UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO

FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERÍA EN ALIMENTOS

INGENIERÍA BIOQUÍMICA
INFORME DE PRÁCTICA DE LABORATORIO
Datos informativos:
Integrantes: Moreta Luis, Pérez Paola, Ayudante de laboratorio: Anabel Mera
Urbina Walter Profesor: Ing. Cecilia Carpio
Carrera: Ingeniería Bioquímica Práctica de Laboratorio N°: 2
Ciclo Académico: Marzo - Agosto 2018 Fecha de Realización: 16/04/ 2018
Asignatura: Ingeniería de las Enzimas Fecha de Presentación: 07/05/2018
Nivel: Octavo “U”

1. TEMA: “PURIFICACIÓN DE INVERTASA DE LEVADURA POR DIFERENTES MÉTODOS

2. OBJETIVO
Objetivo general

 Comparar tres métodos de precipitación para la purificación de la invertasa obtenida de

Saccharomyces cerevisiae.

Objetivos específicos
 Determinar el factor de purificación mediante la actividad específica del extracto
original y la proteína purificada.

 Cuantificar el contenido de proteínas de los extractos enzimáticos y de la fracción

purificada.

3. RESULTADOS OBTENIDOS
RESULTADOS OBTENIDOS
Tabla 1
Datos para la purificación de la enzima invertasa por el método de diálisis

Purificación por diálisis

Volumen inicial de sustrato 5 ml
Peso (NH4)2SO4 30% (g) 0,8800
Peso (NH4)2SO4 80% (g) 1,6007
Vol. de tampón para recuperar los 1
precipitados (ml)
V inicial en el proceso de diálisis (ml) 4,5
V final en el proceso de diálisis (ml) 4,2
FD para Pruebas de actividad 1/16
FD para cuantificación de proteínas -------

Tabla 2
Resultados de las absorbancias del precipitado de la enzima purificada por el método de
filtración en columna de desalado y del sobrenadante mediante diálisis
Muestra Tiempo (min) Absorbancia (540 nm) por el Absorbancia (540 nm)
método de filtración en por el método de diálisis
columna de desalado
Blanco 0 0 0
T1 1 0,058 0,02
T2 2 0,101 0,01
T3 3 0,155 0,01
T4 4 0,206 0,06
T5 5 0,240 0,04
Para la determinación de la actividad se utilizó el precipitado formado en la primera saturación con al 30
% con (NH4)2SO4 para determinar la existencia o no de actividad de la enzima mediante la purificación en
la columna de desalado. Para el método de diálisis después de saturar con 80% de (NH4)2SO4 se utilizó el
sobrenadante para las pruebas de actividad.

Tiempo vs Absorbancia
0.07
Absorbancia (540 nm)

0.06
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0
0 1 2 3 4 5 6
Tiempo (min)

Figura 1. Absorbancia vs tiempo de reacción de la enzima por el método de diálisis

Los resultados obtenidos de la absorbancia por el método de diálisis se presentan en la figura 1,

representada por la absorbancia en cada minuto de reacción de la enzima purificada.

Tabla 3
Datos para la curva estándar de glucosa

N° Vol Std Peso Glc Vol Std Peso Tot Glc Absorb
mL g mL g mg/mL ó g 540 nm
1 0,1000 0,0993 0,9000 0,9879 0,2011 0,0990
3 0,3000 0,2904 0,7000 0,9814 0,5919 0,3160
5 0,5000 0,4926 0,5000 0,9870 0,9984 0,5600
7 0,7000 0,6863 0,3000 0,9871 1,3908 0,7730
9 0,9000 0,8935 0,1000 0,9963 1,7940 1,0000
 Curva estándar de glucosa
1.2000

1.0000
Absorbancia (540 nm)

0.8000

0.6000

0.4000
y = 0.5669x - 0.0146
R² = 0.9998
0.2000

0.0000
0.0000 0.2000 0.4000 0.6000 0.8000 1.0000 1.2000 1.4000 1.6000 1.8000 2.0000
[Glc] (mg/ml)

Figura 2. Curva estándar de glucosa

Determinación de la concentración de glucosa en las muestras

Mediante la utilización de la ecuación de la recta de la curva estándar de glucosa, se procedió a
calcular la concentración de glucosa en cada una de las muestras de enzima purificada por el
método de diálisis.
𝒚 = 𝒂𝒙 + 𝒃 𝒚 = 𝟎, 𝟓𝟔𝟔𝟗𝒙 − 𝟎, 𝟎𝟏𝟒𝟔
[𝐴𝑏𝑠] = 𝑎[𝐺𝑙𝑐] + 𝑏 0,02 + 0,0146
[𝐺𝑙𝑐] =
0,5669
[𝐴𝑏𝑠] − 𝑏
[𝐺𝑙𝑐] = [𝐺𝑙𝑐] = 0,0610 𝑚𝑔/𝑚𝑙
𝑎
Tabla 4
Resultados de la concentración de glucosa por el método de filtración en columna
Muestra Tiempo (min) Absorbancia 540 nm [Glc] mg/ml
Blanco 0 0 0
T1 1 0,058 0,1281
T2 2 0,101 0,2039
T3 3 0,155 0,2992
T4 4 0,206 0,3891
T5 5 0,240 0,4491
Tabla 5
Resultados de la concentración de glucosa por el método de diálisis
Muestra Tiempo (min) Absorbancia 540 nm [Glc] mg/ml
Blanco 0 0,00 0
T1 1 0,02 0,0610
T2 2 0,01 0,0434
T3 3 0,01 0,0434
T4 4 0,06 0,1316
T5 5 0,04 0,0963
 [Glc] vs Tiempo
0.5
0.45
0.4
0.35
[Glc] (mg/ml)

0.3
0.25 y = 0.0893x + 0.0218
0.2 R² = 0.9905
0.15
0.1
0.05
0
0 1 2 3 4 5 6
Tiempo (min)

Figura 3. Concentración de glucosa en el tiempo por el método de filtración en columna

[Glc] vs Tiempo
0.14

0.12

0.1
[Glc] (mg/ml)

0.08

0.06 y = 0.0198x + 0.0131

R² = 0.6505
0.04

0.02

0
0 1 2 3 4 5 6
Tiempo (min)

Figura 4. Concentración de glucosa en el tiempo por el método de diálisis

En la figura 3 y 4 se muestra la ecuación de la recta formada por la concentración de glucosa
determinada por la absorbancia en el tiempo de reacción de la enzima purificada.

 Calculo de la actividad de la invertasa

𝑚𝑔 1 𝑚𝑚𝑜𝑙 𝐶6 𝐻12 𝑂6 103 𝑢𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝐶6 𝐻12 𝑂6

𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 = 𝑝𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 ∗ 𝑚𝐿∗𝑚𝑖𝑛 ∗ ∗ ∗
𝑃𝑀 𝐶6 𝐻12 𝑂6 1 𝑚𝑚𝑜𝑙 𝐶6 𝐻12 𝑂6
𝑉𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 (𝑚𝑙) 1 𝑢𝑚𝑜𝑙 𝐶12 𝐻22 𝑂11
∗ ∗ 𝐹𝐷 (1)
𝑉𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎 (𝑚𝑙) 2 𝑢𝑚𝑜𝑙 𝐶6 𝐻12 𝑂6

𝑚𝑔 1 𝑚𝑚𝑜𝑙 𝐶6 𝐻12 𝑂6 103 𝑢𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝐶6 𝐻12 𝑂6 03 𝑚𝐿 1 𝑢𝑚𝑜𝑙 𝐶12 𝐻22 𝑂11

𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 = 0,0198 ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ 16
𝑚𝐿 ∗ 𝑚𝑖𝑛 180 𝑚𝑔 1 𝑚𝑚𝑜𝑙 𝐶6 𝐻12 𝑂6 0,15 𝑚𝐿 2 𝑢𝑚𝑜𝑙 𝐶6 𝐻12 𝑂6
𝑈𝐼
𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 = 1,76
𝑚𝑙 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎
  Calculo del rendimiento de la actividad total de la enzima

𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜

𝑨𝒄𝒕𝒊𝒗𝒊𝒅𝒂𝒅 𝒕𝒐𝒕𝒂𝒍 = 𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎 ∗
𝑔 𝑙𝑒𝑣𝑎𝑑𝑢𝑟𝑎
𝑈𝐼 23,5 𝑚𝑙
𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 = 1,760 ∗
𝑚𝑙 14,0004 𝑔
𝑈𝐼
𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 = 2,9542
𝑔 𝑑𝑒 𝑙𝑒𝑣𝑎𝑑𝑢𝑟𝑎

Tabla 6
Resultados de la actividad y actividad total de la enzima purificada.
Método de purificación Actividad (UI/ml enzima) Actividad total (UI/g de
levadura)
Por filtración en columna de 7,9378 13,3237
desalado
Por diálisis 1,7600 2,9542

Tabla 7
Resultados de la cuantificación de proteína por el método de filtración en columna de desalado
Muestra Absorbancia 540 nm Promedio
Blanco 0,00 -----
R1 0,1281
R2 0,1253 0,1283
R3 0,1324

Tabla 8
Resultados de la cuantificación de proteína por el método de diálisis
Muestra Absorbancia 540 nm Promedio
Blanco 0,00 -----
R1 0,1008
R2 0,1010 0,1013
R3 0,1020

 Calculo de la curva estándar de BSA

Tabla 9
Datos de la curva estándar de Pepsina
Std PEPSINA P. total Conc-Std Pepsina Absorbancia

g g mg/g (mL) 540 nm

0,0000 0,0000 0,00 0,000
0,0518 0,2657 3,80 0,139
0,0996 0,2532 7,67 0,265
0,1430 0,2441 11,42 0,373
0,1907 0,2422 15,35 0,479
 Curva estándar de BSA
0.600

Absorbancia 540 nm 0.500

0.400

0.300
y = 0.0311x + 0.0133
0.200 R² = 0.996

0.100

0.000
0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00
Conc-Std Pepsina mg/ml

Figura 5. Curva estándar de pepsina

 Calculo de la concentración de proteínas

La curva estándar de pepsina (BSA) permite obtener la ecuación del a recta para cuantificar la
contracción de proteínas en la muestra de la siguiente manera:
𝒚 = 𝟎, 𝟎𝟑𝟏𝟏 𝒙 + 𝟎, 𝟎𝟏𝟑𝟑
𝑎𝑏𝑠 = 0,0311[𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎] + 0,0133
𝑎𝑏𝑠 − 0,0133
[𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 ] =
0,0311
0,1013 − 0,0133
[𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 ] =
0,0311
[𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 ] = 2,8295 𝒎𝒈/𝒎𝒍

 Caculo de la actividad específica de la enzima

unidades de actividad de la enzima en solución

Actividad específica =
contenido total de proteína en la fracción
𝑈𝐼
2,9542
𝑚𝑙 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎
Actividad específica =
2,8295 mg/ml
UI
Actividad específica = 𝟏, 𝟎𝟒𝟒𝟏
mg de proteína

 Calculo del factor de purificación de la enzima por el método de diálisis

𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑐í𝑓𝑖𝑐𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎 𝑝𝑢𝑟𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑑𝑎 𝐸1
𝐹𝑝𝑢𝑟𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛 =
𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑐í𝑓𝑖𝑐𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎 𝑠𝑖𝑛 𝑝𝑢𝑟𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑟 𝐸0
1,0441UI/mg
𝐹𝑝𝑢𝑟𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛 =
1,1125 UI/mg
𝐹𝑝𝑢𝑟𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛 = 0,9385
Tabla 10
Resultados de la cuantificación de proteínas y factor de purificación por los dos métodos
Método de [Proteínas] (mg/ml) Actividad específica F purificación
purificación (UI/mg proteína)
Por filtración en 3,6977 3,6032 3,2389
columna de desalado
Por diálisis 2,8295 1,0441 0,9385

Tabla 11
Resultados de actividad, actividad específica rendimiento y factor de purificación de la enzima
invertasa por diferentes métodos de purificación.
# Método de Actividad Actividad Rendimiento F
Grupo purificación (UI/ml específica (%) purificación
enzima) (UI/mg
proteína)
Muestra del
1 precipitado con 13,0670 1,2760 92,70 1,3100
alcohol
Muestra del
precipitado con
2 (NH4)2SO4 y purificado 12,8000 3,2980 26,10 75,1840
en columna de
desalado
Muestra del
precipitado con
(NH4)2SO4 al 30% y 7,9378 3,6032 52,75 3,2389
purificado en la
columna de desalado
3 Muestra del
sobrenadante 1,7600 1,0441 11,69 0,9385
purificado por diálisis.

4. DISCUSIÓN

De acuerdo a la práctica preliminar, los extractos no purificados, presentaron óptima actividad

tanto para extracto bruto, con una actividad específica de 1,1125 UI/mg así el primer
requerimiento para aislar una enzima es encontrar un ensayo cuantitativo de
actividad mediante el cual pueda valorar convenientemente la actividad. Para decidir si un paso
de la purificación tiene sentido, es necesario medir la cantidad de enzima y la cantidad de
impurezas antes y después de ese paso, por último comparar los resultados de varios
procedimientos posibles (Toledo, 2015). Sólo en términos cuantitativos se puede saber si se ha
producido algún progreso, para lo cual se utilizaron fórmulas matemáticas que determinan
resultados. Puesto que una gran parte del tiempo empleado en el aislamiento de una enzima
está dedicado a determinar la actividad de las distintas fracciones, es deseable que ésta sea una
operación rápida.

Previamente a implementar los procesos de purificación por columna y diálisis se debe

precipitación con sulfato de amonio la cual pertenece a una precipitación selectiva, este es un
procedimiento que induce un cambio en la solución para que la proteína de interés o los
contaminantes alcancen su punto isoeléctrico (el valor de pH en el que la sustancia tiene
una carga de cero) y precipiten (Cuervo, 2005). La diálisis en general es mayor en agua
destilada, sin embargo en muchos casos para estabilizar moléculas objeto de investigación es
necesario utilizar soluciones de fuerza iónica y pH definidos, durante la diálisis penetra agua en
el saco por ósmosis, por lo tanto el tubo debe llenarse completamente con el fin de evitar la
dilución del contenido, como método de purificación principal empleada por este grupo separa
moléculas en una solución por sus diferentes índices de difusión a través de una membrana
semipermeable, en este caso se usó papel celofán con un previo tratamiento, haciendo de este
método mucho más preciso al momento de separar los contaminantes de la invertasa. Según
Mendiondo, (1996), el factor de purificación que expresa cuántas veces ha sido purificada una
proteína en relación con el control inicial para la práctica el valor máximo de purificación fue de
0,9385

Al trabajar por diferentes métodos se ven influenciados por la sensibilidad en su mayoría aunque
un papel muy importante son sus características físicas y el método empleado (Nuñez, 2001).
Los resultados bajos de purificación se deben en gran medida a la perdida de actividad biológica
la cual contrario a este caso aumentar a medida que los pasos de purificación se aumentan, esta
actividad debe ser directamente proporcional a la cantidad de proteínas obtenidas después de
la purificación. Para lograr una buena purificación proteica se debe optimizar el proceso de
rompimiento celular. La concentración de sales en el proceso de diálisis también afecta el
potencial iónico y en consecuencia pueden interferir en ciertos enlaces de las enzimas, los cuales
pueden formar parte del sitio activo de la misma, en estos casos, al igual que con el pH, por
ultimo a medida que aumenta la temperatura, inicialmente la velocidad de reacción aumentará
debido al aumento de la energía cinética, sin embargo, el efecto de la ruptura de la unión será
cada vez mayor, y la velocidad de reacción comenzará a disminuir (Cuervo, 2005).

5. CONCLUSIONES

 En el presente trabajo, se empleó dos métodos de precipitación, los mismo que permitieron
la purificación de la enzima invertasa obtenida de Saccharomyces cerevisiae. Se trabajó con
cuatro grupos de invertasa, dos trabajaron con etanol, uno con diálisis y uno con una columna
de filtración de desalado para eliminar el sulfato de amonio en las muestras, en este se pudo
observar que el método de diálisis es menos efectivo que una columna de filtración en gel
ya que según Rodríguez, (2011), la diálisis separa moléculas en una solución por sus
diferentes índices de difusión a través de una membrana semipermeable, en este caso se usó
papel celofán con un previo tratamiento, haciendo de este método mucho más preciso al
momento de separar los contaminantes de la invertasa, sin embargo la precipitación con
sulfato de amonio podría haber afectado en la actividad de la enzima al momento de realizar
la purificación.

 Se determinó la actividad específica para el extracto original y para la proteína purificada

para la determinación del factor de purificación una vez purificada la enzima utilizando el
𝑈𝐼
reactivo DNS y mediciones de absorbancia a 570 nm obteniéndose 1,76 𝑚𝑙 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎. El factor
de purificación obtenido fue inferior a uno, es decir no existió purificación ya que la actividad
 de la enzima sin purificar fue mayor, lo que indico que el método de purificación por diálisis
no se realizó adecuadamente.

 Se cuantificó el contenido de proteínas de los extractos enzimáticos y de la fracción purificada

mediante el método de Biuret tomando en consideración la curva estándar de BSA. Con los
cuales se obtuvieron 2,8295 𝒎𝒈/𝒎𝒍. La cual se evidencio una disminución ya que se
eliminaron algunas proteínas en la purificación.

6. RECOMENDACIONES

 Las enzimas como la invertasa por lo general son muy sensibles al cambio del pH,
temperaturas altas, presencia de enzimas degradativas, debido a que se puede
desnaturalizar la enzima, por eso en los laboratorios todos los instrumentos y materiales
deben estar muy bien calibrados para tener una lectura exacta que permita obtener datos
sin mayor error.

 Trabajar de manera inmediata con la invertasa después de sacarla del congelador ya que
puede perder su actividad

 Rotular correctamente los tubos de cada grupo para evitar confusión.

7. BIBLIOGRAFÍA

Cuervo, R. (2005). Extracción y purificacion de la enzima de Monoxido de Carbono

Deshidrogenasa. Bogota: UBS.
Mendiondo, B. (1996). Purificación y caracterización proteica de una cepa cubana del virus de
la hepatitis A. Obtenido de:
http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0375-07601996000200009
Rodríguez E. (2011). Métodos de separación de mezclas. Obtenido de: http://eli-
estrelladelmar.blogspot.com/2011/10/metodos-de-separacion-de-mezclas.html.
Nuñez, D. (2001). Caracterización y purificación de la enzima Pardea de Champinion. Roma:
Murcia.
Toledo, J. (21 de 2 de 2015). Quimica y Biologia. Obtenido de Aialamiento y purificación de
enzimas: http://www.calvo.qb.fcen.uba.ar/Trabajo%20con%20enzimas.htm.