulo anterior de esta Memoria. Se utilizaron dos métodos para cuantificar, el

método directo, es decir, preparando patrones a partir de las disoluciones madre, y por el

método de las adiciones estándar.

Operativamente, se volvió a utilizar el mismo procedimiento para poder tomar un

volumen exacto de estos productos, es decir, llenar un matraz aforado de 10 mL hasta la

marca. Se transfirieron estos 10 mL a un matraz de 250 mL, lavando varias veces el matraz

con etanol para arrastrar todo el contenido. Seguidamente se diluyó y enrasó éste con

etanol, dando lugar a una disolución que llamaremos “X”. Así, todo el producto comercial

quedó totalmente disuelto y con una viscosidad que permitía utilizar el material

volumétrico habitual para tomar volúmenes conocidos.

Para cuantificar por el método de las adiciones estándar, se tomó 1 mL de la

disolución “X” y se transfirió a un matraz de 100 mL, llevando a enrase con agua

desionizada (disolución “Y”). Por último, se tomaron cinco alícuotas de 2 mL cada una de

la disolución “Y” y fueron transferidas a sendos matraces de 25 mL. Finalmente, se

añadieron diferentes concentraciones de SMT, SQX y PMT, se llevaron a enrase y se

inyectaron en el cromatógrafo según el método optimizado.

Para cuantificar por el método directo, se tomaron tres alícuotas de 2 mL de la

disolución “Y”, se transfirieron a sendos matraces de 25 mL y se llevaron a enrase con agua

desionizada. Estas muestras fueron inyectadas en el equipo y los cromatogramas

correspondientes fueron almacenados en el ordenador.

186 Capítulo II

Figura II.8. Esquema de preparación de las muestras.

A partir de los cromatogramas y basándonos en el uso de patrones de mezclas de

SMT, SQX y PMT, disueltas también en un 10 % de fase móvil, se obtuvieron los

porcentajes de recuperación para cada compuesto en cada preparado comercial en función

de la altura de pico. Como en el capítulo anterior, se utilizó la secuencia de patrones y

muestras descrita en el capítulo I de esta Memoria.

En la tabla II.10 se muestran los resultados obtenidos que se expresan como

porcentaje de recuperación para SQX, SMT y PMT con respecto a las concentraciones

indicadas en la etiqueta de cada uno de los productos y que corresponden a la media de tres

determinaciones.
Capítulo II 187

Tabla II.10. Concentraciones encontradas y porcentajes de recuperación obtenidos en

productos comerciales por medida directa, por adiciones estándar (A. E.) y por MEKC.

Producto y etiquetado (g/L) Encontrado (g/L) Recuperación (%)

Directa A. E. Directa A.E. MEKC

Cocciamin SQX 50 25.50 ± 0.91 26.71 ± 0.89 51.1 53.4 57.5

PMT 15 9.11 ± 0.34 9.16 ± 0.39 60.9 60.8 55.3

Cocichemical SQX 50 28.42 ± 0.91 28.78 ± 0.91 56.8 57.8 59.1

PMT 15 0 0 0 0 0

Coccilina* SQX 3.9 3.01 ± 0.12 3.12 ± 0.15 77.4 80.0 80.3
PMT 1.3 1.021 ± 0.052 0.897 ± 0.055 73.8 72.5 68.2
SMT 0 0.7013 ± 0.0061 0.7105 ± 0.0062 - - 0

Coccirex SQX 44 42.9 ± 1.6 44.19 ± 0.96 97.6 100.2 95.4

PMT 12 11.32 ± 0.43 11.06 ± 0.41 94.6 91.4 85.2

Coccivet SQX 50 31.32 ± 0.75 30.14 ± 0.68 87.0 85.7 89.8

PMT 15 8.122 ± 0.089 7.53 ± 0.11 89.3 83.5 92.1
MEN 50 - - - - 0

Quinoxipra-P SQX 50 47.9 ± 1.1 46.43 ± 0.98 95.9 93.3 97.4

PMT 15 14.12 ± 0.34 14.15 ± 0.42 94.0 93.6 94.6

*Las unidades en “Coccilina” son g/100 g.

Como se puede observar en la tabla de resultados, se han obtenido recuperaciones

similares en la determinación de SMT, SQX y PMT en productos comerciales cuando se

utilizó como técnica instrumental la cromatografía líquida de alta resolución,

independientemente del método de cuantificación, ya sea por medida directa o por

adiciones estándar.
188 Capítulo II

También se puede observar que estos resultados son comparables con los obtenidos

en el capítulo I, en el que se propuso un método para la determinación de estos mismos

productos utilizando la electroforesis capilar en su modalidad de cromatografía micelar.

Atendiendo a estas observaciones podemos concluir que:

1. Los métodos propuestos en los capítulos I y II son adecuados para la

determinación de SQX, SMT y PMT en productos comerciales, dado que las

recuperaciones obtenidas son comparables cuando se aplican a las mismas muestras.

2. Se confirman definitivamente las discordancias entre concentraciones etiquetadas

y contenidos reales en los productos analizados.

 CAPÍTULO III

DETERMINACIÓN DE SULFAMETOXAZOL, SULFADIMETOXINA,

SULFAMETOXIPIRIDACINA, TRIMETOPRIM Y BROMHEXINA EN

PRODUCTOS ZOOSANITARIOS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA

Capítulo III 191

III.1. INTRODUCCIÓN

Los agentes terapéuticos pueden tener actividad bacteriostática o bactericida. Al

primer grupo pertenecen las sulfamidas, ya que producen la detención en el crecimiento

de las bacterias y evitan la multiplicación de los gérmenes existentes, mientras que al

segundo grupo pertenecen las penicilinas, cefalosporinas y la combinación

sulfametoxazol-trimetoprim, ya que actúan sobre los gérmenes, en fase activa o en fase

de latencia, con un efecto letal.

El trimetoprim (TMP) se asocia por regla general al sulfametoxazol (SMX) o a

otras sulfamidas con parecidas características farmacocinéticas, tales como

sulfametoxipiridacina (SMP) y/o sulfadimetoxina (SDM). El interés de las

determinaciones cuantitativas de estos compuestos radica en el gran uso que se hace de

estas asociaciones en la práctica médica, veterinaria y farmacéutica.

Enfermedades como la coccidiosis y la neumonía, así como otro tipo de

trastornos, como la diarrea o la gastroenteritis se pueden tratar con combinaciones de las

mencionadas sulfamidas. Para ello, TMP se utiliza como potenciador.

Por otra parte, cuando se trata de combatir enfermedades de tipo respiratorio, se

pueden utilizar combinaciones de sulfamidas reforzadas con la presencia de algún

expectorante como la bromhexina (BRO), que restablezca la ventilación pulmonar.

El interés de resolver la mezcla compuesta por SMX, TMP, SDM, SMP y BRO,

cuyas estructuras químicas se hallan en la figura III.1, radica en que existen

combinaciones de estos compuestos, fundamentalmente de tipo sulfamida–trimetoprim,

que se aplican normalmente en la práctica veterinaria para el tratamiento de las citadas

enfermedades.
 192 Capítulo III

La técnica instrumental seleccionada para este trabajo fue la cromatografía

líquida.

O CH3 O N N
H2N S NH H2N S NH OCH3
O
O N
O

SMP
SMX

OCH3 OCH3
O N
H2N S NH N H2N CH2 OCH3
O N N
OCH3 OCH3
TMP
SDM

H2N Br

N CH2
CH3
Br
BRO

Figura III.1. Estructuras químicas de los compuestos en estudio.

La estabilidad de las disoluciones de estos compuestos así como el efecto del pH

y del contenido en etanol en su espectro de absorción han sido ampliamente estudiadas

en nuestro laboratorio. A modo de resumen, se citan brevemente algunos aspectos

referentes a las disoluciones de estos compuestos.

Capítulo III 193

III.1.1. Estabilidad de las disoluciones de sulfametoxazol, sulfadimetoxina,

sulfametoxipiridacina, trimetoprim y bromhexina.

En primer lugar se estudió el comportamiento en disolución de cada una de los

compuestos. Así, se comienza estudiando el disolvente apropiado, la estabilidad de sus

disoluciones y la influencia que ejerce el pH sobre los espectros de absorción UV-VIS de

cada una de las drogas.

1. Estabilidad de las disoluciones de sulfametoxazol

Se preparó una disolución en etanol-agua al 50% de SMX (10-3 M), estudiándose

su estabilidad a través de disoluciones diluidas de concentración 4x10-5 M y que fueron

preparadas diariamente a partir de la anterior. Se observó que durante un mes, las

disoluciones que se preparaban a partir de la concentrada, presentaban espectros de

absorción iguales, en los que se mantenían invariables la intensidad y la longitud de onda

del máximo de absorción característico.

2. Estabilidad de las disoluciones de sulfadimetoxina

Se preparó una disolución acuosa de SDM (100 mg/L) a la que se le estudió la

estabilidad, utilizando para ello la cromatografía líquida. Las muestras, que se preparaban

por dilución 1:5 a partir de la disolución madre, se inyectaban en el cromatógrafo y se iban

almacenando diariamente los cromatogramas, registrados a 255 nm. Se observó que,

durante un período de un mes, las disoluciones preparadas a partir de la disolución madre

de SDM presentaban picos invariables en cuanto a área y altura.

3. Estabilidad de las disoluciones de sulfametoxipiridacina

Se prepararon dos disoluciones de 250 mg/L de SMP, la primera en agua y la

segunda en una mezcla de disolventes etanol-agua al 50%. Se estudió la estabilidad con el

tiempo de cada una de estas disoluciones registrando los espectros de absorción de

194 Capítulo III

disoluciones diluidas de 10 mg/L, que fueron preparadas a partir de las concentradas en el

momento de efectuar la medida. Se observó que las disoluciones diluidas mostraron

espectros de absorción que permanecieron invariables durante al menos 5 días, cuando se

utilizó como disolvente la mezcla etanol-agua, mientras que cuando se utilizó como

disolvente el agua, los espectros fueron invariables durante al menos 18 días.

Se preparó una disolución de SMP (100 mg/L) disolviendo en la mínima cantidad

de HCl 1 M y posteriormente llevando a enrase con agua desionizada para estudiar su

estabilidad cromatográficamente. Se observó que durante un período de un mes, las

disoluciones preparadas a partir de la disolución madre de SMP presentaban picos

invariables.

4. Estabilidad de las disoluciones de trimetoprim

Se preparó una disolución en etanol-agua al 50% de TMP (10-3 M) a la que se le

estudió la estabilidad haciendo diariamente una dilución 1:25 y registrando posteriormente

su espectro de absorción UV-VIS. Se observó que, durante un período de un mes, las

disoluciones preparadas a partir de la disolución madre de TMP presentaban espectros de

absorción invariables.

5. Estabilidad de las disoluciones de bromhexina

Se preparó una disolución de BRO (100 mg/L) en agua:etanol (90:10) a la que se le

estudió la estabilidad de la misma manera que se ha comentado en el caso de SDM y se

observó que durante un período de un mes, las disoluciones preparadas a partir de la

disolución madre de BRO presentaban picos invariables.

Capítulo III 195

III.1.2. Influencia del pH sobre los espectros de absorción

Se prepararon, de forma independiente, cuatro disoluciones de 500 mL de una

concentración de 12 mg/L de TMP en el primer caso, 5 mg/L de SMX en el segundo caso,

5 mg/L de SDM en el tercer caso y 10 mg/L de SMP en el cuarto caso. En todos los casos,

el valor del pH se ajustó por adición de pequeñas cantidades de disolución de NaOH o

HCl, de concentración variable, sobre los 500 mL de disolución, de tal manera que el error

por dilución resultara despreciable. Finalmente, se registraron los espectros de absorción

entre 200 y 350 nm frente a un blanco.

Utilizando los datos obtenidos en el apartado anterior, se procedió a determinar las

constantes de ionización de SMX, TMP, SDM y SMP. Para ello se utilizaron dos métodos

espectrofotométricos, el de Stenstrom y Goldsmith (154) y el de Wilson y Lester (155).

Los valores medios de pKa obtenidos por los dos métodos se muestran a

continuación en la tabla III.1 y se comparan con los encontrados en bibliografía (31)

Tabla III.1. Valores de pKa para SMX, TMP, SMP, SDM y BRO.

Stenstrom y Goldsmith Wilson y Lester Bibliografía

SMX 6.0 5.9 5.9

SDM - - 6.2

SMP 7.2 7.2 6.7

TMP 7.1 7.1 6.6

BRO - - -
196 Capítulo III

III.2. ESTUDIO DE LOS PARÁMETROS EXPERIMENTALES

III.2.1. Estudios preliminares

En este capítulo, se ha utilizado la cromatografía líquida en fase reversa para

estudiar la separación de SMX, SMP, SDM, TMP y BRO, utilizando una columna

Kromasil C18 de 150 mm de longitud por 4.6 mm de diámetro interno, con un tamaño de

partícula de 5 µm. El cromatógrafo que se utilizó fue un Waters serie 35 con detector de

longitud de onda variable Waters 486, equipado con un sistema de cuádruple bomba,

que permite trabajar en gradiente. La inyección se realizó mediante una válvula

Rheodyne 7725 con un bucle de 20 µL. Todo se controló por ordenador, provisto del

programa informático Waters Baseline que permite el registro y el tratamiento de datos.

Se preparó una disolución por dilución exacta de las respectivas disoluciones

madres que contenía 2 mg/L de cada compuesto. Esta disolución, que llamaremos “C”

se utilizó para optimizar todos los parámetros, químicos e instrumentales, de la

separación.

Antes de poner en marcha el cromatógrafo, la fase móvil era filtrada con un

equipo de filtración Millipore y purgada con helio durante diez minutos para eliminar

los gases disueltos. Asimismo, cada día, antes de realizar la primera separación, se hacía

pasar fase móvil por el sistema hasta conseguir la estabilización de la línea base.

El caudal de fase móvil y la longitud de onda del detector fueron inicialmente 1

mL/min y 255 nm, respectivamente. La selección de esta longitud de onda se debe a que

las sulfamidas presentan un máximo de absorción en torno a esa zona de su espectro.

Atendiendo a las condiciones óptimas encontradas para las sulfamidas que

fueron objeto de estudio en el capítulo anterior y dado que las que se estudian en éste,
Capítulo III 197

comparten similitudes estructurales y funcionales con aquéllas, se decidió comenzar a

trabajar en condiciones similares a las empleadas entonces, es decir, a pH 3, impuesto

con un tampón fosfato 100 mM y acetonitrilo como fase móvil.

III.2.2. Optimización del pH de la fase móvil

Para estudiar la influencia del pH de la fase móvil en los tiempos de retención,

se prepararon cuatro disoluciones de tampón fosfato 100 mM de pH comprendidos entre

3.0 y 6.0, que se mezclaron en el equipo con acetonitrilo en proporción 60:40 (v:v;

tampón:acetonitrilo). Se inyectaron alícuotas de la disolución “C” en el sistema

cromatográfico y se registraron los correspondientes cromatogramas.

La influencia del pH en la retención de los compuestos se muestra en la tabla

III.2 y en la figura III.2. Análogamente, en la figura III.3 se muestra, esquemáticamente

cómo afecta el pH en la ionización de los compuestos en estudio.

Observando la figura III.2, es de destacar que el tiempo de retención de BRO

aumenta sensiblemente cuando pasamos de pH 3 a pH 4, y que a partir de este pH es

superior a 15 minutos, por lo que no se recoge en este gráfico a partir del pH citado.

Este comportamiento indica que a pH 3, la molécula de BRO presenta carga positiva,

por lo que su tiempo de retención no es muy superior al de los otros compuestos. Sin

embargo, al comenzar a aumentar el pH, pierde gradualmente esa fracción de carga

positiva, por lo que es más retenida en la fase estacionaria. Tanto es así que a pH > 4, su

tiempo de retención supera los 15 minutos, lo cual no es interesante desde el punto de

vista de análisis rutinario. Esta pérdida de carga positiva hace que la BRO se vuelva

insoluble en medio acuoso, llegando a precipitar en las proximidades del pH 7.

198 Capítulo III

Tabla III.2. Influencia del pH en la retención de los compuestos

pH Tiempo de retención (min)

TMP SMP SMX SDM BRO

3 1.838 2.464 3.600 4.432 5.460

4 1.811 2.422 3.455 4.268 13.806

5 1.808 2.411 3.293 4.128 >15

6 1.824 2.360 2.636 3.445 >15

15
Tiempo de retención (min)

TMP
10 SMP
SMX
SDM
BRO

3.0 4.0 5.0 6.0

pH

Figura III.2. Influencia del pH en los tiempos de retención.

También se puede ver que los tiempos de retención de TMP y SMP no se ven

afectados por el cambio del pH dentro del intervalo estudiado. El TMP se encuentra en

su forma catiónica en el intervalo de pH estudiado y por tener esta carga positiva en su

Capítulo III 199

estructura es poco retenido. En cuanto a SMP, en el intervalo de pH estudiado se

encuentra en su forma neutra, como las demás sulfamidas estudiadas. Dentro de este

intervalo, se observa que el pH no afecta a la retención de este compuesto porque su pKa

es 6.7, por lo que no llega a ionizarse en este intervalo.

Por último, es de destacar que de pH 3 a pH 5, los tiempos de retención de las

sulfamidas SMX y SDM permanecen constantes, mientras que a partir de pH 5,

empiezan a disminuir. Al igual que SMP, estos compuestos se encuentran en su forma

neutra en el intervalo de pH estudiado. Sin embargo, sus pKa están más próximos a 6,

por lo que a partir de pH 5 empiezan a adquirir una importante fracción de carga

negativa. Por ello empieza a detectarse un cambio en la tendencia de la retención de

estos compuestos, que empiezan a eluir más rápidamente.

Como consecuencia de este estudio, se seleccionó como óptimo el pH 3 porque

los compuestos aparecen bien resueltos y la separación se completa en un tiempo

aceptable, mientras que a pH superiores, la separación no es tan buena y el tiempo de

retención de la BRO se vuelve demasiado elevado, lo que aumentaría innecesariamente

el tiempo de análisis.

BRO
TMP
SMP
SDM
SMX

2 3 4 5 6 7 8
pH

forma forma forma

catiónica neutra aniónica

Figura III.3. Esquema de la ionización de los compuestos en estudio.

200 Capítulo III

III.2.3. Influencia de la concentración del tampón en la fase móvil

Este estudio se realizó con el fin de comprobar cómo influye la fuerza iónica de

la fracción acuosa de la fase móvil en la retención de los compuestos estudiados.

Para estudiar la influencia de la concentración del tampón de la fase móvil sobre

los tiempos de retención, se prepararon disoluciones de tampón fosfato de

concentraciones comprendidas entre 10 y 80 mM, ajustadas a pH 3.0, que se mezclaron

en el equipo con acetonitrilo en proporción 60:40 (v:v; tampón:acetonitrilo). Se

inyectaron alícuotas de la disolución “C” en el sistema cromatográfico y se registraron

los correspondientes cromatogramas. La influencia del pH en la retención de los

compuestos se muestra en la tabla III.3 y en la figura III.4.

Como era de esperar, debido al efecto salino, un aumento de la concentración del

tampón en la fase móvil supuso un aumento de los tiempos de retención, si bien éste

solamente resultó ser significativo en el caso de BRO. Como conclusión, se seleccionó

como óptima una concentración de 10 mM porque muestra suficiente capacidad

reguladora y porque, dado que es la concentración más baja del intervalo estudiado, es

la que presenta menor tiempo de análisis.

Capítulo III 201

Tabla III.3. Influencia de la concentración de tampón

Conc. (mM) Tiempos de retención (min)

TMP SMP SMX SDM BRO

10 1.809 2.459 3.584 4.432 5.607

20 1.809 2.459 3.584 4.432 5.705

40 1.837 2.461 3.596 4.438 5.792

60 1.826 2.468 3.613 4.452 6.012

80 1.846 2.476 3.639 4.478 6.116

8
TMP SMX
SMP SDM
BRO
Tiempo de retención (min)

0 20 40 60 80
Concentración de tampón (mM)

Figura III.4. Influencia de la concentración de tampón

202 Capítulo III

III.2.4. Selección del disolvente orgánico

Aunque el pH seleccionado como óptimo produce buenas separaciones entre los

compuestos, se observó que TMP mostraba cierto grado de solapamiento con el t0 y

también mostraba un hombro en las condiciones estudiadas, dentro de todo el intervalo

de pH.

Se comprobó que utilizando metanol en vez de acetonitrilo, se conseguía que

TMP no solapara con el t0 en las mismas condiciones de pH y concentración de tampón.

Por el contrario, el tiempo de retención de SDM y BRO llegaron a ser mayores de 20

minutos.

A pesar de este elevado tiempo de análisis, se optó por continuar el trabajo con

metanol porque se soluciona el problema del solapamiento del TMP aunque para

disminuir los tiempos de análisis se optó por trabajar en la modalidad de gradiente.

III.2.5. Optimización del gradiente

Como ya hemos indicado, es necesario la utilización de un gradiente de elución

para abordar la separación de los compuestos en estudio en un tiempo de análisis no

muy elevado.

El cambio controlado de la composición de la fase móvil durante el proceso

cromatográfico amplía enormemente las posibilidades de la LC, al obtenerse

discriminaciones más efectivas e incluso posibilitar separaciones vedadas cuando se

utiliza un sistema isocrático, además de reducir considerablemente el tiempo de análisis.

Los gradientes de elución pueden ser de varios tipos según se considere el perfil

concentración–tiempo. El más utilizado en LC es el lineal, ya que origina una mejor

Capítulo III 203

discriminación entre solutos, reflejada en un cromatograma con picos bien resueltos y

homogéneamente distribuidos.

Sin embargo el equipo utilizado también permite programar gradientes de

elución no lineales. Dentro de éstos, ofrece dos posibilidades:

1. Cóncavos. En este tipo de gradientes, la concentración de fase orgánica

aumenta poco a poco al principio y posteriormente registra un aumento

considerable, cada vez mayor, hasta alcanzar la concentración final

deseada.

2. Convexos. En este tipo de gradientes, la concentración de fase orgánica

aumenta mucho al principio y posteriormente registra un aumento más

leve hasta alcanzar la concentración final deseada.

Son diversos los sistemas de mezcla controlada de disolventes, empleados para

originar gradientes en LC. En nuestro caso, la mezcla se realizaba, inicialmente, a baja

presión, utilizando una válvula de mezcla controlada. Posteriormente, la mezcla entraba

en una bomba de alta presión. Mediante un programador de gradiente se controló el

funcionamiento del sistema variando la composición de la fase móvil con el tiempo.

Para optimizar el gradiente de elución se ensayaron varios de ellos, siempre

comenzando por pequeñas proporciones de metanol en la fase móvil con el fin de eluir

separadamente los compuestos menos retenidos (TMP, SMP y SMX) y acabando con

contenidos elevados de metanol para eluir rápidamente los más retenidos (SDM y

BRO).

En primer lugar se preparó una muestra de tipo “C” por dilución directa de las

disoluciones madre. Se insertó una alícuota de 20 µL en el sistema cromatográfico, por

el que fluía una fase móvil cuya fracción acuosa estaba formada por disolución
204 Capítulo III

reguladora de H3PO4/H2PO4- de pH 3.0 y concentración 10 mM y cuya fracción

orgánica era metanol, desarrollándose los correspondientes cromatogramas para cada

uno de los gradientes de elución ensayados, tanto lineales como no lineales.

Todos los cromatogramas fueron obtenidos manteniendo un caudal de fase

móvil de 1 mL/min y se midió como señal analítica la absorbancia a 255 nm.

Se seleccionó aquel gradiente lineal de elución de la fase móvil que proporcionó

buenas resoluciones cromatográficas y tiempos de retención no demasiado elevados,

con el fin de no alargar demasiado el tiempo de análisis.

El gradiente seleccionado, de tipo cóncavo, fue el siguiente:

% Acuosa* % CH3OH

0 min. 69 31

4 min. 31 69

14 min. 31 69

16 min. 69 31

* Disolución reguladora de H3PO4/H2PO4- de pH 3.0 y de concentración 10 mM.

Sin embargo, en lo que se refiere a estabilidad de línea base a la longitud de

onda de interés para la cuantificación, ninguno de los gradientes ensayados produjo

resultados aceptables, ya que en todos los casos se observó una deriva en ella que

afectaba al pico de SDM.

Para solventar esta complicación se decidió utilizar otra disolución reguladora

del mismo pH en la fase móvil. De esta manera, se sustituyó el tampón fosfato por el

citrato (pKa 3.06) y se inyectó una muestra preparada del modo habitual en el sistema

cromatográfico según el gradiente optimizado.

Capítulo III 205

Como resultado, se observó que la deriva de la línea base anteriormente citada se

corrigió hasta ser imperceptible, por lo que se decidió utilizar tampón citrato 10 mM de

pH 3.0 en lugar de fosfato. Asimismo, el gradiente optimizado anteriormente se

mantuvo invariable porque con citrato como tampón, se mantiene una excelente

separación en un tiempo aceptable.

III.2.6. Influencia del caudal de fase móvil

Este estudio se realizó con la finalidad de ver cómo influye este parámetro

instrumental en la eficacia del sistema cromatográfico seleccionado, para la separación

de los compuestos en estudio, reflejada en el ancho de pico que presentan, así como en

los tiempos de retención.

Para estudiar la influencia del caudal de fase móvil, se utilizó una disolución de

tampón citrato pH 3.0 de concentración 10 mM, que se mezcló en el equipo con

acetonitrilo según el gradiente optimizado. Se inyectaron alícuotas de la disolución “C”

en el sistema cromatográfico y se registraron los correspondientes cromatogramas. La

influencia del pH en la retención de los compuestos se muestra en la tabla III.4.

En ella podemos observar que, en el intervalo de valores ensayados, el aumento

del caudal hace disminuir notablemente los tiempos de retención, como era de esperar.

Asimismo, se observa que el aumento del caudal de fase móvil conlleva una ligera

disminución de los anchos de pico. Este comportamiento se debe a que la dispersión es

menor cuanto mayor es el caudal de fase móvil, según se explicó con detalle en el

apartado II.2.6 de esta Memoria.

Sin embargo, se observó que la estabilidad de la línea base era mejor cuando las

separaciones se llevaban a cabo con un caudal de 1 mL/min.

206 Capítulo III

Teniendo en cuenta estos resultados, se propone utilizar en lo sucesivo un caudal

de 1 mL/min, con el cual, el cromatograma puede obtenerse completo en 14 minutos.

Tabla III.4. Influencia del caudal de la fase móvil

TMP SMP SQX SDM BRO

Tr (min) 4.125 5.217 6.850 9.017 12.240

Caudal (ml/min)

1.0
Ancho (min) 0.616 0.867 1.088 0.633 0.820

Tr (min) 2.742 3.500 4.608 7.142 8.160

1.5
Ancho (min) 0.458 0.508 0.950 0.550 0.555

III.2.7. Selección de la longitud de onda de medida

El hecho de que el detector utilizado no sea de barra de diodos en línea, sino de

longitud de onda variable, implica que hay que realizar tantas separaciones como

compuestos en estudio si se quiere realizar la determinación de cada uno de ellos a las

respectivas longitudes de onda de máxima absorción. Esto significaría multiplicar por

cinco el tiempo y el coste del análisis, cuando realmente no es necesario. Debido a que

las muestras están suficientemente concentradas, basta con realizar una sola separación

para determinar varios compuestos, seleccionando una sola longitud de onda, a la cual,

la absortividad molar de cada compuesto sea suficientemente elevada para su posterior

determinación cuantitativa.

Este estudio se realizó con la finalidad de ver cómo influye este parámetro

instrumental sobre la sensibilidad de la separación, ya que la longitud de onda de

medida afecta a las áreas y alturas de los picos así como al ruido de la línea base.
Capítulo III 207

Para estudiar la influencia de la longitud de onda de medida en la sensibilidad, se

utilizó una disolución de tampón citrato pH 3.0 de concentración 10 mM, que se mezcló

en el equipo con acetonitrilo según el gradiente optimizado. Se inyectaron alícuotas de

la disolución “C” en el sistema cromatográfico y se registraron los correspondientes

cromatogramas a diferentes longitudes de onda. La influencia de la longitud de onda de

medida en la separación de los compuestos, en términos de ancho y área de pico se

muestra en la tabla III.5.

Tabla III.5. Optimización de la longitud de onda de medida.

TMP SMP SQX SDM BRO

W (min) 0.542 0.792 0.850 0.508 0.690

250
Longitud de onda (nm)

A(mvol×s) 59643 157961 108793 116471 85814

W (min) 0.567 0.667 0.908 0.500 0.680

255
A(mvol×s) 53254 181922 159652 157371 66333

W (min) 0.617 0.700 1.384 0.542 0.670

260
A(mvol×s) 46775 187524 193498 168841 36604

En ella podemos observar que, mientras que los anchos de pico en el intervalo de

valores ensayado no varían significativamente, las áreas de pico sí que varían con la

longitud de onda. Esto es lógico, puesto que la absortividad molar de los diferentes

compuestos en estudio varía con la longitud de onda. Aunque las longitudes de onda de

máxima absorción de TMP y BRO son 210 y 213 nm, respectivamente, la absorbancia

de estos compuestos en el intervalo de longitudes de onda estudiado es suficiente para

realizar su cuantificación. Las áreas de pico son mayores para TMP y BRO cuando la
208 Capítulo III

detección se hace a 250 nm, mientras que para SMP, SMX y SDM, lo son cuando se

mide a 260 nm. Así, las mayores áreas no coincidieron en una sola longitud de onda.

Otro parámetro a tener en cuenta fue la perturbación de la línea base por efecto

del gradiente. Ésta es menos acusada cuando se realiza la detección a 255 nm que

cuando se realiza a otra longitud de onda.

Teniendo en cuenta todo lo expuesto anteriormente, se decidió seleccionar 255

nm como óptima, como solución de compromiso entre la absorción de los distintos

compuestos y el ruido de la línea base, consiguiendo así la mejor relación señal/ruido

para el conjunto de los compuestos a analizar.

III.2.8. Método cromatográfico propuesto

A partir de los estudios realizados anteriormente, se propuso un método

cromatográfico que se esquematiza en la tabla III.6. Asimismo, en la figura III.5 se

muestra un cromatograma obtenido bajo el método propuesto en este capítulo para la

separación de una muestra que contenía 16 mg/L de TMP, SMP, SMX, SDM y BRO y

que fue registrado a 255 nm.

Se puede ver que los picos están bien resueltos y que el cambio de la línea base

debido al gradiente es inapreciable.

Capítulo III 209

Tabla III.6. Método cromatográfico propuesto.

Columna Kromasil C18

Fase móvil Citrato 10 mM (pH 3) : metanol (Gradiente)

Caudal 1 mL/min

Volumen inyectado 20 µL

Detección UV/VIS: 255 nm

0.25

SDM
0.20
Absorbancia

0.15
SMP
SMX
0.10 BRO
TMP

0.05

0.00

0.00 4.00 8.00 12.00 16.00

Tiempo de retención (min)

Figura III.5. Cromatograma de una disolución de 16 mg/L de SMX, SDM, SMP, TMP y

BRO, registrado a 255 nm

210 Capítulo III

III.3. ASPECTOS CUANTITATIVOS

III.3.1. Límites de detección y cuantificación

Los límites de detección y cuantificación, LOD y LOQ, reprectivamente, se

establecieron por medio del método del ruido de la línea base. Se estimó la fluctuación

de la línea base registrando la respuesta del detector frente a un blanco, a lo largo de un

intervalo de tiempo equivalente a diez veces el ancho del pico. Así, el LOD se obtuvo

como la concentración de muestra que produjo una altura de pico de tres veces la

fluctuación de la línea base y el LOQ se calculó como la concentración de muestra que

produjo una altura de pico diez veces la fluctuación de la línea base. Así, se obtuvieron

los límites de detección y cuantificación que figuran en la tabla III.7.

Tabla III.7. Límites de detección (LOD) y (LOQ) en mg/L

TMP SMP SMX SDM BRO

LOD 0.30 0.11 0.13 0.05 0.34

LOQ 1.0 0.4 0.4 0.2 1.1

III.3.2. Rectas de calibrado e intervalo de linealidad

La linealidad del método se estudió inyectando una serie de patrones de distinta

concentración, utilizando el método cromatográfico optimizado. Las rectas de calibrado

se establecieron de tal manera que la concentración correspondiente al límite de

Capítulo III 211

cuantificación fuese el punto de menor concentración y el de mayor concentración,

aquél que fuese 20 veces más concentrado que el primero.

Las rectas de calibrado se obtuvieron para cada componente, representando las

áreas de pico, medidas a 255 nm.

En las rectas de calibrado obtenidas puede verse una buena relación lineal entre

concentración y área de pico y también que las ordenadas en el origen resultaron ser

despreciables, según el intervalo de confianza calculado para un nivel de significación

de 0.05.

En la figura III.6 se representan las áreas de pico frente a las concentraciones de

cada uno de los compuestos. Las ecuaciones de las rectas obtenidas por mínimos

cuadrados se muestran en la tabla III.8, donde se puede apreciar la buena linealidad

obtenida, como lo demuestra el coeficiente de determinación r2, para el intervalo de

concentraciones indicado en la misma tabla.

1600000
TMP
SMP
SMX
1200000 SDM
BRO
Area

800000

400000

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0

Concentración (mg/L)

Figura III.6. Rectas de calibrado

212 Capítulo III

Tabla III.8. Ecuaciones de las rectas de calibrado e intervalo de linealidad.

Concentraciones e intervalo lineal en mg/L

Ecuación r2 Intervalo lineal

TMP A = -0.7 (±6.4) × 103 + 27.72 (±0.71) × 103 × C 0.9995 1-16

SMP A = 0.6 (±7.7) × 103 + 94.83 (±0.89) × 103 × C 0.9999 1-16

SMX A = 2.5 (±8.2) × 103 + 71.19 (±0.90) × 103 × C 0.9999 1-16

SDM A = 0.8 (±2.0) × 104 + 89.5 (±2.1) × 103 ×C 0.9995 1-16

BRO A = 0.1 (±5.9) ×103 + 25.19 (±0.62) × 103 × C 0.9995 1-18

III.3.3. Repetibilidad y reproducibilidad

Se prepararon dos muestras independientes que contenían, cada una, 4 mg/L de

cada compuesto. La repetibilidad se estudió realizando una serie de diez separaciones de

una de las dos muestras citadas anteriormente. En cuanto a la reproducibilidad, se

estudió realizando una serie de diez separaciones de la otra muestra, pasado un plazo de

24 horas y en las mismas condiciones.

Para evaluar la reproducibilidad entre diferentes días, se preparó una muestra

igual que la anteriormente citada y se hicieron dos series de diez separaciones, cada una

en días consecutivos. En ninguna de las dos series se obtuvo una desviación estándar

relativa mayor de 2.5 %, lo que indica el alto grado de precisión y fiabilidad del método

propuesto.

Se compararon las varianzas de las series según el test estadístico F de Snedecor

para pruebas de dos colas, que se aplica en este caso porque se trata de dilucidar si las
Capítulo III 213

variaciones entre las series de diferentes días son significativamente diferentes. Así, se

encontró que no existían diferencias significativas entre las series para un intervalo de

confianza del 95 %.

Los resultados obtenidos, en términos de medias (x), desviaciones estándar (S) y

porcentaje de desviación estándar relativa (% DER) se muestran en la tabla III.9.

Tabla III.9. Repetibilidad y reproducibilidad

Serie 1 Serie 2

x S % DER x S % DER S12/ S22 F0.05

TMP 11657 2581 2.2 114744 1452 1.3 3.1 4.026

SMP 386286 7065 1.8 381377 3878 1.0 3.3 4.026

SMX 305511 4505 1.5 301005 2709 0.9 2.8 4.026

SDM 385400 6292 1.6 385383 3229 0.8 3.8 4.026

BRO 112891 1707 1.5 110316 1309 1.2 1.7 4.026

III.4. APLICACIONES

Una vez más hay que reseñar que dada la alta viscosidad de los productos

comerciales en los que se encuentran los compuestos químicos de nuestro interés, no se

puede tomar un volumen exacto con una pipeta. Así, se decidió trabajar de modo similar

al de los capítulos anteriores. Se tomó una cierta cantidad con una jeringa y se llenó con

ella un matraz de 10 mL hasta la marca. Seguidamente, estos 10 mL se transfirieron a

un matraz de 100 mL, lavando varias veces con etanol el matraz de 10 mL con el fin de
214 Capítulo III

arrastrar todo el producto comercial. Más tarde, el matraz de 100 mL se llevó a enrase

con etanol (disolución “W”).

Tras ser agitado manualmente, se transfirió 1 mL de la disolución “W” a otro

matraz aforado de 100 mL, se añadió etanol para alcanzar una composición final del 25

% y se llevó a enrase con agua desionizada (disolución “X”).

Figura III.7. Esquema para la preparación de las muestras a partir de los productos

comerciales.

Para la determinación de TMP, SMP, SMX y SDM, se tomó 1 mL de la

disolución “X”, se transfirió a un matraz de 25 mL y se diluyó con agua hasta la marca.

Por otra parte, para la determinación de BRO, fue necesario inyectar

directamente la disolución “X” en el sistema cromatográfico, ya que su concentración

en los productos veterinarios es cien veces menor que la de SMP y veinte veces menor

que el TMP.

En el análisis de los productos comerciales, las cantidades se calcularon a partir

de unos patrones preparados por dilución exacta de las disoluciones madre, e inyectados

entre las muestras según el siguiente esquema:

PATRÓN 1 – MUESTRA 1A – PATRÓN 2 – MUESTRA 1B – PATRÓN 1

Capítulo III 215

Las recuperaciones fueron calculadas en base a los valores de concentración

etiquetados en los productos.

Los resultados de los análisis practicados están resumidos en la tabla III.10.

Tabla III.10. Concentraciones encontradas y recuperaciones

Etiquetado (g/L) Encontrado (g/L) Recuperación (%)

Hiprasulfa TS SMX 200 0 0

TMP 40 0 0

Sulfamiven SMP 200 117.9 ± 1.7 59.0

TMP 40 15.61 ± 0.25 39.0

Totaprim SMP 200 162.6 ± 4.8 81.3

TMP 40 32.3 ± 4.1 80.9

BRO 2 2.01 ± 0.10 100.1

Metazaries SMX 200 116.59 ± 0.71 58.3

A la vista de los resultados, cabe hacer los siguientes comentarios:

1. En Hiprasulfa – TS, solamente apareció un pico en los cromatogramas. Su tiempo

de retención no coincidía con ningún compuesto de los estudiados en este capítulo.

En la figura III.8 se ha superpuesto el cromatograma de una muestra de este

producto veterinario y el de su patrón corespondiente.

Además de la superposición de cromatogramas, esto fue confirmado por adiciones

estándar, adicionando al producto cada una de las tres sulfamidas que están

incluidas en la mezcla objeto de nuestro estudio. En estas experiencias, se vio que el

pico que se detectaba en este producto comercial no coincidía con el de ninguna de

las tres sulfamidas.

216 Capítulo III

0.07
Muestra
0.06 Patrón
Absorbancia SMP

0.05

0.04
TMP

0.03

0.02

0.0 1.5 3.0 4.5 6.0 7.5

Tiempo (min)

Figura III.8. Cromatogramas superpuestos de una muestra de Hiprasulfa – TS y de su

patrón correspondiente.

2. Las bajas recuperaciones obtenidas en general en los productos analizados pueden

deberse al empleo de mezclas de sulfamidas con sus correspondientes derivados

fenil-propanol disulfonato sódicos. Estos derivados son muy utilizados en este tipo

de productos porque son más solubles en agua que los productos puros, lo cual

facilita su administración a los animales en el agua de bebida. Cuando se utilizan

estas mezclas, en los productos elaborados estarán presentes tanto el compuesto

puro como el correspondiente derivado, sin embargo, en la etiqueta puede que figure

la concentración expresada, únicamente, como compuesto puro. Por esta razón, las

recuperaciones, que se calculan con respecto al valor etiquetado, no son las

esperadas. A este respecto, se trató de contactar con los responsables de los

laboratorios implicados, pero no se obtuvo ninguna respuesta.

Capítulo III 217

3. En los productos veterinarios que contienen la combinación SMX-TMP se han

observado discrepancias notables entre los valores etiquetados y los encontrados

aplicando el método analítico propuesto, como sucede cuando se analizan los

productos veterinarios que contienen la combinación SQX-PMT. Esto indica una

grave falta de control en la fabricación de este tipo de productos, lo que puede

repercutir seriamente en la salud de los animales y, por medio de la cadena

alimenticia, en la salud humana.

 CAPÍTULO IV

DETERMINACIÓN DE SULFAMETOXAZOL, SULFADIACINA,

TRIMETOPRIM, BROMHEXINA Y GUAYACOL EN PRODUCTOS

FARMACÉUTICOS POR ELECTROFORESIS CAPILAR EN ZONA

Capítulo IV 221

IV.1. INTRODUCCIÓN

En el capítulo III de esta Memoria ya se dio cuenta de las propiedades

bactericidas de la combinación sufametoxazol–trimetoprim y de sus aplicaciones a

ciertas enfermedades conocidas en el terreno de la práctica veterinaria.

Sin embargo, esta combinación también se puede encontrar en preparados

farmacéuticos y se utiliza en tratamientos contra trastornos habituales en los seres

humanos. A veces, como se comentó en el caso de los productos veterinarios, la función

del sulfametoxazol la puede desempeñar con plenas garantías otra sulfamida, en este

caso, la sulfadiacina (SDC). Ésta pertenece al grupo de sulfamidas sistémicas de acción

rápida y se utiliza de forma libre o como sal sódica. Se ha comprobado que es mucho más

activa y mucho mejor tolerada que las otras sulfamidas. Alcanza concentraciones elevadas

en sangre y en el líquido cefalorraquídeo, por lo que está indicada para el tratamiento de la

encefalitis o meningitis causadas por microorganismos sensibles. Esta sulfamida, al igual

que SMX, se suele asociar con el trimetoprim en proporciones (5:1).en los preparados

farmacéuticos.

Como en el caso de los animales, cuando se trata de combatir enfermedades de

tipo respiratorio, se pueden utilizar combinaciones de sulfamidas reforzadas con la

presencia de algún expectorante como la bromhexina (BRO), que restablece la

ventilación pulmonar.

El Guayacol (GUA) también puede encontrarse como compuesto asociado a esta

combinación por su función balsámica y expectorante.

El interés por resolver la mezcla compuesta por SMX, SDC, TMP, BRO y GUA

reside en que existen combinaciones de estos compuestos, fundamentalmente de tipo

 222 Capítulo IV

sulfamida–trimetoprim, que se aplican en la práctica médica para el tratamiento de

enfermedades.

Asimismo, desde el punto de vista cuantitativo, es interesante comparar los

resultados encontrados en los productos farmacéuticos con los de los productos

veterinarios, dado que ya ha quedado demostrado que en los productos veterinarios no

suelen coincidir las concentraciones etiquetadas con las encontradas.

La técnica instrumental seleccionada para este trabajo fue la electroforesis

capilar.

O CH3 O N
H2N S NH H2N S NH
O
O N N
O

SDC
SMX

H2N Br OCH3
N
N CH2 H2N CH2 OCH3
CH3 N
Br OCH3
BRO TMP

OH

OCH3

GUA

Figura IV.1. Estructuras químicas de los compuestos en estudio.

Capítulo IV 223

La estabilidad de las disoluciones de SDC y el efecto del pH sobre su espectro de

absorción ha sido ampliamente estudiado en nuestro laboratorio. A modo de resumen, se

citan brevemente algunos aspectos referentes a las disoluciones de SDC, tales como

estabilidad y cálculo de pKa por métodos espectrofotométricos, ya realizados en nuestros

laboratorios.

VI.1.1. Estabilidad de las disoluciones de sulfadiacina y guayacol

En primer lugar se estudió el comportamiento en disolución de SDC, con objeto de

seleccionar las condiciones óptimas de operación que sean comunes a las de TMP, las

cuales fueron estudiadas en el capítulo anterior. Así, se estudió la estabilidad de sus

disoluciones, y la influencia que ejerce el pH sobre los espectros de absorción UV/VIS de

SDC.

1. Estabilidad de las disoluciones acuosas de sulfadiacina

Se estudió la estabilidad de las disoluciones concentradas (250 mg/L) de SDC

registrando espectros de absorción UV/VIS a disoluciones diluidas preparadas diariamente

a partir de la concentrada.

Así, se prepararon disoluciones concentradas de SDC en etanol-agua al 96%, en

etanol-agua al 50%, en agua desionizada y en NaOH 10-5 M. A partir de ellas se

prepararon, primero cada media hora durante la tres primeras horas y posteriormente cada

día, disoluciones diluidas de 10 mg/L, registrándose inmediatamente después de su

preparación los espectros de absorción frente a sus respectivos blancos entre 190 y 400

nm. Se pudo observar que cuando se utiliza un 96 ó 50% de etanol el espectro inicial no es

estable más de tres horas, mientras que para los dos casos restantes los espectros de

absorción permanecen invariables durante al menos 10 días.

224 Capítulo IV

Debido a que la SDC mostró una gran estabilidad en agua, se utilizó este medio para

preparar las disoluciones madres de la sulfamida.

2. Estabilidad de las disoluciones de guayacol

Se preparó una disolución acuosa de GUA (100 mg/L) a la que se le estudió la

estabilidad, aprovechando las separaciones electroforéticas que se iban efectuando día a

día. Las muestras, que se preparaban por dilución directa a partir de la disolución madre, se

inyectaban en el equipo de electroforesis capilar y, gracias al sistema de diodos en línea, se

iban almacenando diariamente los espectros de absorción UV-VIS correspondientes a

GUA. Se observó que durante un período de un mes, las disoluciones preparadas a partir

de la disolución madre de GUA presentaban espectros de absorción invariables.

IV.1.2. Influencia del pH sobre los espectros de absorción

El estudio fue realizado a temperatura ambiente, utilizando 500 ml de una

disolución de 10 mg/L de SDC. Se ajustó el valor del pH por adición de pequeñas

cantidades de disolución de NaOH o HCl, de concentración variable, sobre los 500 ml de

disolución, de tal manera que el error por dilución resultara despreciable.

A partir de los datos de absorción frente al pH, obtenidos en el apartado anterior

se calculó la constante de ionización de la sulfadiacina, utilizando los métodos

espectrofotométricos de Stenstrom-Goldsmith (154) y de Wilson-Lester (155). Los

valores medios del pKa, obtenidos por estos métodos, se muestran a continuación en la

tabla IV.1. y se comparan con el encontrado en bibliografía (31).

Capítulo IV 225

Tabla IV.I. Valores de pKa para SDC

Stenstrom y Goldsmith Wilson y Lester Bibliografía

SDC 6.5 6.5 6.5

En el caso de GUA, se ha utilizado en esta Memoria la sal sódica de su derivado

sulfónico. Por lo tanto, incluso a valores muy bajos de pH estará desprotonado, es decir,

en su forma aniónica. Análogamente, BRO ha sido utilizada en su forma de clorhidrato,

por lo que, en disolución ácida estará en forma catiónica y a medida que aumente el pH,

esa carga irá disminuyendo hasta que la molécula quede en su forma neutra.

IV.2. ESTUDIO DE LOS PARÁMETROS EXPERIMENTALES

IV.2.1. Estudios preliminares

Se prepararon disoluciones hidroalcohólicas de 100 mg/L de SMX y TMP

(50:50 etanol:agua) y de BRO (10:90 etanol:agua). También se prepararon disoluciones

acuosas de 100 mg/L de SDC y GUA. A partir de éstas, y por dilución directa se

preparó, en un matraz de 25 mL, una disolución que contenía 20 mg/L de SMX, SDC,

TMP, BRO y GUA. Esta disolución, que llamaremos “Q” se utilizó para optimizar

todos los parámetros químicos e instrumentales que influyen en la separación.

El equipo que se utilizó fue un Beckman MDQ, dotado con un detector de

diodos en línea y controlado por ordenador. Las separaciones se llevaron a cabo en un

capilar de sílice fundida de 50 cm de longitud efectiva, 75 µm de diámetro interno y 375

µm de diámetro externo, con recubrimiento de poliamida. Para su refrigeración por

226 Capítulo IV

líquido el capilar estaba alojado en una carcasa con una ventana de detección de

100×800 µm.

Inicialmente se utilizó la electroforesis capilar en zona para separar los

compuestos en estudio. En esta modalidad, es posible separar cationes y aniones,

coincidiendo el tiempo de migración de las moléculas neutras con el del flujo

electroosmótico. De esta manera, la variable crítica en la separación será el pH, ya que

éste condicionará la ionización de las especies químicas según sea su pKa (figura IV.2).

BRO

GUA

SDC

TMP

SMX

4 5 6 7 8 9 10
pH
Forma Forma Forma
catiónica neutra aniónica

Figura IV.2. Esquema de la ionización de SMX, TMP, SDC, GUA y BRO en función del

pH

Para seleccionar un pH adecuado es necesario tener presente que BRO y TMP

no son solubles en disolución acuosa a pH superior a 7. Además, cuando se utilizó un

pH inferior a 5.5, regulado por tampón acetato, los picos de BRO y TMP solapaban

parcialmente, ya que presentan relaciones carga/masa similares. Este comportamiento

obligó a trabajar en un reducido intervalo de pH, entre 5.5 y 7.0. A valores de pH

cercanos a 6, los picos de BRO y TMP empiezan a separarse entre sí. Sin embargo
Capítulo IV 227

también se observó que a pH 6.5 el pico de BRO empezaba a perder intensidad, lo que

sugiere que empieza la precipitación de este compuesto (figura IV.3).

a)
10
TMP
8

6 SMX
SDC GUA
4
mAu

BRO
2

-2

0 1 2 3 4 5 6
Tiempo de migración (min)

b)
10
TMP
8
SMX
6
SDC GUA
4
mAu

2 BRO

-2

0 1 2 3 4 5 6
Tiempo de migración (min)

Figura IV.3. Electroferogramas de una muestra tipo “Q” registrados a 214 nm.

Electrolito de separación: tampón fosfato 15 mM de pH a) 6.0 y b) 6.5.

228 Capítulo IV

Como conclusión, se decidió utilizar tampón fosfato para ajustar el pH del

electrolito de separación a valores comprendidos en el intervalo citado. Según se

observa en la Figura IV.2, entre pH 6 y 7 coexisten compuestos catiónicos y aniónicos

en la disolución “Q” que pueden ser separados utilizando la electroforesis capilar en

zona.

Para estudiar la influencia de los diferentes parámetros, químicos e

instrumentales en la separación, se comenzó trabajando con un electrolito compuesto

por tampón fosfato (pH 6.0) 15 mM, separando con un voltaje de 25 kV a 20 ºC y un

tiempo de inyección de 5 s a una presión de 0.5 psi.

IV.2.2. Optimizacion del pH del electrolito

Para optimizar este parámetro, se preparó una disolución de tipo “Q” por

dilución directa de las disoluciones madre. Se realizaron las separaciones, obteniéndose

los correspondientes electroferogramas con electrolitos constituidos por tampón fosfato

de concentración 15 mM pero ajustados a diferentes pH. Se mantuvo siempre una

presión de 0.5 psi y un tiempo de 5 segundos en la inyección de la muestra y se realizó

la detección simultánea a las longitudes de onda de máxima absorción de cada uno de

los compuestos.

A partir de los electroferogramas obtenidos se midieron los tiempos de

migración para los distintos valores de pH.

En la tabla IV.2 y en la figura IV.4 se resumen los resultados obtenidos. En una

primera aproximación se puede ver que el tiempo del FEO disminuye a medida que

aumenta el pH. Esto es debido a que cuanto mayor es el pH, mayor será la ionización de

la pared del capilar y más acusado será el fenómeno de la electroósmosis.

Capítulo IV 229

Tabla IV.2. Influencia del pH en los tiempos de migración.

pH Tiempo de migración (min)

FEO BRO TMP SDC SMX GUA

5.0 3.36 2.42 2.42 3.36 3.59 7.17

5.5 3.11 2.35 2.35 3.26 3.66 5.84

6.0 2.85 2.19 2.28 3.28 3.81 4.94

6.5 2.82 2.19 2.43 3.79 4.13 4.89

8.00
FEO
BRO
7.00 TMP
Tiempo de migración (min)

SDC
SMX
6.00 GUA

5.00

4.00

3.00

2.00

5.00 5.50 6.00 6.50

pH

Figura IV.4. Influencia del pH en los tiempos de migración.

230 Capítulo IV

Asimismo, se puede observar que TMP y BRO están en su forma catiónica en

todo el intervalo de pH estudiado, ya que su tiempo de migración es inferior al del FEO.

Si se profundiza en el comportamiento electroforético de estos dos compuestos, merece

la pena comentar que a valores de pH comprendidos entre 5 y 5.5, BRO y TMP solapan,

mientras que empiezan a separarse a partir de pH 6, estando, a su vez, sus tiempos de

migración más próximos al del FEO. Como sabemos, ambos compuestos tienen un pKa

alrededor de 7, por lo que a partir de pH 6, su fracción de carga irá desapareciendo, y

tenderían a converger con el FEO si siguiese aumentando el pH (figura IV.3).

Por otro lado, el tiempo de migración de SDC coincide con el del FEO a pH 5 y

va aumentando, diferenciandose de éste a medida que aumenta el pH. Este

comportamiento tiene su explicación en que, por debajo de su pKa, predomina la forma

neutra de SDC, por lo que su tiempo de migración coincidirá, en estas circunstancias,

con el del FEO. Así, a medida que aumenta el pH, la molécula de SDC va adquiriendo

fracción de carga negativa, por lo que, como especie aniónica, su tiempo de migración

será superior al del FEO, como así ocurre.

En el caso de SMX, (pKa 5.6), aunque a pH 5 predomine su forma neutra, ya

presenta cierta fracción de carga negativa a este pH. Por esta razón su tiempo de

migración es próximo al del FEO, pero superior, puesto que está comenzando a adquirir

cierta fracción de carga negativa. Como se ve en la figura IV.4, al ir aumentando el pH,

el tiempo de migración de SMX va aumentando porque la molécula va adquiriendo cada

vez mayor fracción de carga

Finalmente, BRO, que está en forma de sulfonato, presenta carga negativa en

todo el intervalo estudiado, y su tiempo de migración disminuye a medida que aumenta

el pH. El comportamiento electroforético de esta molécula no viene, pues, determinado

Capítulo IV 231

por su pKa, sino por el aumento de la velocidad del FEO cuando aumenta el pH, lo que

conlleva una disminución en su tiempo de migración.

Así, a pH 6.5 se obtienen buenas resoluciones para todos los picos, sin embargo

el pico de BRO empieza a perder intensidad, por lo que, finalmente, se seleccionó como

óptimo el pH 6.2 porque los picos aparecen bien resueltos, sin que BRO precipite.

IV.2.3. Influencia de la concentración de tampón

Como sabemos, el efecto que produce sobre una separación electroforética la

variación de la fuerza iónica del medio no sigue una regla fija. Sin embargo, en la

mayoría de los casos un aumento de la concentración de tampón supone un aumento en

los tiempos de migración, a la vez que se mejora la resolución.

Para optimizar este parámetro se prepararon diferentes disoluciones de

electrolito de separación, que contenían tampón fosfato de pH 6.2 en concentraciones

variables entre 10 y 30 mM. En todos los casos, las separaciones correspondientes se

realizaron a 25 kV y 20 ºC, con un tiempo de inyección de 5 s a una presión de 0.5 psi

sobre una muestra de tipo “Q”. Los resultados de este estudio se encuentran en la tabla

IV.3.

A lo largo de todo el intervalo de concentraciones estudiado se puede ver que la

variación de la fuerza iónica no ejerce una influencia crucial en lo que se refiere a la

resolución de los picos de TMP y BRO.

Por ejemplo, en el caso de GUA, el tiempo de migración aumenta notablemente

con la concentración de tampón, mientras que en los casos de SDC y SMX, la influencia

es mucho menor. Esto puede explicarse en base a la mayor movilidad que presenta

GUA con respecto a SDC y SMX. Un aumento de fuerza iónica produce una
232 Capítulo IV

disminución de la velocidad del FEO, ocasionando un efecto más pronunciado sobre

aquellos compuestos aniónicos que presentan mayores movilidades.

Tabla IV.3. Influencia de la concentración del tampón borato. Tiempos en minutos y

anchuras medidas al 50 % de la altura de los picos.

Concentración de Fosfato (mM)

10 15 20 30
FEO tm 2.58 2.79 2.96 3.22
BRO tm 2.02 2.16 2.25 2.41
Ancho 0.025 0.027 0.025 0.028
TMP tm 2.13 2.27 2.40 2.59
Rs 2.308 2.597 3.365 3.709
Ancho 0.025 0.027 0.028 0.030
SDC tm 3.05 3.35 3.62 3.91
Rs 18.861 20.585 24.199 26.819
Ancho 0.031 0.034 0.035 0.037
SMX tm 3.47 3.87 4.26 4.47
Rs 8.848 11.208 13.731
Ancho 0.028 0.035 0.035 0.039
GUA tm 4.18 4.78 5.36 6.39
Rs 9.288 10.167 12.633 14.715
Ancho 0.058 0.070 0.071 0.093
Capítulo IV 233

En lo que concierne al ancho de pico, medido al 50 % de la altura, se puede ver

que a medida que aumenta la concentración de tampón en el electrolito de separación,

los anchos de pico de todos los compuestos aumentan. Este aumento es mayor cuanto

mayor es el tiempo de migración de los compuestos porque la difusión es mayor cuanto

mayor es el tiempo de migración, lo que se traduce en un pico más ancho. No obstante,

a pesar de este comportamiento, los picos obtenidos en todo el intervalo estudiado eran

simétricos y no llegaron a presentar desdoblamiento ni hombro alguno.

Finalmente, se consideró como óptima una concentración de tampón fosfato en

el electrolito de 15 mM por las siguientes razones:

1. Es una concentración suficiente para mantener el pH fijado en 6.2

2. Las resoluciones de los picos de BRO y TMP mejoran ligeramente con

un aumento de la fuerza iónica aunque también aumenta la corriente

generada.

3. En un corto tiempo de análisis se pueden separar los cinco compuestos

estudiados.

IV.2.4. Selección del voltaje de separación

Como ya se ha expuesto anteriormente, cuanto mayor sea el voltaje aplicado

mayor será la eficacia obtenida y más cortos serán los tiempos de análisis aunque ello

conlleva una disminución de resolución, debida a la mayor producción de calor.

Inicialmente, se comprobó mediante la representación de la ley de Ohm, que

existía linealidad entre voltaje aplicado y corriente generada hasta los 15 kV, como se

puede ver en la figura IV.5.

234 Capítulo IV

70.00

60.00
Corriente (microamperios)

50.00

40.00

30.00

20.00

10.00

0.00

0.00 10.00 20.00 30.00

Potencial (kV)

Figura IV.5. Influencia del voltaje en la corriente obtenida.

Posteriormente, para optimizar el voltaje se llevaron a cabo separaciones de la

muestra “Q” bajo las condiciones establecidas anteriormente, aplicando diferentes

voltajes entre 15 y 30 kV aplicados en una rampa lineal de 0.4 minutos de duración

(tabla IV.4 y figura IV.6)

Aunque un voltaje de 30 kV implica que no todo el calor generado es evacuado

del capilar, se obtienen buenas resoluciones en bajos tiempos de análisis, por lo que se

seleccionó este voltaje óptimo.

Capítulo IV 235

Tabla IV.4. Influencia del voltaje en los tiempos de migración

Tiempos de migración (min)

Voltaje (kV) FEO BRO TMP SDC SMX GUA

15 6.49 4.93 5.22 8.13 9.65 12.52

20 4.71 3.60 3.80 5.83 6.86 8.81

25 3.69 2.82 2.98 4.55 5.32 6.86

30 2.97 2.27 2.41 3.63 4.24 5.45

14.00
FEO
12.00 BRO
TMP
Tiempo de migración (min)

SDC
SMX
10.00 GUA

8.00

6.00

4.00

2.00

15.00 20.00 25.00 30.00

Potencial (kV)

Figura IV.6. Influencia del voltaje aplicado en la separación.

236 Capítulo IV

IV.2.5. Efecto de la temperatura.

Como sabemos, la temperatura se relaciona con la viscosidad del medio

electroforético. Así, un aumento de la temperatura incrementa la velocidad de migración

y por lo tanto disminuye el tiempo de análisis aunque a veces es a expensas de perder

resolución. El intervalo de trabajo suele ir de 20 a 50 ºC, aunque es habitual trabajar a

temperatura ambiente, pero lo más importante es mantenerla constante.

Bajo las condiciones químicas seleccionadas en apartados anteriores, se estudió

el efecto de la temperatura en la migración de los compuestos. Para ello, se realizaron

separaciones a diferentes temperaturas en el intervalo comprendido entre 20 y 35 ºC. No

se consideraron temperaturas inferiores porque la regulación de la temperatura con

nuestro equipo no es eficaz a más de 4 ºC por debajo de la temperatura ambiente.

Como se observa en la tabla IV.5 y figura IV.7, a medida que la temperatura

disminuye, se produce un incremento en los tiempos de migración de los compuestos.

Esto es consecuencia de una disminución en la velocidad del flujo electroosmótico,

debida al aumento de viscosidad del electrolito.

También puede verse que a 35 ºC la separación se completa en menos de 6

minutos, sin embargo, la corriente generada es elevada, 75.4 µA.

Por otro lado, aunque un aumento de la temperatura produce un aumento de la

resolución entre TMP y BRO, se observa que la variación de estos cambios no es

significativa. En lo que concierne al ancho de pico, se puede observar que un aumento

de la temperatura produce una disminución de los anchos de pico en todos los casos.

Esto se debe a que, al aumentar la temperatura de separación, la viscosidad del

electrolito de separación disminuye y los tiempos de migración se acortan, lo que reduce

la dispersión por difusión.

Capítulo IV 237

Tabla IV.5. Influencia de la temperatura

Temperatura (ºC)
20 25 30 35
FEO tm 3.339 2.983 2.701 2.496
BRO tm 2.53 2.27 2.05 1.89
Ancho 0.032 0.031 0.031 0.030
TMP tm 2.64 2.39 2.19 2.03
Rs 2.114 2.335 2.314 2.911
Ancho 0.034 0.033 0.032 0.028
SDC tm 3.99 3.60 3.26 3.03
Rs 20.052 18.652 17.486 18.990
Ancho 0.042 0.040 0.039 0.032
SMX tm 4.66 4.19 3.78 3.52
Rs 9.070 8.441 7.876 8.359
Ancho 0.038 0.035 0.035 0.032
GUA tm 6.03 5.38 4.85 4.47
Rs 11.405 10.711 10.134 9.970
Ancho 0.098 0.091 0.085 0.073
238 Capítulo IV

8.00
FEO
BRO
TMP
Tiempo de migración (min)

6.00 SDC
SMX
GUA

4.00

2.00

0.00

20.00 25.00 30.00 35.00

Temperatura (ºC)

Figura IV.7. Influencia de la temperatura en los tiempos de migración.

Finalmente se seleccionó una temperatura de separación de 25 ºC porque se

consigue una separación rápida, con buena resolución y una línea base más limpia, sin

perturbaciones.

Los parámetros químicos e instrumentales que afectan a la separación de los

compuestos en estudio, una vez estudiada su influencia y optimizado su valor se

encuentran resumidos en la tabla IV.6. Asimismo, en la figura IV.8 se muestra un

electroferograma, registrado a 235 nm de una muestra tipo “Q” utilizando el método

optimizado. Como se puede observar, los cuatro compuestos pueden ser separados

perfectamente, con el método propuesto, en un tiempo de 5 minutos.

Capítulo IV 239

Tabla IV.6. Método optimizado para la separación

Capilar Sílice fundida: 57 cm longitud × 75 µm diámetro interno

Electrolito Tampón fosfato 15 mM pH 6.2

Temperatura 25 ºC

Rampa de voltaje 30 kV (150 kV/min en 0.2 min)

Detector Barra de diodos en línea

Ventana detección 800 × 100 µm

8000

TMP
6000
SDC SMX
4000
mAu

2000 BRO GUA

-2000

0 1 2 3 4 5 6
Tiempo de migración (min)

Figura IV.8. Electroferograma de una muestra tipo “Q” utilizando el método

optimizado y registrado a 235 nm.

240 Capítulo IV

IV.3. ASPECTOS CUANTITATIVOS

En este capítulo se seleccionó como señal analítica el área de pico corregida,

medida a la longitud de onda de máxima absorción de cada compuesto, es decir, 213,

205, 241, 262 y 204 nm para BRO, TMP, SDC, SMX y GUA, respectivamente.

IV.3.1. Límites de detección y de cuantificación

En este capítulo se ha utilizado el método que se expuso en el capítulo I de esta

Memoria para calcular los el límite de detección y de cuantificación, tanto en

electroforesis capilar como en cromatografía líquida de alta resolución. Como ya se

indicó anteriormente, el citado método se basa en la fluctuación de la línea base.

Así, se obtuvieron los límites de detección y cuantificación que constan en la

tabla IV.7. Éstos son aceptables, teniendo presente la absortividad de los compuestos a

las longitudes de onda de medida y están en consonancia con los obtenidos para esta

familia de compuestos en otros trabajos encontrados en bibliografía (ver introducción).

Tabla IV.7. Límite de detección (LOD) y límite de cuantificación (LOQ) en mg/L.

BRO TMP SDC SMX GUA

LOD 0.3 0.1 0.3 0.2 0.2

LOQ 1.1 0.4 1.0 0.6 0.7

Capítulo IV 241

IV.3.2. Linealidad de la respuesta

El estudio de la linealidad se realizó inyectando muestras preparadas a partir de

las disoluciones madre por dilución directa en un intervalo de concentraciones entre 1 y

25 mg/L.

En todos los casos, las separaciones se realizaron utilizando el método

optimizado. Las rectas de calibrado fueron obtenidas representando la concentración

frente al área corregida, medida a la longitud de onda de máxima absorción para cada

componente.

Se obtuvo una buena linealidad entre concentración y área corregida para cada

uno de los compuestos estudiados. En la tabla IV.8 se muestran las ecuaciones,

coeficientes de determinación e intervalos de linealidad. En todos los casos, la ordenada

en el origen fue considerada despreciable, según el intervalo de confianza calculado

para un nivel de significación de 0.05. La representación de las rectas se halla en la

figura IV.9.

Tabla IV.8. Ecuaciones de las rectas de calibrado obtenidas e intervalos de linealidad.

Ecuación R2 Intervalo lineal (mg/L)

BRO A = -109 (±43) + 202.0 (±3.3) × C (mg/L) 0.9987 1.2 – 24

TMP A = -2 (±18) + 549 (±13) × C (mg/L) 0.9970 1.2 – 24

SDC A = 20 (±69) + 188.3 (±5.1) × C (mg/L) 0.9964 1.2 – 25

SMX A = -14 (±60) + 181.7 (±4.3) × C(mg/L) 0.9972 1.3 – 26

GUA A = 4 (±15) + 387 (±12) × C(mg/L) 0.9954 1.1 – 23

242 Capítulo IV

a) 15000

BRO
TMP
GUA
10000
Área corregida

5000

0 10 20 30
Concentración (mg/L)

b) 5000

SDC
4000 SMX
Área corregida

3000

2000

1000

0 10 20 30
Concentración (mg/L)

Figura IV.9. Rectas de calibrado de a) BRO, TMP y GUA y b) SDC y SMX

Capítulo IV 243

IV.3.3. Repetibilidad y reproducibilidad

Para llevar a cabo el estudio de la repetibilidad del método descrito

anteriormente se preparó una muestra que contenía una concentración de 12 mg/L de

cada componente y se hicieron doce replicados consecutivos en las condiciones

químicas e instrumentales seleccionadas como óptimas.

Para evaluar la reproducibilidad entre diferentes días, se prepararon dos muestras

igual que la anteriormente citada y se hicieron dos series de doce separaciones cada una

en días consecutivos. En ninguna de las dos series se obtuvo una desviación estándar

relativa superior al 3.5 %.

Se compararon las varianzas de las series según el test estadístico F de Snedecor

para pruebas de dos colas, que se aplica en este caso porque se trata de dilucidar si las

variaciones entre las series de diferentes días son significativamente diferentes. Así, se

encontró que no existían diferencias significativas entre las series para un intervalo de

confianza del 95 %.

Los resultados obtenidos, en términos de medias (x), desviaciones estándar (S) y

porcentaje de desviación estándar relativa (% DER) se muestran en la tabla IV.9.

Tabla IV.9. Repetibilidad y reproducibilidad del método.

Serie 1 Serie 2

x S % DER x S % DER S12/S22 F (0.05)

BRO 3151 103 3.3 3101 108 3.5 1.084 3.717

TMP 8624 232 2.7 8744 306 3.5 1.739 3.717

SDC 3094 97 3.1 3171 88 2.8 1.203 3.717

SMX 3187 105 3.3 3070 82 2.7 1.625 3.717

GUA 6183 201 3.2 6225 182 2.9 1.227 3.717

244 Capítulo IV

IV.4. APLICACIONES

El método propuesto se utilizó para la determinación de los compuestos

estudiados en seis preparados comerciales ampliamente utilizados en la práctica médica.

Los medicamentos analizados se comercializan, bien en comprimidos, bien en

cápsulas. Independientemente de este hecho, los análisis siempre se llevaron a cabo

tomando diez unidades del medicamento. Las cápsulas se vaciaron cuidadosamente y se

pesaron, tomando luego el peso equivalente a una unidad para los posteriores análisis.

En el caso de los comprimidos, se pesaron las diez unidades y se pulverizaron

mecánicamente en el mortero. Posteriormente se pesó la cantidad equivalente a una

unidad para continuar los análisis.

La cantidad equivalente a una cápsula o comprimido se disolvió en 400 mL de

agua desionizada y posteriormente se añadieron 500 mL de etanol. Tras unos minutos

de agitación mecánica, esta disolución se transfirió a un matraz aforado de 1000 mL y

finalmente se diluyó hasta la marca con agua desionizada (Disolución “X”). Este

tratamiento se esquematiza en la figura IV.10.

Figura IV.10. Esquema del tratamiento de las muestras

Capítulo IV 245

Para la determinación de las mezclas binarias de SMX y TMP y SDC y TMP, se

tomaron tres alícuotas de 1 mL de la disolución “X”, se llevaron a tres matraces de 25

mL y, finalmente, se diluyó hasta la marca con agua desionizada.

Para la determinación de BRO no fue necesario diluir la disolución “X” sino que

la determinación se hizo inyectando directamente esta disolución.

A partir de los electroferogramas registrados y basándonos en el uso de patrones

de mezclas de SDC, SMX, TMP, BRO y GUA, disueltas también en el mismo medio

hidroalcohólico, se obtuvieron los porcentajes de recuperación para cada preparado

comercial en función del área corregida.

El método seguido a la hora de cuantificar cada uno de los compuestos en los

preparados comerciales se basó en las inyecciones sucesivas de patrones y muestras,

según la secuencia:

PATRÓN 1 – MUESTRA 1 – PATRÓN 2 – MUESTRA 2 – PATRÓN 1

En la tabla IV.10 se muestran los resultados obtenidos, que se expresan como

concentraciones encontradas y porcentaje de recuperación para cada uno de los

compuestos con respecto a las concentraciones indicadas en las etiquetas de los

productos y corresponden a la media de tres determinaciones.

246 Capítulo IV

Tabla IV.10. Concentraciones encontradas (mg/L) y recuperaciones (%) obtenidas en

productos comerciales.

Producto y etiquetado Encontrado Recuperación

BRONGENIT SMX 400 404.0 ± 9.3 101.0

TMP 80 81.6 ± 1.9 102.1

TRIGLOBE SDC 820 811 ± 17 99.3

TMP 180 178.8 ± 8.6 98.9

BALSOPRIM SMX 400 386.9 ± 8.2 97.7

TMP 80 78.3 ± 2.6 97.9

BRO 5 4.91 ± 0.19 98.2

PULMOSTERÍN SMX 400 394.9 ± 3.5 98.7

TMP 80 79.9 ± 1.4 99.9

BRO 5 5.148 ± 0.043 102.9

EDUPRIM SMX 400 390 ± 10 97.6

TMP 80 78.1 ± 2.5 97.6

SEPTRÍN SMX 400 410 ± 14 102.5

TMP 80 81.5 ± 2.5 101.9

Capítulo IV 247

Como puede observarse, las recuperaciones son satisfactorias en todos los casos

y están de acuerdo con lo esperado según las etiquetas de los distintos productos

farmacéuticos analizados. En este sentido es de destacar que los productos

farmacéuticos basados en la acción de la mezcla SMX–TMP presentan recuperaciones

próximas al 100 % mientras que los productos veterinarios basados en la acción de la

misma combinación presentan recuperaciones muy lejanas del 100 %, como se vio en el

capítulo III.
 CAPÍTULO V

DETERMINACIÓN DE LOS PRINCIPALES PRODUCTOS DE

DEGRADACIÓN DE SULFAMETOXAZOL Y TRIMETOPRIM

EN PRODUCTOS FARMACÉUTICOS

POR CROMATOGRAFÍA ELECTROCINÉTICA MICELAR

Capítulo V 251

V.1. INTRODUCCIÓN

En los capítulos III y IV de esta Memoria se han propuesto sendos métodos de

separación para la combinación SMX–TMP en productos zoosanitarios y farmacéuticos,

utilizando cromatografía líquida de alta resolución y electroforesis capilar,

respectivamente.

Sin embargo es posible la aparición de subproductos que tengan su origen en los

principios activos presentes en productos farmacéuticos y/o zoosanitarios y que se

hayan generado en el seno de ese producto, según se explica en el capítulo de

introducción de esta Memoria.

En este capítulo abordamos como problema analítico la determinación de los

principales productos de degradación que podrían generarse en fármacos que contienen

una de las combinaciones más ampliamente utilizadas de sulfamida y potenciador, como

es la combinación entre sulfametoxazol y trimetoprim. Los principales productos de

degradación de sulfametoxazol son sulfanilamida (SAM) y ácido sulfanílico (ASU)

mientras que el de trimetoprim es el ácido 3,4,5-trimetoxibenzoico (ATMB).

252 Capítulo V

O CH3
H2N S NH H2N SO2NH2
O
O N
SAM
SMX

OCH3
N
- +
H2N CH2 OCH3 H2N SO3 H
N
OCH3
TMP ASU

COOH

H3CO OCH3
OCH3

ATMB

Figura V.1. Estructuras químicas de los compuestos en estudio.

Capítulo V 253

V.2. ESTUDIO DE LOS PARÁMETROS EXPERIMENTALES

V.2.1. Estudios preliminares

Se prepararon disoluciones hidroalcolhólicas de 100 mg/L de SMX, SAM,

ATMB y TMP (50:50 etanol:agua) y una disolución acuosa de ASU de la misma

concentración. A partir de éstas, y por dilución directa, se preparó, en un matraz de 25

mL, una disolución que contenía 20 mg/L de SMX, TMP, SAM, ASU y ATBM, que

llamaremos “E” para optimizar los parámetros químicos e instrumentales que influyen

en la separación.

El equipo que se utilizó fue un Beckman MDQ, dotado con un detector de

diodos en línea y controlado por ordenador. Las separaciones se llevaron a cabo en un

capilar de sílice fundida de 50 cm de longitud efectiva, 75 µm de diámetro interno y 375

µm de diámetro externo, con recubrimiento de poliamida. Para su refrigeración por

líquido, el capilar estaba alojado en una carcasa con una ventana de detección de 100 ×

800 µm.

Dado que en la separación que se plantea en este capítulo intervienen moléculas

que ya han sido separadas por electroforesis capilar en zona, (SMX y TMP) en el

capítulo IV, se decidió realizar una primera separación mediante esta técnica, gracias a

la cual es posible separar simultáneamente cationes y aniones, mientras que las

moléculas neutras eluirán junto con el flujo electroosmótico.

Para establecer unas condiciones iniciales de separación, se tuvieron en cuenta

los valores de pKa de cada uno de los compuestos, así como sus ionizaciones

respectivas, que se encuentran en la tabla V.1 y en la figura V.2, respectivamente.

254 Capítulo V

Tabla V.1. Valores de pKa para SMX, TMP, ASU, SAM y ATBM

SMX TMP ASU SAM ATMB

pKa 5.6 7.2 3.2 2.4; 10.4 4.7

ATMB

TMP
ASU

SAM

SMX

1 3 5 7 9 11 13
pH
zwitterion forma forma forma
catiónica neutra aniónica

Figura V.2. Esquema de la ionización de SMX, TMP, ASU, SAM y ATMB

Capítulo V 255

Como se ve en la figura V.2, a priori, no existe ningún valor de pH donde no se

encuentre algún compuesto en su forma neutra, lo cual indica la necesidad de utilizar la

modalidad de cromatografía electrocinética micelar.

Para confirmar este comportamiento experimentalmente, se realizó una

separación utilizando el mismo electrolito que se utilizó en el capítulo IV, es decir,

tampón fosfato de pH 6.2 de concentración 15 mM. Se inyectó una muestra tipo “E” en

modo hidrodinámico aplicando una presión de 0.5 psi durante un tiempo de 5s. La

separación se llevó a cabo a 30 kV y 25 ºC y el electroferograma correspondiente a esta

primera separación es el que se muestra en la figura V.3.

25
ATMB

20

TMP
15 SMX
mAu

10 ASU

5
FEO
0

0 2 4 6 8 10
Tiempo de migración (min)

Figura V.3. Electroferograma correspondiente a la separación de un muestra tipo “E”

utilizando fosfato de pH 6.2 (15 mM) como electrolito de separación

256 Capítulo V

Según muestra el electroferograma, el tiempo de migración del TMP es inferior

al del FEO, mientras que los tiempos de migración de SMX, ATMB y ASU son

superiores al del FEO. Por su parte, se comprobó que el tiempo de migración de SAM

coincidía con el del FEO. Esto confirma que, a pH 6.2, el TMP está en forma de catión,

que SMX, ATMB y ASU están en forma aniónica y que SAM está en su forma neutra.

El TMP se protona por debajo de su pKa, que es 7.2. Esto hace que aparezca una

carga positiva en esta molécula a pH 6.2, por lo que su tiempo de migración es menor

que el del FEO.

El ASU y el ATMB tienen en sus estructuras dos grupos ácidos orgánicos, uno

sulfónico y otro carboxílico, respectivamente. Éstos se desprotonan a valores de pH

superiores a sus pKa, que para ASU es 3.2 y para ATMB es 4.7. Esta desprotonación

implica que estos compuestos estén en forma aniónica cuando trabajamos a este pH, por

lo que sus tiempos de migración son superiores al del FEO.

En el caso de SMX, la desprotonación del nitrógeno en posición 4 se produce a

pH superiores a 5.6, por lo que a pH 6.2, esta molécula presentará carga negativa y su

tiempo de migración será superior al del FEO.

Por su parte, el segundo pKa de SAM es 10.4, que corresponde a la

desprotonación de la agrupación sulfamídica que presenta la molécula. Por esta razón

no presenta carga a pH 6.2 y su tiempo de migración coincide con el del FEO.

Como se puede ver, las conclusiones que se sacaron a partir del esquema de

ionización de los compuestos en estudio quedan plenamente avaladas por los resultados

experimentales. Consecuentemente, fue necesario trabajar en la modalidad de

cromatografía micelar electrocinética para poder separar todos los compuestos en

estudio.
Capítulo V 257

V.2.2. Optimización del pH del electrolito

Sabiendo de la necesidad de trabajar en medio micelar, sea cual sea el pH del

electrolito de separación, se planteó cuál sería el pH óptimo para realizar esta

separación. Como agente micelar se seleccionó el SDS por las mismas razones que se

explicaron en el capítulo I de esta Memoria e, inicialmente, se empleó en una

concentración de 40 mM.

Atendiendo a la figura V.2, aparecen dos zonas de pH en las cuales, solamente

existe una especie en su forma neutra, que será la que interaccione con las micelas del

medio. Entre pH 6 y 7, la única especie neutra que habrá será SAM. Por otra parte, a

partir de pH 10.5, la única especie que se encontrará en forma neutra será TMP. A

cualquier otro valor de pH, siempre tendremos, al menos, dos especies en su forma

neutra. Esto indica la conveniencia de estudiar qué ocurre en estos intervalos de pH.

Para ello se preparó una disolución de tipo “E” por dilución directa de las

disoluciones madre. Se realizaron las separaciones, obteniéndose los correspondientes

electroferogramas con electrolitos constituidos por tampón fosfato de concentración 10

mM ajustados a pH 6.5, 11.4 y 12.6 y 40 mM de SDS. Se mantuvo siempre una presión

de 0.5 psi y un tiempo de 5 segundos en la inyección de la muestra y se realizó la

separación a 25 ºC, aplicando una diferencia de potencial de 20 kV .

Se observó que, a pH 6.5, la concentración de 40 mM SDS no era suficiente para

que SAM, que es el compuesto que se encuentra en su forma neutra a este pH, se

separara del flujo electrosmótico. Asimismo, cuando se realizó la separación a pH 11.4

se observó un comportamiento análogo para TMP, que es el compuesto que se

encuentra en su forma neutra a este pH. Sin embargo, cuando la separación se realizó a

pH 12.6, el TMP se separó del FEO, pudiéndose finalmente llevar a cabo la separación
258 Capítulo V

de todos los compuestos estudiados. El electroferograma resultante se muestra en la

figura V.4. En él se puede ver que todos los compuestos en estudio se separaron en un

tiempo de 12 minutos. Aunque el pico de TMP presenta un hombro, éste se puede

eliminar en posteriores etapas de la optimización del método. Así, se decidió seguir

trabajando con tampón fosfato de pH 12.6 en posteriores separaciones.

25
ATMB
20

15 SAM
SMX
mAu

10
ASU TMP
5 FEO

-5

0 2 4 6 8 10 12 14
Tiempo de migración (min)

Figura V.4. Electroferograma correspondiente a la separación de un muestra tipo “E”.

Electrolito de separación: tampón fosfato de pH 12.6 (8 mM) y 40 mM de SDS.

Capítulo V 259

V.2.3. Influencia de la concentración de SDS

Para optimizar este parámetro se preparó una disolución de tipo “E” por dilución

directa de las disoluciones madre. Se realizaron las separaciones, obteniéndose los

correspondientes electroferogramas con electrolitos constituidos por tampón fosfato 10

mM de pH 12.6 pero con cantidades variables de SDS. Se mantuvo siempre una presión

de 0.5 psi y un tiempo de 5 segundos en la inyección de la muestra y se realizó la

separación a 25 ºC, aplicando una diferencia de potencial de 25 kV .

A partir de los electroferogramas obtenidos se midieron los tiempos de

migración para los distintos valores de concentración de SDS.

A la vista de los resultados (tabla V.2 y figura V.5) se puede observar que el

único componente cuyo tiempo de migración se ve afectado por la presencia de micelas

es TMP, que no presenta carga a este pH, por lo que, a medida que la concentración de

SDS aumenta, también lo hace el tiempo de migración del TMP.

Así, se seleccionó como óptima una concentración de SDS 20 mM porque

proporcionaba una separación con buenas resoluciones y un tiempo de análisis de 7

minutos.

Sin embargo también se observa que el pico de TMP presenta un hombro en

estas condiciones (figura V.6). Este comportamiento debe atribuirse a que este

compuesto no es suficientemente soluble en el electrolito. Para salvar esta dificultad, se

puede adicionar algún modificador orgánico al electrolito de separación que favorezca

la disolución de TMP en éste.

260 Capítulo V

Tabla V.2. Influencia de la concentración de SDS en la separación

SDS (mM) Tiempos de migración (min)

FEO SMX ATMB SAM ASU TMP

10 3.41 5.28 5.36 5.80 6.77 5.02

20 3.49 5.35 5.44 5.88 6.89 6.70

30 3.43 5.13 5.21 5.61 6.52 7.26

40 3.49 5.24 5.32 5.73 6.68 8.14

50 3.62 5.49 5.56 5.99 7.03 9.23

60 3.65 5.47 5.55 6.00 7.03 9.72

10
FEO
SMX
ATMB
SAM
8
Tiempo de migraci n (min)

ASU
TMP

10 20 30 40 50 60
Concentración de SDS (mM)

Figura V.5. Influencia de la concentración de SDS.

Capítulo V 261

20
ATMB

SMX SAM
10
mAu

FEO TMP ASU

0 2 4 6 8
Tiempo de migración (min)

Figura V.6. Electroferograma correspondiente a la separación de un muestra tipo E”.

Electrolito de separación tampón fosfato de pH 12.6 (10 mM) y 20 mM de SDS.

262 Capítulo V

V.2.4. Influencia de la concentración de modificador orgánico

Ya se ha comentado anteriormente que el efecto de la adición de un modificador

orgánico al electrolito no sigue una regla fija, por lo que no se puede predecir fácilmente

el tipo de modificador a utilizar ni tampoco su concentración. En este caso, se utilizaron

como modificadores orgánicos acetonitrilo, metanol y etanol.

Cualitativamente, se observó que cuando se realizaban las separaciones en

presencia de acetonitrilo, se conseguían picos más simétricos, mientras que en presencia

de metanol y etanol, los picos del TMP aparecían desdoblados o presentaban hombros.

Por esta razón, el acetonitrilo fue seleccionado como modificador orgánico óptimo para

posteriores separaciones.

Para estudiar la influencia de la presencia y concentración del acetonitrilo, se

realizaron separaciones de una muestra de tipo “E”, obteniéndose los correspondientes

electroferogramas con electrolitos constituidos por tampón fosfato 10 mM de pH 12.6 y

SDS 20 mM, adicionando cantidades de modificador orgánico de tal manera que las

concentraciones finales de éste fueran 1, 2.5, 5 y 15 %. Se mantuvo siempre una presión

de 0.5 psi y un tiempo de 5 segundos en la inyección de la muestra. Se realizaron las

separaciones a 25 ºC, aplicando una diferencia de potencial de 25 kV .

Como resultado se obtuvo que la adición de diferentes concentraciones de

acetonitrilo afectaba a la forma del pico del TMP, que se mostraba sin hombros ni

desdoblamientos. En lo referente a los tiempos de migración, se puede apreciar que

todos los compuestos salvo TMP, experimentan un incremento en sus tiempos de

migración cuando se aumenta la cantidad de acetonitrilo debido al aumento de

viscosidad del electrolito de separación. En el caso de TMP, se observa que, para una

concentración de acetonitrilo del 2.5 %, su tiempo de migración disminuye y se produce

Capítulo V 263

un cambio en la selectividad de la separación. Este comportamiento es debido a que el

TMP se vuelve más soluble en el electrolito cuanto mayor es la cantidad de disolvente

orgánico que se encuentra en él, por lo tanto, menor afinidad muestra por la fase

micelar.

Desafortunadamente, para esta concentración de acetonitrilo no se consiguieron

resoluciones aceptables. Como consecuencia, y teniendo en cuenta la resolución, el

tiempo de análisis y la forma del pico de TMP, se seleccionó como óptima una

concentración de acetonitrilo de 5 % para posteriores separaciones (figura V.7).

ATMB
20.00

SMX SAM
mAu

10.00
TMP ASU
FEO

0.00

0.00 2.00 4.00 6.00 8.00

Tiempo de migración (min)

Figura V.7. Electroferograma correspondiente a la separación de un muestra tipo E”.

Electrolito de separación: tampón fosfato de pH 12.6 (10 mM), 20 mM de SDS y5 % de

acetonitrilo
264 Capítulo V

V.2.5. Influencia de la concentración del tampón

Para optimizar este parámetro se preparó una disolución de tipo “E” por dilución

directa de las disoluciones madre. Se realizaron las separaciones, obteniéndose los

correspondientes electroferogramas con electrolitos constituidos por tampón fosfato de

pH 12.6 de concentraciones variables (entre 5 y 30 mM) y 20 mM de SDS, en presencia

de un 5 % de acetonitrilo. Se mantuvo siempre una presión de 0.5 psi y un tiempo de 5

segundos en la inyección de la muestra y se realizó la detección simultánea a las

longitudes de onda de máxima absorción de cada uno de los compuestos. Las

separaciones se llevaron a cabo a 25 kV y 25 ºC.

A partir de los electroferogramas obtenidos se midieron los tiempos de

migración, las resoluciones y los anchos de pico medidos al 50 % de altura, para los

distintos valores de concentración de tampón (tabla V.3).

En lo concerniente a los tiempos de migración y a las resoluciones, éstos

aumentan con la concentración del tampón en todos los casos.

Por el contrario los anchos de pico aumentan significativamente, también en

todos los casos, a partir de una concentración de 10 mM, lo cual es debido a que cuanto

mayor es la concentración del tampón, mayor será la corriente generada y mayor será el

calor generado por efecto Joule. Esto tiene como consecuencia un ensanchamiento de

los picos. En el caso del TMP, este efecto es tan acusado para una concentración de 30

mM de tampón que su pico correspondiente aparece como una perturbación de la línea

base. Por esta razón no figura en la tabla su ancho de pico ni la resolución de SMX con

respecto a TMP.

La ligera disminución que se registra en los anchos de pico de SMX y ATMB

hasta 10 mM se debe a que en esas concentraciones de tampón predomina el efecto de

Capítulo V 265

compresión de pico, que se produce en la zona de muestra cuando la fuerza iónica en

ésta es menor que la que existe en el electrolito. Sin embargo, a partir de esta

concentración empieza a predominar el calentamiento por efecto Joule, que produce los

efectos anteriormente comentados, por lo que los anchos de pico empiezan a aumentar.

Como conclusión, se decidió seleccionar 10 mM como concentración óptima de

tampón porque el pico de TMP es más estrecho y además porque se consigue una buena

resolución entre SMX y ATMB, manteniéndose la corriente a 80 µA.

Tabla V.3. Influencia de la concentración del tampón fosfato. Tiempos en minutos y

anchos medidos al 50 % de la altura de los picos.

Concentración de Fosfato (mM)

5 10 20 30
FEO tm 3.404 3.750 4.342 4.697
TMP tm 4.904 5.535 6.718 7.578
Ancho 0.107 0.098 0.143 -
SMX tm 5.108 5.914 7.579 8.925
Rs 1.722 3.582 6.164 12.913
Ancho 0.039 0.032 0.040 0.050
ATMB tm 5.165 5.995 7.709 9.133
Rs 0.411 1.339 1.870 2.739
Ancho 0.031 0.030 0.040 0.050
SAM tm 5.299 6.453 8.799 10.933
Rs 2.360 7.638 13.351 17.263
Ancho 0.032 0.035 0.052 0.070
ASU tm 6.263 7.653 10.892 >12
Rs 15.243 17.074 20.254 -
Ancho 0.037 0.042 0.067 -
266 Capítulo V

V.2.6. Estudio de la influencia del voltaje sobre la separación

Como ya se ha expuesto anteriormente, cuanto mayor sea el voltaje aplicado,

mayor será la eficacia obtenida y más cortos serán los tiempos de análisis aunque ello

puede conllevar una disminución de la resolución, debida a la mayor producción de

calor.

Para optimizar el voltaje, se llevaron a cabo separaciones de la muestra “E”

utilizando como electrolito de separación una disolución que contenía tampón fosfato

10 mM de pH 12.6, SDS de concentración 20 mM y 5 % (v:v) de acetonitrilo. Todos los

electroferogramas se registraron a 25 ºC, pero aplicando diferentes voltajes,

comprendidos en el intervalo de 5 y 30 kV en una rampa lineal de 0.4 minutos de

duración. La representación gráfica de la Ley de Ohm probó que existía linealidad entre

voltaje aplicado y corriente generada hasta 15 kV, como se puede ver en la figura V.8.

100.00

75.00
Corriente (microAmperios)

50.00

25.00

0.00

0 5 10 15 20 25 30
Voltaje (kV)

Figura V.8. Influencia del voltaje en la corriente obtenida.

Capítulo V 267

Por otra parte, para optimizar el voltaje de separación se llevaron a cabo

separaciones de una muestra que tipo “E”, utilizando el electrolito de separación

optimizado previamente y aplicando diferentes voltajes entre 15 y 30 kV.

Tabla V.4. Influencia del voltaje aplicado en los tiempos de migración

Voltaje (kV) Tiempos de migración (min)

FEO TMP SMX ATMB SAM ASU

15 6.619 10.21 10.55 10.67 11.55 13.90

20 4.940 7.52 7.92 8.02 8.76 10.46

25 3.911 5.88 6.23 6.31 6.86 8.19

30 3.075 4.15 4.90 4.96 5.37 6.44

15
FEO
SMX
ATMB
12 SAM
Tiempo de migracion (min)

ASU
TMP
9

15 20 25 30
Voltaje (kV)

Figura V.9. Influencia del voltaje aplicado en la separación

268 Capítulo V

Observando los datos de la tabla V.4 y la figura V.9 se puede ver que un

aumento del potencial de separación acorta los tiempos de migración en todos los casos,

como era de esperar. Merece la pena comentar que, cuando se realiza la separación a 20

kV, el tiempo de análisis es superior en 5 minutos al que se obtiene con 25 kV, pero la

resolución es similar en ambos casos. Análogamente, cuando se realiza la separación a

30 kV el tiempo de análisis es menor pero, por el contrario, la resolución disminuye y la

corriente generada aumenta demasiado.

Como conclusión, se seleccionó 25 kV como voltaje óptimo porque se consigue

un tiempo de análisis razonable y además la resolución entre los picos de SMX y

ATMB es máxima. La corriente generada bajo estas condiciones es de 80 µA.

V.2.7. Influencia de la temperatura en la separación

Bajo las condiciones químicas seleccionadas en apartados anteriores, se estudió

el efecto de la temperatura en los tiempos de migración, así como en las resoluciones y

anchos de pico de los compuestos. Para ello, se realizaron separaciones a diferentes

temperaturas en el intervalo comprendido entre 20 y 35 ºC.

Como se observa en la tabla V.5, a medida que la temperatura aumenta, se

produce una disminución en los tiempos de migración de los compuestos como

consecuencia de un aumento en el flujo elctroosmótico, producido por la disminución

de viscosidad del electrolito. Por supuesto, esto se traduce una disminución en las

resoluciones. Por otra parte, la temperatura también tiene influencia sobre la constante

de reparto entre compuestos y micelas. Así, un aumento de temperatura hace que

disminuyan las interacciones entre el compuesto, en este caso TMP, y la micela. Esto

tendría como efecto un aumento en el tiempo de migración de TMP, sin embargo se

Capítulo V 269

observa lo contrario porque predomina el efecto de la disminución de la viscosidad del

electrolito a medida que aumenta la temperatura de separación.

A bajas temperaturas, la viscosidad del electrolito de separación aumenta y los

tiempos de migración, también. Como consecuencia, los picos serán más anchos,

llegando a solapar parcialmente en algunos casos, como ocurre entre SMX y TMP a una

temperatura de 20 ºC.

Tabla V.5. Influencia de la temperatura

Temperatura (ºC)
20 25 30 35
FEO tm 4.285 3.785 3.323 3.060
TMP tm 6.581 5.583 4.665 4.133
Ancho - 0.080 0.114 -
SMX tm 6.677 5.952 5.075 4.656
Rs - 3.979 3.426 0.244
Ancho - 0.036 0.029 0.027
ATMB tm 6.754 6.025 5.131 4.710
Rs 1.243 1.187 1.168 1.148
Ancho 0.033 0.032 0.026 0.024
SAM tm 7.367 6.490 5.412 4.919
Rs 9.278 7.236 5.616 4.382
Ancho 0.041 0.039 0.030 0.028
ASU tm 8.648 7.681 6.381 5.808
Rs 16.593 15.981 15.515 15.216
Ancho 0.046 0.045 0.035 0.033
270 Capítulo V

Por otra parte, cuando se realiza la separación a 35 ºC se obtiene el menor

tiempo de análisis, alrededor de 6 minutos, sin embargo la corriente generada es la

mayor (87.1 µA).

Finalmente, se seleccionó una temperatura de 25 ºC como óptima porque se

consigue una separación rápida, con buena resolución y una línea base sin

perturbaciones.

V.2.8. Efecto del disolvente de la muestra

Se estudió cómo afecta el disolvente en que se encuentre la muestra sobre la

resolución y sobre la forma del pico de TMP. Teniendo en cuenta que estas muestras se

preparan por dilución de las madres, en todos los casos contendrán 10 % de etanol. Se

prepararon tres tipos de muestra:

1. Muestra preparada por dilución directa de las disoluciones madre.

2. Muestra preparada por dilución directa de las disoluciones madre, añadiendo

una cantidad de electrolito de separación de manera que su concentración

final fuese 10 % (v:v).

En el caso de la muestra disuelta en el electrolito de separación, se observó que

el pico de TMP es más estrecho que en el otro caso. Este comportamiento puede

explicarse debido a que cuando se disuelve la muestra en electrolito de separación,

debido probablemente a que la fuerza iónica en la zona de muestra aumenta, la difusión

del compuesto en la zona de muestra será menor y como consecuencia, el pico

correspondiente aparecerá menos ancho.

Capítulo V 271

Por otra parte, no se apreciaron diferencias significativas entre las resoluciones

de ATMB con respecto a SMX cuando se disolvió la muestra en uno u otro disolvente.

Por esta razón, se decidió que las muestras se preparasen por dilución de las

disoluciones madre y adicionando una cantidad de electrolito de separación tal que su

concentración final fuera del 10 % (v:v).

Los parámetros químicos e instrumentales que afectan a la separación de los

compuestos en estudio, una vez analizada su influencia y optimizado su valor, se

encuentran resumidos en la tabla V.6. Asimismo, en la figura V.10. se muestra un

electroferograma de una muestra de 24 mg/L de SMX, 4.8 mg/L de TMP, 5.6 mg/L de

ATMB, 7.9 mg/L de SAM y 6.4 mg/L de ASU utilizando el método optimizado y

registrado a 214 nm.

Tabla V.6. Método optimizado para la separación

Capilar Sílice fundida: 57 cm longitud × 75 µm de diámetro interno

Electrolito Tampón fosfato 15 mM pH 12.6; SDS 20 mM; 5 % CH3CN

Rampa de voltaje 25 kV (62.5 kV/min en 0.4 min)

Temperatura 25 ºC

Detector Barra de diodos en línea

Ventana de detección 800 × 100 µm

272 Capítulo V

20

SMX
ATMB

10 SAM
TMP
mAu

ASU

0 2 4 6 8 10
Tiempo de migración (min)

Figura V.10. Electroferograma de una muestra que contenía 24 mg/L de SMX, 4.8

mg/L de TMP, 5.6 mg/L de ATMB, 7.9 mg/L de SAM y 6.4 mg/L de ASU utilizando el

método optimizado y registrado a 214 nnm.

20
SMX
ATMB

10
mAu

6.4 6.6 6.8

Tiempo de migración (min)

Figura V.11. Detalle de la resolución entre ácido 3,4,5-trimetoxibenzoico y

sulfametoxazol
Capítulo V 273

V.3. ASPECTOS CUANTITATIVOS

Para el análisis cualitativo del problema analítico del que nos ocupamos en este

capítulo, hemos realizado las separaciones en medio acuoso, es decir, simplemente

disolviendo nuestros compuestos en agua. Hemos trabajado con disoluciones de 20

mg/L en medio acuoso, es decir con concentraciones de sulfamida y potenciador hasta

20 veces menores que las que existen en los productos farmacéuticos. Si realizáramos

las separaciones en muestras reales a estas concentraciones, la matriz también quedaría

diluida por igual y su influencia no sería apreciable. Sin embargo, por la propia

naturaleza de los compuestos con los que trabajamos, éstos siempre aparecerán en el

seno de un producto comercial, es decir, en el seno de una matriz.

Por esta razón se han abordado los aspectos cuantitativos concernientes a la

determinación de los productos de degradación de sulfametoxazol y trimetoprim en

productos farmacéuticos realizando las correspondientes separaciones en la matriz en la

que están presentes.

En este capítulo, se ha abordado como problema analítico la determinación de

los productos de degradación en una concentración del 1 % con respecto a los productos

principales y en presencia de éstos. Sin embargo, para la determinación de los productos

principales, es decir, SMX y TMP, se propone el método de electroforesis capilar en

zona descrito en el capítulo IV de esta Memoria.

274 Capítulo V

V.3.1. Límites de detección y de cuantificación

El problema analítico que nos ocupa presenta la peculiaridad de que no todos los

componentes de la mezcla están en proporciones parecidas en el seno de la muestra real,

sino todo lo contrario. Esto significa que hay que determinar unos compuestos, los

productos de degradación, en concentraciones muy pequeñas, en presencia de otros, los

principios activos, cuyas concentraciones son mucho mayores.

En este sentido, se realizaron experiencias para ver si se podían determinar los

productos de degradación en una concentración equivalente al 1 % de la de los

principios activos. Esta experiencia se realizó disolviendo una tableta de uno de los

productos farmacéuticos (“Septrín”) en medio hidroalcohólico (50:50, v:v) y

adicionando cantidades de SAM y ASU equivalentes a un 1 % de la concentración de

SMX y de ATMB equivalente a un 1 % de la concentración de TMP. Finalmente se

llevó esta disolución a un volumen final de 1 L. Se realizó la separación de esta

disolución bajo el procedimiento optimizado y se registró el electroferograma

correspondiente, que se muestra en la figura V.14.

En el electroferograma se observa que los productos de degradación del

sulfametoxazol (ácido sulfanílico y sulfanilamida) se encuentran suficientemente

resueltos para su determinación, tanto cualitativa como cuantitativa, mientras que el

producto de degradación del TMP, el ATMB queda parcialmente solapado por el pico

del SMX, cuya concentración es 500 veces mayor, por lo que el ATMB se puede

detectar, pero es muy difícil su cuantificación. Para la determinación cuantitativa de

ATBM, en la actualidad se está desarrollando en nuestro laboratorio un método basado

en las condiciones en las que se obtuvo el electroferograma de la figura V.3, aunque aún

no se tiene optimizado.
Capítulo V 275

20
SMX

15 TMP

10
mAu

SAM
5 ASU

-5

0 2 4 6 8 10
Tiempo de migración (min)

Figura V.14. Electroferograma de una disolución de una tableta de “Septrín” en 1L de

disolución hidroalcohólica al 50 % (v:v) en presencia de un 1 % de los productos de

degradación de SMX y TMP

Así, utilizando las condiciones antes descritas, se obtuvieron los límites de

detección y de cuantificación. En este capítulo se ha utilizado el método que se ha

expuesto en capítulos anteriores de esta Memoria y los resultados se encuentran en la

tabla V.7.

Tabla V.7. Límites de detección (LOD) y de cuantificación (LOQ) en mg/L

SAM ASU

LOD 0.6 1.26

LOQ 2.0 4.2

276 Capítulo V

V.3.2. Linealidad de la respuesta

El estudio de la linealidad se realizó preparando muestras de concentraciones

crecientes de ASU y SAM en presencia y ausencia de la matriz del medicamento donde

se encuentran. Es decir, para la obtención de la recta de calibrado en la matriz del

medicamento, se disolvió una tableta de uno de los productos farmacéuticos en medio

hidroalcohólico (50:50, v:v) y se llevó a 1 L en un matraz aforado (disolución “X”). Se

transfirieron 20 mL de esta disolución a un matraz aforado de 25 mL y se adicionaron

cantidades variables de las disoluciones madre de SAM y ASU de manera que su

concentraciones finales estuvieran entre 3 y 12 mg/L. Finalmente se llevó a enrase con

agua desionizada.

Para la obtención de la recta de calibrado en ausencia de la matriz del

medicamento, se pusieron en un matraz aforado 10 mL de etanol, 10 mL de agua

desionizada y cantidades variables de las disoluciones madre de SAM y ASU de manera

que su concentraciones finales estuvieran entre 3 y 12 mg/L. Finalmente se llevó a

enrase con agua desionizada.

En todos los casos, las separaciones se efectuaron utilizando el método

optimizado. Las rectas de calibrado fueron obtenidas representando la concentración

frente al área corregida, medida a la longitud de onda de máxima absorción para cada

compuesto, es decir, 254 y 251 nm para SAM y ASU, respectivamente.

Se obtuvo una buena linealidad entre concentración y área corregida para cada

uno de los compuestos estudiados. En las tablas V.8 y V.9, se muestran las ecuaciones,

coeficientes de determinación e intervalos de linealidad. En todos los casos, la ordenada

en el origen fue considerada despreciable según el intervalo de confianza obtenido para

un nivel de significación de 0.05.

Capítulo V 277

Para estudiar el posible efecto de la interferencia de la matriz, se llevaron a cabo

dos calibrados, uno en presencia de la matriz y otro en su ausencia. Puesto que las

pendientes obtenidas son estimaciones de la pendiente verdadera se aplicó un test

estadístico, descrito pormenorizadamente en el apartado de la introducción dedicado a

los métodos estadísticos, para decidir si las pendientes diferían o no de una manera

significativa y evaluar así la interferencia de la matriz. De esta forma, se han comparado

las pendientes de las rectas de regresión obtenidas en presencia de la matriz con la

pendiente del calibrado preparado en ausencia de la misma.

Tabla V.8. Rectas de calibrado obtenidas en presencia de la matriz

Ecuación r2 Intervalo lineal (mg/L)

ASU A= 1.1 (± 1.4) × 102 + 109 (± 17) × C (mg/L) 0.9973 3.2 – 13

SAM A= 0.3 (± 2.2) × 102 + 159 (± 21) × C (mg/L) 0.9982 3.9 – 16

Tabla V.9. Rectas de calibrado obtenidas en ausencia de la matriz

Ecuación r2 Intervalo lineal (mg/L)

ASU A= -0.5 (± 1.9) × 102 + 114 (± 22)×C (mg/L) 0.9960 3.2 – 13

SAM A= -0.8 (± 2.6) × 102 + 154 (± 24)×C (mg/L) 0.9974 3.9 – 16

En la tabla V.10, se resumen los resultados obtenidos en el estudio estadístico

aplicado, que se describió con detalle en el apartado dedicado al análisis estadístico

elemental, en la introducción de esta Memoria.

278 Capítulo V

Tabla V.10. Comparación de las rectas de ASU y SAM

Varianzas de los residuales Pendientes

ASU Fexperimental = 1.336 Ftabulado = 19.00 texperimental = 0.737 ttabulado = 2.78

SAM Fexperimental = 52.7 Ftabulado = 19.00 texperimental = 1.046 tcalculado = 4.303

Observando la comparación entre los valores de t, se ve que no existen

diferencias significativas entre las pendientes de las rectas en presencia y en ausencia de

la matriz. De todo ello se deduce que se podría realizar la cuantificación en ausencia de

la matriz, es decir, a partir del calibrado preparado con las muestras sintéticas.

V.3.3. Repetibilidad y reproducibilidad

Para llevar a cabo el estudio de la repetibilidad del método descrito

anteriormente se preparó una muestra que contenía una concentración de 3.93 mg/L de

SAM y 3.32 mg/L de ASU en disolución hidroalcohólica (50:50, v:v) por dilución

directa de las disoluciones madre y se hicieron doce replicados consecutivos en las

condiciones químicas e instrumentales seleccionadas como óptimas.

Para evaluar la reproducibilidad entre diferentes días, se preparó una muestra

igual que la anteriormente citada y se hicieron dos series de once separaciones cada una

en días consecutivos. En ninguna de las dos series se obtuvo una desviación estándar

relativa superior al 3.5 %.

Se compararon las varianzas de las series según el test estadístico F de Snedecor

para pruebas de dos colas, que se aplica en este caso porque se trata de dilucidar si las
Capítulo V 279

variaciones entre las series de diferentes días son significativamente diferentes. Así, se

encontró que no existían diferencias significativas entre las series para un intervalo de

confianza del 95 %.

Los resultados obtenidos, en términos de medias (x), desviaciones estándar (S) y

porcentajes de desviación estándar relativa ( %DER) se muestran en la tabla V.11.

Tabla V.11. Repetibilidad y reproducibilidad en las áreas corregidas en medio

hidroalcohólico (50:50, v:v)

Serie 1 Serie 2 Fexp Ftab

x S %DER x S %DER

SAM 745 24 3.3 660 19 2.9 1.67 3.717

ASU 460 12 2.7 418 14 3.4 1.26 3.717

También se estudió si la repetibilidad de las medidas variaba en presencia de la

matriz. Para ello se siguió un procedimiento similar al del caso anterior. Se prepararon

sendas muestras que contenían 3.93 mg/L de SAM y 3.32 mg/L de ASU por dilución

directa de las disoluciones madre en sendos matraces aforados de 25 mL. Uno de ellos

contenía 20 mL de disolución “X” y el otro contenía 20 mL de disolución

hidroalcohólica (50:50 v,v). Después de llevar a enrase con agua desionizada, se

hicieron once replicados consecutivos de cada muestra en las condiciones químicas e

instrumentales seleccionadas como óptimas.

Los resultados obtenidos, en términos de medias (x), desviaciones estándar (S) y

porcentajes de desviación estándar relativa ( %DER) se muestran en la tabla V.12.

280 Capítulo V

Tabla V.12. Repetibilidad en etanol:agua y en presencia de la matriz.

Etanol:agua Matriz Fexp Ftab

x S %DER x S %DER

SAM 745 24 3.3 727 24 3.3 1.0 3.717

ASU 460 12 2.7 575 19 3.2 2.2 3.717

Como se desprende de los datos de esta tabla, las repetibilidades entre series

fueron comparables y nunca superiores al 3.3 %. Además, la comparación de las

varianzas por medio del estadístico F de Snedecor para un nivel de confianza del 95 %

reveló que no existían diferencias significativas entre las dos series.

Al finalizar este estudio podemos concluir que se puede realizar la

determinación cuantitativa de los compuestos de degradación del sulfametoxazol (ácido

sulfanílico y sulfanilamida) sin necesidad de trabajar en presencia de la matriz.

V.4. APLICACIONES

La determinación cuantitativa de ASU y SAM se realizó en muestras sintéticas

porque, según se ha comprobado con anterioridad, la matriz no afecta ni a la linealidad

ni a la precisión de la determinación. Las concentraciones relativas ensayadas fueron

desde la 1:1 hasta la 4:1 (ASU:SAM) y viceversa. De esta manera, las muestras cuya

concentración de ASU permaneció fija se prepararon en matraces aforados de 25 mL,

que contenían lo siguiente:

- 3.12 mg/L de ASU

- Concentraciones variables de SAM

- 2.5 mL de electrolito de separación

Capítulo V 281

Análogamente se prepararon las disoluciones correspondientes a las muestras

sintéticas cuya concentración de SAM permanecía constante. Las proporciones relativas

entre los productos de degradación, ASU y SAM, se seleccionaron teniendo en cuenta

que la formación de uno de ellos pudiera estar más favorecida que la del otro,

dependiendo de las condiciones en que se haya producido la aparición de estos

compuestos.

La disolución que actuaban como patrón se preparó de manera similar a las

muestras. La concentración del patrón era 6.27 mg/L de SAM y 6.25 mg/L de ASU.

Una vez preparadas todas las disoluciones, se procedió a la efectuar la secuencia

de separación:

PATRÓN – M1 – PATRÓN – M2– PATRÓN – M3 – PATRÓN – M4 – PATRÓN

Se realizaron todas las separaciones según el método analítico optimizado y

siguiendo la secuencia descrita anteriormente.

Lógicamente, para la determinación de ASU y SAM en muestras sintéticas con

concentración fija de SAM y variable de ASU se trabajó de manera análoga.

Los resultados de las determinaciones figuran en la tabla V.13 y en ella se puede

ver claramente que las recuperaciones fueron próximas al 100 % en todos los casos.
282 Capítulo V

Tabla V.13. Concentraciones encontradas y recuperaciones de ASU y SAM.

SAM:ASU Concentración (mg/L) Recuperación (%)

SAM ASU SAM ASU

1:1 3.436 3.124 97.8 101.2

2:1 6.872 3.124 97.9 96.9

3:1 10.308 3.124 100.9 99.1

4:1 13.744 3.124 103.4 97.2

1:2 3.436 6.248 103.0 104.5

1:3 3.436 9.372 102.5 103.1

1:4 3.436 12.496 99.0 100.1

 CAPÍTULO VI

DETERMINACIÓN DE LOS PRINCIPALES METABOLITOS DE

DEGRADACIÓN DE SULFAMETOXAZOL Y TRIMETOPRIM

EN SUERO HUMANO POR CROMATOGRAFÍA

ELECTROCINÉTICA MICELAR
Capítulo VI 285

VI.1. INTRODUCCIÓN

Parte importante en la investigación analítica de las sulfamidas es la referente a su

determinación en fluidos biológicos. Una vez que son ingeridas, tanto las propias

sulfamidas como sus potenciadores sufren reacciones metabólicas dentro del organismo.

Estas reacciones originan unos derivados, los metabolitos, que pueden ser detectados en

sangre, orina, leche, carne y otros tejidos animales.

En esta Memoria, el estudio y la determinación de las sulfamidas y sus metabolitos

se concretó en la combinación SMX-TMP, que es una de las más utilizadas en la industria

farmacéutica y veterinaria.

Los principales metabolitos del TMP son el Trimetoprim-1-óxido (TMP1) y el

Trimetoprim-3-óxido (TMP3), mientras que el principal metabolito de SMX es el N4-Acetil-

sulfametoxazol (NAC), y proceden, respectivamente, de la oxidación y acetilación de los

productos principales en las posiciones indicadas.

Tanto la optimización del método de separación como la determinación de estos

compuestos se realizó en suero humano, previa desproteinización del mismo con

acetonitrilo.
286 Capítulo VI

VI.2. PRETRATAMIENTO DE LA MUESTRA

VI.2.1. Obtención del suero

La sangre utilizada fue extraída de personas sanas, en ayunas, y posteriormente

centrifugada a 582 g. El suero obtenido de esta manera se depositó en tubos de plástico con

fondo cónico de 2 mL de volumen, provistos de una tapa. Seguidamente se guardaron los

tubos de plástico a -18 ºC para su conservación.

VI.2.2. Desproteinización del suero

Según consta en el apartado dedicado a bibliografía, uno de los tratamientos más

extendidos para el tratamiento previo del suero consiste en precipitar las proteínas que éste

contiene mediante adición de acetonitrilo. Por esta razón se decidió establecer un método

de tratamiento previo del suero a utilizar, basado en su desproteinización con acetonitrilo,

que reuniera las siguientes características:

1. La precipitación de las proteínas del suero ha de ser cuantitativa.

2. Los compuesto de nuestro interés, es decir, SMX, TMP y sus metabolitos no deben

coprecipitar.

3. El sobrenadante o extracto debe evaporarse hasta sequedad. En esta etapa, el control

de la temperatura es crítico, porque hay que evaporar todo el sobrenadante (fracción

líquida de acetonitrilo) sin llegar a afectar a los compuestos de nuestro interés.

4. Todo el residuo seco debe disolverse en un volumen conocido, bien de agua

desionizada, de disolución hidroalcohólica o de electrolito de separación.

Capítulo VI 287

Con el fin de evaluar la conveniencia del tratamiento previo, se prepararon dos

disoluciones de 100 mg/L de SMX y TMP en las condiciones que se detallan en el apartado

de “Material y disoluciones” de esta Memoria.

El pretratamiento siempre se llevó a cabo por duplicado. A una de las muestras de

suero, se le adicionaban 100 µL de las disoluciones madre de SMX y TMP antes de iniciar

el pretratamiento y a la otra se le adicionaban estas cantidades una vez evaporado el

extracto, de manera que se pudiera evaluar si había ocurrido algún fenómeno de

coprecipitación y/o degradación por calefacción de las muestras.

Tras efectuar el pretratamiento, se inyectaban las disoluciones resultantes en el

equipo de electroforesis capilar y se obtuvieron los electroferogramas en las condiciones

establecidas para la separación de SMX y TMP en el capítulo IV. El equipo que se utilizó

fue un Beckman MDQ, dotado con un detector de diodos en línea, y controlado por

ordenador. Las separaciones se llevaron a cabo en un capilar de sílice fundida de 50 cm de

longitud efectiva, 75 µm de diámetro interno, y 375 µm de diámetro externo, con

recubrimiento de poliamida. Para su refrigeración por líquido, el capilar estaba alojado en

una carcasa con una ventana de detección de 100 × 800 µm.

Posteriormente, se evaluó si había habido pérdida de analito por precipitación y/o

degradación comparando las áreas de los compuestos en los dos casos. Tras numerosos

ensayos, se tomó como óptimo el siguiente proceso de pretratamiento del suero:

288 Capítulo VI

1. Se toman 500 µL de suero con una micropipeta, una vez descongelado, y se ponen

en un tubo de centrífuga de 5 mL.

2. Se añade 1 mL de acetonitrilo.

3. Se centrifuga a 582 g durante 10 minutos y posteriormente se separa el

sobrenadante con una pipeta Pasteur.

4. En el mismo tubo de centrífuga, al precipitado se le añaden 500 µL de acetonitrilo y

se agitan con una varilla de vidrio fina hasta la generación de una suspensión.

5. Se centrifuga nuevamente en las mismas condiciones, se separa el sobrenadante y

éste se une con el obtenido en la etapa 3.

6. Se toman 800 µL del sobrenadante y se evaporan a 80 ºC en una estufa hasta llevar

a sequedad.

7. Se disuelve el residuo obtenido en 400 µL de agua y 100 µL de electrolito de

separación.

8. De esta última disolución, se toman 200 µL para realizar la separación.

Con este procedimiento se consigue evitar la coprecipitación y también controlar la

temperatura de evaporación para evitar, en ambos casos, la pérdida de analito.

Capítulo VI 289

VI.3. ESTUDIO DE LOS PARÁMETROS EXPERIMENTALES

VI.3.1. Estudios preliminares

Se prepararon disoluciones madres de 100 mg/L de SMX y TMP y de 200 mg/L de

TMP1, TMP3 y NAC en etanol-agua (50:50). Se adicionaron 100 µL de las disoluciones de

SMX y TMP y 50 µL de las disoluciones de TMP1, TMP3 y NAC a 500 µL de suero. Esta

disolución se sometió a pretratamiento. El residuo obtenido tras evaporar a 80 ºC se

disolvió en una disolución que contenía 400 µL de agua desionizada y 100 µL del

electrolito de separación que se fuera a utilizar en cada momento. Con un simple cálculo, se

puede ver que la concentración de todos los compuestos de esta disolución resultante, que

llamaremos “S”, era 20 mg/L, de la cual se tomaron alícuotas de 200 µL para optimizar

todos los parámetros, químicos e instrumentales, que influyen en la separación.

Inicialmente se estudió la posibilidad de realizar la separación por CZE. Teniendo

en cuenta los pKa de los componentes de la mezcla (Tabla VI.1), y asumiendo que los

metabolitos de SMX y TMP presentarían pKa parecidos a los de éstos, solamente era

posible efectuar estas experiencias en las proximidades de pH 6.5, que es donde,

presumiblemente, podemos tener SMX y NAC en su forma aniónica y TMP, TMP1 y TMP3

en su forma catiónica, según el esquema de ionización de estos compuestos, propuesto en la

figura VI.1.
290 Capítulo VI

Tabla VI.1. Valores de pKa para SMX y TMP.

Stenstrom y Goldsmith Wilson y Lester Bibliografía

SMX 6.0 5.9 5.6

TMP 7.1 7.1 7.2

TMP

SMX

1 3 5 7 9 11 13
pH
forma forma forma
catiónica neutra aniónica

Figura VI.1. Esquema de ionización de SMX y TMP

Así, se llevó a cabo una separación de una muestra tipo “S” utilizando como

electrolito de separación tampón fosfato de pH 6.5 de concentración 20 mM. Se inyectó la

muestra en modo hidrodinámico aplicando una presión de 0.5 psi durante 5 segundos. La

separación se realizó a 25 kV y 20 ºC. El electroferograma correspondiente se muestra en la

figura VI.2.
Capítulo VI 291

15
FEO+TMP1 + TMP3

10
TMP
mAu

NAC
5 SMX

0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0

Tiempo de migración (min)

Figura VI.2. Electroferograma de una muestra tipo “S”registrado a 214 nm.

Electrolito de separación: tampón fosfato 20 mM de pH 6.5

En este electroferograma se observa que SMX y NAC presentan tiempos de

migración superiores al del FEO, lo cual indica que son aniones a este pH, según se indicó,

a priori, a partir del esquema de ionización de SMX y suponiendo una ionización similar

para su derivado acetilado.

Igualmente, se comprueba que TMP está en forma catiónica a este pH, según indica

dicho esquema.

Desafortunadamente, no fue posible separar los metabolitos del TMP, TMP1 y

TMP3, entre sí, sino que ambos presentaban un mismo tiempo de migración, el cual,

además coincidía con el del FEO al pH estudiado. Este comportamiento se debe a que los
292 Capítulo VI

mencionados compuestos no están ionizados, sino en su forma neutra a pH 6.5. Esto

significa que la modificación en su estructura molecular es suficiente para cambiar las

características ácido-base del TMP.

Debido a la imposibilidad de realizar esta separación por CZE, se decidió utilizar la

modalidad de MEKC y, en este caso, también se utilizó SDS como agente micelar por ser el

que más comúnmente se utiliza en MECK para la separación de este tipo de compuestos.

VI.3.2. Influencia del pH en la separación

A la vista de los resultados anteriores y teniendo en cuenta la ionización de los

diferentes compuestos, se observó que se necesitaba un pH suficientemente básico, por una

parte para que SMX y NAC adquierieran carga negativa y por otra parte para que las

micelas presentaran una migración neta hacia el cátodo que permitiera obtener un tiempo

de análisis razonable. Por esta razón, el estudio de la optimización del pH en el electrolito

de separación se realizó por encima de pH 7.0, utilizando tampón fosfato o borato según el

pH al que se deseara fijar el electrolito.

Así, para optimizar este parámetro, se realizaron separaciones de la muestra “S”,

utilizando como electrolito de separación diferentes disoluciones reguladoras de

concentración 20 mM ajustadas a valores de pH de 7.0, 8.0 (fosfato), 9.3 y 10.0 (borato) y

SDS de concentración 20 mM. Estas separaciones se llevaron a cabo aplicando un potencial

de 25 kV y a manteniendo una temperatura de 20 ºC.

Finalmente, se seleccionó como óptimo un pH de 9.3, proporcionado por disolución

reguladora de borato. Como se ve en el electroferograma de la figura VI.3, todos los picos

correspondientes a los analiltos aparecen perfectamente separados entre sí y también con

Capítulo VI 293

respecto a los compuestos que se encuentran en la matriz y que no han podido ser

eliminados mediante el tratamiento previo de las muestras de suero.

15.00

TMP

TMP1 TMP3
10.00 NAC
SMX
mAu

5.00

FEO
0.00

0.00 4.00 8.00 12.00

Tiempo de migración (min)

Figura VI.3. Electroferograma de una muestra tipo “S”registrado a 214 nm.

Electrolito de separación: tampón borato 20 mM de pH 9.3 y 20 mM de SDS

294 Capítulo VI

VI.3.3. Influencia de la concentración del tampón

Ya se ha comentado con anterioridad que, aunque en la gran mayoría de los casos

un aumento de la concentración de tampón supone un aumento en los tiempos de

migración, mejorando la resolución y evitando, en algunos casos, distorsiones en los picos

del electroferograma debido a efectos de electrodispersión, también tiene el inconveniente

de ocasionar altas intensidades de corriente que recorren el capilar generando mucho calor

por efecto Joule, provocando el ensanchamiento de los picos y pérdida de resolución.

Así, para optimizar este parámetro, se realizaron separaciones de la muestra “S”,

utilizando como electrolito de separación disoluciones que contenían 20 mM de SDS y

tampón borato de pH 9.3 de concentraciones entre 10 y 40 mM. Estas separaciones se

llevaron a cabo aplicando un potencial de 25 kV y manteniendo una temperatura de 20 ºC.

En general, se cumple que a mayor concentración de tampón en el electrolito de

separación, mayores son los tiempos de migración de todos los compuestos (tabla VI.2).

Sin embargo, este aumento es más acusado en los casos de SMX y NAC que en los de

TMP, TMP1 y TMP3. Este hecho se puede apreciar claramente en la figura VI.4, donde se

puede ver que un aumento de la fuerza iónica de la disolución hace que los picos de SMX y

TMP3 vayan aproximándose hasta solapar cuando la concentración es 30 mM. A

concentraciones mayores, se llega a producir una variación de la selectividad de la

separación.

Aunque la resolución entre TMP3 y SMX no es buena en ningún punto del intervalo

estudiado, esta dificultad puede salvarse variando la concentración de SDS porque, como

sabemos, SMX presenta carga negativa al pH de trabajo mientras que TMP3 se encuentra

en su forma neutra. Este hecho propiciará la interacción de TMP3 con las micelas,
Capítulo VI 295

aumentando su tiempo de migración a medida que aumente la concentración de SDS,

mientras que SMX no presentará afinidad por la fase micelar, por lo que su tiempo de

migración no se verá afectado por interacciones con las micelas.

Tabla VI.2. Influencia de la concentración del tampón borato. Tiempos en minutos y

anchuras medidas al 50 % de la altura de los picos.

Concentración de Borato (mM)

10 20 30 40
FEO tm 3.74 4.28 4.78 5.17
TMP1 tm 4.87 5.70 6.46 7.15
Ancho 0.042 0.053 0.059 0.124
NAC tm 5.20 6.40 7.48 8.56
Rs 4.070 8.163 11.532 10.897
Ancho 0.061 0.045 0.042 0.047
SMX tm 5.51 6.89 8.06 9.46
Rs 3.561 6.387 2.269 2.111
Ancho 0.051 0.039 - 0.052
TMP3 tm 5.78 6.96 8.15 9.18
Rs 3.000 0.787 0.323 4.721
Ancho 0.049 0.075 - 0.106
TMP tm 8.12 10.09 12.12 14.46
Rs 24.395 17.297 18.001 19.877
Ancho - 0.131 0.189 0.235
296 Capítulo VI

16
FEO
TMP1
14 NAC
SMX

Tiempo de migracion (min)

12 TMP3
TMP

10

10 20 30 40
Concentración de borato (mM)

Figura VI.4. Influencia de la concentración de borato en la separación.

En cuanto a los anchos de pico, se pueden observar dos tendencias. Por una parte,

en los casos de TMP, TMP1 y TMP3 se observa que cuanto mayor es la fuerza iónica del

electrolito, sus anchos de pico también son mayores porque aumenta el tiempo de

migración debido a que disminuye la movilidad. Por otra parte, en los casos de SMX y

NAC, se observa que sus anchos de pico disminuyen al aumentar la fuerza iónica hasta 30

mM y que aumentan para concentraciones mayores. Este comportamiento se debe a que en

la primera fase, es decir, hasta concentraciones de 30 mM, predomina el efecto de

compresión de pico, producido porque la fuerza iónica en la zona de muestra es mucho

menor que en el electrolito de separación.

Capítulo VI 297

En consecuencia, y a la vista de los resultados, se consideró como óptima una

concentración de tampón borato en el electrolito de 20 mM porque esta concentración es

suficiente para fijar el pH y porque la corriente generada no es tan elevada como para

producir distorsiones significativas en los picos, debidas a la dispersión por efecto Joule.

Por otra parte, aunque la resolución entre TMP3 y SMX no es buena, se puede mejorar

sensiblemente variando la concentración de SDS.

VI.3.4. Influencia de la concentración de SDS

Ya se ha explicado en esta Memoria que la modalidad de cromatografía

electrocinética micelar se basa en la presencia en el electrolito de separación de un

surfactante que tenga la capacidad de formar agregados micelares, como el dodecilsulfato

de sodio.

Cuando hay agregados micelares en el medio electroforético, las moléculas neutras

pueden interaccionar con las micelas, cuya parte exterior tiene carga negativa, de tal

manera que éstas migrarán en el campo eléctrico como un compuesto aniónico más, pero

llevando en su seno el analito en su forma neutra.

Se realizaron separaciones de una muestra “S”, utilizando como electrolito de

separación una disolución compuesta por tampón borato de pH 9.3 y de concentración 20

mM, en el que la concentración de SDS se fue variando desde 10 hasta 50 mM. Las

separaciones se realizaron aplicando un potencial de 25 kV y manteniendo una temperatura

de 20 ºC.

La influencia de la concentración de SDS en el electrolito de separación sobre el

tiempo de migración se muestra en la figura VI.5. Los resultados muestran que un aumento
298 Capítulo VI

en la concentración de SDS produce un ligero aumento de los tiempos de migración de

NAC y SMX. Como sabemos, a este pH, estos compuestos presentan carga negativa, al

igual que las micelas, produciéndose repulsiones electrostáticas que evitan la interacción

entre ambos. Por lo tanto ese ligero aumento no se debe a la interacción con las micelas,

sino al aumento de fuerza iónica del electrolito de separación que conlleva la adición de

cantidades crecientes de SDS. Por el contrario, la concentración de SDS ejerce una

influencia notable sobre los tiempos de migración de TMP1, TMP3 y TMP, ya que estos

compuestos están en su forma neutra al pH de la separación, por lo que interaccionan con

las micelas del medio. Esto se constata al observar que a medida que aumenta la

concentración de SDS los tiempos de migración de TMP1, TMP3 y TMP aumentan

notablemente. Mientras que, a bajas concentraciones de SDS, los tiempos de migración de

TMP1, TMP3 y TMP son bajos, a medida que se aumenta la concentración de SDS

aumentan las interacciones de estos compuestos con los agregados micelares, produciendo

un claro efecto de diferenciación de sus tiempos de migración.

Este efecto es especialmente notable en el caso de TMP entre 10 y 20 mM de SDS,

ya que es en este intervalo donde más aguda es la diferenciación de su tiempo de migración

con respecto a los de sus metabolitos.

En vista de los resultados de este estudio y para posteriores experiencias, se

seleccionó como óptima una concentración de 25 mM de SDS en el electrolito, porque en

estas condiciones se consiguen picos estrechos, bien resueltos y en un tiempo de análisis

aceptable.
Capítulo VI 299

Tabla VI.3. Variación de los tiempos de migración con la concentración de SDS

SDS (mM) Tiempo de migración (min)

FEO TMP1 NAC SMX TMP3 TMP

10 4.275 4.275 6.469 7.000 4.275 4.275

20 4.400 5.912 6.660 7.18 7.260 10.750
25 4.435 6.348 6.695 7.209 7.952 11.691
30 4.504 6.760 6.760 7.286 8.609 12.499
40 4.600 7.572 6.913 7.438 9.796 14.005
50 4.734 8.546 7.163 7.710 11.257 16.152

20
FEO
TMP1
NAC
SMX
15
Tiempo de migraci n (min)

TMP3
TMP

10

10 20 30 40 50
Concentración de SDS (mM)

Figura VI.5. Influencia de la concentración de SDS en los tiempos de migración.

300 Capítulo VI

VI.3.5. Estudio de la influencia del voltaje sobre la separación

Como ya se ha expuesto anteriormente, cuanto mayor sea el voltaje aplicado

mayores eficacias se obtienen y más cortos tiempos de análisis aunque ello conlleva una

disminución de resolución, debida a la mayor producción de calor.

En este sentido, la representación gráfica de la Ley de Ohm probó que existía

linealidad entre voltaje aplicado y corriente generada hasta 15 kV, como se puede ver en la

figura VI.6.

100

80
Corriente (microAmperios)

60

40

20

0 10 20 30
Voltaje (kV)

Figura VI.6. Influencia del voltaje en la corriente obtenida

Capítulo VI 301

De igual manera, la aplicación del voltaje requiere hacerlo de manera gradual, es

decir, aplicar una rampa de voltaje. Se sabe que hay una relación directa entre voltaje

aplicado y calor generado. Aplicando una rampa de voltaje progresiva y adecuada se puede

evitar un calentamiento brusco del capilar, de manera que se evite un calentamiento

instantáneo de la zona de muestra que provoque su dilatación y, como consecuencia, la

pérdida de la misma.

Para optimizar el voltaje, se llevaron a cabo separaciones de la muestra “S”

utilizando como electrolito de separación una disolución que contenía tampón borato 20

mM de pH 9.3 y SDS de concentración 25 mM. Todos los electroferogramas se registraron

a 20 ºC, pero aplicando diferentes voltajes, comprendidos en el intervalo de 15 a 30 kV,

todos ellos en una rampa de 0.2 minutos.

Como se esperaba, se observó que los tiempos de migración de todos los

compuestos disminuían a medida que aumentaba el potencial de separación (tabla VI.4), lo

cual redujo notablemente el tiempo de análisis sin que por ello, las resoluciones de los

compuestos variaran de manera significativa (figura VI.7). Por estas razones, se seleccionó

como óptimo un voltaje de 30 kV para efectuar la separación. Por otro lado, aunque en la

representación de la corriente generada frente al voltaje, se puede ver claramente que el

efecto Joule empieza a ser importante a partir de 20 kV, se comprobó que, a 30 kV, la

dispersión producida por este fenómeno no afectaba a las resoluciones, aunque sí a la forma

de los picos y, especialmente en el caso de TMP, que se estrecha considerablemente a

medida que aumenta el voltaje aplicado, por ser el de mayor tiempo de migración.

En cuanto a la rampa de potencial, se mantuvo la inicialmente ensayada, de 0.2

minutos porque con ella, se consiguen resoluciones y tiempos de análisis aceptables.

302 Capítulo VI

Tabla VI.4. Influencia del voltaje en los tiempos de migración.

Voltaje (kV) Tiempo de migración (min)

FEO TMP1 NAC SMX TMP3 TMP

15 7.450 10.624 11.052 11.855 13.216 19.148

20 5.444 7.791 8.148 8.759 9.715 14.185

25 4.356 6.194 6.497 6.985 7.715 11.227

30 3.510 4.945 5.232 5.623 6.136 8.847

20
FEO
TMP1
NAC
Tiempo de migracion (min)

15 SMX
TMP3
TMP

10

15 20 25 30
Voltaje (kV)

Figura VI.7. Influencia del voltaje aplicado sobre los tiempos de migración
Capítulo VI 303

IV.3.6. Efecto de la temperatura

Como sabemos, la temperatura se relaciona con la viscosidad del medio

electroforético. De este modo, un aumento de la temperatura diminuye la viscosidad, por lo

que aumenta la velocidad del FEO y como consecuencia la movilidad aparente de los

compuestos, acortando el tiempo de análisis.

Durante el proceso de separación, se estudió el efecto de la temperatura en la

migración de los compuestos. Para ello, se realizaron separaciones de una muestra tipo “S”,

utilizando como electrolito de separación una disolución que contenía tampón borato 20

mM de pH 9.3 y SDS de concentración 25 mM. Todos los electroferogramas se registraron

a 30 kV, pero a diferentes temperaturas, comprendidas en el intervalo de 15 a 30 ºC.

Como se preveía, una aumento de la temperatura produjo una disminución de los

tiempos de migración (tabla VI.5) y, por consiguiente, del tiempo de análisis. Así, se puede

ver que a 30 ºC, la separación está completada en menos de 8 minutos. Sin embargo,

también se ve que los picos de SMX y TMP3 solapan a esa temperatura. Por otro lado, se

observó que a lo largo de todo el intervalo de temperatura estudiado, los picos de todos los

compuestos aparecían perfectamente separados, si bien el tiempo de migración de TMP a

15 ºC era superior a 10 minutos, lo cual resultaba demasiado elevado. Ante esta situación,

hubo que encontrar una solución de compromiso que tuviera en cuenta la mejor resolución

en un tiempo de análisis aceptable.

La influencia de la temperatura sobre las anchuras de los picos no se consideró

significativa. La pequeña disminución que produce el aumento de la temperatura se puede

deber a que cuanto mayor es ésta, menor es la viscosidad del medio y los tiempos de

migración se acortan, disminuyendo así la dispersión.

304 Capítulo VI

Finalmente se seleccionó como óptima una temperatura de 20 ºC porque se consigue

una buena resolución en un tiempo de análisis aceptable.

Tabla VI.5. Influencia de la temperatura

Temperatura (ºC)
15 20 25 30
FEO tm 4.032 3.515 2.812 2.781
TMP1 tm 5.849 4.948 3.956 3.687
Ancho 0.043 0.041 0.038 0.035
NAC tm 6.048 5.256 4.205 4.129
Rs 2.647 4.480 6.102 7.724
Ancho 0.042 0.039 0.040 0.041
SMX tm 6.509 5.649 4.519 4.441
Rs 6.708 6.128 5.829 5.531
Ancho 0.036 0.034 0.032 0.031
TMP3 tm 7.356 6.139 4.911 4.491
Rs 8.501 5.872 4.056 -
Ancho 0.076 0.063 0.050 -
TMP tm >10 8.814 7.051 5.908
Rs - 18.580 17.815 17.049
Ancho - 0.098 0.082 0.067
Capítulo VI 305

VI.3.5. Influencia del modificador orgánico

Hasta este momento se ha visto que hay una diferencia de 1.2 minutos entre el

tiempo de migración del TMP1, el primer compuesto en ser detectado, y el del TMP3, que

es el cuarto compuesto en ser detectado. Esta circunstancia no impide la cuantificación de

ninguno de ellos porque sus picos aparecen bien resueltos. No obstante, la resolución puede

mejorarse incorporando al electrolito una cierta cantidad de modificador orgánico para

alterar la selectividad de la separación.

El disolvente orgánico que se utilizó en este estudio fue el acetonitrilo, y su

concentración se varió para obtener porcentajes entre el 2.5 y el 15 % (v:v) en el electrolito

de separación.

Cuando se estudió el efecto del acetonitrilo (figura VI.8), se observó que un

aumento en la concentración de modificador orgánico suponía un aumento en los tiempos

de migración de aquellos compuestos que presentaban ionización al pH de trabajo, es decir,

NAC y SMX. Este comportamiento puede explicarse porque un aumento del disolvente

orgánico provoca un aumento en la viscosidad del electrolito de separación, disminuyendo

considerablemente la velocidad del flujo electroosmótico, lo que origina que los tiempos de

migración de los compuestos sean mayores, de manera que aumentan los tiempos de

análisis.

Por el contrario, en los casos de los compuestos que interaccionan con las micelas,

es decir, TMP y sus metabolitos, la tendencia es diferente. Los tiempos de migración de los

compuestos TMP1 y TMP3 disminuyen levemente a concentraciones bajas de acetonitrilo,

se estabilizan a concentraciones moderadas y aumentan manifiestamente a concentraciones

elevadas. El tiempo de migración del TMP disminuye drásticamente al aumentar la

306 Capítulo VI

concentración de acetonitrilo, pero a partir de un 10 % de concentración de modificador,

aumenta notablemente. La disminución de los tiempos de migración de estos compuestos se

produce a bajas concentraciones de acetonitrilo, cuando no es tan acusado el aumento de la

viscosidad. Como sabemos TMP y sus metabolitos son muy poco solubles en disolución

acuosa, de manera que la presencia de acetonitrilo favorece su disolución en el electrolito

de separación, por lo que disminuirá su tendencia a la asociación con las micelas. Sin

embargo, para concentraciones mayores, predomina el efecto de la viscosidad del medio,

que al aumentar, hace que la velocidad del FEO disminuya y su tiempos de migración

aumenten.

10
Tiempo de migracion (min)

FEO
4 TMP1
NAC
SMX
TMP3
TMP
2

2 4 6 8 10 12 14 16
Concentración de acetonitrilo (%)

Figura VI.8. Influencia de la concentración de acetonitrilo en los tiempos de migración

Capítulo VI 307

Este modificador orgánico permite alterar la selectividad de la separación y además,

rebajar el tiempo de análisis. Cuando la concentración de acetonitrilo alcanza el 5 %, los

tiempos de migración de los cuatro compuestos mencionados al principio de este apartado

están separados en un intervalo de 1.9 minutos, lo cual mejora la resolución, y el tiempo de

migración del TMP disminuye en 1.6 minutos, lo cual redunda en beneficio del tiempo de

análisis.

Por estas razones se seleccionó como óptima una concentración de 5 % de

acetonitrilo en el electrolito de separación.

VI.3.6. Influencia del disolvente de la muestra

Se estudió el efecto del disolvente en que se encuentre la muestra sobre la simetría

de los picos. Se prepararon muestras en presencia y en ausencia de electrolito de separación

según se indica a continuación:

1. Muestra en disolución de etanol : agua al 10 % (v:v).

2. Muestra diluida en electrolito de separación al 10 % (v:v).

Se registraron y compararon los electroferogramas correspondientes y se observó

que cuando se disolvió la muestra en un 10 % de electrolito, los picos de TMP y sus

metabolitos eran ligeramente más altos. Por el contrario, los de SMX y NAC no mostraban

ninguna diferencia significativa en estos aspectos. Por esta razón se decidió adicionar a las

muestras electrolito de separación hasta alcanzar una concentración final de un 10 % para

disolver el residuo seco resultante del pretratamiento de la muestra.

Finalmente, en la tabla VI.6 se muestran las condiciones químicas e instrumentales

optimizadas para la separación de TMP1, TMP3, NAC, SMX y TMP. Asimismo, en la

308 Capítulo VI

figura VI.9 se muestra un electroferograma de una muestra tipo “S” utilizando el método

optimizado y registrado a 214 nm.

Tabla VI.6. Método optimizado para la separación.

Capilar Sílice fundida: 57 cm longitud × 75 µm diámetro interno

Electrolito Borato (pH = 9.3) 20 mM : SDS 25 mM : 5 % (v:v) acetonitrilo

Temperatura 20 ºC

Rampa de voltaje 30 kV (150 kV/min)

Detector Barra de diodos en línea

Ventana detección 800 × 100 µm

10
TMP
TMP3
TMP1

5 SMX
mAu

NAC

0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00

Tiempo de migración (min)

Figura VI.9. Electroferograma de una muestra tipo “S” utilizando el método optimizado y

registrado a 214 nm
Capítulo VI 309

VI.4. ASPECTOS CUANTITATIVOS

En este capítulo, se ha abordado como problema analítico la determinación de

SMX, TMP y sus metabolitos principales en suero humano. Aunque en el capítulo IV de

esta Memoria se propuso un método por electroforesis capilar en zona para la

determinación de SMX y TMP, éste estaba enfocado al análisis de estos dos compuestos,

entre otros, en productos farmacéuticos. Sin embargo, en el caso que nos ocupa, estos dos

compuestos, se encuentran en una matriz muy diferente, por lo que es muy probable que

aquel método no se pudiera aplicar en este caso. Además, cuando SMX y TMP se

encuentran presentes en medio biológico, suelen ir acompañados por sus metabolitos, por lo

que parece más apropiado aplicar un mismo método para la determinación de todos los

compuestos. Por estas razones, no sólo se determinaron los metabolitos, sino también los

compuestos de los que derivan, es decir, los principios activos.

VI.4.1. Límites de detección y cuantificación

Como en los capítulos precedentes, el procedimiento utilizado para establecer los

límites de detección y de cuantificación, tanto en electroforesis capilar como en

cromatografía líquida de alta resolución, se basa en el método del ruido de la línea base.

Para ello se prepararon dos muestras, de las cuales una actuó como blanco, siguiendo el

siguiente procedimiento:
310 Capítulo VI

1. Se tratan 2.5 mL de suero con 5 mL de acetonitrilo y se centrífuga según el

procedimiento descrito en el apartado correspondiente.

2. Se separa el sobrenadante y se lava el precipitado con 2.5 mL de acetonitrilo,

volviendo a centrifugar.

3. Se unen ambos sobrenadantes y se lleva todo el volumen (10 mL) a sequedad a

80ºC.

4. Se repiten los pasos 1 a 3, utilizando un suero al que se le han añadido todos los

compuestos de manera que su concentración fuera 0.4 mg/L de cada uno.

5. Los residuos de estas disoluciones se disuelven en 250 µL de electrolito al 10 %

(v:v), dando lugar a dos nuevas disoluciones, con analitos (“M”) y sin ellos (“B”).

6. Finalmente, se registran los electroferogramas correspondientes bajo las condiciones

optimizadas previamente.

De esta manera, comparando las fluctuaciones de la línea base de “M” frente a “B”

se pueden calcular los límites de detección y cuantificación en el extracto obtenido.

Evidentemente, como se ha concentrado la muestra inicial de suero 10 veces, los límites de

detección y cuantificación en el suero serán proporcionales al factor de concentración, y así

se refleja en la tabla VI.7.

Capítulo VI 311

Tabla VI.7. Límites de detección y de cuantificación (mg/L)

Extracto Suero

LOD LOQ LOD LOQ

TMP1 0.6 2.1 0.06 0.21

TMP3 0.7 2.4 0.07 0.24

NAC 0.4 1.4 0.04 0.14

SMX 0.4 1.3 0.04 0.13

TMP 0.6 1.9 0.06 0.19

VI.4.2. Linealidad de la respuesta

El estudio de la linealidad se realizó adicionando diferentes cantidades de TMP1,

TMP3, NAC, SMX y TMP, en un intervalo de concentraciones entre 0.2 y 3 mg/L en suero,

siguiendo el tratamiento establecido. Posteriormente, estas disoluciones se inyectaron en el

equipo de electroforesis capilar y se procedió a su separación de acuerdo con el método

optimizado anteriormente.

En todos los casos, para realizar los cálculos se obtuvieron los resultados usando

áreas de pico corregidas y la determinación de cada compuesto fue realizada a la longitud

de onda correspondiente a su máximo de absorción, es decir, 206 nm para TMP, TMP1 y

TMP3 y 260 nm para SMX y NAC. Para seleccionar esta longitud de onda se utilizaron los

espectros de absorción UV-Visible obtenidos con el detector de diodos en línea.

312 Capítulo VI

En las rectas de calibrado obtenidas puede verse una buena relación lineal entre

concentración y área de pico corregida y también que las ordenadas en el origen resultaron

ser despreciables, según el intervalo de confianza obtenido para un nivel de significación de

0.05.

En las figura VI.10 a VI.12 se representan las áreas corregidas de los compuestos

frente a las concentraciones. Las ecuaciones de las rectas obtenidas por mínimos cuadrados

se muestran en la tabla VI.8 y se puede apreciar que la linealidad obtenida es satisfactoria y

que las ordenadas en el origen son despreciables en todos los casos.

Tabla VI.8. Ecuaciones de las rectas de calibrado e intervalos de linealidad.

Ecuación r2 Intervalo lineal (mg/L)

TMP1 A = 33 (± 56) + 272.5 (± 3.4) × C (mg/L) 0.9999 0.2 – 3

TMP3 A = -10 (± 90) + 240.4 (± 5.4) × C (mg/L) 0.9997 0.2 – 3

NAC A = -10 (± 13) + 109.70 (± 0.75) × C (mg/L) 0.9997 0.2 – 3

SMX A = -30 (± 62) + 112.2 (± 3.7) × C (mg/L) 0.9994 0.2 – 3

TMP A = -0.2 (± 1.3)×102 + 286.4 (± 2.5) × C (mg/L) 0.9967 0.2 – 3

Capítulo VI 313

a)

10000

7500
Area corregida

5000

2500

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5

Concentración (mg/L)

b)

4000

3000
Area corregida

2000

1000

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5

Concentración (mg/L)

Figura VI.10. Rectas de calibrado de a) TMP1 y b) NAC

314 Capítulo VI

a)

8000

6000
Area corregida

4000

2000

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5

Concentración (mg/L)

b)

4000

3000
Area corregida

2000

1000

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5

Concentración (mg/L)

Figura VI.11. Rectas de calibrado de a)TMP3 y b)SMX

Capítulo VI 315

10000

8000
Area corregida

6000

4000

2000

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5

Concentración (mg/L)

Figura VI.12. Recta de calibrado de TMP

316 Capítulo VI

VI.4.3. Repetibilidad y reproducibilidad del método

Para llevar a cabo el estudio de la repetibilidad del método descrito anteriormente se

preparó una muestra de suero que contenía unas concentraciones de 8 mg/L de TMP1,

TMP3, NAC, SMX y 12 mg/L de TMP y se hicieron once separaciones consecutivas en las

condiciones químicas e instrumentales seleccionadas como óptimas. Se comprobó que la

precisión de las medias de área corregida mejoraba cuando se lavaba el capilar con NaOH

0.1 M durante 2 minutos entre separaciones.

Para evaluar la reproducibilidad entre diferentes días, se preparó una muestra igual

que la anteriormente citada y se hicieron dos series de once separaciones, cada una en días

consecutivos y se compararon las varianzas de las dos series según el test estadístico F de

Snedecor para pruebas de dos colas. Así, se encontró que no existían diferencias

significativas entre las series para un intervalo de confianza del 95 %.

Los resultados obtenidos, en términos de medias (x), desviaciones estándar (S) y

porcentaje de desviación estándar relativa (%DER) se muestran en la tabla VI.9.

Tabla VI.9. Repetibilidad y reproducibilidad del método.

Serie 1 Serie 2

x S %DER x S %DER S12/S22 F (0.05)

TMP1 2002 93 4.6 2036 64 3.2 2.08 3.717

TMP3 1697 89 5.2 1696 65 3.8 1.82 3.717

NAC 854 38 4.4 859 40 4.7 1.16 3.717

SMX 780 34 4.4 777 34 4.4 1.00 3.717

TMP 2688 127 4.7 2542 114 4.5 1.24 3.717

Capítulo VI 317

VI.5. APLICACIONES

El método propuesto se aplicó a la cuantificación de los componentes de la mezcla

en estudio en muestras preparadas en el laboratorio, con distintas relaciones entre sus

concentraciones, todas ellas, naturalmente, dentro del intervalo de linealidad encontrado.

Las recuperaciones se calcularon con respecto a patrones preparados también en el

laboratorio. La secuencia de separación fue similar a la realizada en capítulos anteriores, es

decir, intercalando la medida de la muestra (por triplicado) con la medida de dos patrones.

El parámetro seleccionado para la cuantificación fue el área de pico corregida,

medida a la longitud de onda de máxima absorción de cada uno de los compuestos, como se

hizo en los capítulos anteriores.

Se realizaron las separaciones y se registraron los electroferogramas para su

posterior análisis cuantitativo. En la tabla VI.10 se recogen los valores de recuperación para

todas las muestras preparadas en el laboratorio.

Como se puede ver, todos las recuperaciones estuvieron próximas al 100 %, dentro

de la precisión que se espera para la determinación de cada uno de los compuestos. El único

caso en el que no se consiguió una buena recuperación fue el de TMP3 en la mezcla

denominada M 3, donde se obtiene un valor algo elevado. Esto podría deberse a un

pequeño error cometido a la hora de la preparación de la muestra, ya que las demás están en

intervalos de error menores.

318 Capítulo VI

Tabla VI.10. Recuperaciones obtenidas en las muestras preparadas en el laboratorio

TMP1 TMP3 NAC SMX TMP

Concentración (mg/L) 0.83 0.83 0.42 0.83 0.60

M1

Recuperación (%) 104.5 104.5 99.8 101.9 101.2

Concentración (mg/L) 0.41 0.42 0.85 0.42 1.20

M2

Recuperación (%) 98.3 103.5 98.2 100.6 104.0

Concentración (mg/L) 0.41 0.42 0.42 0.83 1.20

M3

Recuperación (%) 103.3 108.6 99.5 104.9 102.7

Concentración (mg/L) 0.83 0.83 0.85 0.42 0.60

M4

Recuperación (%) 100.1 101.8 96.5 95.0 97.5

Concentración (mg/L) 0.21 0.21 1.06 1.04 0.30

M5

Recuperación (%) 95.4 101.5 100.2 97.3 94.9

Concentración (mg/L) 1.04 1.04 0.21 1.67 1.51

M6

Recuperación (%) 101.8 98.0 97.1 95.8 99.6

CONCLUSIONES
Conclusiones 321

La cromatografía líquida, utilizando columna C18 y fase móvil formada por tampón

fosfato 40 mM (pH 3.0), 10 mM de NaClO4:acetonitrilo es útil para la separación entre las

sulfamidas sulfaquinoxalina y sulfametacina y el compuesto asociado pirimetamina.

Igualmente, utilizando columna C18 y fase móvil formada por tampón citrato 10 mM (pH

3.0):metanol, en modo de gradiente, es útil para la separación entre las sulfamidas

sulfametoxipiridacina, sulfadimetoxina y sulfametoxazol y de los compuestos asociados

bromhexina y trimetoprim.

La electroforesis capilar, en su modalidad de cromatografía electrocinética micelar,

resuelve, en menos de 10 minutos, muestras que contienen las sulfamidas sulfaquinoxalina

y sulfametacina y los compuestos asociados pirimetamina y menadiona. Igualmente, en su

modalidad de electroforesis capilar en zona, resuelve, en menos de 6 minutos, muestras que

contienen las sulfamidas sulfadiacina y sulfametoxazol y los compuestos asociados

trimetoprim, bromhexina y guayacol.

Tanto la cromatografía líquida como la electroforesis capilar pueden recomendarse

para el control de calidad de los productos farmacéuticos y zoosanitarios que contengan

este tipo de combinaciones.

Los resultados encontrados en el análisis de productos zoosanitarios, muy

discordantes con los señalados en sus etiquetas, tanto por cromatografía líquida como por

electroforesis capilar, nos permiten comprobar el prácticamente inexistente control de

calidad que se ejerce en estos productos, ni por parte de los laboratorios implicados, no por

parte de la Administración.
322 Conclusiones

La cromatografía electrocinética micelar es apropiada para cuantificar ácido

sulfanílico y sulfanilamida, dos de los principales productos de degradación de

sulfametoxazol. Sin embargo no fue posible la cuantificación del ácido 3,4,5-

trimetoxibenzoico, principal producto de degradación de trimetorpim, aunque sí fue posible

su detección.

La comatografía electrocinética micelar es apropiada para la determinación de los

principales metabolitos de sulfametoxazol y trimetoprim, N4-acetil-sulfametoxazol,

trimetoprim-1-óxido y trimetoprim-3-óxido, en suero humano. Además, gracias a la técnica

de preconcentración utilizada, consistente en la extracción de los compuestos de nuestro

interés con acetonitrilo y su posterior evaporación, se consiguen unos límites de detección

del orden de 10-2 mg/L.

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ÍNDICE
Índice 337

OBJETO DE LA TESIS

INTRODUCCIÓN

ANTECEDENTES HISTÓRICOS DE LAS SULFAMIDAS ............................ 5

CLASIFICACIÓN DE LAS SULFAMIDAS ..................................................... 10
ANÁLISIS DE SULFAMIDAS .......................................................................... 13
Determinación de sulfamidas y metabolitos.................................................. 33
Determinación de sulfamidas, potenciadores y sus productos
de degradación............................................................................................... 43
INTRODUCCIÓN A LA ELECTROFORESIS CAPILAR................................ 57
Definición de electroforesis y principios generales de la técnica ................. 58
TEORÍA DE LA ELECTROFORESIS ............................................................... 61
Aspectos teóricos........................................................................................... 61
El fenómeno de electroforesis y el flujo electroosmótico ............................. 63
Los beneficios del flujo electroosmótico....................................................... 64
El tampón de separación................................................................................ 68
Parámetros determinantes de la separación................................................... 69
Factores que afectan al desarrollo de la separación ...................................... 72
ASPECTOS INSTRUMENTALES Y OPERACIONALES
DE LA ELECTROFORESIS CAPILAR ............................................................ 75
Inyección de la muestra ................................................................................. 75
Fuente de alto voltaje..................................................................................... 77
Capilar ........................................................................................................... 78
Sistemas de termostatización del capilar....................................................... 79
Sistemas de detección.................................................................................... 79
MODALIDADES DE ELECTROFORESIS CAPILAR..................................... 81
Electroforesis capilar en zona........................................................................ 81
Cromatografía electrocinética micelar .......................................................... 82
INTRODUCCIÓN A LA CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA
DE ALTA RESOLUCIÓN.................................................................................. 86
Principios básicos .......................................................................................... 88
Concepto de plato teórico.............................................................................. 88
338 Índice

Retención cromatográfica.............................................................................. 89
ASPECTOS INSTRUMENTALES Y OPRACIONALES DE LA
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN ............................ 90
Sistemas de bombeo ...................................................................................... 90
Sistema de inyección ..................................................................................... 91
Columna cromatográfica ............................................................................... 91
Detector ......................................................................................................... 91
Integrador o procesador................................................................................. 92
PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS.......................................................... 93
MODALIDADES DE CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA .................................... 95
Cromatografía de partición en fase reversa ................................................... 96
ANÁLISIS ESTADÍSTICO ELEMENTAL ....................................................... 101
Parámetros estadísticos descriptivos clásicos................................................ 101
Test estadístico t de Student .......................................................................... 102
Métodos de correlación ................................................................................. 103
Rectas de calibración (Regresión por mínimos cuadrados) .......................... 104
Comparación de las pendientes de dos rectas de calibrado........................... 107

PARTE EXPERIMENTAL

MATERIAL Y DISOLUCIONES
INSTRUMENTACIÓN UTILIZADA ...................................................................... 113
DISOLUCIONES UTILIZADAS ............................................................................. 115

I. DETERMINACIÓN DE SULFAQUINOXALINA,
SULFAMETACINA, PIRIMETAMINA Y MENADIONA EN
PRODUCTOS ZOOSANITARIOS POR CROMATOGRAFÍA
ELECTROCINÉTICA MICELAR

I.1. INTRODUCCIÓN........................................................................................ 119

I.1.1. Estabilidad de las disoluciones de sulfaquinoxalina,
sulfametacina, menadiona y pirimetamina............................................ 121
Índice 339

I.1.2. Influencia del contenido en etanol..................................................... 123

I.1.3. Influencia del pH sobre los espectros de absorción ......................... 124

I.2. ESTUDIO DE LOS PARÁMETROS EXPERIMENTALES...................... 125

I.2.1. Estudios preliminares ........................................................................ 125
I.2.2. Influencia del modificador orgánico ................................................. 127
I.2.3. Influencia de la concentración de SDS.............................................. 130
I.2.4. Influencia de la concentración de tampón ......................................... 133
I.2.5. Efecto de la temperatura .................................................................... 135
I.2.6. Estudio de la influencia del voltaje sobre la separación.................... 138
I.2.7. Efecto del disolvente de la muestra ................................................... 141

I.3. ASPECTOS CUANTITATIVOS................................................................. 144

I.3.1. Límites de detección y cuantificación ............................................... 144
I.3.2. Linealidad de la respuesta ................................................................. 147
I.3.3. Repetibilidad y reproducibilidad del método .................................... 149

I.4.. APLICACIONES ......................................................................................... 150

II. DETERMINACIÓN DE SULFAQUINOXALINA,

SULFAMETACINA, PIRIMETAMINA Y MENADIONA EN
PRODUCTOS ZOOSANITARIOS POR CROMATOGRAFÍA
LÍQUIDA

II.1. INTRODUCCIÓN........................................................................................ 159

II.2. ESTUDIO DE LOS PARÁMETROS EXPERIMENTALES...................... 160
II.2.1. Estudios preliminares ........................................................................ 160
II.2.2. Optimización del pH de la fase móvil ............................................... 163
II.2.3. Influencia de la concentración de perclorato..................................... 166
II.2.4. Influencia de la fuerza iónica en la fase móvil .................................. 170
II.2.5. Influencia de la concentración de acetonitrilo................................... 173
II.2.6. Influencia del caudal de fase móvil .................................................. 175
II.2.7. Método cromatográfico propuesto .................................................... 177
340 Índice

II.3. ASPECTOS CUANTITATIVOS................................................................. 179

II.3.1. Límites de detección y cuantificación ............................................... 179
II.3.2. Rectas de calibrado e intervalo de linealidad .................................... 180
II.3.3. Repetibilidad y reproducibilidad ....................................................... 183

II.4. APLICACIONES ......................................................................................... 185

III. DETERMINACIÓN DE SULFAMETOXAZOL,

SULFADIMETOXINA, SULFAMETOXIPIRIDACINA,
TRIMETOPRIM Y BROMHEXINA EN PRODUCTOS
ZOOSANITARIOS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA

III.1. INTRODUCCIÓN...................................................................................... 191

III.1.1. Estabilidad de las disoluciones de sulfaquinoxalina,
sulfametacina, menadiona y pirimetamina ........................................ 193
III.1.2. Influencia del pH sobre los espectros de absorción .......................... 195

III.2. ESTUDIO DE LOS PARÁMETROS EXPERIMENTALES .................... 196

III.2.1. Estudios preliminares ........................................................................ 196
III.2.2. Optimización del pH de la fase móvil ............................................... 197
III.2.3. Influencia de la concentración del tampón en la fase móvil ............. 200
III.2.4. Selección del disolvente orgánico ..................................................... 202
III.2.5. Optimización del gradiente................................................................ 202
III.2.6. Influencia del caudal de fase móvil ................................................... 205
III.2.7. Selección de la longitud de onda de medida ..................................... 206
III.2.8. Método cromatográfico propuesto .................................................... 208

III.3. ASPECTOS CUANTITATIVOS ............................................................... 210

III.3.1. Límites de detección y cuantificación ............................................... 210
III.3.2. Rectas de calibrado e intervalo de linealidad .................................... 210
III.3.3. Repetibilidad y reproducibilidad ....................................................... 212

III.4. APLICACIONES ....................................................................................... 213

Índice 341

IV. DETERMINACIÓN DE SULFAMETOXAZOL, SULFADIACINA,

TRIMETOPRIM, GUAYACOL Y BROMHEXINA EN PRODUCTOS
FARMACÉUTICOS POR ELECTROFORESIS CAPILAR EN ZONA

IV.1. INTRODUCCIÓN...................................................................................... 221

IV.1.1. Estabilidad de las disoluciones de sulfadiacina y guayacol .............. 223
IV.1.2. Influencia del pH sobre los espectros de absorción .......................... 224

IV.2. ESTUDIO DE LOS PARÁMETROS EXPERIMENTALES .................... 225

IV.2.1. Estudios preliminares ........................................................................ 225
IV.2.2. Optimización del pH del electrolito .................................................. 228
IV.2.3. Influencia de la concentración del tampón........................................ 231
IV.2.4. Selección del voltaje de separación................................................... 233
IV.2.5. Efecto de la temperatura .................................................................... 236

IV.3. ASPECTOS CUANTITATIVOS ............................................................... 240

IV.3.1. Límites de detección y cuantificación ............................................... 240
IV.3.2. Linealidad de la respuesta ................................................................. 241
IV.3.3. Repetibilidad y reproducibilidad ....................................................... 243

IV.4. APLICACIONES ....................................................................................... 244

V. DETERMINACIÓN DE LOS PRINCIPALES PRODUCTOS DE

DEGRADACIÓN DE SULFAMETOXAZOL Y TRIMETOPRIM POR
CROMATOGRAFÍA ELECTROCINÉTICA MICELAR

V.1. INTRODUCCIÓN........................................................................................ 251

V.2. ESTUDIO DE LOS PARÁMETROS EXPERIMENTALES...................... 253

V.2.1. Estudios preliminares ........................................................................ 253
V.2.2. Optimización del pH del electrolito .................................................. 257
V.2.3. Influencia de la concentración de SDS.............................................. 259
V.2.4. Influencia de la concentración de modificador orgánico .................. 262
V.2.5. Influencia de la concentración del tampón........................................ 264
342 Índice

V.2.6. Estudio de la influencia del voltaje sobre la separación.................... 266

V.2.7. Influencia de la temperatura en la separación ................................... 268
V.2.8. Efecto del disolvente de la muestra ................................................... 270

V.3. ASPECTOS CUANTITATIVOS................................................................. 273

V.3.1. Límites de detección y de cuantificación .......................................... 274
V.3.2. Linealidad de la respuesta ................................................................. 276
V.3.3. Repetibilidad y reproducibilidad ....................................................... 278

V.4. APLICACIONES ......................................................................................... 280

VI. DETERMINACIÓN DE LOS PRINCIPALES METABOLITOS DE

SULFAMETOXAZOL Y TRIMETOPRIM EN SUERO HUMANO
POR CROMATOGRAFÍA ELECTROCINÉTICA MICELAR

VI.1. INTRODUCCIÓN...................................................................................... 285

VI.2. PRETRATAMIENTO DE LA MUESTRA ............................................... 286

VI.2.1. Obtención del suero........................................................................... 286
VI.2.2. Desproteinización del suero .............................................................. 286

VI.3. ESTUDIO DE LOS PARÁMETROS EXPERIMENTALES .................... 289

VI.3.1. Estudios preliminares ........................................................................ 289
VI.3.2. Influencia del pH en la separación .................................................... 292
VI.3.3. Influencia de la concentración del tampón........................................ 294
VI.3.4. Influencia de la concentración de SDS.............................................. 297
VI.3.5. Estudio de la influencia del voltaje sobre la separación.................... 300
VI.3.6. Efecto de la temperatura .................................................................... 303
VI.3.7. Influencia del modificador orgánico ................................................. 305
VI.3.8. Influencia del disolvente de la muestra ............................................. 307

VI.4. ASPECTOS CUANTITATIVOS ............................................................... 309

VI.4.1. Limites de detección y cuantificación ............................................... 309
VI.4.2. Linealidad de la respuesta ................................................................. 311
Índice 343

VI.4.3. Repetibilidad y reproducibilidad del método .................................... 316

VI.5. APLICACIONES ....................................................................................... 317

CONCLUSIONES ................................................................................................... 319

BIBLIOGRAFÍA ..................................................................................................... 323

ÍNDICE..................................................................................................................... 335