INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
Unidad Profesional Interdisciplinaria de
Biotecnología
MÉTODOS ANALÍTICOS E INSTRUMENTALES
Práctica 10: Cromatografía liquida de alta
resolución
Grupo: 4FV1
Equipo 1:
OBJETIVOS
Analizar los conceptos de cromatografía de líquidos para explicar la
separación de diversos compuestos de interés en el ámbito científico e
industrial.
Familiarizarse con el manejo correcto del cromatógrafo de líquidos,
identificando físicamente las partes de que consta.
Identificar cualitativamente y cuantitativamente por el método de estándar
externo el compuesto acarbosa contenido en diferentes muestras, utilizando
la técnica de cromatografía de líquidos de alta resolución.
INTRODUCCIÓN
La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC por sus siglas en inglés:
High Performance Liquid Chromatography). es el tipo de cromatografía por elución
más versátil y más utilizada. La técnica es utilizada por científicos para separar y
determinar especies en una variedad de materiales orgánicos, inorgánicos y
biológicos. En la cromatografía líquida, la fase móvil es un disolvente líquido que
contiene a la muestra en la forma de una mezcla de solutos mientras que podemos
definir a la fase estacionaria, un sólido o líquido inmovilizado en el cual las especies
químicas del analito son particionadas durante el recorrido de la fase móvil. El
tiempo de retención, tR, es el tiempo que transcurre entre la inyección de una
muestra en una columna cromatográfica y la llegada del máximo del pico del analito
al detector. A continuación se definirán conceptos importantes en HPLC:
Factor de capacidad (k'): Se define como la razón de la cantidad de soluto en fase
estacionaria entre la cantidad en fase móvil al equilibrio. Es igual a la relación del
tiempo que el soluto permanece en fase estacionaria respecto al tiempo en fase
móvil:
… ec1
Factor de selectividad, es la constante de distribución para una especie química
retenida con menor fuerza y KA es la constante para especies químicas retenidas
con mayor fuerza.
Resolución, Rs Determina la capacidad de una columna cromatográfica para
separar dos analitos; definida como la diferencia entre los tiempos de retención de
dos picos dividido entre sus anchos promedio. En la figura 1 se muestran unos
ejemplos.
1
Figura 1. Ejemplos de resolución entre dos picos cromatográficos.
Número de platos teóricos (N): Cada plato teórico representa un equilibrio teórico
de distribución del soluto entre las fases. El número total de platos teóricos de una
columna representa el poder de separación de la columna. Una buena columna
tiene un número alto de platos teóricos. Se calcula con cualquiera de las
ecuaciones:
…ec2
donde tr y wb o w½ se deben expresar en las mismas unidades, por ser N
adimensional.
En la cromatografía de fase reversa (RPC, del inglés Reverse Phase
Chromatography) se utiliza un empaque hidrofóbico, usualmente un
grupo funcional octadecilo u octilo y una fase móvil polar. Puede considerarse que
la RPC es un proceso de partición en donde los solutos están distribuidos entre una
fase estacionaria no polar y una fase móvil polar. Los solutos no polares tienden a
adsorberse en la fase estacionaria y se mueven a través del sistema más
lentamente que los solutos polares.
En la cromatografía de fase normal, la fase
estacionaria presenta puntos activos de alta polaridad y
las interacciones que se producen con el soluto son
específicas del grupo activo. La fase estacionaria puede
ser un sólido adsorbente (sílice o alúmina), o bien, un
soporte al que se unen químicamente molecular
organicas que representan grupos funcionales de alta
polaridad (ciano, amino, etc).
En esta práctica se analizó el estudio de HPLC para Figura 2. Estructura de la acarbosa.
una muestra de ACARBOSA.
La acarbosa es un fármaco oral antihiperglucemiante que produce una mejoría del
control metabólico de la diabetes mellitus disminuyendo la respuesta glucémica
2
postprandial (Calle,2001). La estructura de este fármaco se muestra a continuación
en la figura 2.
RESULTADOS
A continuación, se muestra la tabla 1 donde se muestran las condiciones del sistema
cromatográfico a las cuales se trabajó:
Tabla 1. Sistema cromatográfico
Equipo Cromatógrafo de Líquidos de Alta Resolución
Columna 250 mm x 4.0 mm, 5 µm empaque de enlaces amino
(APS-2 Hypersil)
Detector UV a 210 nm
Flujo 2 mL/min
Volumen de inyección 20 µL
Temperatura de columna 35 °C
Tiempo de corrida 8 min
Curva tipo
En primer lugar, para este análisis se realizó una curva tipo. Las concentraciones
conocidas junto con los demás datos se muestran en la tabla 2 a continuación
Tabla 2. Datos para la construcción de la curva tipo.
Concentración Tiempo de Área Platos teóricos
(mg/L) residencia (Tr)
Blanco 0 0 0
20% - 0.01107 3.347 3205265 1069
40% - 0.02214 3.340 6244260 1082
60% - 0.03321 3.333 9571582 1070
80% - 0.04428 3.340 12567187 1079
100% - 0.05535 3.333 15616360 1075
120% - 0.06642 3.327 18638443 1081
En la figura 3 se muestra los datos graficados, obteniendo así la curva tipo para este
estudio. La ecuación 3 es la ecuación de obtenida por regresión lineal de los datos
y con la cual se proceder al cálculo de las concentraciones de las muestras
problema en el siguiente apartado.
3
20000000
18000000
16000000
14000000
12000000
Área
10000000
8000000
6000000
4000000
2000000
0
0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07
Concentración (mg/mL)
Ecuación obtenida:
Á𝒓𝒆𝒂 = 𝟑𝒙𝟏𝟎𝟖 [𝑪𝒐𝒏𝒄𝒆𝒏𝒕𝒓𝒂𝒄𝒊ó𝒏] + 𝟕𝟖𝟐𝟓𝟐 … 𝒆𝒄 𝟑
𝑹𝟐 = 𝟎. 𝟗𝟗𝟗𝟖
Análisis cuantitativo y cualitativo
En la tabla 4 se muestran los tiempos de muestreo, el tiempo de retención
comparando con la referencia, así como los platos teóricos y la concentración para
cada tiempo. Los cálculos se muestran en la memoria de cálculo.
Tiempo de Tiempo de Área Platos Concentración
muestreo retención (Tr) teóricos (mg/mL)
(min)
Referencia * 3.373 15,041,566 1099 0.0499
10 3.320 15,009,231 1076 0.0498
15 3.267 15,108,607 1091 0.0501
20 3.220 15,180,456 1088 0.0503
30 3.167 14,645,993 1091 0.0486
*Acarbosa
4
Se realizó la cromatografía HPLC de fase reversa en el laboratorio, como analito se
utilizó el acetonitrilo, como fase móvil fue una mezcla con 80% de metanol y 20%
de agua. La fase estacionaria fue una columna de sílice C-18 de 15 cm. Se
realizaron tres determinaciones cuyos cromatogramas se muestran a continuación
en la figura 3, 4 y 5:
Figura 3. Primer ensayo con acetonitrilo, cuya curva se muestra en la figura
Figura 4. Segundo ensayo con acetonitrilo
5
Figura 5. Tercer ensayo con acetonitrilo
ANÁLISIS DE RESULTADOS
APLICACIONES
El HPLC, es un método empleado para determinar tanto cualitativa como
cuantitativamente la presencia de uno o más fármacos en una muestra problema.
Un ejemplo de esto es la determinación simultánea de fosinopril sódico e
hidroclorotiazida en formulaciones de comprimidos.
El fosinopril sódico es un éster profármaco, el cual es hidrolizado por las esterasas
presentes en el plasma a su forma activa: fosinoprilato. Esta última molécula es un
inhibidor competitivo de la enzima convertidora de angiotensina (ECA), por lo cual
al inhibirse se interrumpe la generación de angiotensina II y por lo tanto la presión
sanguínea disminuye. Por otro lado, la hidroclorotiazida es un diurético
tiazídico empleado en el tratamiento de la hipertensión (Goodman, 2007).
Dicha determinación se lleva a cabo empleando fase inversa con un detector de luz
UV específico, exacto y preciso para la determinación de estos fármacos a nm. La
fase móvil empleada es una mezcla de 0,2% p/v de ácido fosfórico en agua y
acetonitrilo (30:70) añadida a una velocidad de flujo de 0,5 ml/min a 29° C(Mashru,
2006).
6
CONCLUSIONES
La cromatografía líquida de alta resolución es un método que permite
determinar la presencia de un fármaco de manera tanto cualitativa como
cuantitativa.
El análisis del tiempo de retención y área bajo la curva de la acarbosa
estudiada concuerdan con los datos de referencia.
La cromatografía empleada fue de intercambio iónico de fase reversa, pues
la fase estacionaria era no polar.
BIBLIOGRAFÍA
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Esquivel, E.E., etal. (2004). CROMATOGRAF ÍA DE FASE REVERSA. (Trabajo de
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Cuernavaca, Morelos.
Skoog. (2015). Química analítica. México: CENGAGE Learning. (9°). pp.912-930.
Goodman (2007). Farmacología. México: Reverte. (3°). Pp.523-524,621
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determinación simultánea de fosinopril sódico e hidroclorotiazida en formulaciones
de comprimidos. Ars Pharm; 47 (4): 375-383.
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http://www.polygen.com.pl/imagesdb_kolumny-hypersil-gold-130828-0.pdf
