QUÍMICA SECA
La química seca tiene entre sus ventajas la de no emplear reactivos
químicos líquidos. Esto facilita la eliminación de desechos y, por tanto, la
contaminación es mínima. Esta característica fue la que impulsó, hace
décadas, el uso de las tiras reactivas, tanto por el médico en el consultorio
como por el propio paciente en su casa, para determinar la glucosa en
sangre y orina, lo cual ha contribuido al buen control de la glicemia en los
pacientes diabéticos. Más tarde aparecieron los glucosímetros, que
sustituyeron la lectura visual por la reflectometría. En la actualidad se
encuentran en el mercado múltiples aplicaciones de la química seca que
van desde las pruebas de embarazo hasta la detección de marcadores
tumorales como el antígeno prostático específico (PSA).
Se sugiere al lector que vea el tema de reflectometría, en el acápite de
Análisis Instrumental. Se hace referencia a las nuevas tecnologías que se
usan en química clínica y que han repercutido de manera positiva en el
desarrollo de esta especialidad diagnóstica. Más adelante, en este capítulo
y en capítulos posteriores, se expone cómo estas tecnologías han
penetrado el resto de los campos diagnósticos del laboratorio como:
hematología, hemostasia, inmunología, endocrinología, nefrología,
oncología y farmacocinética. Los resultados son muy importantes: aumento
de la calidad y disminución de los costos. El acortamiento en los tiempos de
entrega de los resultados (turn-around-time) y la fusión de tales equipos
automáticos, ha tenido también repercusiones muy importantes en la
atención médica.
Algunas definiciones nuevas comienzan a aparecer en la literatura
especializada. Tal es el caso de la quimiohematología, como se denomina a
la fusión de los analizadores químicos con los hematológicos, y a los que ya
aparecen unidos en el mercado, los inmunológicos.
La versatilidad del equipamiento automático se debe en gran medida al
desarrollo de la informática y de otras tecnologías:
1. Aplicaciones de diferentes medidas para el aseguramiento de la
calidad.
2. Uso de métodos fotométricos, fluorimétricos, quimioluminiscentes,
electroquímicos y de la fotometría de reflectancia.
3. La posibilidad de incorporar la inteligencia artificial y, por esta vía,
brindar información sobre el funcionamiento del equipo: capaz de
seleccionar los resultados y de transferirlos a una red de
procesadores, para que estén a la disposición de los médicos de cada
una de las estaciones terminales cercanas o distantes.
4. Los microprocesadores que, entre sus múltiples funciones, le
permiten al equipo la adquisición de datos, su organización y
exposición al operador en la pantalla (monitor o display), así como
interactuar con él por medio del teclado. Estos equipos (es decir, los
microprocesadores) marcaron el cambio de la mecanización en
automatización y permitieron compactar los equipos al sustituir
válvulas, interruptores y cronómetros con el programa de
computación (software).
5. Aplicación de los métodos matemáticos y estadísticos (quimiometría)
a las determinaciones químicas.
6. Uso de los sensores que responden a los estímulos físicos con un
impulso y que pueden ser electroquímicos y ópticos.
7. Uso del código de barras para la identificación única de muestras y
pacientes.
8. Aplicación de la robótica, que consiste en el uso de robots durante el
transcurso de procesos, transportación, manipulación individual de
las muestras y mezclas de reacción. Aunque los robots son más lentos
que el ser humano, son capaces de trabajar durante 24 horas sin
detenerse. Un sencillo ejemplo lo constituye el brazo que sujeta a la
pipeta de muestras de un analizador químico (figura 1.15).
Figura 1.15 Movimiento del brazo que sostiene la pipeta de muestra de un
analizador químico.
Ya es una realidad que la robótica aumentará la eficiencia de los
laboratorios y liberará de tareas rutinarias a los profesionales que laboran
en él; entonces estos podrán dedicarse al desarrollo de métodos e
investigaciones, así como interactuar con el resto de los profesionales del
hospital
QUÍMICA SECA
La tecnología de química seca tiene sus inicios en los años 70’s. En 1976 ya
se tenían algunos avances pero fue hasta 1978 cuando realmente se hizo la
introducción de esta tecnología.
Actualmente se cuenta con un analizador automatizado que utiliza la
tecnología de química seca, el cual emplea un sistema de multicapas en un
soporte de plástico. Este contiene todos los reactivos necesarios para
analizar la muestra, utilizando 10µL de suero, plasma, líquido
cefalorraquídeo u orina, la cual es aplicada a una lámina o “slide” que
contiene reactivos que permiten la detección y cuantificación del analito en
estudio.
Existen diferentes tipos de “slide”, dependiendo del tipo de análisis por
realizar:
Colorimétricas la cual hace una determinación de punto final, ya que hace
la medición una vez terminada la reacción, ejemplo: glucosa, ácido úrico,
colesterol.
Enzimáticas, se llevan a cabo varias lecturas durante el curso de la reacción,
ejemplo: lactato deshidrogenasa, amilasa, lipasa. En ambas la
concentración del analito se cuantifica a través de una medición
espectrofotométrica.
Potenciométricas, mide el diferencial de potencial entre la muestra y el
fluido de referencia, por medio de un electrodo de ion selectivo. Permite
medir la concentración de electrolitos.
Un “slide” típico consta de cuatro capas y se clasifican de acuerdo a la
función que cumplan:
Capa difusora: es una capa porosa que permite distribuir uniformemente la
muestra además de funcionar como filtro, ya que no deja pasar moléculas
como proteínas, lípidos, hemoglobina, o bilirrubina. Sirve también como
pantalla para al reflexión de la luz.
Capa de reacción: contiene sustancias que pueden ser enzimas o cualquier
sustancia química, que se encuentra en condiciones muy controladas que
intervienen en la reacción.
Capa indicadora: contiene el colorante para formar un complejo colorido,
que será proporcional a la concentración del analito, la cual se cuantifica
por espectrofotometría de reflexión.
Capa de soporte: es la base de la laminilla donde están depositadas las
demás capas. Está fabricada con un material de plástico transparente que
permite que pase la luz para que la reacción pueda ser medida.
La tecnología de química seca tiene varias ventajas: Excelente precisión y
exactitud, el control de calidad, se corre una vez al día, la calibración es
estable por seis meses o cada cambio de lote, utiliza 10µL de muestra por
prueba y cada muestra usa una punta diferente disminuyendo el peligro de
contaminación. El equipo es sencillo de utilizar, la manipulación de la
muestra se reduce a colocar el líquido por analizar en el equipo, y
programar los análisis deseados.
ESÁNDAR
Una Disolución Estándar es aquella que contiene una concentración
conocida de un elemento a la que llamamos Patrón Primario que debido a
su estabilidad se utiliza para valorar concentraciones de otras disoluciones.
En química analítica, un estándar es una preparación que contiene
una concentración conocida de un elemento específico o sustancia. Un
estándar simple será la dilución del elemento o substancia en
un disolvente neutro. No obstante, la mayoría de las muestras naturales
contienen un variado rango de distintas substancias, y si se mide la
concentración elemental, pueden tener una composición diferente de la
que se utilice como estándar. Esto puede ocasionar inexactitudes, y algunas
muestras son diseñadas específicamente para que sean lo más parecidas
posible a la realidad.
Se dispone también de materiales de referencia certificados que contienen
concentraciones, verificadas de forma independientes, de elementos
disponibles en distintas matrices o materiales de muestra
CURVA DE CALIBRACIÓN
La curva de calibración es un método muy utilizado en química analítica
para determinar la concentración de una sustancia (analito) en una muestra
desconocida, sobre todo en disoluciones. El método se basa en la relación
proporcional entre la concentración y una determinada señal
analítica (propiedad). Conociendo esta relación, será posible conocer la
concentración en una muestra dada mediante la medida de esa señal. La
relación concentración – señal se suele representar en una gráfica a la que
se le conoce como curva de calibración o curva de calibrado.
Es imprescindible que la señal analítica utilizada mantenga una relación
proporcional con la concentración. Las señales más utilizadas son aquellas
cuya relación con la concentración es lineal, al menos en el rango de
trabajo. Por ejemplo, una de las propiedades más utilizadas es la
absorbancia (absorción lumínica) que suele mantener una relación lineal
con la concentración de solutos en disoluciones. Al ser una relación lineal,
se puede representar mediante una recta, de ahí que este tipo específico
de curva de calibración se conozca también como recta de calibración.
Preparación de patrones
Para elaborar una curva de calibrado se parte de varias disoluciones con
una concentración conocida de analito (la sustancia a medir). Estas
disoluciones se conocen como disoluciones patrón. Se han de elaborar una
batería de patrones suficiente para cubrir un rango que incluya la
concentración esperada en las muestras desconocidas.
Las concentraciones utilizadas en los patrones también han de estar dentro
del rango válido para la técnica analítica que se va a utilizar. Es decir, han
de estar por encima del mínimo de concentración de analito cuantificable
por la técnica utilizada. Este mínimo es conocido como límite mínimo
cuantificable. También ha de estar por debajo del límite de linealidad. La
relación lineal entre concentración y señal no se suele mantener a altas
concentraciones y el límite de linealidad marca la concentración máxima
para la cuál la curva de calibración sería fiable.
Límites de una recta de calibración
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Construcción de la curva: relación concentración de analito y señal
analítica
La curva de calibrado se construye midiendo la señal analítica en cada uno
de los patrones previamente elaborados. En el eje de ordenadas se asigna
el valor de la señal medida y en el eje de abscisas la concentración del
patrón. De esta forma podemos señalar puntos en la gráfica según las
coordenadas (concentración (x), señal (y)).
A estos puntos podemos aplicar la regresión lineal, generalmente mediante
el ajuste por mínimos cuadrados, para obtener la recta que los relaciona y
su función.
Precisión se refiere a la dispersión del conjunto de valores obtenidos de
mediciones repetidas de una magnitud. Cuanto menor es la dispersión
mayor la precisión. Una medida común de la variabilidad es la desviación
estándar de las mediciones y la precisión se puede estimar como una
función de ella. Es importante resaltar que la automatización de diferentes
pruebas o técnicas puede producir un aumento de la precisión. Esto se debe
a que con dicha automatización, lo que logramos es una disminución de los
errores manuales o su corrección inmediata. No hay que
confundir resolución con precisión.
Exactitud se refiere a cuán cerca del valor real se encuentra el valor medido.
En términos estadísticos, la exactitud está relacionada con el sesgo de una
estimación. Cuanto menor es el sesgo más exacta es una estimación.
Cuando se expresa la exactitud de un resultado, se expresa mediante el
error absoluto que es la diferencia entre el valor experimental y el valor
verdadero
Se entiende por Linealidad la capacidad de un método analítico de obtener
resultados proporcionales a la concentración de analito en la muestra
dentro de un intervalo determinado.
Introducción
Dicho de otro modo, la linealidad es la proporcionalidad entre la
concentración del analito y la respuesta del método en un intervalo o rango
de concentraciónes.
El ensayo de linealidad puede efectuarse tanto sobre soluciones
de concentraciones crecientes del analito que se determina o sobre
muestras problemas a las que se han adicionado cantidades crecientes de
un patrón del analito. En ambos casos el procedimiento se conoce como
“curva de calibración” o “curva de calibrado”.
Errores determinados o sistemáticos
Son los errores del mismo signo debidos a causas definidas que influyen en
el resultado, aumentando o disminuyéndolo. Estos errores generalmente
se puede prever y eliminar o efectuar correcciones correspondientes.
Señalemos los siguientes tipos de errores determinados..
Pasos generales para la realización de una curva de calibración
1. Se prepara una serie de soluciones de un patrón del analito a
concentraciones crecientes y se procede a su determinación en cada
solución aplicando el método que se evalúa y obteniéndose para
cada solución una respuesta o señal (mL
consumidos, absorbancia, índice de refracción, etc.). el número de
soluciones puede estar comprendido entre 6 y 10 y las
concentraciones se seleccionan de acuerdo con las cantidades
esperadas del analito en la muestra. Así por ejemplo, en el análisis
de la linealidad de un método de determinación de proteínas
solubles en un extracto proteico deharina de soya se preparan
soluciones de una proteína patrón (albúmina de suero bovino) a
concentraciones de 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 y 1 mg/mL y se procede al
análisis midiendo la respuesta del método analítico (pudiera ser una
señal instrumental como por ejemplo absorbancia), para cada una
de las soluciones preparadas.
2. Se determina la proporcionalidad existente entre la concentración y
la respuesta del método analítico, calculando por el método de
ajuste mínimos cuadrados la ecuación de regresión lineal del tipo.
Sensibilidad del calibrado
La sensibilidad de calibrado se define como el coeficiente diferencial entre
la señal medida (respuesta del método) y la concentración del analito,
