AISLAMIENTO BACILLUS LICHENIFORMIS

ELDER CAMPILLO LÓPEZ

RUGERO IGNACIO CÁRDENAS SÁEZ
GEORGETTE CELIS QUIÑONEZ
TATIANA MARGARITA DÍAZ CHALARCA
MARÍA ANGÉLICA SUAREZ OROZCO

ING. YENIS PASTRANA PUCHE

MICROBIOLOGÍA GENERAL
GRUPO # 1
[Link]
VIERNES DE 7 A 10 AM

UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA
INGENIERÍA DE ALIMENTO
SEDE- BERASTEGUI
16/04/2018
 MARCO TEÓRICO

Bacillus licheniformis es una Gram-positivo, móvil, formadora de esporas, la vara de

anaerobios facultativos este puede ser aislado de casi todas partes debido a sus endosporas
altamente resistentes que se difunden con el polvo. El Bacillus licheniformis es utilizado
por la industria para producir proteasas y amilasas, Las proteasas son necesarios en
grandes cantidades, por ejemplo como adiciones a los agentes de lavado Las bacterias del
género Bacillus son aislados del suelo, que participa conjuntamente con otras bacterias en
las primeras etapas de descomposición de la biomasa vegetal y que mediante el uso de
carbohidrolasas extracelulares degrada varios polisacáridos presentes en estos materiales,
produciendo oligo, di o mono sacáridos que son transportados, fosforilados y
subsecuentemente catabolizados vía glicólisis o pentosas fosfatos.
Bacillus licheniformis es reconocido industrialmente atractivo por sus altas tasas de
crecimiento, y su desarrollo bajo condiciones ambientales extremas; además, por su
capacidad para secretar grandes cantidades de enzimas extracelulares directamente al medio
de cultivo en condiciones aeróbicas, Bacillus licheniformis es reconocido industrialmente
atractivo por sus altas tasas de crecimiento, y su desarrollo bajo condiciones ambientales
extremas; además, por su capacidad para secretar grandes cantidades de enzimas
extracelulares directamente al medio de cultivo en condiciones aeróbicas. Se sabe que
naturalmente metaboliza una amplia variedad de azúcares incluyendo xilosa, arabinosa,
almidón, celulosa, sacarosa, celobiosa y glucosa; sin embargo, a pesar del extenso
conocimiento genético y bioquímico del género
Las plantas producen una gran cantidad de polisacáridos, los cuales sirven como sustratos a
bacterias del suelo. La yuca es una de las principales plantas tropicales difundidas en todos
los continentes, originaria de la zona tropical de América, florece en suelos pobres en
nutrientes, con periodos vegetativos que van desde 8 hasta 12 meses. Las variedades de
yuca son: yuca dulce o comestible y yuca amarga o brava, esta clasificación se basa en la
cantidad de glucósidos tóxicos producidos, los cuales se forman por la acción de las
enzimas linamarasa, al romper los tejidos sobre dos glucósidos cianogenicos llamados
linamarina y lotaustralina.
En este aislamiento se utilizará la yuca como materia prima y el agar sangre para el
crecimiento e identificación de colonias, el agar sangre es un Medio de cultivo altamente
nutritivo, adecuado para el cultivo de una gran variedad de microorganismos incluyendo
aquellos de mayores exigencias para su desarrollo. Su formulación permite la recuperación
de la mayoría de los patógenos de importancia clínica, obteniéndose características de
desarrollo con valor predictivo. La adición de sangre de cordero desfibrada permite
observar los distintos patrones de hemólisis y a la vez aporta nutrientes específicos para los
microorganismos más fastidiosos.
 METODOLOGÍA
El aislamiento es es la separación de un determinado microorganismo del resto que le
acompañan este caso se utilizara el bacillus licheniforme el cual se aísla de la yuca,
específicamente de su cascara, Es una bacteria de tipo Gram positiva, tiene un alto parecido
genómico con Bacillus subtilis. Habita normalmente en agua y en suelo, lugar donde
produce esporas como mecanismo de conservación y proliferación. Es un bacilo de tipo
anaerobio facultativo, lo cual favorece su crecimiento en presencia o ausencia de oxígeno.
Representa una bacteria de importancia industrial debido al uso comercial y agrícola de
algunos de sus productos extracelulares utilizados para la producción de enzimas,
antibióticos y productos químicos.
Bacillus licheniformis se asocia comúnmente con el deterioro de los alimentos y el
envenenamiento. Provoca el deterioro del pan, o más específicamente, una condición
llamada "pan ropy”. La contaminación con esta bacteria hará que el pan sea pegajoso y
fibroso; el pan ropy también comenzará a desarrollar un fuerte olor después de la
contaminación. Esporas de cuerda es lo que causa el deterioro; desafortunadamente estas
esporas no mueren durante el proceso de cocción.
Aislamiento de la bacteria B. licheniformis a partir de la cáscara de la yuca
1. Tomar la cáscara y hacer un macerado.
2. Diluir el macerado en caldo peptona.
3. Incubar por 24 horas.

Tinción de Gram
La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en
bacteriología para la visualización de bacterias.
Al decirse que las bacterias B. licheniformis son gram +, este tinción se vuelve esencial
para el estudio y reconocimiento de dichas bacterias.
Procedimiento
1. Recoger muestras para ubicarlas en el microscopio.
2. Hacer el extendido con un asa redonda sobre el portaobjetos
3. Dejar secar a temperatura ambiente o fijarlas utilizando un mechero.
4. Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar un minuto.
5. Enjuagar con agua no directamente sobre la muestra
6. Agregar lugol y esperar un minuto aproximadamente.
7. Agregar alcohol acetona y esperar entre 5 y 30 segundos según la concentración del
reactivo (parte crítica de la coloración). (Las gram - se decoloran, las gram + no)
8. Enjuagar con agua.
9. Tinción de contraste agregando safranina o fucsina básica y esperar un minuto. Este
tinte dejará de color rosado-rojizo las bacterias gram negativas.
10. Lavar levemente con agua.
Interpretación de resultados
Bacterias Gram +: coloración morada (Crecimiento de B. Licheniformis)
Bacterias Gran - : coloración roja.

Tinción de Schaeffer-Fulton.
Esta tinción es utilizada para la identificación de esporas y células vegetativas de una
muestra. La B. licheniformis es una bacteria capaz de producir esporas para su
conservación ante condiciones externas que la afecten, por ello, este tipo de tinción es
conveniente para la observación de la B. licheniformis como espora.

Procedimiento
1. Realizar un frotis a partir del cultivo que contiene la B. licheniformis.
2. Dejar secar al aire y fijar con calor.
3. Cubrir el portaobjetos con verde de Malaquita y calentar con el mechero durante 30
segundos.
4. Dejar enfriar.
5. Lavar con agua destilada.
6. Adicionar Safranina al 0,5% por 1 minuto.
7. Lavar con agua destilada.
8. Dejar secar.
Interpretación de resultados
Espora: coloración verde.
Célula vegetativa: coloración roja.
Prueba con Agar Citrato de Simmons
Este medio nos permite comprobar la capacidad de la bacteria de utilizar el citrato como
fuente exclusiva de carbono.
La degradación del citrato conlleva a la alcalinización del medio y el viraje de color azul de
bromoticol de verde a azul.
Procedimiento
1. La muestra se debe tomar con un asa en punta.
2. La siembra se realiza con picadura profunda y estriado en el pico.
Interpretación de resultados.
- Positivo: crecimiento bacteriano con un intenso color azul en el pico.
- Negativo: ausencia de crecimiento y permanencia de color verde del medio de
cultivo.

Prueba con Agar KIA

El agar Hierro de Kliger (KIA), es un medio sólido y diferencial. El fundamento se basa en
la capacidad de fermentación de dos azucares (glucosa y lactosa), en la producción de ácido
sulfhídrico y en la producción de gas.
Procedimiento
1. Tomar muestra con asa en punta.
2. Sembrar en picadura profunda y por estrías en el pico.

Interpretación de resultados
- Los microorganismos que fermentan glucosa pero no lactosa mostrará un
crecimiento K/A, mientras que los que sí fermentan lactosa mostrarán un resultado A/A,
con o sin formación de gas.

- La formación de H₂S se demostrará por el ennegrecimiento del medio.

- Si el medio no muestra ningún cambio es porque la bacteria no consume ni glucosa
ni lactosa.
 FLUJOGRAMA GENERAL

Aislamiento de la bacteria B. licheniformis a partir de la cáscara de yuca

Tomar 15 gramos de
cascara de yuca

Macerar Cascara de yuca

Diluir Macerado en
agua peptona

Disolución
Incubar
por 24 horas

Muestra en medio
Sembrar
agar sangre y pda

Incubar Por 24 horas

Tinción de gram-
Tinciones
Tinción de Schaeffer-
Fulton.

Prueba con Agar

Pruebas bioquímicas Citrato-Prueba con
Agar KIA
 TINCIÓN DE GRAM

Esterilizar zona Algodón, Alcohol

Esterilizar Asa redonda

Coger inoculo B. licheeniformis

Extender la muestra Portaobjetos

Dejar secar

Fijar portaobjetos Mechero

Agregar azul violeta Portaobjetos

Enjuagar Agua destilada

Agregar lugol Esperar 1 minuto

Agregar alcohol cetona

Enjuagar Agua destilada

Agregar fucsina basico Esperar 1 minuto

Lavar levemente Portaobjetos

 Ubicar en el microscopio

TINCIÓN DE SCHAEFFER- FULTON

Esterilizar zona Algodón, Alcohol

Esterilizar Asa redonda

Realizar frotis Cultivo B. licheniformis

Secar al aire libre Portaobjetos

Fijar con calor Mechero

Cubrir con verde de maliquita Portaobjetos

Calentar (30 s) Mechero

Dejar enfriar

Lavar Agua destilada

Adicionar safranina al 0.5% Por 1 minuto

Lavar Agua destilada

 Dejar secar

Ubicar en el microscopio

Anotar observaciones

PRUEBAS BIOQUIMICA

Agar Kia

Esterilizar zona Algodón, Alcohol

Esterilizar Asa de punta

Coger inoculo B. licheniformis

Flamear tubo de ensayo

Introducir inoculo

Flamear el tubo Mechero

Tapar el tubo
 Incubar incubadora

Observaciones

Agar citrato de Simmons

Esterilizar zona Algodón, Alcohol

Esterilizar Asa de punta

Coger inoculo B. licheniformis

Flamear tubo de ensayo

Introducir inoculo

Flamear el tubo Mechero

Tapar el tubo

Incubar incubadora

Observaciones
 CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

ABRIL MAYO
ACTIVIDADES
16 23 24 25 26 27 17 25

Entrega de revisión
bibliográfica X

Proyecto X

Lista de materiales X

Preparación de la muestra X X

Pre-enriquecimiento X

Incubación de muestra X

Siembra en agar sangre y

pda X X

Incubación de muestra X

Tinción de Gram X

Pruebas bioquímicas X

Incubación de pruebas X

Toma de resultados X

Entrega del articulo X

Sustentación X
 LISTA DE MATERIALES

Día Procedimiento Materiales Fecha

1 separación de la  10 gramos de cascara de yuca 23-04-2018
bacteria  Agua peptona
 Balanza analítica (1)
 Tubos de ensayo (3)
 Gradilla (1)
 Incubadora (1)
 Beaker 250 ml (3)
 Pipetas 10 ml (3)
 Pinzas (3)
 Estomacher (2)
2 Siembra de la  Muestra preparada del procedimiento anterior 24-04-2018
muestra  Asa redonda (4)
 Incubadora (1)
 Medio de cultivo agar sangre
 Medio de cultivo PDA
 Mechero
 Alcohol
 Algodón
 Encendedor
 Marcador
3 Tinciones 1- tinción de gram 25/04/2018
 lugol
 cristal violeta
 agua destilada
 alcohol acetona
 safranina de gram
 asa redonda (2)
 asa en punta (2)
 microscopio
 cubre objeto (5)
 porta objeto (5)
 aceite de inmersión
 mechero

2-tincion de Schaeffer-Fulton
 verde malaquita
 mechero
 agua destilada
 safranina al 0.5%
 microscopio
 aceite de inmersión
  asa en punta (4)
 asa redonda (2)

4 Pruebas 1-Prueba con agar kia

bioquímicas  medio kia (2)
 incubadora
 asa en punta (4)
 asa redonda (2)
 alcoholo
 algodón
2.-Prueba agar citrato
 medio Simmons citrato (2)
 incubadora
 asa en punta (4)
 asa redonda (2)
5 Toma de 27/04/2018
resultados
 BIBLIOGRAFÍA

 GROVER M, NAIN L, SINGH S, SAXENA A. Molecular and biochemical

approaches for characterization of antifungal trait of a potent biocontrol agent
Bacillus subtilis RP24. Curr Microbiol. 2010; 60 (2): 99-106.
 SÁNCHEZ A. Obtención de jarabes de glucosa por hidrolisis enzimática de
almidón extraído de tres variedades de yuca (amarga, armenia y chile) cultivados en
la provincia de Guanenta (Santander). [Tesis de pregrado en Química]. Facultad de
Ciencias. Universidad de Bucaramanga. 2002
 MONTOR J, OLVERA C, REYES D, SACHMAN B, RAMÍREZ L, DEL MORAL
S. Caracterización bioquímica de AmiJ33 una amilasa de Bacillus
amyloliquefaciens aislada de suelos cultivados con caña de azúcar en la región de
Papaloapan. Rev. Electrónica Nova Scientia 2013; 6 (12): 39-59